Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

Summary

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

Abstract

Atherosklerose ist eine entzündliche Erkrankung der arteriellen Regionen, die einem gestörten Blutfluss (D-Flow) ausgesetzt sind. D-flow reguliert die Expression von Genen im Endothel auf transkriptomischer und epigenomischer Ebene, was zu proatherogenen Reaktionen führt. Vor kurzem wurden Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und Einzelzell-Assay für Transposase Accessible Chromatin Sequencing (scATACseq) Studien durchgeführt, um die transkriptomischen und chromatin-Zugänglichkeitsänderungen bei einer Einzelzellauflösung unter Verwendung des Maus-PCL-Modells (Partial Carotisligation) zu bestimmen. Da Endothelzellen (ECs) nur einen geringen Teil der gesamten Zellpopulationen in der Arterienwand ausmachen, wurde eine luminale Verdauungsmethode verwendet, um EC-angereicherte Einzelzellpräparate zu erhalten. Für diese Studie wurden Mäuse einer PCL-Operation unterzogen, um einen d-Fluss in der linken Halsschlagader (LCA) zu induzieren, während die rechte Halsschlagader (RCA) als Kontrolle verwendet wurde. Die Halsschlagadern wurden zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation seziert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung unterzogen, und endothelial angereicherte Einzelzellen oder einzelne Kerne wurden erhalten. Diese Einzelzell- und Einzelkernpräparate wurden anschließend mit einem 10-fachen mikrofluidischen Aufbau von Genomics mit einem Barcode versehen. Die mit Barcodes versehenen Einzelzellen und Einzelkerne wurden dann für die RNA-Vorbereitung, Bibliotheksgenerierung und Sequenzierung auf einem Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierer verwendet. Nach der bioinformatischen Verarbeitung identifizierten die Datensätze scRNAseq und scATACseq verschiedene Zelltypen aus dem luminalen Aufschluss, die hauptsächlich aus ECs bestanden. Glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Immunzellen waren ebenfalls vorhanden. Diese EC-Anreicherungsmethode half dabei, die Wirkung des Blutflusses auf das Endothel zu verstehen, was mit der Methode der Gesamtarterienverdauung schwierig gewesen sein könnte. Die EC-angereicherte Einzelzellpräparationsmethode kann verwendet werden, um Einzelzell-Omics-Studien an EC-Knockouts und transgenen Mäusen durchzuführen, bei denen die Wirkung des Blutflusses auf diese Gene nicht untersucht wurde. Wichtig ist, dass diese Technik angepasst werden kann, um EC-angereicherte Einzelzellen aus menschlichen Arterienexplantaten zu isolieren, um ähnliche mechanistische Studien durchzuführen.

Introduction

Dieses Labor zeigte zuvor, dass die Induktion von d-flow zu einer schnellen und robusten Atheroskleroseentwicklung bei hyperlipidämischen Mäusen führt ^1,2. Das neuartige Mausmodell der d-Flow-induzierten Atherosklerose wurde mittels partieller Carotisligatur (PCL) möglich ³. Die PCL-Chirurgie induziert einen niedrigen und oszillatorischen Blutfluss oder D-Fluss in der ligierten linken Halsschlagader (LCA). Im Gegensatz dazu ist die kontralaterale rechte Halsschlagader (RCA) weiterhin einer stabilen laminaren Strömung (s-flow) ausgesetzt. Um die Wirkung des d-Flusses auf Endothelzellen zu verstehen, wurden die Halsschlagadern nach einer partiellen Ligaturoperation seziert und mit einem auf Phenol- und Guanidinisothiocyanat basierenden Lysemittel (luminale RNA/DNA-Spülmethode)^2,4 gespült^, das endothelial angereicherte "gepoolte Bulk"-RNAs oder DNAs lieferte. Diese gepoolten Bulk-RNAs oder DNAs wurden dann für transkriptomische Studien oder epigenomische DNA-Methylom-Studien bzw. ^4,5,6 verarbeitet. Diese Studien halfen, mehrere flussempfindliche Gene und microRNAs zu entdecken, deren Rolle in der Endothelbiologie und Atherosklerose umfassend untersucht wurde ^4,6,7.

