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Bioengineering

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。

Abstract

Caenorhabditis elegans(C. elegans) は、発生および細胞生物学的プロセスを研究するための貴重なモデルシステムであることが証明されています。これらの生物学的プロセスを理解するには、多くの場合、同じ動物の長期にわたる繰り返しのイメージングが必要です。寒天パッドで行われる従来の固定化方法に関連する長い回復時間は、動物の健康に悪影響を及ぼし、同じ動物を長期間にわたって繰り返し画像化することは不適切です。この論文では、マイクロ流体チップの設計、製造方法、オンチップ C.エレガンス 培養プロトコル、および個々の動物の発生過程を研究するための長期イメージングの3つの例について説明します。ポリジメチルシロキサンで作製し、カバーガラス上に接着したチップは、窒素ガスを用いて偏向されたエラストマー膜を用いてガラス基板上に動物を固定化する。 C.エレガンス の完全な固定化により、麻酔薬を使用しない方法で細胞および細胞内イベントの堅牢なタイムラプスイメージングが可能になります。大きな断面を有するチャネル形状は、動物が2つの部分的に密封された隔離膜内を自由に動くことを可能にし、連続的な食物供給を伴うチャネル内の成長を可能にする。このシンプルなチップを用いて、PVD感覚ニューロンにおける神経突起の成長、外陰部の発達、樹状突起の樹状突起などの発生現象を、動物がチャネル内で成長するにつれてイメージングすることができます。長期的な成長およびイメージングチップは、単一の圧力ラインで動作し、外部バルブ、安価な流体消耗品がなく、 C.エレガンスを使用する他のラボで簡単に適応できる標準的なワーム処理プロトコルを利用しています。

Introduction

Caenorhabditis elegansは、細胞生物学、老化、発生生物学、および神経生物学を研究するための強力なモデル生物であることが証明されています。その透明な体、短いライフサイクル、容易なメンテナンス、定義された数の細胞、いくつかのヒト遺伝子との相同性、およびよく研究された遺伝学などの利点により、C.エレガンスは基礎生物学の発見と応用研究の両方で人気のあるモデルになりました1,2。個々の動物の繰り返しの長期観察から細胞の生物学的および発生的プロセスを理解することは有益であることがわかります。従来、C.エレガンスは寒天パッド上で麻酔をかけ、顕微鏡下で画像化されていました。動物の健康に対する麻酔薬の悪影響は、同じ動物の長期および反復断続的なイメージングのための麻酔動物の使用を制限します3,4。近年のマイクロ流体技術の進歩と、健康被害が無視できるほどのC.エレガンスの無麻酔トラップへの適応により、同じ動物の短期間および長期間にわたる高解像度イメージングが可能になりました。

マイクロ流体チップは、C. elegans'5ハイスループットスクリーニング6,7,8、トラップおよび分注9、薬物スクリーニング10,11、高解像度イメージングによるニューロン刺激12、および動物の高解像度イメージング12,13,14用に設計されています。スライドに固定化するための超薄型マイクロ流体シートも開発されている15。C.エレガンスの長期研究は、液体培養で成長する動物の低解像度画像を使用して、成長、カルシウム動態、行動に対する薬物の影響を観察して行われています16,17,18,19、それらの寿命、および老化20。シナプスの発達21、ニューロンの再生22、およびミトコンドリアの付加23を評価するために、高解像度顕微鏡を使用した長期的な研究が行われています。細胞の運命および分化の長期高解像度画像化および追跡は、マルチチャネルデバイス24,25で行われている。いくつかの細胞および細胞内イベントは数時間の時間スケールで発生し、in vivoでの細胞動態を理解するためのプロセスのすべての中間ステップを特徴付けるために、発生中の異なる時点で同じ個体をトラップする必要があります。器官形成、神経発生、細胞移動などの生物学的プロセスを画像化するには、動物を複数の時点で同じ方向に固定化する必要があります。我々は以前、ミトコンドリアが触覚受容体ニューロン(TRN)に沿って付加される場所を決定するために、C.エレガンスを36時間以上高解像度イメージングするためのプロトコルを公開しました23。

この論文は、高解像度イメージングを繰り返すためのマイクロフルイディクスベースの方法論を確立するためのプロトコルを提供します。この装置は、単一の流路を有し、装置ごとに1匹の動物の繰り返しイメージングに最適です。スループットを向上させ、一度に多くの動物を画像化するために、複数のデバイスを同じ圧力ラインに接続できますが、各デバイスの1匹の動物を制御する別々の3ウェイコネクタを使用します。このデザインは、胚発生後の発生過程、細胞移動、オルガネラ輸送、遺伝子発現研究など、高解像度のタイムラプス画像を必要とする研究に役立ちます。この技術は、多くの後期動物の並行成長とイメージングを必要とする寿命や老化の研究など、一部のアプリケーションに制限される可能性があります。ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーは、その生物学的安定性26、生体適合性27,28、気体透過性29,30、および調整可能な弾性率31のために、このデバイスの製造に使用されました。この2層装置は、マイクロ流体チャネルでの連続的な食物供給と、窒素ガスを使用したPDMS膜圧縮による個々のC.エレガンスの捕獲により、動物の成長を可能にします。この装置は、連続的な食物供給3の下でマイクロチャネル内で同じ動物を成長および画像化できるという利点を有する以前に公開された装置の拡張である。追加の分離膜ネットワークと2mm幅のトラップ膜により、発育中の動物の効率的な固定化が可能になります。このデバイスは、感覚PVDニューロンのニューロンの発達、外陰部の発達、および樹状突起の樹木形成を観察するために使用されています。動物は、デバイス内で健康に悪影響を与えることなく成長し、その発生中に同じ動物における細胞内イベントのイメージングを容易にするために繰り返し固定化することができる。

