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Biology

एकल-कोशिका मल्टी-ओमिक्स प्रयोगों के लिए माउस कैरोटिड धमनियों के लुमेन से एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/63128
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

हम एकल-कोशिका ओमिक्स प्रयोगों को करने के लिए स्थिर या परेशान प्रवाह स्थितियों के संपर्क में आने वाले माउस कैरोटिड धमनियों के लुमेन से एंडोथेलियल कोशिकाओं और नाभिक को अलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एथेरोस्क्लेरोसिस अशांत रक्त प्रवाह (डी-प्रवाह) के संपर्क में आने वाले धमनी क्षेत्रों की एक भड़काऊ बीमारी है। डी-फ्लो ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक स्तरों पर एंडोथेलियम में जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोथेरोजेनिक प्रतिक्रियाएं होती हैं। हाल ही में, माउस आंशिक कैरोटिड लिगेशन (पीसीएल) मॉडल का उपयोग करके एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर ट्रांसक्रिप्टोमिक और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए ट्रांसपोसेज एक्सेसिबल क्रोमैटिन सीक्वेंसिंग (एससीएटीएसीक्यू) अध्ययन के लिए सिंगल-सेल आरएनए सीक्वेंसिंग (एससीआरएनएसेक) और सिंगल-सेल परख का प्रदर्शन किया गया था। चूंकि एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) धमनी की दीवार में कुल कोशिका आबादी के एक मामूली अंश का प्रतिनिधित्व करती हैं, ईसी-समृद्ध एकल-कोशिका तैयारी प्राप्त करने के लिए एक ल्यूमिनल पाचन विधि का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन के लिए, चूहों को नियंत्रण के रूप में दाईं कैरोटिड धमनी (आरसीए) का उपयोग करते हुए बाएं कैरोटिड धमनी (एलसीए) में डी-प्रवाह को प्रेरित करने के लिए पीसीएल सर्जरी के अधीन किया गया था। पीसीएल सर्जरी के दो दिन या दो सप्ताह बाद कैरोटिड धमनियों को विच्छेदित किया गया था। प्रत्येक कैरोटिड के लुमेन को कोलेजनेज पाचन के अधीन किया गया था, और एंडोथेलियल-समृद्ध एकल कोशिकाओं या एकल नाभिक प्राप्त किए गए थे। इन एकल-कोशिका और एकल-नाभिक तैयारियों को बाद में 10x जीनोमिक्स माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप का उपयोग करके बारकोड किया गया था। बारकोडेड एकल-कोशिकाओं और एकल-नाभिक का उपयोग तब आरएनए तैयारी, पुस्तकालय उत्पादन और उच्च-थ्रूपुट डीएनए अनुक्रमक पर अनुक्रमण के लिए किया गया था। जैव सूचना विज्ञान प्रसंस्करण के बाद, एससीआरएनएसेक और एससीएटीएसीक्यू डेटासेट ने ल्यूमिनल पाचन से विभिन्न सेल प्रकारों की पहचान की, जिसमें मुख्य रूप से ईसी शामिल थे। चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी मौजूद थीं। इस ईसी-संवर्धन विधि ने एंडोथेलियम पर रक्त प्रवाह के प्रभाव को समझने में सहायता की, जो कुल धमनी पाचन विधि के साथ मुश्किल हो सकता था। ईसी-समृद्ध एकल-कोशिका तैयारी विधि का उपयोग ईसी-नॉकआउट और ट्रांसजेनिक चूहों में एकल-सेल ओमिक्स अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जहां इन जीनों पर रक्त प्रवाह के प्रभाव का अध्ययन नहीं किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, इस तकनीक को समान यांत्रिक अध्ययन करने के लिए मानव धमनी खोजों से ईसी-समृद्ध एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

इस प्रयोगशाला ने पहले प्रदर्शित किया था कि डी-प्रवाह के प्रेरण से हाइपरलिपिडेमिक चूहोंमें त्वरित और ऊबड़-खाबड़ एथेरोस्क्लेरोसिस विकास होता है। डी-फ्लो-प्रेरित एथेरोस्क्लेरोसिस का नया माउस मॉडल आंशिक कैरोटिड लिगेशन (पीसीएल) सर्जरी 3 का उपयोग करके संभव था। पीसीएल सर्जरी लिगेटेड लेफ्ट कैरोटिड धमनी (एलसीए) में कम और ऑसिलेटरी रक्त प्रवाह की स्थिति या डी-फ्लो को प्रेरित करती है। इसके विपरीत, विपरीत दाईं कैरोटिड धमनी (आरसीए) स्थिर लैमिनार प्रवाह (एस-प्रवाह) का सामना करना जारी रखती है। इससे पहले, एंडोथेलियल कोशिकाओं पर डी-प्रवाह के प्रभाव को समझने के लिए, कैरोटिड धमनियों को आंशिक बंधाव सर्जरी के बाद विच्छेदित किया गया था और फिनोल और गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट-आधारित लाइसिंग एजेंट (ल्यूमिनल आरएनए / डीएनए फ्लशिंग विधि) 2,4 के साथ फ्लश किया गया था, जो एंडोथेलियल-समृद्ध "पूल्ड बल्क" आरएनए या डीएनए प्रदान करता था। इन पूल किए गए थोक आरएनए या डीएनए को तब ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन या एपिजेनोमिक डीएनए मेथिलोम अध्ययन के लिए संसाधित किया गया था, क्रमशः 4,5,6। इन अध्ययनों ने कई प्रवाह-संवेदनशील जीन और माइक्रोआरएनए की खोज मेंमदद की, जिनकी एंडोथेलियल जीव विज्ञान और एथेरोस्क्लेरोसिस में भूमिकाओं की बड़े पैमाने पर जांच की गई थी।