Trotz der endothelialen Anreicherung konnten diese RNA/DNA-Massenstudien jedoch nicht die spezifische Rolle jedes Zelltyps in der Arterienwand bei d-flow-induzierter Atherosklerose unterscheiden. Um^{diese Einschränkung zu} überwinden, wurden endothelial angereicherte Einzelzellisolierungen (sc) sowie scRNA- und scATAC-Sequenzierungsstudien durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden C57Bl6-Mäuse der PCL-Operation unterzogen, um einen d-Flow in der LCA zu induzieren, während die s-flow-exponierte RCA als Kontrolle verwendet wurde. Zwei Tage oder zwei Wochen nach der PCL-Operation wurden die Mäuse geopfert und die Halsschlagader seziert und gereinigt. Das Lumen sowohl von LCAs als auch von RCAs wurde mit Kollagenase infundiert, und die luminalen Kollagenase-Verdauungen, die ECs als signifikante Fraktion enthielten, und andere arterielle Zellen wurden gesammelt. Die Einzelzellsuspension (scRNAseq) oder Einzelkernsuspension (scATACseq) wurde hergestellt und mit eindeutigen Identifikatoren für jede Zelle oder jeden Kern unter Verwendung eines 10-fachen Genomics-Setups versehen. Die RNAs wurden einer cDNA-Bibliotheksvorbereitung unterzogen und sequenziert.

Die Datensätze scRNAseq und scATACseq wurden mit der Cell Ranger Single-Cell Software verarbeitet und von den Seurat und Signac R Paketen ^9,10 weiter analysiert. Jeder Zelle und jedem Zellkern wurde aus diesen Analysen ein Zelltyp zugeordnet und basierend auf den Markergenen und einzigartigen Genexpressionsmustern in den Zelltyp gruppiert. Die Ergebnisse der scRNAseq und scATACseq zeigten, dass diese Einzelzellpräparate mit ECs angereichert sind und auch glatte Muskelzellen (SMCs), Fibroblasten und Immunzellen enthalten.

Weitere Analysen ergaben, dass die EC-Population in der luminalen Verdauung sehr divergent und plastisch (8 verschiedene EC-Cluster) ist und auf den Blutfluss reagiert. Am wichtigsten ist, dass diese Ergebnisse zeigten, dass d-flow ECs von einem athero-geschützten entzündungshemmenden Phänotyp zu pro-atherogenen Phänotypen umprogrammiert, einschließlich entzündungsförderndem, endothelialem zu mesenchymalem Übergang, endothelialem Stamm / Vorläuferzellübergang und überraschenderweise endothelial-zu-immunzellähnlichem Übergang. Darüber hinaus zeigen scATACseq-Daten genomweit neuartige flussabhängige Chromatin-Zugänglichkeitsänderungen und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, die die Grundlage für mehrere neue Hypothesen bilden. Die Methodik und das Protokoll zur Vorbereitung einzelner Endothelzellen für Einzelzell-Multi-Omics-Studien aus den Halsschlagadern der Maus sind unten aufgeführt.

Protocol

Alle unten beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Emory University genehmigt. Nicht-hypercholesterinämische, alters- und geschlechtsangepasste C57BL/6-Mäuse wurden verwendet, um geschlechtsabhängige Variationen zu mildern und Komplikationen hypercholesterinämischer Zustände auszugleichen.

1. Partielle Karotisligatur (PCL)

HINWEIS: Die partielle Karotis-Ligatur der LCA wurde wie zuvor beschrieben und demonstriert^{durchgeführt 3}.