プロトコル全体は5つの部分に分かれています。パート1では、成長およびイメージングチップのデバイス製造について説明します。パート2では、PDMS膜たわみの圧力システムを設定して、個々の C.エレガンスを固定化して分離する方法について説明します。パート3では、デバイスイメージングのために線虫増殖培地(NGM)プレート上で C.エレガンス を同期させる方法について説明します。パート4では、1匹の動物をデバイスにロードし、マイクロ流体デバイス内で数日間動物を成長させる方法について説明します。パート5では、複数の時点で個々の動物を固定し、さまざまな対物レンズを使用して高解像度の画像をキャプチャし、フィジーを使用して画像を分析したりする方法について説明します。

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Protocol

1. 成長・イメージングデバイスの作製

  1. SU8金型製作
    1. ワープロソフト(またはコンピュータ支援設計CADソフト)で矩形を使用してパターン1(フロー層)とパターン2(制御層)を設計し、ポリエステル系フィルムに最小フィーチャーサイズ8μmのレーザープロッターを使用してフォトマスクを印刷します(図1)。
    2. シリコンウェーハを2.5cm×2.5cmにカットし、20%KOHで1分間洗浄します。ウェーハを脱イオン(DI)水ですすいでください。フロー層と制御層にそれぞれ1枚のウェーハを使用します。
      注意: KOHは腐食性であるため、取り扱いには注意が必要です。
    3. 14psiの圧縮窒素ガスでピースを乾燥させた後、ホットプレートで120°Cで4時間脱水します。次のステップに進む前に、2つのピースを室温まで冷却します。
    4. シリコン片の1つを取り、スピンコーターのチャックに置き、真空をオンにしてウェーハを所定の位置に保持します。シリコン片に~20μLのヘキサメチルジシラン(HMDS)を入れ、スピンコーターで毎分500回転(rpm)で5秒間、続いて3,000rpmで30秒間コーティングします。
      注意: この手順は黄色のライトで実行する必要があります。室内で白色光を使用しないでください。
    5. ~40 μmの均一なフォトレジスト厚さを得るには(フロー層に固有で、初期の幼虫のステージ1からステージ3(L1-L3)の動物のイメージングに適しています)、スピンコーターを使用して500 rpmで5秒間、続いて2,000 rpmで30秒間、シリコンウェーハに~1.5 mLのネガフォトレジスト-1をコーティングします。
    6. 2枚目のウェーハで手順1.1.4と1.1.5を繰り返して、制御層に固有の~40μmの均一なフォトレジスト厚さを取得します。
    7. あるいは、高齢の動物のためにフロー層の厚さを~80μmに増やすには、スピンコーターを使用して500rpmで5秒間、続いて2,000rpmで30秒間、シリコンウェーハを~1.5mLのネガフォトレジスト-2でコーティングします。この厚さは、成体動物へのL3段階に適しています。
      注意: スピンコート層への損傷を防ぐため、シリコンウェーハは側面を持ってください。この手順の間、白色ライトをオフのままにします。
    8. フォトレジストでコーティングされたシリコン片(フロー層および制御層用)をホットプレート上で65°Cで1分間焼き、続いて95°Cで10分間ベークします。焼きたての部分を室温に冷却します。
      注意: 焼きたてのシリコン片は、次のステップに進む前に1日間保管できます。暗所に保管し、白色光にさらさないでください。
    9. UVイルミネーターの露光ステージにソフトベークしたシリコン片を置き、フォトレジストコーティング面をUVランプに向けます。200 Wのランプを使用して、パターン1と2のフォトマスクを通して、2つのピースを別々にUVに15秒間さらし、それぞれフローレイヤーとコントロールレイヤーを取得します。
      注意: 安全ゴーグルを着用し、紫外線に直接さらさないようにしてください。この段階では、部屋の白色光を点灯しないでください。
    10. コーティング層を上に向けて露出した2つのシリコン片を65°Cで、続いて95°Cでそれぞれ1分と10分間焼きます。次のステップに進む前に、ピースを室温まで冷却します。
    11. シリコン片をフォトレジスト現像液(現像液をイソプロパノールで1:3に希釈)に20分間浸してパターンを現像します。パターンが見えたら、純粋なイソプロピルアルコール(IPA)ですすぎ、窒素ガス(14 psi)を使用して静かにブロードライします。
      注意: 人体への暴露を避けるために、この化学処理には換気の良い環境を使用してください。白色光は、機能が開発され、IPAですすいだ後にのみ使用してください。
    12. シリコン片は、コーティングされた面を上に向けてデシケーターに入れます。50 μLの純粋なトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランを小さなプラスチックカップまたはスライドガラスに注ぎ、破片をシラン蒸気にさらします。カップ/スライドをデシケーターの中に置き、2時間インキュベートします。
      注意: シラン蒸気に直接さらさないでください。シラン蒸気処理には常に密閉チャンバーを使用してください。
      注意: 必要に応じて、開発されたシリコン片を1〜2日間保管してから、次のステップに進むことができます。
  2. PDMSチップ製造
    1. エラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で混合することにより、プラスチックカップにPDMSを作成します。3分間絶えず攪拌して内容物をよく混ぜます。混合により、PDMSミックスに多くの気泡が発生します。
    2. PDMSミックスをデシケーターで30分間脱気して、すべての気泡を取り除きます。
      注意: 気泡は欠陥のある機能しないデバイスを引き起こす可能性があるため、機能に注ぐ前に、PDMSミックスから気泡が除去されていることを確認してください。
    3. 制御層(パターン2)のあるシリコンウェーハをペトリ皿に入れます。厚さ5mmのPDMSミックス層をシリコン片にそっと注ぎ、気泡の形成を防ぎます。
    4. PDMSミックスをデシケーターで脱気して、PDMS注入プロセス中に形成される追加の気泡を除去します。
    5. フロー層(パターン1)を備えたシリコンウェーハをスピナーチャックに置き、200〜500mTorrの真空圧を加えてウェーハを保持します。シリコンウェーハに~1 mLのPDMSを注ぎ、スピンコーターを使用して500 rpmで5秒間、続いて1,000 rpmで30秒間コーティングして、~80 μmの厚さの層を得ます。
    6. スピンコートされたPDMSで2つのシリコンウェーハを焼き、PDMS層を熱風対流式オーブンで50°Cで6時間注ぎました。焼いた後、室温で冷えるのを待ちます。
    7. 鋭利な刃を用いて制御層(パターン2)の周りのシリコン片から厚さ5mmのPDMS層を切り取り、シリコン基板から剥離します。
    8. PDMSブロックのリザーバーにハリスパンチャーを使用して直径~1mmの2つの穴を開け、固定化チャネルと隔離チャネルの入口をPDMS膜偏向用のガスラインに接続します。
    9. パターン1(フロー層)上にスピンコートされたPDMS層を備えたシリコン片を、PDMSコーティングされた表面を上に向けて、プラスチックトレイに置きます。パターン2(制御層)のパンチされたPDMSブロックを、成形面を上に向けてトレイに保管します。
    10. プラスチックトレイをプラズマクリーナー内に保ち、2つのPDMS表面を低真空(200〜600 mTorr)下で2分間18 Wエアプラズマにさらします。チャンバーが明るい紫色に変わるまで真空を適用します。暗い場所でこの手順を実行して、プラズマの色の変化を確認します。
    11. プラズマ処理された2つのブロックを取り出し、パターン1とパターン2のプラズマ処理面を一緒に押してブロックを穏やかに結合します。接着パターンを熱風対流式オーブンで50°Cで2時間焼きます。
    12. 接着されたデバイスをオーブンから取り出します。パターン1とパターン2のシリコンウェーハから接合されたデバイスを切り出し、ハリスパンチャーを使用してフロー層の入口と出口のリザーバーに穴を開けます。
    13. フロー層を上に向けて接着されたPDMSブロックをプラスチックトレイに置きます。同じトレイに清潔なカバーガラス(#1.5)を置いてください。ブロックとカバーガラスを18Wの空気プラズマに2分間さらします。真空圧を調整して、紫色のチャンバーを確認します。
      注意: この手順は、プラズマの色の変化を確認するために、暗い場所で実行する必要があります。カバーガラスを洗浄するには、IPAで洗浄し、窒素ガスを使用して14psiでブロードライします。
    14. プラズマ露出したPDMSブロックをカバーガラスの上に置き、接合した構造を50°Cのオーブンで2時間焼きます。将来の実験のために、デバイスをクリーンチャンバーに保管してください。