हालांकि, एंडोथेलियल संवर्धन के बावजूद, ये थोक आरएनए / डीएनए अध्ययन डी-प्रवाह-प्रेरित एथेरोस्क्लेरोसिस में धमनी की दीवार में प्रत्येक सेल प्रकार की विशिष्ट भूमिका को अलग नहीं कर सके। एंडोथेलियल-समृद्ध एकल-कोशिका (एससी) अलगाव और एससीआरएनए और एससीएटीएसी अनुक्रमण अध्ययन इस सीमाको दूर करने के लिए किए गए थे। इसके लिए, सी 57 बीएल 6 चूहों को नियंत्रण के रूप में एस-फ्लो-उजागर आरसीए का उपयोग करते हुए एलसीए में डी-फ्लो को प्रेरित करने के लिए पीसीएल सर्जरी के अधीन किया गया था। पीसीएल सर्जरी के दो दिन या दो सप्ताह बाद, चूहों की बलि दी गई, और कैरोटिड्स को विच्छेदित और साफ किया गया। एलसीए और आरसीए दोनों के लुमेन को कोलेजनेज के साथ जोड़ा गया था, और ल्यूमिनल कोलेजनेज डाइजेस्ट जिसमें ईसी एक महत्वपूर्ण अंश के रूप में और अन्य धमनी कोशिकाओं को एकत्र किया गया था। एकल-कोशिका निलंबन (scRNAAseq) या एकल-नाभिक निलंबन (scATACseq) तैयार किया गया था और 10x जीनोमिक्स सेटअप का उपयोग करके प्रत्येक कोशिका या नाभिक के लिए अद्वितीय पहचानकर्ताओं के साथ बारकोड किया गया था। आरएनए को सीडीएनए लाइब्रेरी तैयार करने और अनुक्रमित करने के अधीन किया गया था।

एससीआरएनएसेक और एससीएटीएसीक्यू डेटासेट को सेल रेंजर सिंगल-सेल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया गया था और आगे सेरेट और सिग्नैक आर पैकेज 9,10 द्वारा विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक कोशिका और नाभिक को इन विश्लेषणों से एक सेल प्रकार सौंपा गया था और मार्कर जीन और अद्वितीय जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर सेल प्रकार में क्लस्टर किया गया था। scRNAAseq और scATACseq के परिणामों से पता चला है कि ये एकल-कोशिका तैयारी ईसी से समृद्ध होती हैं और इसमें चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी), फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी होती हैं।

आगे के विश्लेषण से पता चला है कि ल्यूमिनल पाचन में ईसी आबादी अत्यधिक भिन्न और प्लास्टिक (8 अलग-अलग ईसी क्लस्टर) और रक्त प्रवाह के प्रति उत्तरदायी है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन परिणामों से पता चला है कि डी-फ्लो एक एथेरो-संरक्षित एंटी-इंफ्लेमेटरी फेनोटाइप से प्रो-एथेरोजेनिक फेनोटाइप ्स में ईसी को पुन: प्रोग्राम करता है, जिसमें प्रो-इंफ्लेमेटरी, एंडोथेलियल-टू-मेसेनकाइमल संक्रमण, एंडोथेलियल स्टेम / पूर्वज सेल संक्रमण और सबसे आश्चर्यजनक रूप से, एंडोथेलियल-टू-इम्यून सेल जैसे संक्रमण शामिल हैं। इसके अलावा, एससीएटीएसीक्यू डेटा जीनोम-व्यापक तरीके से नए प्रवाह-निर्भर क्रोमैटिन पहुंच परिवर्तन और प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों को प्रकट करता है, जो कई नई परिकल्पनाओं का आधार बनाते हैं। माउस कैरोटिड धमनियों से एकल-कोशिका बहु-ओमिक्स अध्ययन के लिए एकल एंडोथेलियल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए पद्धति और प्रोटोकॉल नीचे विस्तृत हैं।

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Protocol

नीचे वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं को एमोरी विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। गैर-हाइपरकोलेस्ट्रोलेमिक, आयु- और लिंग-मिलान सी 57बीएल /6 चूहों का उपयोग सेक्स-निर्भर भिन्नता को कम करने और हाइपरकोलेस्ट्रोलेमिक स्थितियों की किसी भी जटिलता को दूर करने के लिए किया गया था।