1. Betäuben Sie die Maus durch Isofluran-Inhalation (5% Isofluoran in Sauerstoff für die Induktion und 1,5% danach für die Erhaltung) während des gesamten Verfahrens mit einem Anästhesie-Vaporizer. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein isothermes Deltaphase-Pad, um den Verlust von Körperwärme während der Operation zu verhindern.
2. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um eine Keratitis zu verhindern, und bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen einer Zehenklemmreaktion.
3. Injizieren Sie Buprenorphin 0,05 mg/kg subkutan, um Schmerzen präventiv zu behandeln. Desinfizieren Sie den epilierten Bereich durch dreimaliges Auftragen und Reinigen mit Betadin und Isopropanollösung. Stellen Sie sicher, dass Betadin der letzte Schritt zur Sterilisation des Operationsbereichs ist, beginnend in der Mitte und endend an den Seiten.
4. Machen Sie mit aseptischen Techniken einen ventralen Mittellinienschnitt (~ 1 cm) im Halsbereich und legen Sie den LCA-Zweigpunkt durch stumpfe Dissektion frei.
5. Ligiert die linke innere Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die Hinterhauptsarterien mit 6-0 Seidennaht; Lassen Sie die Arteria schilddrüse superior unberührt.
6. Nähern Sie sich der Haut an und schließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber und / oder Nähten.
7. Bringen Sie die Maus in einen vorgewärmten Erholungskäfig (bei 37 °C) und legen Sie sie bis zu 1 Stunde auf ein sauberes Handtuch, um eine postoperative Unterkühlung zu vermeiden.
   HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist eine präventive Einzeldosis von Buprenorphin (0,05 mg / kg) in der Regel ausreichend für die postoperative Schmerzbehandlung. Eine wiederholte Dosis von Buprenorphin kann verabreicht werden, wenn das Tier nach den ersten 24 Stunden in Not ist. Bei korrekter Durchführung ist mit diesem Verfahren keine Mortalität verbunden, und der postoperative Stress für die Maus ist minimal. Die Mäuse werden in ihre jeweiligen Käfige zurückgebracht und nach der Operation täglich überwacht.
8. Bereiten Sie das Perfusions-Setup vor.
   1. Verwenden Sie 0,9% NaCl (normale Kochsalzlösung) mit 10 U / ml Heparin in einem IV-Beutel. Haken Sie den Infusionsbeutel 244-274 cm (8-9 Fuß) vom Boden oder etwa 122-152 cm (4-5 Fuß) höher als das Präparierbrett. Befestigen Sie die Schmetterlingsnadel am Ende der Kochsalzlösung und spülen Sie alle Luftblasen aus der IV-Leitung.

2. Isolierung der Halsschlagadern nach dem Opfer

1. Opfern Sie die Mäuse durch CO₂ -Inhalation gemäß dem institutionellen IACUC-Protokoll.
2. Sprühen Sie 70% Ethanol auf die Haut der Maus und legen Sie es in Rückenlage auf die Sezierplatte, die Adsorptionspapiertücher enthält. Befestigen Sie die Pfoten der Maus mit Klebeband oder einer 21 G Nadel an den Adsorptionstüchern auf der Präparierplatte.
3. Entfernen Sie mit einer sterilen Schere die Haut der Maus vom Bauch bis zur Spitze des Thorax.
4. Verwenden Sie eine Schere, um die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs durch stumpfe Dissektion zu öffnen.
5. Machen Sie mit der Schere vorsichtig einen Einschnitt entlang der Länge des Zwerchfells und fahren Sie durch die Rippen auf beiden Seiten des Thorax, bis das Brustbein abgehoben werden kann. Heben Sie das Brustbein vorsichtig mit einer Pinzette ab; Danach entfernen Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
6. Entfernen Sie vorsichtig den Thymus und das Bindegewebe über dem Herzen, um die Hauptgefäße sichtbar zu machen.
7. Durchtrennen Sie die Hohlvene mit einer Schere, damit Blut aus dem geschlossenen Kreislauf austreten kann.
8. Führen Sie eine 21 G Schmetterlingsnadel, die mit der IV-Leitung verbunden ist, durch die Spitze des Herzens in den linken Ventrikel ein und lassen Sie eine retrograde Perfusion für 2-3 min mit normaler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur zu. Stellen Sie sicher, dass eine konstante Durchflussrate der normalen Kochsalzlösung aufrechterhalten wird, indem Sie den Kochsalzbeutel in der Höhe von 8-9 Fuß über dem Boden halten.
   HINWEIS: Die Lunge und die Leber werden blass, was auf eine optimale Durchblutung hinweist. Für jede Maus werden ca. 20 ml Perfusionspuffer verwendet.
9. Entfernen Sie die Haut aus der Halsregion und entfernen Sie das gesamte Fett, die Muskeln und das Bindegewebe, um die Halsschlagadern freizulegen (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Der Rest des Verfahrens wird unter dem Seziermikroskop durchgeführt.
10. Passen Sie das Sichtfeld an, um die Ligationsstellen zu lokalisieren. Machen Sie mit der 10-mm-Mikrodissektionsschere einen kleinen Schnitt unterhalb der Ligaturstelle in der LCA, um die Durchblutung zu ermöglichen.
11. Durchbluten Sie erneut für weitere 1 min über den linken Ventrikel und stellen Sie sicher, dass die LCA gut durchblutet und frei von sichtbaren Blutspuren ist.
12. Verwenden Sie eine feine Pinzette und eine kleine Federschere, um das periadventitiale Gewebe, das die Halsschlagader umgibt, vorsichtig zu entfernen, während die Halsschlagader am Körper befestigt ist.
    HINWEIS: Achten Sie sehr darauf, die Halsschlagadern während dieses Reinigungsschritts nicht zu quetschen oder zu dehnen, da dies die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen erhöhen kann. Bei korrekter Durchführung beträgt die Zelllebensfähigkeit in der endgültigen Zellsuspension in der Regel >93%.