2. PDMSメンブレンプライミング

  1. 装置を取り、実体顕微鏡に置き、チューブを取り付けます。マイクロフレックスチューブ(内径~5mm、外径~8mm)を一端の圧縮窒素ガスラインに接続します。もう一方の端に三方コネクタを接続します。三方コネクタのチューブ1と2は、それぞれトラップと隔離膜に接続されます。
  2. 2本のマイクロフレックスチューブ(内径~1.6mm、外径~5mm)を三方活栓の2つの出口ポートに接続します。2本のチューブのもう一方の端を長さ8mmの18G針に接続します。
  3. 入口ポートを通してマイクロピペットを使用して、フロー層をM9バッファーで満たします。針に接続された端から両方のチューブにDI水を入れます。2本の針をパンチ穴に挿入し、それぞれ隔離膜と捕捉膜を接続します。
  4. 窒素ガスレギュレーターを14psiで開き、チューブ1から三方弁を回して、制御層のマイクロ流体チャネル、つまりトラップ膜と隔離膜を介して水をデバイスに押し込みます。
  5. 両方のチャネルに空気滴が存在せずに水がチャネルを満たすまで待ちます。チャネルが水で満たされると、チャネルはプライミングされていると見なされます。
  6. チャネルが水で満たされ、プライミングされたら、三方活栓を使用して圧力を解放します。プライミングは、流動層内に気泡を生じさせることができ、流路を通して追加の媒体を流すことによって気泡を除去する。

3. C.エレガンスの メンテナンスと同期

注:C.エレガンス株:この研究では、外陰部の発達32に以下の導入遺伝子PS3239(dpy-20(e1282)syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+)+ pJB100(ZMP-1::GFP)])、タッチ受容体ニューロン(TRN)の発生とミトコンドリア輸送イメージングにjsIs609(mec7p::MLS(ミトコンドリアマトリックス局在シグナル)::GFP)33、PVDの発達を追跡するためにwdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+))を使用しました34。標準C.エレガンスの培養および維持プロトコルは35に従った。

  1. 線虫増殖培地(NGM)ペトリプレート上で大腸菌OP50を食物源として22°CでC.エレガンスを増殖させる。 数匹の雌雄同体を繰り返し移すか、数匹の動物を含む少量の寒天をOP50芝生を備えた新しいNGMプレートにチャンクすることにより、C.エレガンス株を維持します。
  2. 3〜5日後、NGMプレートで動物の成長と C.エレガンスの 卵を確認します。約30個の卵を集めて、プレートからOP50芝生の新鮮なNGMプレートに移します。
  3. 動物をイメージング用に同期させるには、孵化していないすべての卵を2時間ごとにプレートから新しいプレートに移し、22°Cに維持します。 各プレートに約15〜20個の卵が孵化します。
  4. 幼虫2(L2)と幼虫3(L3)の段階で、孵化後14〜16時間から28〜30時間の間に動物を選びます。動物をイメージングのためにマイクロ流体デバイスに移します。次のセクションで説明するように食物供給を追加して、長期的な成長とイメージング実験のためにデバイス内に動物を維持します。

