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Summary
Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.
Abstract
A aterosclerose é uma doença inflamatória das regiões arteriais expostas ao fluxo sanguíneo perturbado (fluxo d). O fluxo D regula a expressão de genes no endotélio nos níveis transcriptômico e epigenômico, resultando em respostas proaterogênicas. Recentemente, estudos de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e ensaio de célula única para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (scATACseq) foram realizados para determinar as alterações de acessibilidade transcriptômica e cromatina em uma resolução de célula única usando o modelo de ligadura parcial de carótida (PCL) de camundongo. Como as células endoteliais (CE) representam uma fração menor das populações celulares totais na parede da artéria, um método de digestão luminal foi usado para obter preparações unicelulares enriquecidas com CE. Para este estudo, camundongos foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na artéria carótida esquerda (ACV) enquanto usavam a artéria carótida direita (ACR) como controle. As artérias carótidas foram dissecadas dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagenase, e células únicas enriquecidas com endotelial ou núcleos únicos foram obtidos. Essas preparações de célula única e núcleos únicos foram subsequentemente codificadas usando uma configuração microfluídica de 10x Genomics. As células únicas e os núcleos únicos com código de barras foram então utilizados para preparação de RNA, geração de biblioteca e sequenciamento em um sequenciador de DNA de alto rendimento. Após o processamento bioinformático, os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq identificaram vários tipos de células da digestão luminal, consistindo principalmente de CEs. Células musculares lisas, fibroblastos e células imunes também estavam presentes. Este método de enriquecimento CE ajudou a entender o efeito do fluxo sanguíneo no endotélio, o que poderia ter sido difícil com o método de digestão total da artéria. O método de preparação de célula única enriquecido com CE pode ser usado para realizar estudos de ômica de célula única em camundongos knockouts e transgênicos em que o efeito do fluxo sanguíneo sobre esses genes não foi estudado. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada para isolar células únicas enriquecidas com CE de explantes de artérias humanas para realizar estudos mecanicistas semelhantes.
Introduction
Este laboratório demonstrou anteriormente que a indução do fluxo d leva ao desenvolvimento rápido e robusto de aterosclerose em camundongos hiperlipidêmicos 1,2. O novo modelo de aterosclerose induzida por fluxo d em camundongos foi possível usando a cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP) 3. A cirurgia de LCP induz a condição de fluxo sanguíneo baixo e oscilatório ou fluxo d na artéria carótida esquerda ligada (ACV). Em contraste, a artéria carótida direita (ACR) contralateral continua a enfrentar fluxo laminar estável (s-flow). Anteriormente, para entender o efeito do fluxo d nas células endoteliais, as artérias carótidas foram dissecadas após a cirurgia de ligadura parcial e lavadas com um agente lisador à base de isotiocianato de fenol e guanidina (método de liberação de RNA/DNA luminal)2,4, que forneceu RNAs ou DNAs "a granel agrupados" enriquecidos com endotélio. Esses RNAs ou DNAs agrupados a granel foram então processados para estudos transcriptômicos ou estudos epigenômicos de metiloma de DNA, respectivamente 4,5,6. Esses estudos ajudaram a descobrir múltiplos genes sensíveis ao fluxo e microRNAs cujos papéis na biologia endotelial e na aterosclerose foram extensivamente investigados 4,6,7.
No entanto, apesar do enriquecimento endotelial, esses estudos de RNA/DNA em massa não conseguiram distinguir o papel específico de cada tipo de célula na parede da artéria na aterosclerose induzida pelo fluxo d. Isolamento unicelular (sc) enriquecido com endotélio e estudos de sequenciamento de scRNA e scATAC foram realizados para superar essa limitação8. Para isso, camundongos C57Bl6 foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na ACV enquanto usavam o RCA exposto ao fluxo s como controle. Dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP, os ratos foram sacrificados e as carótidas foram dissecadas e limpas. O lúmen de ambos os LCAs e RCAs foi infundido com colagenase, e os digestos de colagenase luminal contendo CEs como fração significativa e outras células arteriais foram coletadas. A suspensão de célula única (scRNAseq) ou a suspensão de núcleos únicos (scATACseq) foram preparadas e codificadas com identificadores únicos para cada célula ou núcleo usando uma configuração de Genômica 10x. Os RNAs foram submetidos à preparação da biblioteca de cDNA e sequenciados.