1. आंशिक कैरोटिड बंधाव (पीसीएल) सर्जरी

नोट: एलसीए के आंशिक कैरोटिड धमनी बंधाव को पहले वर्णितऔर प्रदर्शित किया गया था।

  1. एनेस्थेटिक वेपोराइज़र का उपयोग करके प्रक्रिया के दौरान आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन (प्रेरण के लिए ऑक्सीजन में 5% आइसोफ्लोरेन और रखरखाव के लिए उसके बाद 1.5%) द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें। सर्जरी के दौरान शरीर की गर्मी के नुकसान को रोकने के लिए डेल्टाफ़ेज़ इज़ोटेर्मल पैड पर माउस सुपाइन रखें।
  2. एक्सपोजर केराटाइटिस को रोकने के लिए एक ओकुलर मलहम लागू करें, और पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
  3. दर्द को पूर्वव्यापी रूप से प्रबंधित करने के लिए ब्यूप्रेनोर्फिन 0.05 मिलीग्राम / किग्रा को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें। बीटाडाइन और आइसोप्रोपेनोल समाधान के साथ तीन बार लगाने और सफाई करके एपिलेटेड क्षेत्र को कीटाणुरहित करें। सुनिश्चित करें कि बीटाडाइन सर्जरी क्षेत्र को निष्फल करने का अंतिम चरण है, जो केंद्र से शुरू होता है और किनारों पर समाप्त होता है।
  4. सड़न रोकनेवाली तकनीकों का उपयोग करके, गर्दन के क्षेत्र में एक उदर मध्य रेखा चीरा (~ 1 सेमी) बनाएं, और कुंद विच्छेदन द्वारा एलसीए शाखा बिंदु को उजागर करें।
  5. बाएं आंतरिक कैरोटिड, बाहरी कैरोटिड और ओसीसीपटल धमनियों को 6-0 रेशम सीवन के साथ लपेटें; बेहतर थायराइड धमनी को अछूता छोड़ दें।
  6. त्वचा का अनुमान लगाएं और ऊतक गोंद और / या सीवन के साथ चीरा बंद करें।
  7. माउस को एक पूर्व-गर्म रिकवरी पिंजरे (37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया) में स्थानांतरित करें और सर्जरी के बाद हाइपोथर्मिया से बचने के लिए इसे 1 घंटे तक एक साफ तौलिया पर रखें।
    नोट: हमारे अनुभव में, ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) की एक पूर्व-निर्धारित एकल खुराक आमतौर पर सर्जरी के बाद दर्द प्रबंधन के लिए पर्याप्त होती है। पहले 24 घंटों के बाद जानवर संकट में है तो ब्यूप्रेनोर्फिन की एक दोहराई जाने वाली खुराक दी जा सकती है। यदि सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो इस प्रक्रिया से जुड़ी कोई मृत्यु दर नहीं है, और माउस के लिए पोस्टऑपरेटिव तनाव न्यूनतम है। चूहों को उनके संबंधित पिंजरों में वापस कर दिया जाता है और सर्जरी के बाद दैनिक निगरानी की जाती है।
  8. छिड़काव सेटअप तैयार करें।
    1. एक IV बैग में 10 U/mL हेपरिन युक्त 0.9% NaCl (सामान्य खारा) का उपयोग करें। IV बैग को जमीन से 244-274 सेमी (8-9 फीट) या विच्छेदन बोर्ड से लगभग 122-152 सेमी (4-5 फीट) ऊंचा हुक करें। तितली सुई को खारा रेखा के अंत में संलग्न करें और किसी भी हवा के बुलबुले को IV रेखा से बाहर निकालें।

2. बलिदान के बाद कैरोटिड धमनियों का अलगाव

  1. संस्थागत आईएसीयूसी प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सीओ2 इनहेलेशन द्वारा चूहों का बलिदान करें।
  2. माउस की त्वचा पर 70% इथेनॉल स्प्रे करें और इसे अधिशोषक पेपर तौलिए युक्त विच्छेदन बोर्ड पर लापरवाह स्थिति में रखें। चिपकने वाला टेप या 21 जी सुई का उपयोग करके विच्छेदन बोर्ड पर अधिशोषक तौलिए पर माउस के पंजे को सुरक्षित करें।
  3. बाँझ कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके, पेट से शुरू होने वाले माउस की त्वचा को हटा दें और वक्ष के शीर्ष तक जाएं।
  4. कुंद विच्छेदन द्वारा रिबकेज के नीचे पेट की दीवार खोलने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  5. कैंची का उपयोग करके, डायाफ्राम की लंबाई के साथ सावधानीपूर्वक एक चीरा बनाएं, और वक्ष के दोनों किनारों पर पसलियों के माध्यम से जारी रखें जब तक कि उरोस्थि को दूर नहीं उठाया जा सकता। धीरे से बल की एक जोड़ी के साथ उरोस्थि को दूर उठाएं; उसके बाद, दिल को उजागर करने के लिए रिबकेज को हटा दें।
  6. प्रमुख वाहिकाओं की कल्पना करने के लिए हृदय पर थाइमस और किसी भी संयोजी ऊतक को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  7. रक्त को बंद परिसंचरण से बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए कैंची के साथ वेना कावा को काट दें।
  8. बाएं वेंट्रिकल में हृदय के शीर्ष के माध्यम से आईवी लाइन से जुड़ी 21 ग्राम तितली सुई डालें और कमरे के तापमान पर सामान्य खारा के साथ 2-3 मिनट के लिए प्रतिगामी छिड़काव की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि जमीन से 8-9 फीट की ऊंचाई पर खारा बैग रखकर सामान्य खारा की निरंतर प्रवाह दर बनाए रखी जाए।
    नोट: फेफड़े और यकृत पीला हो जाते हैं, जो इष्टतम छिड़काव का संकेत देते हैं। प्रत्येक माउस के लिए लगभग 20 एमएल छिड़काव बफर का उपयोग किया जाता है।
  9. गर्दन क्षेत्र से त्वचा को हटा दें और कैरोटिड धमनियों को उजागर करने के लिए सभी वसा, मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों को हटा दें (चित्रा 1 ए)।
    नोट: शेष प्रक्रिया विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत की जाती है।
  10. लिगेशन साइटों का पता लगाने के लिए दृश्य क्षेत्र समायोजित करें। 10 मिमी माइक्रो-विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, छिड़काव की अनुमति देने के लिए एलसीए में बंधाव साइट के नीचे एक छोटा सा चीरा लगाएं।
  11. बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से अतिरिक्त 1 मिनट के लिए फिर से आगे बढ़ें और सुनिश्चित करें कि एलसीए अच्छी तरह से संक्रमित है और रक्त के किसी भी दृश्य निशान से मुक्त है।
  12. कैरोटिड के शरीर से जुड़े होने के दौरान कैरोटिड्स के आसपास के पेरी-एडवेंटियल ऊतकों को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए फाइन-टिप फोर्स और छोटी स्प्रिंग कैंची का उपयोग करें।
    नोट: इस सफाई चरण के दौरान कैरोटिड धमनियों को निचोड़ने या फैलाने के लिए बेहद सावधान रहें, क्योंकि इससे गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या बढ़ सकती है। यदि सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो अंतिम सेल निलंबन में सेल व्यवहार्यता आमतौर पर >93% होती है।