4. C. エレガンス の成長とイメージングマイクロ流体デバイスの内部

  1. 成長・イメージング用マイクロ流体デバイスを倒立顕微鏡上にマウントし、パターン2を見て、隔離膜と固定化膜を接続した後、低倍率(4倍または10倍)で観察する。チャネルがきれいな蒸留水で満たされていることを確認してください。
  2. pH 6.0の1 Mクエン酸カリウム10 mL、微量金属溶液10 mL、1 M CaCl2 3 mL、1 M MgSO4 3 mLを使用して、S培地の新しい1 L溶液を調製します。無菌条件下で溶液を調製する。S培地をオートクレーブしないでください。
  3. 実験の10分前に流路を増殖培地(S培地)で満たす。流路に気泡が入らないようにしてください。気泡を除去するために、必要に応じて追加の媒体を流します。
  4. マイクロピペットを使用して、10 μLのS培地中のNGMプレートから必要な発生段階から1匹の動物を選び、その動物を入口孔を通して流路に押し込みます。
  5. 低倍率対物レンズを使用して流路内の動物の位置を監視します。入口または出口に追加の培地を流して動物を押し、2つの隔離膜の間に制限された流路内に配置します。
  6. 三方活栓を開いて、絶縁チャネルに14psiの圧力をかけ、膜を流路に押し下げます。
    注:メンブレンは流路を部分的に密閉し、動物の動きを2つの隔離メンブレンの間の領域に制限します。
  7. ストリークプレートからの 大腸菌 OP50の単一コロニーを使用して、250 mLのLブロス(2.5 gのバクトトリプトン、1.25 gのバクト酵母、1.25 gのH2O中のNaCl)を接種します。接種培養物を37°Cで一晩生育させる。
  8. 500 μLのOP50培養液を1.5 mL滅菌遠心チューブに分注し、ストックとアリコートを4°Cで2週間保存します。
  9. OP50培養液を1.3 x g で5分間遠心分離してペレットダウンします。ペレットを1 mLの新鮮なS培地(0.5倍希釈)で溶解し、室温で3〜4日間保存します。この希釈OP50を使用して、マイクロ流体デバイス内の C.エレガンスを供給します 。
  10. 流路内のS媒体の蒸発を減らすために、入口と出口のリザーバーの上にS媒体を一滴残します。
  11. 希釈したOP50溶液を10 μLマイクロピペットに入れます。OP50溶液で満たされたマイクロチップをピペットから取り出し、チップをインレットリザーバーに圧入します。次に、別のマイクロピペットチップに10 μLの食品溶液を置き、出口リザーバーに挿入します。
  12. 指で圧力をかけながら先端ヘッドを密閉し、エアギャップのない食品溶液の連続性を確保します。マイクロピペットチップをOP50溶液で毎日交換し、3〜4日以内です。
  13. 両方のチップに追加の20〜30μLの食品溶液を充填します。マイクロピペットチップに食品溶液を追加または削除して、勾配を調整して動物を流路に押し込み、イメージングのためにトラッピング膜の下で動物の位置を調整します。
  14. 明視野画像を使用して、細菌の流れを監視し、流路内の部分的に閉じた隔離膜を通って連続していることを確認します。
    注:細菌の流れがない場合、動物は2つの分離膜間の流路で利用可能な細菌を食べる可能性があります。チャネルに細菌がない場合、または流れがない場合は、入口と出口の2つのマイクロピペットチップを、作りたての食品で満たされた新しいピペットチップと交換します。