3. Endothelzell-angereicherte Einzelzellisolierung aus der Carotis-Schicht von Mäusen

ANMERKUNG: Die nachstehend beschriebenen Reagenzien können im Voraus hergestellt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden: 1x und 0,1x Einzelkernlysepuffer mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien; Einkern-Waschpuffer mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien; Einzelkern Nuclei Buffer Rezeptur mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien. Die Arbeitsbestände dieser Puffer sind nach dem Protokoll des Herstellers vorzubereiten. Zusammensetzung des Verdauungspuffers: Kollagenase Typ II 600 U/ml und DNase I 60 U/ml in 0,5% fetalem Rinderserum (FBS)-haltiger phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).

1. Während die Halsschlagader noch befestigt sind, waschen Sie die Außenseite der Halsschlagadern mit normaler Kochsalzlösung, um Blutspuren wegzuspülen.
2. Mit einer Insulinspritze, die mit einer 29-G-Nadel ausgestattet ist, injizieren Sie ~ 50 μL des Verdauungspuffers in das Lumen des distalen Endes der linken Halsschlagader. Wenn der Verdauungspuffer beginnt, die Halsschlagader zu füllen, klemmen Sie das proximale Ende der Halsschlagader mit einem Mikroclip fest (Abbildung 1B). Führen Sie zusätzliche 15-20 μL Verdauungspuffer in das Lumen ein und schneiden Sie das distale Ende ab, um die Freisetzung des Verdauungspuffers zu vermeiden.
3. Die Halsschlagadern der Maus vorsichtig explantationieren (Abbildung 1B,C) und in 35-mm-Schalen geben, die warme (bei 37 °C) Hepes-gepufferte Kochsalzlösung enthalten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass beide Klemmen sicher platziert sind. Wenn sich die Klemme löst, kann die Verdauungslösung aus dem Lumen austreten und die erhaltene Zellzahl beeinflussen. In diesem Fall fügen Sie zusätzliche enzymatische Lösung mit einer Insulinspritze mit einer 29-G-Nadel vom offenen Ende der Halsschlagader hinzu und sichern Sie die Klemme erneut (Abbildung 1D). Wenn die Enzympufferlösung erneut ausläuft, ist es wahrscheinlich, dass die Halsschlagader während des Explantationsprozesses durchtrennt wird. Verwerfen Sie in diesem Fall die Halsschlagader und schließen Sie die Probe von der Studie aus. Eine wiederholte grobe Handhabung der Halsschlagader verringert die Zelllebensfähigkeit und die Qualität der Einzelzellpräparation. Achten Sie darauf, die linke und rechte Halsschlagadern zu identifizieren und korrekt zu kennzeichnen.
4. Inkubieren Sie die explantierten Carotiden für 45 min bei 37 °C mit intermittierendem Schaukeln.