3. चूहों कैरोटिड्स से एंडोथेलियल-सेल-समृद्ध एकल-कोशिका अलगाव

नोट: नीचे वर्णित अभिकर्मकों को अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है: तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ 1x और 0.1x एकल-नाभिक लाइसिस बफर; तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ एकल-नाभिक वॉश बफर; तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ एकल-नाभिक नाभिक बफर नुस्खा। इन बफरों के कार्यशील स्टॉक निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए तैयार किए जाने हैं। पाचन बफर संरचना: कोलेजनेज टाइप II 600 यू / एमएल और डीनेस आई 60 यू / एमएल 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में।

  1. जबकि कैरोटिड अभी भी जुड़े हुए हैं, रक्त के किसी भी निशान को दूर करने के लिए सामान्य खारा घोल के साथ कैरोटिड धमनियों के बाहरी हिस्से को धोएं।
  2. 29 जी सुई से सुसज्जित इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके, पाचन बफर के ~ 50 μL को बाएं कैरोटिड धमनी के बाहर के छोर के लुमेन में इंजेक्ट करें। चूंकि पाचन बफर कैरोटिड धमनी को भरना शुरू कर देता है, कैरोटिड के समीपस्थ छोर को माइक्रो-क्लिप (चित्रा 1 बी) के साथ दबाएं। लुमेन में अतिरिक्त 15-20 μL पाचन बफर पेश करें और पाचन बफर की रिहाई से बचने के लिए डिस्टल छोर को क्लिप करें।
  3. माउस (चित्रा 1 बी, सी) से कैरोटिड धमनियों को सावधानीपूर्वक खोजें और उन्हें गर्म (37 डिग्री सेल्सियस पर) हेप्स-बफर ्ड खारा समाधान वाले 35 मिमी व्यंजनों में रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि दोनों क्लैंप सुरक्षित रूप से रखे गए हैं। यदि क्लैंप ढीला हो जाता है, तो पाचन समाधान लुमेन से बाहर निकल सकता है और प्राप्त सेल गिनती को प्रभावित कर सकता है। यदि ऐसा होता है, तो कैरोटिड के खुले छोर से 29 जी सुई के साथ फिट इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके अतिरिक्त एंजाइमेटिक समाधान जोड़ें और क्लैंप को फिर से सुरक्षित करें (चित्रा 1 डी)। यदि एंजाइम बफर समाधान फिर से लीक हो जाता है, तो यह संभावना है कि कैरोटीनीकरण प्रक्रिया के दौरान कैरोटिड अलग हो जाता है। इस मामले में, कैरोटिड को छोड़ दें और अध्ययन से नमूने को बाहर करें। कैरोटिड की बार-बार खुरदरी हैंडलिंग सेल व्यवहार्यता और एकल-सेल तैयारी की गुणवत्ता को कम कर देगी। बाएं और दाएं कैरोटिड धमनियों को पहचानने और सही ढंग से लेबल करने का ध्यान रखें।
  4. आंतरायिक रॉकिंग के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए खोजे गए कैरोटिड्स को इनक्यूबेट करें।

4. कैरोटिड धमनियों को फ्लश करना

  1. ल्यूमिनल एंजाइमेटिक पाचन को पूरा करने के बाद, 35 मिमी डिश से क्लैंप के साथ कैरोटिड धमनी को हटा दें। प्रत्येक क्लैंप को ध्यान से हटा दें, ध्यान रखें कि पाचन बफर लीक नहीं होना चाहिए।
  2. धीरे से कैरोटिड धमनी के एक छोर को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के शीर्ष पर महीन बल के साथ पकड़ें। दूसरे हाथ से लुमेन में 100 μL गर्म पाचन बफर (37 °C) युक्त इंसुलिन सिरिंज से सुई फिट 29 ग्राम की सुई डालें (चित्रा 1 डी)।
  3. कैरोटिड के लुमेन को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जल्दी से फ्लश करें। 1.5 एमएल ट्यूब में 0.3 एमएल एफबीएस जोड़कर एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को अवरुद्ध करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    नोट: फ्लशिंग में ल्यूमिनल एंजाइमेटिक पाचन से कोशिकाएं होती हैं। एफबीएस जोड़ने और तापमान को कम करने से एंजाइमेटिक पाचन प्रक्रिया रुक जाती है। यदि तैयारी में कोशिकाओं की संख्या अधिक है और इसमें मलबे या वसा ऊतक होते हैं, तो अवांछित ऊतक मलबे को फ़िल्टर करने के लिए 50 या 70 μm सेल छन्नी के उपयोग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। एकल-कोशिका गिनती बढ़ाने के लिए, कई कैरोटिड्स को फ्लश करने की सिफारिश की जाती है। यहां, कम से कम 5,000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, 10-12 कैरोटिड्स को फ्लश किया गया और एक नमूने के रूप में पूल किया गया।
  4. एक निश्चित कोण रोटर से लैस सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 500 × ग्राम पर कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. सुपरनैटेंट को त्याग दें और सभी कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त पाचन बफर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यदि तैयारी में कोशिकाओं की संख्या कम है, तो कोशिकाओं को नीचे घुमाने के लिए सेंट्रीफ्यूज की गति को 2,000-3,000 × ग्राम तक बढ़ाएं। इसके अलावा, 0.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग ट्यूब के तल पर सेल गोली के बेहतर दृश्य की सुविधा प्रदान करता है।
  6. 0.5 एमएल ट्यूब में 0.15 एमएल एफबीएस जोड़कर एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को अवरुद्ध करें।
  7. चरण 4.4 के अनुसार, एक निश्चित-कोण रोटर से लैस सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 500 × ग्राम पर सिंगल-सेल सस्पेंशन को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 0.2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस में बर्फ-ठंडा 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) समाधान के 100 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    नोट: 0.2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग ट्यूब के तल पर एकल-सेल-गोली के विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ाता है।