5. C.エレガンスの 固定化とイメージング

  1. C.トラ ッピング膜下のエレガンス固定化
    1. 低倍率で成長チャネル内の単一の動物を見つけます。入口と出口のリザーバーに接続された2つのマイクロピペットチップで食品溶液の高さを調整します。流路の静水圧差を使用して、動物を必要な方向に押します。
    2. 動物を捕獲膜の中央に配置し、低倍率の対物レンズ(4倍)を使用してその水泳行動を監視します。
    3. 三方活栓を回して、トラップチャネル内の圧力をゆっくりと上げます。成長チャネル境界壁に沿ってまっすぐな姿勢でトラップ膜の下に動物を固定する。
      注意: ZまたはUの曲げ位置で流路を横切って動物を閉じ込めないでください。これにより、動物の体がより大きな圧力で圧迫され、その健康に永久的な損傷を与えます。
  2. C.エレガンスの イメージングと膜からの放出
    1. 顕微鏡ステージにデバイスを運び、積み込みます。高解像度明視野、微分イメージングコントラスト(DIC)、または蛍光イメージングに必要なすべての光学部品(対物レンズ、光源、蛍光フィルター、検出器)を備えた倒立顕微鏡を目的のイメージング設定でセットアップします(補足図1)。
    2. 単一または複数のタイムラプス蛍光画像を取得して、細胞および細胞内イベントをキャプチャします。
    3. 回転ディスク顕微鏡上で、60倍、1.4個の開口数(NA)対物レンズ、7%〜10%のレーザー出力を持つ488nmの波長レーザー、CCDカメラを使用して、 C.エレガンス ニューロンの蛍光画像を発生の関数として取得します。顕微鏡に付属のソフトウェアでタイムラプス撮影を行い、毎秒4フレームの速度で画像を取得します(補足図1)。
    4. 画像を取得した後、捕集圧を解放し、4倍と10倍の低倍率で動物の移動を監視します。動物を隔離膜によって定義された領域内に制限します(実験中ずっと14psi未満に保たれます)。
    5. 2つのマイクロピペットチップの食品溶液の量を調整して、成長チャネル内のゆっくりとした重力駆動の食品の流れを継続します。この食品の流れは、入口と出口のマイクロピペット内の食品溶液のレベルを調整することによって得られます(通常、高さ差は1〜5 mm)。
    6. 成長チャネル内の細菌の流れパターンから明視野下の流れを視覚化します。
      注:流れがない場合、動物は利用可能なOP50バクテリアを食べ、チャネルは透明に見え、動物は数時間にわたって飢えます。飢餓状態の動物は通常、高い自家蛍光を発し、タイムラプス蛍光画像を取得するときに容易に観察できます。このような事象は動物生理学に有害な影響を及ぼし、実験では回避された。
    7. 所定の時間間隔の後に手順5.2.1〜5.2.3を繰り返して、複数の時点で同じ個人の蛍光/ DIC/明視野画像を取得します。
    8. 同じ個々の動物から複数の所望の時点で画像を取得した後、単離および捕捉圧力を解放する。チャネルをM9バッファーで洗い流し、動物を入口リザーバーに押し込みます。リザーバーから動物を回収し、さらなる健康モニタリングのために動物を新鮮なNGMプレートに置きます。
    9. チャネルをM9バッファーで数回洗い流して、細菌を除去します。流路を70%エチルアルコール(蒸留水で希釈)ですすいでください。注射器を使用して空気を押してチャネルを乾燥させます。将来繰り返し使用するために、乾燥したほこりのない場所にデバイスを保管してください。
  3. 画像解析と統計
    1. TIFF画像解析にはFIJI ImageJソフトウェアを使用してください。フィジーImageJの wdIs51 動物からのPVDタイムラプス画像のTIFF画像を開きます。[ Z > プロジェクトのスタック]>[画像]タブを選択して、主要なプロセスを示すz平面のスタックから最適な平面を抽出します。
    2. 一連の画像全体をスクリーニングし、動物の画像フレームの重なり合うセクションを使用して、ニューロンプロセス全体を正常にカバーする特定の画像フレームを見つけます。プラグインを選択して>FIJIツールバーからセル カウンター>分析 します。これにより、さまざまなブランチに番号を付け、選択した各ニューロンの数を保持するためのウィンドウが開きます。
    3. [ Type1 > > カウンターの初期化] を選択し、セカンダリ ブランチをマークします。次に、 タイプ 2を選択して 第四紀をマークし、すべてのブランチの数を示す 結果 ウィンドウをクリックします(補足図2)。このメソッドは、すでにカウントされているブランチを表示します。
    4. 次の重なり合う画像を開き、残りのブランチを数えます。このプロセスにより、二重カウントが防止され、すべてのプロセスが確実にカウントされます。 C. elegansの初期幼虫期に存在する一次枝の総数を特定して数えます。高齢動物の二次および四次過程の画像に対して同様の分析を実行します。
      注:成人は、体壁の筋肉を神経支配する多くのプロセスを示し、数えるのが難しい場合があります。すべてのプロセスが一度だけカウントされるようにします。
    5. PVD細胞体(CB)からPVC CBへのセグメント化された線を引くことにより、 wdIs51 動物におけるPVD細胞体間の距離を計算する。幼虫4(L4)期の動物の場合、細胞体は遠く離れており、60倍の対物レンズで画像化された場合、同じフレーム内にありません。
    6. ImageJのスタック> Zプロジェクト>[画像]タブ を使用して、スタックから重なり合う画像を選択して、頭から尾までの動物の長さ全体をカバーします。PVDとPVC CBの間のニューロンプロセスに沿ってセグメント化された線を引きます。
    7. ImageJ を使用して、すべてのセグメント化された線の長さを測定し > [分析>測定] を使用します。すべてのセグメントの長さを加算して、各時点のPVDとPVC CBの合計距離を計算します。
    8. jsIs609動物のTRNのニューロン長については、フィジーで画像をロードします。細胞体から最初のミトコンドリアの重心まで、後外側微小管(PLM、可溶性GFPで見える)に沿ってセグメント化された線を引きます。最初の距離値のラインの長さを計算します。
    9. 最初のミトコンドリアの中心から2番目のミトコンドリアの中心からセグメント化された線を引きます。ニューロンのプロセスの長さの終わりまで、ミトコンドリアの各ペアについてこのプロセスを繰り返します。すべての長さを加算して、ニューロンの突起の合計長を計算します。
    10. 細胞系譜解析では、フィジーのすべての外陰部画像をロードし、複数のZ平面のタイムラプス画像から細胞のベストフォーカス画像を抽出します。
    11. データを平均の標準誤差±標準誤差(SEM)として表します。2つ以上のサンプルに対して一元配置分散分析を使用して、または2つのサンプルのペアに対して2サンプルのt検定を使用して、統計的有意性を計算します。有意性を p 値 < 0.05 (*)、p 値 < 0.005 (**)、p 値 > 0.05 (ns、有意ではない) で示します。

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Representative Results

デバイスの特性評価: 成長およびイメージングデバイスは、不可逆プラズマ結合を使用して結合された2つのPDMS層(図1)で構成されています。長さ10mm、高さ40μmまたは80μmの流動層(パターン1)により、液体培養で動物を成長させることができます(図1A)。捕捉層(パターン2)は、高解像度イメージングのために動物を固定化するための2mm幅の膜(図1B)を有する。捕捉層用のマスクはまた、連続する画像化時点間の流路のセクション内の動物の動きを制限するための一対の隔離膜を作成する。装置の捕集膜は、我々の以前の撮像装置3から適合されている。現在の装置(図1C、L)には、複数の時間ポイントにわたって同じ動物を効率的に固定化するために、分離膜を追加し、捕捉膜の幅を2mmに増やすことが含まれています。

デバイスをテストするために、トラップ膜を接続するマイクロ流体チャネルにきれいな蒸留水を満たし(図1D、E、および補足図3)、厚さ2 mmのPDMS膜の下で動物をトラップするためにも使用される14psi窒素ガスを使用して加圧しました(図1H、K、L)。マイクロピペットを用いてNGMプレートから1匹の動物を採取し、流路に装填した(図1F)。増殖チャネルは、S培地に再懸濁された細菌で満たされた(図1F、G、I、J)。2つの分離膜間の流路内の動物を監視しながら、装置の入口と出口に接続されたピペットチップの培地の高さを調整することにより、イメージングの期間中一定の流れを維持しました。新たに調製したOP50溶液をマイクロピペットチップに毎日充填し、マイクロチャネル内の動物の健康的な食料源を確保しました。生鮮食品源および気体透過性PDMS材料は、マイクロチャネル30、29の内部に十分な酸素供給を確保する。デバイス内の動物の成長は、細胞特異的マーカーまたは発生中の細胞系統または可変細胞発現パターンを示すマーカーのいずれかを使用して追跡されました。動物を14psiの窒素ガスを用いて捕集膜の下に固定化し、水虫をチャネル壁に沿ってまっすぐな位置に保持した。動物は、NGMプレート23上と比較して、マイクロ流体チャネル内でゆっくりと成長した。