Os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq foram processados utilizando o Cell Ranger Single-Cell Software e posteriormente analisados pelos pacotes Seurat e Signac R 9,10. A cada célula e núcleo foi atribuído um tipo de célula a partir dessas análises e agrupados no tipo de célula com base nos genes marcadores e padrões únicos de expressão gênica. Os resultados do scRNAseq e scATACseq demonstraram que essas preparações de célula única são enriquecidas com CEs e também contêm células musculares lisas (SMCs), fibroblastos e células imunes.
Uma análise mais aprofundada revelou que a população CE na digestão luminal é altamente divergente e plástica (8 clusters CE diferentes) e responsiva ao fluxo sanguíneo. Mais importante ainda, esses resultados demonstraram que o fluxo d reprograma as CEs de um fenótipo anti-inflamatório protegido por ateróbio para fenótipos pró-aterogênicos, incluindo transição pró-inflamatória, endotelial para mesenquimal, transição de células-tronco endoteliais / progenitoras e, mais surpreendentemente, transição endotelial para célula imune. Além disso, os dados scATACseq revelam novas alterações de acessibilidade à cromatina dependentes do fluxo e locais de ligação ao fator de transcrição de maneira genômica, que formam a base de várias novas hipóteses. A metodologia e o protocolo para a preparação de células endoteliais únicas para estudos multi-ômicos de célula única das artérias carótidas de camundongos são detalhados abaixo.
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Protocol
Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Emory. Camundongos C57BL/6 não hipercolesterolêmicos, pareados por idade e sexo foram usados para mitigar a variação dependente do sexo e compensar qualquer complicação de condições hipercolesterolêmicas.
1. Cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP)
NOTA: A ligadura parcial da artéria carótida da ACL foi realizada conforme descrito e demonstrado anteriormente3.
- Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano (5% de isofluorano em oxigênio para indução e 1,5% depois para manutenção) durante todo o procedimento utilizando um vaporizador anestésico. Coloque o rato em decúbito dorsal numa almofada isotérmica Deltaphase para evitar a perda de calor corporal durante a cirurgia.
- Aplique uma pomada ocular para evitar a ceratite de exposição e confirme a profundidade da anestesia pela ausência de resposta de beliscão do dedo do pé.
- Injete buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea para controlar a dor preventivamente. Desinfetar a área depilada aplicando e limpando com betadina e solução de isopropanol três vezes. Certifique-se de que a betadina é o último passo para esterilizar a área da cirurgia, começando pelo centro e terminando nas laterais.
- Usando técnicas assépticas, faça uma incisão ventral na linha média (~ 1 cm) na região do pescoço e exponha o ponto de ramificação da ACV por dissecção contundente.
- Lige as artérias carótida interna esquerda, carótida externa e occipital com sutura de seda 6-0; deixar a artéria tireoidiana superior intocada.
- Aproxime a pele e feche a incisão com cola de tecido e/ou suturas.
- Transfira o rato para uma gaiola de recuperação pré-aquecida (mantida a 37 °C) e coloque-o numa toalha limpa até 1 h para evitar hipotermia pós-cirúrgica.
NOTA: Em nossa experiência, uma dose única preventiva de buprenorfina (0,05 mg/kg) geralmente é suficiente para o controle da dor pós-cirúrgica. Uma dose repetida de buprenorfina pode ser administrada se o animal estiver em perigo após as primeiras 24 horas. Se realizado corretamente, não há mortalidade associada a este procedimento, e o estresse pós-operatório para o camundongo é mínimo. Os ratos são devolvidos às suas respectivas gaiolas e monitorados diariamente após a cirurgia. - Prepare a configuração de perfusão.
- Use NaCl a 0,9% (solução salina normal) contendo 10 U/mL de heparina em um saco intravenoso. Gancho o saco IV 244-274 cm (8-9 pés) do chão ou aproximadamente 122-152 cm (4-5 pés) mais alto do que a placa de dissecção. Anexe a agulha da borboleta ao final da linha salina e libere todas as bolhas de ar para fora da linha IV.