4. Spülung der Halsschlagadern

1. Nach Abschluss der luminalen enzymatischen Verdauung entfernen Sie die Halsschlagader zusammen mit den Klemmen aus der 35 mm Schüssel. Entfernen Sie vorsichtig jede Klemme und achten Sie darauf, dass der Verdauungspuffer nicht ausläuft.
2. Halten Sie vorsichtig ein Ende der Halsschlagader mit einer feinen Pinzette auf einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie mit der anderen Hand eine 29-G-Nadel mit einer Insulinspritze mit 100 μl warmem Verdauungspuffer (37 °C) in das Lumen ein (Abbildung 1D).
3. Spülen Sie das Lumen der Halsschlagader schnell in das Mikrozentrifugenröhrchen. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,3 ml FBS in das 1,5-ml-Röhrchen geben. Legen Sie die Röhre auf Eis.
   HINWEIS: Die Spülung enthält die Zellen aus der luminalen enzymatischen Verdauung. Die Zugabe von FBS und die Senkung der Temperatur stoppt den enzymatischen Verdauungsprozess. Wenn die Anzahl der Zellen in der Zubereitung hoch ist und Ablagerungen oder Fettgewebe enthält, wird die Verwendung eines 50 oder 70 μm großen Zellsiebs dringend empfohlen, um unerwünschte Gewebeablagerungen herauszufiltern. Um die Einzelzellzahl zu erhöhen, wird empfohlen, mehrere Halsschlagader zu spülen. Um hier mindestens 5.000 Zellen zu erhalten, wurden 10-12 Carotiden gespült und als eine Probe gepoolt.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 min bei 4 °C mit einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor (siehe Materialtabelle).
5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Verdauungspuffer, der das Zelldissoziationsreagenz enthält (siehe Materialtabelle), für 5 min bei 37 °C, um alle Zellen in einzelne Zellen zu trennen.
   HINWEIS: Wenn die Anzahl der Zellen in der Zubereitung gering ist, erhöhen Sie die Zentrifugengeschwindigkeit auf 2.000-3.000 × g , um die Zellen herunterzudrehen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen eine bessere Visualisierung des Zellpellets am Boden des Röhrchens.
6. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,15 ml FBS in das 0,5-ml-Röhrchen geben.
7. Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension bei 500 × g für 5 min bei 4 °C mit einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor, wie in Schritt 4.4.
8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL eiskalter 1% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung in PBS in einem 0,2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die Verwendung von 0,2 ml Zentrifugenröhrchen verbessert die Visualisierung des einzelligen Pellets am Boden des Röhrchens.

5. Einzelzell- und Einzelkernanalysen

1. Resuspendieren und reichen Sie das Einzelzellpräparat für scRNAseq ein.
   1. Resuspendieren Sie das einzellige Pellet mit 100 μL eiskaltem 1% BSA in PBS in einem 0,2 ml Röhrchen.
   2. Nach der Resuspendierung der Zellen für die Einzelzellverkapselung fahren Sie sofort mit der Einzelzellverkapselung und Barcodierung unter Verwendung eines mikrofluidikbasierten Einzelzellpartitionierungs- und Barcodesystems fort (siehe Materialtabelle).
   3. Bevor Sie die Proben an den Genomics Core senden, zählen und inspizieren Sie die Einzelzellpräparate. Stellen Sie sicher, dass keine Zellaggregate vorhanden sind.
      HINWEIS: Die Aggregation einzelner Zellen kann weiter minimiert werden, indem die BSA-Menge auf bis zu 2% erhöht wird.
2. Resuspendieren und reichen Sie das Einzelzellpräparat für scATACseq ein.
   1. Das Zellpellet wird in 100 μL 0,04% BSA in eiskaltem 1x PBS resuspendiert und die Einzelzellsuspension bei 500 × g bei 4 °C zentrifugiert.
   2. Die Einzelzellsuspension mit eiskaltem 0,1-fach-Lysepuffer lysieren (Tabelle 1) und 5 min auf Eis inkubieren.
   3. Mischen Sie das Lysat 10 mal mit einer P-20 Pipette und inkubieren Sie für weitere 10 min.
   4. 500 μL gekühlten Waschpuffer (Tabelle 1) zu den lysierten Zellen geben und 5-mal mit einer Pipette mischen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein 70-μm-Zellsieb, um Ablagerungen aus der Zellsuspension zu filtern und in ein 2-ml-Röhrchen zu überführen.
   5. Das Lysat wird bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Kernpellet im verdünnten Kernpuffer (150 μL) resuspendiert (siehe Materialtabelle und Tabelle 1). Zählen und untersuchen Sie die Einzelkernpräparate mit einem Hämozytometer¹¹.
   6. Senden Sie die Einzelkernprobe an den Genomics-Kern zur Transposition, Kernpartitionierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung.
      HINWEIS: Wenn die anfängliche Zellzahl niedrig ist, ist es üblich, Trümmer entlang der Kerne zu beobachten. Daher wird empfohlen, mit einer hohen Zellzahl zu beginnen.