長期イメージングデバイスを用いた細胞系譜研究: マイクロ流体デバイス内での C.エレガンスの 発達を評価するために、PS3239 (ZMP-1::GFP)株32 を一定の食物供給で増殖させ、成長のさまざまな時点での外陰部の発達を追跡しました。 ZMP-1 は亜鉛メタロプロテアーゼをコードし、L3ステージのアンカー細胞、L4ステージのvulDおよびvulE細胞、および1日目(1D)成体動物のvulAで発現します(図2A)。発現パターンの変化は、同じ遺伝子が異なる発生段階の異なる細胞で発現される時間的遺伝子調節の例を表す。外陰部の発達を観察するために、動物を最初に固定し、次に外陰部領域をL3以降から成虫期まで8〜10時間ごとに複数のz平面にわたって画像化しました。ZMP-1::GFPは、発生段階に応じて異なる外陰細胞で発現します(図2B)。マイクロ流体デバイス内で増殖する動物由来の外陰細胞の高解像度蛍光画像は、正常な外陰部発達を示し、ZMP-1::GFPの発現および局在は以前の報告32と同様である。

長期成長およびイメージングデバイスを使用したニューロン発達の追跡:個々の動物からの細胞内イメージングのためのデバイスの使用を実証するために、2つの機械感覚ニューロンPVDおよびTRNの発達をモニターした。2つのPVDニューロンにおいてGFPを発現するwdIs51を発現するNC1686株を34、36を用いた。各PVDニューロンは、それぞれL2(14-16時間)、後期L2(20-22時間)、L3(24-26時間)、およびL4(36-42時間)の発生段階で、一次(PP)、二次(SP)、三次(TP)、および四次(QP)プロセスからなるメノラー様分岐樹状突起構造を示します(図3)。PVD細胞体は外陰部の後方に存在します。それは、SPとTPを生じさせる1つの軸索と2つの一次樹状突起突起を送り出し、それが次に体壁の筋肉を神経支配するQP樹状突起枝を生じさせる。後期L3およびL4ステージは高いアーボライゼーションを示します37,34。NC1686をマイクロ流体デバイス内で1匹育て、細菌性食品を継続的に与えました。動物をL2から1Dの発達段階まで固定化し、PVDニューロンを60倍、1.3NAオイル対物レンズを使用して8〜12時間ごとに繰り返しイメージングし、SP、TP、およびQP分岐の数を3次元でカウントしました。図3Bに示すように、分岐の程度は開発中に増加しました。以前の研究で見られたように、ワーム発生のさまざまな段階でのSPとQPの数は年齢とともに増加しました(図4A)37。L2動物は、デバイスを使用して測定した場合、10 ± 3.8(n = 9)SPを示しましたが、QPはありませんでした(図4A)。高解像度イメージングに必要な動物の動きを減らし、十分な麻痺を引き起こしながら、オルガネラ輸送への悪影響を最小限に抑えるために、体壁筋の収縮と麻痺を引き起こす麻酔薬である3 mMレバミゾールの滴下にC.エレガンスを入れました3,4。SP値(4 ± 1.6、n = 25、p = 0.15)は、NGMプレート上で増殖させ、寒天スライド上で3 mMレバミゾールを使用して画像化した場合、有意差はありませんでした(図4B)。データは、デバイスの固定化が複雑なニューロン構造の高解像度イメージングを可能にし、それらの発達に影響を与えないことを示唆しています。L3期の動物は、発達とともに数が増えるQPの数が少ない。1D成虫は、装置で増殖した動物において67±2.8QP(n = 5)を示した。以前の研究では、自己回避として知られる発達中のPVDプロセスの形成と後退が示されており、分岐数が減少します38。孵化後51時間(1D)でのSPの減少は、そのような後退の結果である可能性があります。NGMプレート上で増殖し、3mMレバミゾールを用いて画像化された動物は、同等の発達段階について同様の分岐数傾向を示した(図4A、B)。さらに、尾部に存在する2つのPVC細胞体間の距離は、装置内で増殖した動物またはNGMプレート上で増殖した動物において、それらが離れるにつれて増加する(図4C、D)。イメージングプロセス全体を通して、動物は健康を維持し、動物がこの長期間にわたって繰り返し膜の下に固定された後でも産卵することができました。

この装置を用いて、動物を同じ向きで固定化し、微弱なGFP発現でも同一のニューロンとその構造を高解像度で画像化することができました。我々の成長および固定化技術の有用性を実証するために、L3から成体へのTRNsの発達をjsIs609(mec-7p::MLS::GFP)動物を用いて画像化した。後部TRNは体の外側に存在し、動物の右側と左側に対応するPLMRおよびPLMLと名付けられています。マイクロ流体チップ内で成長している同じ動物を画像化し、12〜14時間間隔で固定化しました。モンタージュは、ミトコンドリアとニューロンプロセスの両方を強調する連続した時点でのPLMRニューロンプロセス全体を表しています(図5A)。ニューロンの突起全体の長さを計算したところ、10.4 μm/hの傾きで増加することがわかりました(図5B)。ニューロン突起長のこの増加率は、~10 μm/hの以前の報告と一致しています18,31,39,40,41。また、増殖過程における新しいミトコンドリアの追加と、以前に報告されたように、細胞体に対するシナプス分岐点位置の変化を観察しました23。