2. Isolamento das artérias carótidas após o sacrifício
- Sacrificar os camundongos por inalação de CO2 seguindo o protocolo institucional da IACUC.
- Pulverize etanol a 70% na pele do rato e coloque-o na posição supina sobre a placa de dissecação contendo toalhas de papel adsorventes. Prenda as patas do rato às toalhas adsorventes na placa de dissecação usando fita adesiva ou uma agulha 21 G.
- Usando um par de tesouras estéreis, remova a pele do rato a partir do abdômen e até o topo do tórax.
- Use um par de tesouras para abrir a parede abdominal abaixo da caixa torácica por dissecção contundente.
- Usando a tesoura, faça cuidadosamente uma incisão ao longo do comprimento do diafragma e continue através das costelas em ambos os lados do tórax até que o esterno possa ser levantado. Levante suavemente o esterno com um par de pinças; depois disso, remova a caixa torácica para expor o coração.
- Remova cuidadosamente o timo e qualquer tecido conjuntivo sobre o coração para visualizar os principais vasos.
- Separe a veia cava com uma tesoura para permitir que o sangue saia da circulação fechada.
- Insira uma agulha de borboleta 21 G conectada à linha IV através do ápice do coração no ventrículo esquerdo e permita a perfusão retrógrada por 2-3 min com solução salina normal à temperatura ambiente. Certifique-se de que uma taxa de fluxo constante de solução salina normal seja mantida, mantendo o saco salino na altura de 8-9 pés do solo.
NOTA: Os pulmões e o fígado ficam pálidos, indicando perfusão ideal. Aproximadamente 20 mL de tampão de perfusão são usados para cada rato. - Remova a pele da região do pescoço e remova toda a gordura, músculos e tecidos conjuntivos para expor as artérias carótidas (Figura 1A).
NOTA: O resto do procedimento é realizado sob o microscópio de dissecação. - Ajuste o campo de visão para localizar os locais de ligadura. Usando a tesoura de microdissecção de 10 mm, faça uma pequena incisão abaixo do local da ligadura na ACV para permitir a perfusão.
- Perfunda novamente por mais 1 min através do ventrículo esquerdo e certifique-se de que a ACV está bem perfundida e livre de quaisquer vestígios visíveis de sangue.
- Use pinças de ponta fina e pequenas tesouras de mola para remover cuidadosamente os tecidos peri-adventícios ao redor das carótidas enquanto a carótida está ligada ao corpo.
NOTA: Tenha muito cuidado para não espremer ou esticar as artérias carótidas durante esta etapa de limpeza, pois isso pode aumentar o número de células inviáveis. Se realizada corretamente, a viabilidade celular na suspensão celular final é geralmente de >93%.
3. Isolamento unicelular enriquecido com células endoteliais de carótidas de camundongos
NOTA: Os reagentes a seguir descritos podem ser preparados com antecedência e armazenados a 4 °C até a utilização: tamponadores de lise de núcleos únicos de 1x e 0,1x com os reagentes listados na Tabela 1; tampão de lavagem de núcleos únicos com os reagentes listados na Tabela 1; receita de tampão de núcleos únicos com os reagentes listados na Tabela 1. As existências de trabalho destes reservatórios devem ser preparadas de acordo com o protocolo do fabricante. Composição do tampão de digestão: Colgenase Tipo II 600 U/mL e DNase I 60 U/mL em soro fetal bovino (FBS) contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 0,5%.
- Enquanto as carótidas ainda estão ligadas, lave o exterior das artérias carótidas com solução salina normal para eliminar quaisquer vestígios de sangue.
- Usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G, injete ~ 50 μL do tampão de digestão no lúmen da extremidade distal da artéria carótida esquerda. À medida que o tampão de digestão começa a preencher a artéria carótida, prenda a extremidade proximal da carótida com um microclipe (Figura 1B). Introduza um adicional de 15-20 μL de tampão de digestão no lúmen e prenda a extremidade distal para evitar a liberação do tampão de digestão.