5. एकल-कोशिका और एकल-नाभिक विश्लेषण

  1. SCRNAAseq के लिए एकल-सेल तैयारी को पुन: निलंबित और सबमिट करें।
    1. 0.2 एमएल ट्यूब में पीबीएस में 100 μL बर्फ-ठंडा 1% बीएसए के साथ एकल-सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    2. एकल-सेल एनकैप्सुलेशन के लिए कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के बाद, तुरंत माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित एकल-सेल विभाजन और बारकोडिंग सिस्टम का उपयोग करके एकल-सेल एनकैप्सुलेशन और बारकोडिंग के लिए आगे बढ़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. जीनोमिक्स कोर में नमूने जमा करने से पहले, एकल-सेल तैयारी की गणना और निरीक्षण करें; सेल समुच्चय की अनुपस्थिति सुनिश्चित करें।
      नोट: बीएसए राशि को 2% तक बढ़ाकर एकल कोशिकाओं के एकत्रीकरण को और कम किया जा सकता है।
  2. SCATACseq के लिए एकल-सेल तैयारी को पुन: निलंबित और सबमिट करें।
    1. सेल पेलेट को बर्फ-ठंडा 1x PBS में 0.04% बीएसए के 100 μL में पुन: निलंबित किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 × ग्राम पर एकल-सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज किया गया।
    2. बर्फ-ठंडा 0.1x लाइसिस बफर (तालिका 1) के साथ एकल-कोशिका निलंबन को लाइस करें और बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. लाइसेट को पी -20 पिपेट के साथ 10 बार मिलाएं और अतिरिक्त 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. लाइस्ड कोशिकाओं में 500 μL ठंडा धो बफर (तालिका 1) जोड़ें और पिपेट का उपयोग करके 5 बार मिलाएं।
      नोट: सेल निलंबन से किसी भी मलबे को फ़िल्टर करने और उन्हें 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 70 μm सेल छन्नी का उपयोग करें।
    5. लाइसेट को 500 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और पतला नाभिक बफर (150 μL) में नाभिक-गोली को पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका और तालिका 1 देखें)। हेमोसाइटोमीटर11 का उपयोग करके एकल-नाभिक तैयारी की गणना और निरीक्षण करें।
    6. एकल-नाभिक ट्रांसपोज़ेशन, नाभिक विभाजन, पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण के लिए जीनोमिक्स कोर में एकल-नाभिक नमूना जमा करें।
      नोट: यदि प्रारंभिक कोशिका संख्या कम है, तो नाभिक के साथ मलबे का निरीक्षण करना आम है। इसलिए, एक उच्च सेल संख्या के साथ शुरू करने की सिफारिश की जाती है।

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Representative Results

44 चूहों पर आंशिक कैरोटिड बंधाव सर्जरी की गई थी, और एलसीए में डी-फ्लो की शुरुआत को आंशिक बंधाव सर्जरी के एक दिन बाद अल्ट्रासोनोग्राफी करके मान्य किया गया था। सफल आंशिक बंधाव सर्जरी रक्त प्रवाह वेग को कम करती है और एलसीए 3 में रक्त प्रवाह (अशांत प्रवाह) को उलट देतीहै। कैरोटिड धमनियों को या तो दो दिनों में या बंधाव के दो सप्ताह बाद विच्छेदित किया गया था। प्रत्येक कैरोटिड के लुमेन को कोलेजनेज पाचन के अधीन किया गया था, और एंडोथेलियल-समृद्ध एकल-कोशिकाओं या एकल-नाभिक निलंबन तैयार किए गए थे। सेल उपज बढ़ाने के लिए 10 आरसीए और एलसीए से सिंगल-सेल सस्पेंशन पूल किए गए थे। तैयार की गई कोशिकाओं / नाभिक को बाद में बारकोड और अनुक्रमित किया गया था। एससी-आरएनएसेक अध्ययन के लिए, प्राप्त एकल कोशिकाओं की संख्या ~ 9,700 थी। 4 नमूनों से कोशिकाओं का वितरण तालिका 2 में दिखाया गया है।