Figure 1
図1: C. elegansの長期増殖とイメージングのためのシンプルな マイクロ流体チップ。 (A)流動層は、薄いPDMS層に長さ10mmのマイクロ流体チャネル(パターン1)からなる。(B)トラッピング層は、厚さ2mmの固定化チャネルと、バルクPDMS層内の一対の薄い絶縁チャネルとからなる。(C)2つのPDMS層を薄いカバーガラスと一緒に接着してデバイスを作成します。(D、E)トラップおよび分離制御チャネルは、圧縮窒素(N2)ガス下で脱イオン(DI)水で満たされます。(F)年齢同期 したC.エレガンスは NGMプレートからピックアップされ、デバイスのフロー層内にロードされます。(G)食品は、入口と出口のリザーバーにある2つのマイクロピペットチップを使用して提供されます。(H)動物は、2つの隔離チャネル内を自由に移動でき、固定化膜の下に閉じ込められている。(i)2つのマイクロピペットチップを介した食物供給を備えた成長およびイメージングデバイスの画像。(J, K)マイクロ流体チャネル内の自由に動き固定化された C.エレガンスの 画像。スケールバーは1ミリメートル(I)と200ミリメートル(J、K)です。(L)流路(FC)、PDMS膜(M)、および制御流路(CC)の高さを示すデバイス断面の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:デバイス内で発達している C.エレガンス の外陰部マーカーの発現を追跡します。 (A)発生中のPS3239動物においてZMP-1::GFPを発現する外陰細胞の模式図。GFPシグナルは、L3ステージのアンカー細胞、L4ステージのvulDおよびvulE細胞、および成人1DステージのvulA細胞に現れます。(B)マイクロ流体チップ内で成長し、8〜10時間ごとに固定化されたPS3239動物の画像は、L3、L4、および1日(1D)成体からの外陰部発達中のZMP-1::GFP発現の蛍光画像をキャプチャしました。略語:AC =アンカーセル、A =vulA、D =vulD、E =vulE。スケールバーは10μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:PVDニューロンの発達を追跡するための個々の wdIs51 C.エレガンスの イメージング 。 (A)L2からL4段階までのPVDニューロンの成長と樹状突起樹状化の模式図。緑色の円はPVD細胞本体を示す(CB、黄色矢印)。樹状突起は、CBの前側と後側の両方からL2で一次突起(PP)、後期L2で二次突起(SP)、L3で三次突起(TP)、L4段階で四次突起(QP)の出現を示しています。(B)マイクロ流体デバイス内で増殖する動物のPVDニューロンの画像。(C)NGMプレート上で増殖し、3mMレバミゾール(Lev)で固定化した動物由来のPVDニューロンの画像。スケールバーは10μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:デバイス成長動物とNGMプレート上で増殖した動物におけるPVD発生の比較 。 (A)マイクロ流体デバイス内で増殖する同じ動物からの二次プロセス(SP)および四次プロセス(QP)の平均数。値は、16時間(L2)、24時間(L3)、36時間(初期L4)、42時間(後期L4)、および51時間(成人1D)に計算されます。(B)NGMプレート上で増殖し、3 mMレバミゾールで麻酔をかけた異なる動物のバッチからのSPおよびQPの平均数。(C)マイクロ流体デバイス内で増殖する同じ動物からの2つのPVDニューロン細胞体間の平均分離。(D)NGMプレート上で増殖し、3 mMレバミゾールで麻酔をかけた異なる動物セットからの平均分離。データはSEM±平均値として表される(3mMレバミゾールについてはn≥10、デバイス固定化動物についてはn≥6)。統計的有意性は一元配置分散分析で計算され、 p値<0.05(*)、 p値<0.005(** )、p値>0.05(ns)で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:マイクロ流体デバイス内で成長する動物からのタッチ受容体ニューロン(TRN)の高解像度イメージング 。 (A)異なる時間に画像化された単一の動物からのニューロンプロセスのモンタージュ。細胞本体(CB、矢印)、シナプス分岐点(BP、矢印)、およびニューロン先端(先端、上矢印)が標識されています。各ミトコンドリアのニューロンプロセスと位置は、フィジーを使用して手動で追跡されます。スケールバーは10μmです。 (B)異なるイメージング時点における平均ニューロンプロセス長。データはSEM±平均値として表す(n=8)。統計的有意性は一元配置分散分析を使用して計算され、 p値<0.005(**)および p値>0.05(ns)として表されます。回帰式は、1時間あたり10.4μmのニューロン突起伸長の傾き、R2=0.9425に適合します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1: C.エレガンスの蛍光イメージングのための顕微鏡設定のスクリーンショット。 (A)画像解析ソフトウェアのパネルには、スキャン速度、フィルターセット、およびイメージングの目的を設定するための強調表示されたセクションが表示されます。(B)次に、ソフトウェアを使用して、フルレーザー出力の488%の7nmレーザーを選択します。(C)画像解析ソフトウェアは、単一の画像フレームまたは一連のタイムラプス画像を撮影し、将来の分析のためにそれらを保存することができる。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2: wdIs51 動物のPVD分岐をカウントするための分析手順を示すFIJIソフトウェアのスクリーンショット。 (A)フィジーImageJソフトウェアで開いたPVD画像とセルカウンタープラグインへのリンクを表示します。(B) 画像のカウンタを初期化するためのセルカウンタウィンドウ。(C)含まれている枝をマークし、複数のカウントを回避するためのカウンターの選択。(D) 各カテゴリのブランチの総数を示す結果ウィンドウ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:成長およびイメージングデバイスの概略図。 異なる量のバクテリア食品溶液(黄色)で満たされた2つのマイクロピペットチップが、最下層の流路の入口パンチと出口パンチに挿入されます。先端の食品溶液の高さの違いにより、溶液がチャネル内を流れ、それが次に動物にバクテリアを供給して成長させます。トラップおよびアイソレーションチャネル(青)は蒸留水で充填され、窒素ガス(14psiに設定)供給を使用して圧縮されます。絶縁チャネルは常に14psiに接続されています。トラップ膜への圧力は、3方向コネクタを使用して0(動物は自由に移動して給餌できる)と14psi(動物は高解像度イメージングのために固定化される)の間で切り替えられます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