- Explantar cuidadosamente as artérias carótidas do rato (Figura 1B,C) e colocá-las em placas de 35 mm contendo solução salina quente (a 37 °C) tamponada com hepes.
NOTA: Certifique-se de que ambas as braçadeiras estão colocadas de forma segura. Se o grampo se soltar, a solução de digestão pode vazar para fora do lúmen e afetar a contagem de células obtida. Se isso acontecer, adicione solução enzimática adicional usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G da extremidade aberta da carótida e prenda a braçadeira novamente (Figura 1D). Se a solução tampão enzimática vazar novamente, é provável que a carótida seja cortada durante o processo de explante. Neste caso, descarte a carótida e exclua a amostra do estudo. O manuseio áspero repetido da carótida diminuirá a viabilidade celular e a qualidade da preparação de uma única célula. Tome cuidado para identificar e rotular corretamente as artérias carótidas esquerda e direita. - Incubar as carótidas explantadas durante 45 min a 37 °C com balanço intermitente.
4. Rubor das artérias carótidas
- Depois de completar a digestão enzimática luminal, remova a artéria carótida juntamente com os grampos do prato de 35 mm. Remova cuidadosamente cada braçadeira, tomando cuidado para que o tampão de digestão não vaze.
- Segure suavemente uma extremidade da artéria carótida com pinça fina em cima de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Inserir uma agulha de 29 G equipada com uma seringa de insulina contendo 100 μL de tampão de digestão quente (37 °C) no lúmen com a outra mão (figura 1D).
- Lave rapidamente o lúmen da carótida no tubo de microcentrífuga. Bloquear a reação enzimática adicionando 0,3 mL de FBS no tubo de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo.
NOTA: A lavagem contém as células da digestão enzimática luminal. A adição de FBS e a redução da temperatura interrompem o processo de digestão enzimática. Se o número de células na preparação for alto e contiver detritos ou tecido adiposo, o uso de um filtro celular de 50 ou 70 μm é altamente recomendado para filtrar detritos de tecidos indesejados. Para aumentar a contagem de células únicas, recomenda-se a lavagem de várias carótidas. Aqui, para obter pelo menos 5.000 células, 10-12 carótidas foram lavadas e agrupadas como uma amostra. - Centrifugar as células a 500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo (ver Tabela de Materiais).
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em tampão de digestão contendo reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) durante 5 min a 37 °C para separar todas as células em células únicas.
NOTA: Se o número de células na preparação for baixo, aumente a velocidade da centrífuga até 2.000-3.000 × g para girar as células. Além disso, o uso de tubos de centrífuga de 0,5 mL facilita uma melhor visualização da pastilha celular na parte inferior do tubo. - Bloqueie a reação enzimática adicionando 0,15 mL de FBS ao tubo de 0,5 mL.
- Centrifugar a suspensão de célula única a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo, como na etapa 4.4.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de solução gelada de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em PBS em um tubo de microcentrífuga de 0,2 mL.
NOTA: O uso de tubos de centrífuga de 0,2 mL melhora a visualização do pellet de célula única na parte inferior do tubo.
5. Análises unicelulares e unicelulares
- Ressuspeite e submeta a preparação de célula única para scRNAseq.
- Ressuspender o pellet unicelular com 100 μL de BSA gelado a 1% em PBS em um tubo de 0,2 mL.
- Depois de ressuspender as células para encapsulamento de célula única, prossiga imediatamente para encapsulamento de célula única e codificação de barras usando um sistema de particionamento e código de barras de célula única baseado em microfluídica (consulte a Tabela de Materiais).
- Antes de submeter as amostras ao Núcleo Genómico, contar e inspeccionar as preparações unicelulares; assegurar a ausência de agregados celulares.
NOTA: A agregação de células individuais pode ser ainda mais minimizada aumentando a quantidade de BSA em até 2%.
- Suspenda novamente e envie a preparação de célula única para scATACseq.
- Ressuspender o pellet celular em 100 μL de BSA a 0,04% em PBS gelado a 1x e centrifugar a suspensão de célula única a 500 × g a 4 °C.