इसी तरह, एससीएटीएसीक्यू अध्ययन के लिए, एकल कोशिकाओं को 12 आरसीए और एलसीए से अलग किया गया था, जो तैयार किए गए थे, ट्रांसपोसेज उपचार के अधीन थे, बारकोडेड और अनुक्रमित थे। अनुक्रमण 18,324 एकल नाभिकों के लिए किया गया था, जिन्हें 1,291 (2-दिवसीय आरसीए [2 डी-आर]), 5,351 (2-दिवसीय एलसीए [2 डी-एल]), 5,826 (2-सप्ताह आरसीए [2 डब्ल्यू-आर]), और 5,856 (2 सप्ताह एलसीए [2 डब्ल्यू-एल]) (तालिका 2) से पूल किया गया था। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी और फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना के अनुसार प्रतिनिधि एकल-कोशिका और एकल-नाभिक तैयारी चित्रा 2 ए, बी में दिखाई गई है। एकल-कोशिका निलंबन से एकल-नाभिक तैयारी की दक्षता चित्रा 2 सी में दिखाई गई है।

निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 2 डी (आरसीए और एलसीए) और 2 डब्ल्यू (आरसीए और एलसीए) नमूनों से नाभिक (~ 7,000 प्रत्येक) को 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए ट्रांसपोजिशन मिक्स (टीएन 5 ट्रांसपोसेस एंजाइम और बफर) सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। निर्माता की सिफारिश के आधार पर, एक हल्के डिटर्जेंट की स्थिति ने टैगमेंटेशन के दौरान नाभिक को बरकरार रखने में मदद की। एक मास्टर मिश्रण, जिसमें बारकोडिंग अभिकर्मक, रिड्यूसिंग एजेंट बी और बारकोडिंग एंजाइम शामिल थे, को निर्माता के निर्देशों के अनुसार बारकोडिंग के साथ एकल-नाभिक जेल इमल्शन तैयार करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक सेल / नाभिक एनकैप्सुलेशन प्लेटफॉर्म पर लोड किया गया था।

अनुक्रमण के बाद, सेल रेंजर सिंगल-सेल सॉफ्टवेयर सूट का उपयोग डीमल्टीप्लेक्सिंग, बारकोड प्रोसेसिंग संरेखण और कच्चे एससीएटीएसीक्यू और एससीआरनेसेक प्रोफाइल के प्रारंभिक क्लस्टरिंग के लिए किया गया था। एससीआरएनएसेक अध्ययन के लिए, प्रति सेल जीन का वितरण, प्रति सेल अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई), माइटोकॉन्ड्रियल रीड प्रति सेल, और अनुक्रमण संतृप्ति जानकारी चित्रा 3 ए-सी में दिखाई गई है। इसी तरह, एससीएटीएसीक्यू अध्ययन के लिए, सम्मिलित आकार वितरण (न्यूक्लियोसोम बैंडिंग पैटर्न) और सामान्यीकृत टीएसएस संवर्धन स्कोर दिखाने वाले गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स को चित्रा 3 डी-एफ में दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, प्रतिशत टुकड़ा चोटियों, पीक क्षेत्र के टुकड़ों, टीएसएस संवर्धन स्कोर, ब्लैकलिस्ट जीनोमिक साइटों में पढ़ने का अनुपात और न्यूक्लियोसोम सिग्नल अनुपात को चित्रा 3 जी-के में दिखाया गया है।

एंडोथेलियल संवर्धन को इस विधि की तुलना पूरे कैरोटिड धमनी12 के एंजाइमेटिक पाचन से करके की गई थी। पूर्ण कैरोटिड धमनी पाचन से एंडोथेलियल सेल गिनती प्राप्त कुल कोशिकाओं का 3-5% थी, जबकि इस विधि ने एंडोथेलियल कोशिकाओं के संवर्धन को >50% 8 तक अनुमति दी। इसी तरह, पूरे माउस महाधमनी का उपयोग करने वाले एक अन्य एकल-कोशिका अध्ययन से पता चला है कि एंडोथेलियल अंश कुल सेल गिनती का <7% था। गहन एकल-सेल आरएनएसेक और एकल-सेल एटीएसीक्यू विश्लेषण के लिए, पाठकों से अनुरोध है कि वे 8 का संदर्भ लें।