この論文では、成長中の単一の動物の一定の食物供給と高解像度イメージングを備えた C.エレガンス を成長させるための単純なマイクロ流体デバイスの製造と使用のためのプロトコルが説明されています。この製造プロセスは簡単で、非滅菌環境で行うことができます。製造段階では、ほこりのない環境が重要です。ダスト粒子の存在は、2つの結合面間の不適切な接触につながり、 C.エレガンス が固定されている間、高圧印加中のデバイスの結合不良および漏れをもたらす。製造されたすべてのデバイスのうち、95%のデバイスが実験に適しています。製造中または使用中の不適切なボンディングが原因で、少数のデバイス(5%)が故障します。世界中のいくつかの学術機関で利用可能な無塵(>1,000グレードのクリーンルーム)内で製造プロセスを実行することで、接着の失敗を減らすことができます。流路からバクテリアフードをきれいにし、デバイスの再利用を可能にするには、実験のたびにアルコールを流してデバイスを洗い流します。

このプロトコルは、C. elegansのさまざまな発生段階やサイズに合わせて簡単に変更できるシンプルなデザインのリソグラフィ製造プロセスを示しています。さらに、この装置設計は、様々な発生過程および細胞内過程を観察するために流動層および捕捉層3の寸法を増加させることによって、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエのような他のモデル生物に適合させることができる。このプロトコルでは、流動層チャネルの2つの異なる高さ(40 μmと80 μm)が、体のサイズに応じて、C.エレガンスのさまざまな発生段階における細胞および細胞内の特徴の完全な固定化と追跡に使用されてきました。例えば、PVD感覚ニューロンにおける樹状突起樹状化は、初期のL2段階で始まり、L4段階まで続く。これは、40μmの高流動層を有する装置で画像化された。PVDニューロンは体壁の筋肉を神経支配する樹状突起を形成するため、プロセスを3Dで定量化するために光学切片が必要です。樹枝状アーバーの定量分析には、体の直径に一致する装置内の動物の完全な固定化が必要です。しかし、外陰部の発達を監視するために、80μmの高さの流動層を使用して外陰部の系統を追跡しました。TRNの長さとミトコンドリアのイメージングでは、フロー層の厚さが40 μmのデバイスを使用してL2からL4のステージをイメージングしました。間違った高さのデバイスを使用すると、固定が困難になります。たとえば、フロー層の高さが80 μmのデバイス内の小動物(L2または初期のL3ステージ)は、デバイス内で動物の反転を可能にし、トラップ膜が14psiの圧力下にある後でも不完全な固定化を示します。一方、大きな体径(後期L4を超える)の動物は、流動層の高さが40μmの装置内に容易に侵入しません。高圧下で小さな装置に大きな動物を閉じ込めると、体に損傷を与える可能性があります。40 μmのフロー層を有する現在の装置の適用は限られており、膜の下に完全に固定されていないため、非常に若い初期の幼虫期の動物(孵化後10時間未満のL1段階の動物など)の高解像度イメージングには適していません。体のサイズが小さいため、小型の幼虫は動き続け、レーザー光で興奮するとトラップから逃れることがあります。L1ステージの動物の場合、4倍または10倍の対物レンズと短いカメラ露光時間を使用して、低解像度の明視野または蛍光イメージングを実行できます。別のアプローチとして、若い幼虫期C.エレガンスを完全に固定するために、高さ<20μmの新しいフロー層デバイスが必要になります。

高解像度蛍光イメージングを使用して、同じ動物の発生現象を長い時間スケールで追跡すると、自家蛍光が増加する可能性があります。すべてのタイムラプスイメージングアッセイでは、C.エレガンス研究からの生理学的に関連する発生情報のために、励起強度、露光時間、イメージング時間間隔、動物の回復時間、および食品品質の最適化が必要です。L4段階以降の動物を使用する場合>発生研究のために3時間の時間間隔を選択しました。このデバイスは、より頻繁な画像(数時間で5〜10分ごと)または毎秒複数のフレーム(<1時間)を取得して、C.エレガンスニューロン3,23におけるオルガネラ輸送および分布などの他の動的プロセスを研究することができます。発達初期のトラップとイメージングは、完全に回復せずに短い時間間隔でトラップを繰り返すと健康に影響を与える可能性があるため、より注意深い観察が必要です。実験中に、それらを流動層に移動するために高圧を必要とする動物は、健康状態が悪く、時間の経過とともにより多くの自家蛍光を示すことがわかりました。高ストレスレベルに関連することが知られている高い体蛍光を有する動物は、画像検査のために避けられた。良好な生理機能を維持するために、動物をチャネル壁に隣接する直線位置に捕捉した。この位置で14psiの圧力下で体を圧迫すると動物が病気になるため、チャネル幅を横切って動物を固定することは避けられました。オイル対物レンズで繰り返しイメージングする際に良好な信号対雑音比を維持するには、すべての時点の後にカバーガラスを適切にクリーニングする必要があります。デバイスとそのアプリケーションの製造プロセス中に特別な注意を払った後、同じデバイスを複数のイメージングセッションで再利用できます。

このデバイスは、麻酔薬に敏感な可能性のある変異体を使用した研究に役立つ可能性があります。提示されたアプローチは、成長と生理学に対する有害な麻酔薬の影響を排除し、長期間にわたる動物の形態学的、機能的、および行動的欠陥の観察を容易にすることができます。このデバイスは製造が容易で、断続的な高解像度イメージングを必要とする C.エレガンスの 長期的な発生/細胞生物学的問題に対処するために、あらゆる実験室でセットアップできます。

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Disclosures

S.M.およびS.P.K.は、マイクロ流体成長およびイメージングデバイスに関する出願中の特許(特許出願番号640/CHE/2011)の著者である。

Acknowledgments

我々は、CIFFイメージング施設、NCBSがDST-ナノテクノロジーセンター(No.SR / 55 / NM-36-2005)。DBT (SPK)、CSIR-UGC (JD)、DST (SM)、DBT (SM)、DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK and Gautam Menon) が支援するスピニングディスク、および HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK) からの研究資金に感謝する。HB101、 PS3239、および wdIs51 株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されている Caenorhabditis 遺伝学センター(CGC)によって提供されました。S.P.K.はマイク・ノネットの研究室で jsIs609 を製作しました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

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References

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<em>カエノラブディティス・エレガンスの</em>長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ
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Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

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