- Lisar a suspensão unicelular com tampão de lise gelado 0,1x (Tabela 1) e incubar por 5 min no gelo.
- Misture o lisado 10 vezes com uma pipeta P-20 e incube por mais 10 minutos.
- Adicionar 500 μL de tampão de lavagem refrigerado (Tabela 1) às células lisadas e misturar 5 vezes utilizando uma pipeta.
NOTA: Use um filtro de células de 70 μm para filtrar quaisquer detritos da suspensão celular e transferi-los para um tubo de 2 mL. - Centrifugar o lisado a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet de núcleos no tampão de núcleos diluídos (150 μL) (ver Tabela de Materiais e Tabela 1). Contar e inspecionar as preparações de núcleos únicos utilizando um hemocitômetro11.
- Envie a amostra de núcleos únicos para o Núcleo Genômico para transposição de núcleos únicos, particionamento de núcleos, preparação de biblioteca e sequenciamento.
NOTA: Se o número inicial de células for baixo, é comum observar detritos ao longo dos núcleos. Portanto, recomenda-se começar com um número de células alto.
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Representative Results
Cirurgias de ligadura parcial da carótida foram realizadas em 44 camundongos, e o início do fluxo d na ACV foi validado pela realização de ultrassonografia um dia após a cirurgia de ligadura parcial. A cirurgia de ligadura parcial bem-sucedida causa redução da velocidade do fluxo sanguíneo e reverte o fluxo sanguíneo (fluxo perturbado) na ACV3. As artérias carótidas foram dissecadas aos dois dias ou duas semanas após a ligadura. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagenase e foram preparadas suspensões de células únicas ou núcleos únicos enriquecidos com endotelial. Suspensões unicelulares foram agrupadas a partir de 10 RCAs e LCAs para aumentar o rendimento celular. As células/núcleos preparados foram posteriormente codificados e sequenciados. Para o estudo sc-RNAseq, o número de células únicas obtidas foi de ~9.700. A distribuição das células de 4 amostras é mostrada na Tabela 2.
Da mesma forma, para o estudo scATACseq, células únicas foram isoladas de 12 RCAs e LCAs que foram preparadas, submetidas ao tratamento com transposase, codificadas por barras e sequenciadas. O sequenciamento foi realizado para 18.324 núcleos únicos, que foram agrupados de 1.291 (ACR de 2 dias [2D-R]), 5.351 (ACV de 2 dias [2D-L]), 5.826 (ACR de 2 semanas [2W-R]) e 5.856 (ACV de 2 semanas [2W-L]) (Tabela 2). Preparações representativas de célula única e núcleos únicos, visualizadas por microscopia de campo brilhante e microscopia de contraste de fase, são mostradas na Figura 2A,B. A eficiência da preparação de núcleos únicos a partir da suspensão de célula única é mostrada na Figura 2C.
Os núcleos (~7.000 cada) de amostras 2D (RCAs e LCAs) e 2W (RCAs e LCAs) foram incubados com uma Mistura de Transposição (enzima e tampão de transposase Tn5) ver Tabela de Materiais) por 60 min a 37 °C seguindo o protocolo do fabricante. Com base na recomendação do fabricante, uma condição de detergente suave ajudou a manter os núcleos intactos durante a marcação. Uma mistura mestre, consistindo de um Reagente de Codificação de Barras, Agente Redutor B e Enzima de Codificação de Barras, foi então carregada em uma plataforma de encapsulamento de células / núcleos microfluídicos para preparar emulsões de gel de núcleos únicos com código de barras de acordo com as instruções do fabricante.
Após o sequenciamento, o conjunto Cell Ranger Single-Cell Software foi usado para desmultiplexação, alinhamento de processamento de código de barras e agrupamento inicial dos perfis scATACseq e scRNaseq brutos. Para o estudo scRNAseq, a distribuição de genes por célula, identificador molecular único (UMI) por célula, leituras mitocondriais por célula e informações de saturação de sequenciamento são mostradas na Figura 3A-C. Da mesma forma, para o estudo scATACseq, as métricas de controle de qualidade que mostram a distribuição do tamanho da inserção (padrão de bandas de nucleossomos) e o escore de enriquecimento normalizado do TSS são mostrados na Figura 3D-F. Além disso, a porcentagem de leituras de fragmentos nos picos, fragmentos de região de pico, escore de enriquecimento de TSS, razão de leituras em locais genômicos da lista negra e razão de sinal de nucleossomo são mostrados na Figura 3G-K.