Representative Results

Partielle Carotis-Ligaturoperationen wurden an 44 Mäusen durchgeführt, und der Beginn des d-Flows in der LCA wurde durch Ultraschall einen Tag nach der partiellen Ligatur validiert. Eine erfolgreiche partielle Ligatur bewirkt eine verminderte Durchblutungsgeschwindigkeit und kehrt den Blutfluss (gestörter Fluss) in der LCA³ um. Die Halsschlagadern wurden entweder zwei Tage oder zwei Wochen nach der Ligatur präpariert. Das Lumen jeder Halsschlagader wurde einer Kollagenase-Verdauung unterzogen, und endothelial angereicherte Einzelzellen oder Einzelkernsuspensionen wurden hergestellt. Einzelzellsuspensionen wurden aus 10 RCAs und LCAs gepoolt, um die Zellausbeute zu erhöhen. Die präparierten Zellen/Kerne wurden anschließend mit einem Barcode versehen und sequenziert. Für die sc-RNAseq-Studie betrug die Anzahl der erhaltenen Einzelzellen ~9.700. Die Verteilung der Zellen aus 4 Proben ist in Tabelle 2 dargestellt.

Ebenso wurden für die scATACseq-Studie einzelne Zellen aus 12 RCAs und LCAs isoliert, die präpariert, einer Transposase-Behandlung unterzogen, mit Barcodes versehen und sequenziert wurden. Die Sequenzierung wurde für 18.324 Einzelkerne durchgeführt, die aus 1.291 (2-tägige RCA [2D-R]), 5.351 (2-tägige LCA [2D-L]), 5.826 (2-wöchige RCA [2W-R]) und 5.856 (2-wöchige LCA [2W-L]) gepoolt wurden (Tabelle 2). Repräsentative Einzelzell- und Einzelkernpräparate, dargestellt durch Hellfeldmikroskopie und Phasenkontrastmikroskopie, sind in Abbildung 2A,B dargestellt. Die Effizienz der Einzelkernpräparation aus Einzelzellsuspension ist in Abbildung 2C dargestellt.

Die Kerne (jeweils ~7.000) aus 2D- (RCAs und LCAs) und 2W- (RCAs und LCAs) Proben wurden mit einem Transposition Mix (Tn5-Transposase-Enzym und -Puffer) für 60 min bei 37 °C nach dem Protokoll des Herstellers inkubiert. Basierend auf der Empfehlung des Herstellers half ein milder Reinigungsmittelzustand, die Kerne während der Tagmentation intakt zu halten. Eine Mastermischung, bestehend aus einem Barcoding-Reagenz, einem Reduktionsmittel B und einem Barcoding-Enzym, wurde dann auf eine mikrofluidische Zell-/Kernverkapselungsplattform geladen, um Einzelkern-Gelemulsionen mit Barcoding gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen.

Nach der Sequenzierung wurde die Cell Ranger Single-Cell Software-Suite für das Demultiplexing, die Ausrichtung der Barcode-Verarbeitung und das anfängliche Clustering der rohen scATACseq- und scRNaseq-Profile verwendet. Für die scRNAseq-Studie sind die Verteilung der Gene pro Zelle, der eindeutige molekulare Identifikator (UMI) pro Zelle, die mitochondrialen Lesevorgänge pro Zelle und die Sequenzierungssättigungsinformationen in Abbildung 3A-C dargestellt. Ebenso sind für die scATACseq-Studie Qualitätskontrollmetriken, die die Insertgrößenverteilung (Nukleosomenbandenmuster) und den normalisierten TSS-Anreicherungswert zeigen, in Abbildung 3D-F dargestellt. Darüber hinaus sind die prozentualen Fragmentlesevorgänge in den Peaks, die Fragmente der Peakregion, der TSS-Anreicherungswert, das Verhältnis der Lesevorgänge an genomischen Standorten der Blacklist und das Nukleosomensignalverhältnis in Abbildung 3G-K dargestellt.