Figure 1
चित्रा 1: एकल-कोशिका तैयारी के लिए कैरोटिड धमनियों का अलगाव। (ए) चूहों में कैरोटिड धमनियों का शारीरिक दृश्य। लाल तीर और इनसेट पेरिएडवेंटियल वसा को साफ करने के बाद पृथक बाएं कैरोटिड धमनी को दिखाते हैं। कैरोटिड एनाटॉमी और लिगेशन के एक योजनाबद्ध के लिए, नाम एट अल3 (बी) में चित्रा 1 देखें, छवि पाचन बफर के साथ कैरोटिड धमनी को भरने के बाद माइक्रो-क्लिप के स्थान को दर्शाती है। (सी) पाचन बफर युक्त कैरोटिड धमनी का पता लगाया गया। स्केल: काली रेखाओं के बीच की दूरी = 1 मिमी (डी) माउस कैरोटिड धमनी के लुमेन में एक 29 जी सुई। यदि आवश्यक हो तो यह कदम पाचन बफर के साथ कैरोटिड धमनी को फिर से भरने में मदद करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माउस कैरोटिड धमनी के ल्यूमिनल एंजाइमेटिक पाचन से एकल-कोशिका और एकल-नाभिक तैयारी। स्केल बार = 0.25 मिमी (बी) एकल-नाभिक तैयारी के प्रतिनिधि चरण-कंट्रास्ट और जेल-लाल चित्र। (C) बाएं स्तंभ में एकल-नाभिक तैयारी की दक्षता शुरुआत में एकल कोशिकाओं की संख्या दिखाती है जबकि दायां स्तंभ विभिन्न चरणों में नाभिक अलगाव बफर के साथ प्रसंस्करण के बाद एकल नाभिक की संख्या दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: SCRNAAseq और scATACseq अध्ययन के लिए मानक QC मैट्रिक्स। वायलिन प्लॉट (ए) एससीआरएनएसेक डेटा के लिए प्रति सेल जीन (एनफीचर आरएनए), (बी) यूएमआई प्रति सेल (nCount_RNA), (सी) माइटोकॉन्ड्रियल रीड प्रति सेल (प्रतिशत एमटी) का वितरण दिखाते हैं। (डी और ई) एससीएटीएसीक्यू अध्ययन के लिए न्यूक्लियोसोम बैंडिंग पैटर्न दिखाते हैं। डीएनए टुकड़े के आकार का हिस्टोग्राम एक एकल न्यूक्लियोसोम के चारों ओर लिपटे डीएनए की लंबाई के अनुरूप एक मजबूत न्यूक्लियोसोम बैंडिंग पैटर्न प्रदर्शित करता है। (च) टीएसएस के सापेक्ष प्रत्येक स्थिति पर सामान्यीकृत टीएसएस संवर्धन स्कोर। वायलिन के भूखंडों से पता चलता है कि (जी) प्रतिशत टुकड़ा चोटियों में पढ़ता है, अनुक्रमण गहराई का एक माप, (एच) चरम क्षेत्र के टुकड़े अतिव्यापी चोटियों की संख्या दिखाते हैं, (I) टीएसएस संवर्धन स्कोर, टीएसएस पर केंद्रित रीड के कुल वितरण के बीच एक अनुपात और संबंधित टीएसएस, (जे) ब्लैकलिस्ट अनुपात, ब्लैकलिस्ट जीनोमिक साइटों में पढ़ने का अनुपात। और (के) न्यूक्लियोसोम सिग्नल, मोनोन्यूक्लियोसोमल से न्यूक्लियोसोम-मुक्त टुकड़ों का अनुपात। संक्षेप: scRNAAseq = एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण; ट्रांसपोसेज एक्सेसिबल क्रोमैटिन अनुक्रमण के लिए एससीएटीएसीक्यू = एकल-कोशिका परख; क्यूसी = गुणवत्ता नियंत्रण; यूएमआई = अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता; टीएसएस = प्रतिलेखन प्रारंभ साइट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: एकल-नाभिक लाइसिस और वॉश बफर की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: माउस कैरोटिड धमनी ल्यूमिनल पाचन से एकल-कोशिका और एकल-नाभिक गिनती। तालिका में एससीआरएनएसेक डेटा के लिए रीड/सेल और जीन/सेल की संख्या भी दिखाई गई है। scATACseq डेटा के लिए, प्रति नमूना प्राप्त औसत टुकड़े / सेल और कुल पठन8 दिखाए गए हैं। संक्षेप: scRNAAseq = एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण; ट्रांसपोसेज एक्सेसिबल क्रोमैटिन अनुक्रमण के लिए एससीएटीएसीक्यू = एकल-कोशिका परख; 2 डी = 2-दिन; 2W = 2 सप्ताह; आरसीए = दाहिनी कैरोटिड धमनी; एल /एलसीए = बाएं कैरोटिड धमनी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह पेपर माउस कैरोटिड धमनियों से एकल-सेल तैयारी को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं पर डी-प्रवाह के प्रभाव का सटीक अध्ययन किया जा सकता है यदि पीसीएल सर्जरी सही ढंग से की जाती है। आम कैरोटिड की शाखाओं को सही ढंग से पहचानना महत्वपूर्ण है, जैसे कि बाहरी कैरोटिड, आंतरिक कैरोटिड, ओसीसीपिटल धमनी और बेहतर थायरॉयड धमनी। अल्ट्रासोनोग्राफी द्वारा प्रवाह पैटर्न का सत्यापन डी-प्रवाह स्थितियों की सफल शुरुआत को और मान्य करता है। हालांकि पीसीएल सर्जरी चूहों पर उनकी उम्र के बावजूद की जा सकती है, पसंदीदा उम्र 10 ± 2 सप्ताह है। हाइपरकोलेस्ट्रोलेमिक पृष्ठभूमि वाले पुराने चूहों और चूहों में आम तौर पर अधिक पेरिएडवेंटियल वसा और कठोर त्वचा होती है।

कैरोटिड धमनी एंडोथेलियल-समृद्ध एकल-कोशिका तैयारी को आसपास के ऊतक और पेरिएडवेंटियल वसा से मुक्त सावधानीपूर्वक विच्छेदित करना आवश्यक है। एकल-कोशिका तैयारी में रक्त कोशिकाओं को दूषित करने से बचने के लिए कैरोटिड्स के लुमेन को अच्छी तरह से संक्रमित किया जाना चाहिए। अनुचित ऊतक पहचान और लेबलिंग के परिणामस्वरूप उच्च मानक विचलन हो सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए सावधानीपूर्वक योजना और समय प्रबंधन की आवश्यकता है। एक कुशल सर्जन और ऑपरेटर एक पीसीएल सर्जरी करने के लिए 15-20 मिनट ले सकते हैं। प्रत्येक माउस से बलिदान, कैरोटिड अलगाव और ल्यूमिनल एंजाइमेटिक पाचन में अतिरिक्त 35-40 मिनट लगेंगे। एंडोथेलियल सेल फ्लशिंग से सिंगल-सेल / सिंगल-न्यूक्लियस प्रेप तक हैंड्स-ऑन प्रोसेसिंग समय एक अतिरिक्त 2 घंटे है। सावधानीपूर्वक योजना और टीम वर्क अत्यधिक अनुशंसित हैं।