O enriquecimento endotelial foi quantificado comparando-se esse método com o da digestão enzimática de toda a artéria carótida12. A contagem de células endoteliais a partir da digestão completa da artéria carótida foi de 3-5% do total de células obtidas, enquanto este método permitiu o enriquecimento das células endoteliais para >50% 8. Da mesma forma, outro estudo de célula única que usou toda a aorta do rato mostrou que a fração endotelial foi <7% da contagem total de células. Para uma análise aprofundada de RNAseq de célula única e ATACseq de célula única, os leitores são solicitados a consultar 8.
Figura 1: Isolamento das artérias carótidas para preparo unicelular. (A) Visão anatômica das artérias carótidas em camundongos. Setas vermelhas e inserções mostram a artéria carótida esquerda isolada após a limpeza da gordura periadventícia. Para um esquema da anatomia da carótida e ligaduras, consulte a Figura 1 em Nam e cols.3 (B) A imagem mostra a localização dos microclipes após o preenchimento da artéria carótida com o tampão de digestão. (C) Artéria carótida explantada contendo tampão de digestão. Escala: distância entre linhas pretas = 1 mm. (D) Agulha 29 G no lúmen da artéria carótida do rato. Esta etapa ajuda a reabastecer a artéria carótida com tampão de digestão, se necessário. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação de unicélulas e núcleos únicos a partir da digestão enzimática luminal da artéria carótida de camundongos . (A) Preparações representativas de célula única e núcleos únicos. Barras de escala = 0,25 mm (B) Imagens representativas de contraste de fase e Gel-Red de preparações de núcleos únicos. Barras de escala = 0,25 mm. (C) A eficiência da preparação de núcleos únicos na coluna da esquerda mostra o número de células únicas no início, enquanto a coluna da direita mostra o número de núcleos únicos após o processamento com tampão de isolamento de núcleos em diferentes etapas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Métricas de QC padrão para o estudo scRNAseq e scATACseq. Os gráficos de violino mostram (A) a distribuição de genes por célula (nFeature RNA), (B) UMI por célula (nCount_RNA), (C) leituras mitocondriais por célula (porcentagem mt) para os dados scRNAseq. (D e E) mostram o padrão de bandas de nucleossomos para o estudo scATACseq. O histograma de tamanhos de fragmentos de DNA exibe um forte padrão de bandas de nucleossomos correspondente ao comprimento do DNA envolvido em torno de um único nucleossomo. (F) Escore normalizado de enriquecimento do TSS em cada posição em relação ao TSS. Os gráficos de dispersão/violino mostram (G) por cento de leituras de fragmentos nos picos, uma medida de profundidade de sequenciamento, (H) fragmentos de região de pico mostrando o número de fragmentos sobrepostos a picos, (I) escore de enriquecimento de TSS, uma razão entre a distribuição agregada de leituras centrada em TSSs e que flanqueia o TSS correspondente, (J) razão de lista negra, uma proporção de leituras em locais genômicos de lista negra, e (K) sinal de nucleossomo, uma razão entre fragmentos mononucleossomos e livres de nucleossomos. Abreviaturas: scRNAseq = sequenciamento de RNA unicelular; scATACseq = ensaio unicelular para sequenciamento de cromatina acessível à transposase; QC = controle de qualidade; UMI = identificador molecular único; TSS = local de início da transcrição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição dos tampões de lise e lavagem de núcleos únicos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Contagem de unicélulas e núcleos únicos da digestão luminal da artéria carótida de camundongos. A tabela também mostra as médias de leituras/célula e o número de genes/célula para dados de scRNAseq. Para os dados scATACseq, são mostradas as leituras médias de fragmentos/célula e totais obtidas por amostra8. Abreviaturas: scRNAseq = sequenciamento de RNA unicelular; scATACseq = ensaio unicelular para sequenciamento de cromatina acessível à transposase; 2D = 2 dias; 2W = 2 semanas; R/RCA = artéria carótida direita; L/LCA = artéria carótida esquerda. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Este artigo fornece um protocolo detalhado para isolar preparações unicelulares das artérias carótidas de camundongos. A influência do fluxo d nas células endoteliais pode ser estudada com precisão se a cirurgia de LCP for realizada corretamente. É crucial identificar corretamente os ramos da carótida comum, como a carótida externa, a carótida interna, a artéria occipital e a artéria tireoidiana superior. A validação dos padrões de fluxo por ultrassonografia valida ainda mais o início bem-sucedido das condições de fluxo d . Embora a cirurgia de LCP possa ser realizada em camundongos, independentemente da idade, a idade preferida é de 10 ± 2 semanas. Ratos mais velhos e camundongos com origens hipercolesterolêmicas geralmente tendem a ter mais gordura periadventícia e pele mais rígida.