Die endotheliale Anreicherung wurde quantifiziert, indem diese Methode mit der enzymatischen Verdauung der gesamten Halsschlagader verglichen wurde¹². Die Endothelzellzahl aus der vollständigen Karotisverdauung betrug 3-5% der gesamten erhaltenen Zellen, während diese Methode eine Anreicherung der Endothelzellen auf >50 ^{% 8} ermöglichte. In ähnlicher Weise zeigte eine andere Einzelzellstudie, die die gesamte Mausaorta verwendete, dass die Endothelfraktion <7% der gesamten Zellzahl betrug. Für eine eingehende Einzelzell-RNAseq- und Einzelzell-ATACseq-Analyse werden die Leser gebeten, sich auf ⁸ zu beziehen.

Abbildung 1: Isolierung von Halsschlagadern zur Einzelzellpräparation. (A) Anatomische Ansicht der Halsschlagadern bei Mäusen. Rote Pfeile und Einschub zeigen die isolierte linke Halsschlagader nach der Reinigung von periadventitialem Fett. Eine schematische Darstellung der Anatomie und der Ligaturen der Halsschlagader finden Sie in Abbildung 1 in Nam et al³ (B) Das Bild zeigt die Position der Mikroclips nach dem Füllen der Halsschlagader mit dem Verdauungspuffer. (C) Explantierte Halsschlagader mit Verdauungspuffer. Maßstab: Abstand zwischen schwarzen Linien = 1 mm. (D) Eine 29 G Nadel im Lumen der Halsschlagader der Maus. Dieser Schritt hilft, die Halsschlagader bei Bedarf mit Verdauungspuffer aufzufüllen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Einzelzell- und Einzelkernpräparation aus luminaler enzymatischer Verdauung der Halsschlagader der Maus. (A) Repräsentative Einzelzell- und Einzelkernpräparate. Maßstabsbalken = 0,25 mm (B) Repräsentative Phasenkontrast- und Gel-Rot-Bilder von Einzelkern-Preps. Maßstabsbalken = 0,25 mm. (C) Effizienz der Einzelkernpräparation in der linken Spalte zeigt die Anzahl der Einzelzellen am Start, während die rechte Spalte die Anzahl der Einzelkerne nach der Verarbeitung mit Kernisolierungspuffer in verschiedenen Schritten zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Standard-QC-Metriken für die scRNAseq- und scATACseq-Studie. Geigendiagramme zeigen (A) die Verteilung der Gene pro Zelle (nFeature RNA), (B) UMI pro Zelle (nCount_RNA), (C) mitochondriale Lesevorgänge pro Zelle (Prozent mt) für die scRNAseq-Daten. (D und E) zeigen das Nukleosomenbandenmuster für die scATACseq-Studie. Das Histogramm der DNA-Fragmentgrößen zeigt ein starkes Nukleosomenbandenmuster, das der Länge der DNA entspricht, die um ein einzelnes Nukleosom gewickelt ist. (F) Normalisierter TSS-Anreicherungswert an jeder Position relativ zum TSS. Die Streu-/Violindiagramme zeigen (G) prozentuale Fragmentlesevorgänge in den Peaks, ein Maß für die Sequenzierungstiefe, (H) Fragmente der Peakregion, die die Anzahl der Fragmente zeigen, die Peaks überlappen, (I) TSS-Anreicherungsscore, ein Verhältnis zwischen der aggregierten Verteilung der auf TSS zentrierten Lesevorgänge und der Flankierung des entsprechenden TSS, (J) Blacklist-Verhältnis, ein Verhältnis von Lesevorgängen an genomischen Stellen der Blacklist, und (K) Nukleosomensignal, ein Verhältnis von mononukleosomalen zu nukleosomenfreien Fragmenten. Abkürzungen: scRNAseq = Single-cell RNA sequencing; scATACseq = Single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing; QC = Qualitätskontrolle; UMI = eindeutiger molekularer Identifikator; TSS = Transkriptionsstartseite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Einzelkernlyse- und Waschpuffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Einzelzell- und Einzelkernzahl aus der luminalen Verdauung der Halsschlagader der Maus. Die Tabelle zeigt auch Mittelwerte Lesevorgänge/Zelle und Anzahl der Gene/Zelle für scRNAseq-Daten. Für die scATACseq-Daten werden die mittleren Fragmente/Zellen und die Gesamtlesevorgänge pro Probe angezeigt⁸. Abkürzungen: scRNAseq = Single-cell RNA sequencing; scATACseq = Single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing; 2D = 2 Tage; 2W = 2 Wochen; R/RCA = rechte Halsschlagader; L/LCA = linke Halsschlagader. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Einzelzellpräparaten aus den Halsschlagadern der Maus. Der Einfluss von d-flow auf die Endothelzellen kann genau untersucht werden, wenn die PCL-Operation korrekt durchgeführt wird. Es ist wichtig, die Äste der gewöhnlichen Halsschlagader, wie die äußere Halsschlagader, die innere Halsschlagader, die Okzipitalarterie und die Arteria thyroidea superior, korrekt zu identifizieren. Die Validierung von Strömungsmustern durch Ultraschall validiert den erfolgreichen Beginn von d-flow-Bedingungen . Obwohl eine PCL-Operation an Mäusen unabhängig von ihrem Alter durchgeführt werden kann, beträgt das bevorzugte Alter 10 ± 2 Wochen. Ältere Mäuse und Mäuse mit hypercholesterinämischem Hintergrund neigen im Allgemeinen dazu, mehr periadventitiales Fett und steifere Haut zu haben.