किसी भी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के साथ, कुछ नुकसान और सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। वर्तमान प्रोटोकॉल में ल्यूमिनल ऊतक पृथक्करण के दौरान तत्काल प्रारंभिक प्रतिक्रिया के कलात्मक सक्रियण से बचने के लिए कदम शामिल नहीं हैं। साहित्य में यह बताया गया है कि एंजाइमेटिक पाचन से तनाव सिग्नलिंग घटनाएं हो सकती हैं, जैसे कि सूजन और एपोप्टोसिस। इसे प्रयोगात्मक डिजाइन में उपयुक्त नियंत्रण समूहों को शामिल करके संबोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, गीली प्रयोगशाला विधियां जो एंजाइमेटिक पाचन के दौरान तत्काल प्रतिक्रिया के कलात्मक सक्रियण को कम कर सकती हैं, जैसे कि ठंड-सक्रिय प्रोटीज,को 13,14 माना जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी माउस तनाव के लिए किया जा सकता है, चाहे इसकी आनुवंशिक पृष्ठभूमि कुछ भी हो। हालांकि, एंडोथेलियल-समृद्ध तैयारी एंडोथेलियम में परिवर्तन से संबंधित अनुसंधान प्रश्नों का सबसे अच्छा उत्तर दे सकती है और इसलिए ईसी-विशिष्ट नॉकआउट और ईसी-विशिष्ट ट्रांसजेनिक चूहों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। इस एकल-सेल अलगाव विधि को एकल-सेल मल्टी-ओमिक्स अध्ययन और अन्य फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परख जैसे इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ल्यूमिनल पाचन दृष्टिकोण का उपयोग ताजा प्राप्त माउस महाधमनी, बड़े जानवरों (खरगोशों और सूअरों) से धमनियों के साथ-साथ ताजा प्राप्त मानव संवहनी खोजों के लिए किया जा सकता है। सामूहिक रूप से, यह विधि हमें एंडोथेलियल फ़ंक्शन पर रक्त प्रवाह की सटीक भूमिका को पूरी तरह से समझने और एकल-कोशिका संकल्प पर रीप्रोग्रामिंग करने की अनुमति देगी।

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Disclosures

एचजे फ्लोकिन्स फार्मा के संस्थापक हैं। अन्य लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एचजे को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान एचएल 119798, एचएल095070 और एचएल 139757 से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। एचजे को वालेस एच कूल्टर प्रतिष्ठित संकाय चेयर प्रोफेसरशिप द्वारा भी समर्थित किया जाता है। एमोरी इंटीग्रेटेड जीनोमिक्स कोर (ईआईजीसी) द्वारा प्रदान की गई सेवाओं को एमोरी यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन द्वारा सब्सिडी दी गई थी और आंशिक रूप से नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के जॉर्जिया क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंस एलायंस द्वारा भी समर्थित किया गया था। UL1TR002378. ऊपर दी गई सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade) Corning 21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile Fablab FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes Labcon 3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile Covidien s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged Thermo Fisher Scientic 08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered Sigma-Aldrich A6964-100ML or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) 10x Genomics 2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) 10x Genomics 2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin Sigma-Aldrich A7906-500G
Buprenorphine Med-Vet International RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics 1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 10X Genomics 1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 10X Genomics 1000175
Collagenase II MP Biomedicals 2100502.5
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Dissecting Forceps Roboz Surgical Instruments Co RS-5005
Dnase1 New England Biolabs Inc M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) Eppendorf 22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select R&D systems S11550
Fixed Angle Rotor Eppendorf FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline Millipore Sigma 51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) BD 305932
Isoflurane Patterson vet 789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)  Miltenyi Biotec 130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride) Baxter International Inc 2B1323
Nuclei Buffer (20x) 10x Genomics PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher Scientic 70011-044
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock Roboz Surgical Instruments Co. RS-5480 or similar
Tissue Mend II Webster Veteinanry 07-856-7946
Type II Collagenase MP biomedicals 2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0 10X Genomics https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero Pliner et al., 2018 https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1 Hadley Wickham https://cran.r-project.org
Harmony Korsunsky et al., 2019 https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ Schneider et al., 2012 https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0 Qiu et al., 2017 https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2 R Foundation https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3 Stuart et al., 2019 https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5 Stuart et al., 2019 https://github.com/timoast/signac

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References

  1. Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
  2. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  3. Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
  4. Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
  5. Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
  6. Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
  7. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
  8. Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
  9. Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
  10. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  11. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
  12. Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
  13. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  14. O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).

Tags

जीव विज्ञान अंक 176 धमनी कोशिकाएं एंडोथेलियल कोशिकाएं एकल-कोशिका आरएनएसेक एकल-कोशिका एटीएसीक्यू एथेरोस्क्लेरोसिस

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally

to:

Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally

एकल-कोशिका मल्टी-ओमिक्स प्रयोगों के लिए माउस कैरोटिड धमनियों के लुमेन से एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव
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Kumar, S., Andueza, A., Villa-Roel,… More

Kumar, S., Andueza, A., Villa-Roel, N., Kim, J., Kang, D. W., Jo, H. Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments. J. Vis. Exp. (176), e63128, doi:10.3791/63128 (2021).

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