É essencial dissecar cuidadosamente as preparações unicelulares enriquecidas com endotélio da artéria carótida, livres do tecido circundante e da gordura periadventícia. O lúmen das carótidas deve ser perfundido completamente para evitar a contaminação das células sanguíneas nas preparações unicelulares. A identificação e a rotulagem inadequadas do tecido podem resultar em alto desvio padrão. Planejamento cuidadoso e gerenciamento de tempo são necessários para este protocolo. Um cirurgião e operador qualificado pode levar de 15 a 20 minutos para realizar uma cirurgia de LCP. O sacrifício, o isolamento carotídeo e a digestão enzimática luminal de cada rato levariam mais 35-40 minutos. O tempo de processamento prático desde a lavagem das células endoteliais até a preparação de uma única célula/núcleos únicos é de 2 h adicionais. Planejamento meticuloso e trabalho em equipe são altamente recomendados.
Como em qualquer protocolo experimental, algumas desvantagens e limitações devem ser consideradas. O protocolo atual não incorpora etapas para evitar a ativação artifactual da resposta precoce imediata durante a dissociação do tecido luminal. Tem sido relatado na literatura que a digestão enzimática pode levar a eventos de sinalização de estresse, como inflamação e apoptose. Isso pode ser resolvido incorporando grupos de controle apropriados no desenho experimental. Além disso, métodos laboratoriais úmidos que possam minimizar a ativação artifactual da resposta imediata durante a digestão enzimática, como as proteases ativas a frio, devem ser considerados13,14.
Este protocolo pode ser usado para qualquer cepa de camundongo, independentemente de seu histórico genético. No entanto, as preparações enriquecidas com endotélio podem responder melhor às questões de pesquisa relativas às mudanças no endotélio e, portanto, são adequadas para knockouts específicos da CE e camundongos transgênicos específicos da CE. Este método de isolamento de célula única pode ser adaptado para realizar estudos multi-ômicos de célula única e outros ensaios baseados em citometria de fluxo, como a Citometria de Fluxo de Imagem. A abordagem de digestão luminal pode ser usada para aortas de camundongos recém-obtidos, artérias de animais de grande porte (coelhos e porcos), bem como para explantes vasculares humanos recém-obtidos. Coletivamente, esse método nos permitiria entender completamente o papel preciso do fluxo sanguíneo na função endotelial e na reprogramação em uma resolução de célula única.
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Disclosures
HJ é o fundador da FloKines Pharma. Outros autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde HL119798, HL095070 e HL139757 para HJ. HJ também é apoiado pelo Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Os serviços prestados pelo Emory Integrated Genomics Core (EIGC) foram subsidiados pela Escola de Medicina da Universidade de Emory e também foram parcialmente apoiados pela Georgia Clinical and Translational Science Alliance dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio. UL1TR002378. O conteúdo fornecido acima é de responsabilidade exclusiva dos autores e não reflete as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
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- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
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Tags
Biologia Edição 176 Células arteriais Células endoteliais RNAseq de célula única ATACseq de célula única AteroscleroseErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
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Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