Es ist wichtig, die endothelangereicherten Einzelzellpräparate der Halsschlagader sorgfältig zu sezieren, frei von umgebendem Gewebe und periadventitialem Fett. Das Lumen der Carotiden muss gründlich durchblutet werden, um eine Kontamination der Blutzellen in den Einzelzellpräparaten zu vermeiden. Eine unsachgemäße Identifizierung und Markierung von Gewebe kann zu einer hohen Standardabweichung führen. Für dieses Protokoll sind sorgfältige Planung und Zeitmanagement erforderlich. Ein erfahrener Chirurg und Bediener kann 15-20 Minuten benötigen, um eine PCL-Operation durchzuführen. Opfern, Karotisisolierung und luminale enzymatische Verdauung von jeder Maus würde zusätzliche 35-40 Minuten dauern. Die praktische Verarbeitungszeit von der Endothelzellspülung bis zur Einzelzell- / Einzelkernvorbereitung beträgt zusätzliche 2 Stunden. Eine sorgfältige Planung und Teamarbeit sind sehr zu empfehlen.

Wie bei jedem experimentellen Protokoll sollten einige Nachteile und Einschränkungen berücksichtigt werden. Das aktuelle Protokoll enthält keine Schritte zur Vermeidung einer künstlichen Aktivierung einer sofortigen Frühreaktion während der luminalen Gewebedissoziation. In der Literatur wurde berichtet, dass die enzymatische Verdauung zu Stresssignalereignissen wie Entzündungen und Apoptose führen kann. Dies kann durch die Einbeziehung geeigneter Kontrollgruppen in das Versuchsdesign angegangen werden. Darüber hinaus sollten feuchte Labormethoden, die die künstliche Aktivierung der sofortigen Reaktion während der enzymatischen Verdauung minimieren können, wie kälteaktive Proteasen, in Betracht gezogen werden^13,14.

Dieses Protokoll kann für jeden Mausstamm unabhängig von seinem genetischen Hintergrund verwendet werden. Die endothelangereicherten Präparate können jedoch am besten Forschungsfragen zu den Veränderungen des Endothels beantworten und eignen sich daher gut für EC-spezifische Knockouts und EC-spezifische transgene Mäuse. Diese Einzelzellisolationsmethode kann angepasst werden, um Einzelzell-Multi-Omics-Studien und andere Durchflusszytometrie-basierte Assays wie die bildgebende Durchflusszytometrie durchzuführen. Der luminale Verdauungsansatz könnte für frisch gewonnene Mausaorten, Arterien von Großtieren (Kaninchen und Schweine) sowie für frisch gewonnene menschliche Gefäßexplantate verwendet werden. Insgesamt würde diese Methode es uns ermöglichen, die genaue Rolle des Blutflusses auf die Endothelfunktion und die Reprogrammierung bei Einzelzellauflösung vollständig zu verstehen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac