Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En simpel mikrofluidisk chip til langsigtet vækst og billeddannelse af Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Protokollen beskriver et simpelt mikrofluidisk chipdesign og mikrofabrikationsmetode, der bruges til at dyrke C. elegans i nærvær af en kontinuerlig fødevareforsyning i op til 36 timer. Vækst- og billeddannelsesenheden muliggør også intermitterende langsigtet højopløsningsbilleddannelse af cellulære og subcellulære processer under udvikling i flere dage.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vist sig at være et værdifuldt modelsystem til undersøgelse af udviklings- og cellebiologiske processer. At forstå disse biologiske processer kræver ofte langvarig og gentagen billeddannelse af det samme dyr. Lange restitutionstider forbundet med konventionelle immobiliseringsmetoder udført på agarpuder har skadelige virkninger på dyresundheden, hvilket gør det upassende at gentagne gange forestille sig det samme dyr over lange perioder. Dette papir beskriver et mikrofluidisk chipdesign, fremstillingsmetode, on-chip C. elegans dyrkningsprotokol og tre eksempler på langsigtet billeddannelse for at studere udviklingsprocesser hos individuelle dyr. Chippen, fremstillet med polydimethylsiloxan og bundet på et dækglas, immobiliserer dyr på et glassubstrat ved hjælp af en elastomerisk membran, der afbøjes ved hjælp af nitrogengas. Komplet immobilisering af C. elegans muliggør robust time-lapse-billeddannelse af cellulære og subcellulære hændelser på en bedøvelsesfri måde. En kanalgeometri med et stort tværsnit gør det muligt for dyret at bevæge sig frit inden for to delvist forseglede isolationsmembraner, der tillader vækst i kanalen med en kontinuerlig fødevareforsyning. Ved hjælp af denne enkle chip kan billeddannelse af udviklingsfænomener som neuronal procesvækst, vulvaludvikling og dendritisk arborisering i PVD-sensoriske neuroner, når dyret vokser inde i kanalen, udføres. Den langsigtede vækst- og billedbehandlingschip fungerer med en enkelt trykledning, ingen eksterne ventiler, billige fluidiske forbrugsstoffer og bruger standard ormhåndteringsprotokoller, der let kan tilpasses af andre laboratorier ved hjælp af C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans har vist sig at være en stærk modelorganisme til at studere cellebiologi, aldring, udviklingsbiologi og neurobiologi. Fordele som dens gennemsigtige krop, korte livscyklus, nem vedligeholdelse, et defineret antal celler, homologi med flere menneskelige gener og velundersøgt genetik har ført til, at C. elegans er blevet en populær model både for grundlæggende biologiske opdagelser og anvendt forskning 1,2. At forstå cellens biologiske og udviklingsmæssige processer fra gentagen langtidsobservation af individuelle dyr kan vise sig at være gavnligt. Konventionelt bedøves C. elegans på agarpuder og afbildes under mikroskopet. Anæstetikas skadelige virkninger på dyrs sundhed begrænser brugen af bedøvede dyr til langvarig og gentagen intermitterende billeddannelse af det samme dyr 3,4. De seneste fremskridt inden for mikrofluidiske teknologier og deres tilpasning til bedøvelsesfri fældefangst af C. elegans med ubetydelige sundhedsfarer muliggør billeddannelse i høj opløsning af det samme dyr over en kort og lang periode.

Mikrofluidiske chips er designet til C. elegans'5 high throughput screening 6,7,8, trapping og dispensering 9, drug screening 10,11, neuron stimulering med høj opløsning billeddannelse 12, og høj opløsning billeddannelse af dyret12,13,14. Ultratynde mikrofluidiske ark til immobilisering på dias er også blevet udviklet15. Langsigtede undersøgelser af C. elegans er blevet udført ved hjælp af lavopløsningsbilleder af dyr, der vokser i flydende kultur for at observere vækst, calciumdynamik, lægemiddeleffekter på deres adfærd16,17,18,19, deres levetid og aldring20. Langtidsundersøgelser med mikroskopi med høj opløsning er blevet udført for at vurdere synaptisk udvikling21, neuronal regenerering 22 og mitokondrietilsætning23. Langsigtet højopløsningsbilleddannelse og sporing af celleskæbne og differentiering er blevet udført i multikanalsenheder24,25. Flere cellulære og subcellulære hændelser forekommer over tidsskalaer på flere timer og kræver fangst af det samme individ på forskellige tidspunkter under deres udvikling for at karakterisere alle mellemliggende trin i processen for at forstå cellulær dynamik in vivo. For at afbilde biologisk proces som organogenese, neuronal udvikling og cellemigration skal dyret immobiliseres i samme orientering på flere tidspunkter. Vi har tidligere offentliggjort en protokol for højopløsningsbilleddannelse af C. elegans i over 36 timer for at bestemme, hvor mitokondrier tilsættes langs berøringsreceptorneuronerne (TRN'er)23.

Dette papir indeholder en protokol til etablering af en mikrofluidikbaseret metode til gentagen billeddannelse i høj opløsning. Denne enhed med en enkelt flowkanal er bedst egnet til gentagen billeddannelse af et enkelt dyr pr. Enhed. For at forbedre gennemstrømningen og afbilde mange dyr på én gang kan flere enheder tilsluttes den samme trykledning, men med separate trevejsstik, der styrer et enkelt dyr i hver enhed. Designet er nyttigt til undersøgelser, der kræver time-lapse-billeder i høj opløsning, såsom postembryonale udviklingsprocesser, cellemigration, organelletransport, genekspressionsundersøgelser osv. Teknologien kan være begrænsende for nogle applikationer såsom levetid og aldringsundersøgelser, der kræver parallel vækst og billeddannelse af mange dyr i sen fase. Polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer blev brugt til fremstilling af denne enhed på grund af dens biostabilitet26, biokompatibilitet 27,28, gaspermeablilitet 29,30 og justerbar elastisk modul 31. Denne to-lags enhed tillader vækst af dyr med kontinuerlig fødeforsyning i en mikrofluidisk kanal og fangst af individuelle C. elegans via PDMS-membrankompression ved hjælp af nitrogengas. Denne enhed er en udvidelse af den tidligere offentliggjorte enhed med fordelen ved at dyrke og billeddanne det samme dyr i mikrokanalen under en kontinuerlig fødevareforsyning3. Det ekstra isolationsmembrannetværk og en 2 mm bred fangstmembran muliggør effektiv immobilisering af udviklende dyr. Enheden er blevet brugt til at observere neuronal udvikling, vulvaludvikling og dendritisk arborisering i sensoriske PVD-neuroner. Dyrene vokser uden sundhedsskadelige virkninger i enheden og kan gentagne gange immobiliseres for at lette billeddannelse af subcellulære hændelser i det samme dyr under dets udvikling.

Hele protokollen er opdelt i fem dele. Del 1 beskriver enhedsfremstilling til vækst- og billedchippen. Del 2 beskriver, hvordan man opretter et tryksystem til PDMS-membranafbøjningen for at immobilisere og isolere individuelle C. elegans. Del 3 beskriver, hvordan man synkroniserer C. elegans på en nematodevækstmedium (NGM) plade til enhedsbilleddannelse. Del 4 beskriver, hvordan man indlæser et enkelt dyr i enheden og dyrker dyret inde i den mikrofluidiske enhed i flere dage. Del 5 beskriver, hvordan man immobiliserer et enkelt dyr på flere tidspunkter, tager billeder i høj opløsning ved hjælp af forskellige mål og analyserer billederne ved hjælp af Fiji.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af vækst- og billeddannelsesenhed

  1. SU8 fremstilling af skimmelsvamp
    1. Design mønstre 1 (flowlag) og 2 (kontrollag) ved hjælp af rektangulære former i en tekstbehandlingssoftware (eller en computerstøttet design CAD-software) og udskriv fotomaskerne ved hjælp af en laserplotter med en mindste funktionsstørrelse på 8 μm på polyesterbaseret film (figur 1).
    2. Skær siliciumskiver i stykker på 2,5 cm × 2,5 cm og rengør dem med 20% KOH i 1 min. Skyl vaflerne i deioniseret (DI) vand. Brug en wafer hver til flowet og kontrollaget.
      FORSIGTIG: KOH er ætsende og skal håndteres med forsigtighed.
    3. Emnerne tørres med 14 psi komprimeret nitrogengas efterfulgt af dehydrering på en kogeplade ved 120 °C i 4 timer. Før du går videre til næste trin, skal du afkøle de to stykker ned til stuetemperatur.
    4. Tag et af siliciumstykkerne og læg det på chucken på en spin coater og tænd vakuumet for at holde waferen på plads. På siliciumstykket sættes ~ 20 μL hexamethyldisilan (HMDS) og belægges det ved hjælp af spincoateren ved 500 rotation pr. Minut (omdr./min.) i 5 s efterfulgt af 3.000 o / min i 30 s.
      FORSIGTIG: Dette trin skal udføres i gult lys. Brug ikke hvidt lys i rummet.
    5. For at få en ensartet fotoresisttykkelse på ~ 40 μm (specifik for strømningslaget; egnet til billeddannelse af tidlige larvetrin 1 til trin 3 (L1 - L3) dyr), skal du belægge siliciumskiven med ~ 1,5 ml negativ fotoresist-1 ved hjælp af en spin coater ved 500 o / min i 5 s efterfulgt af 2,000 o / min i 30 s.
    6. Gentag trin 1.1.4 og 1.1.5 med den anden wafer for at opnå en ensartet fotoresisttykkelse på ~ 40 μm, der er specifik for kontrollaget.
    7. Alternativt, for at øge tykkelsen af strømningslaget til ~ 80 μm for ældre dyr, skal du belægge siliciumskiver med ~ 1,5 ml negativ fotoresist-2 ved hjælp af spincoateren ved 500 o / min i 5 s efterfulgt af 2.000 o / min i 30 s. Denne tykkelse er velegnet til L3-trin til voksne dyr.
      FORSIGTIG: Hold siliciumskiverne ved deres sider for at undgå skader på de spin-coatede lag. Hold hvide lys slukket under dette trin.
    8. Bag de fotoresistovertrukne siliciumstykker (til flow- og kontrollag) på en kogeplade ved 65 °C i 1 minut efterfulgt af 95 °C i 10 min. Afkøl de bagte stykker til stuetemperatur.
      BEMÆRK: De bagte siliciumstykker kan opbevares i en dag, før de fortsætter til næste trin. Opbevares i mørke og udsæt ikke for hvidt lys.
    9. Sæt blødbagte siliciumstykker på UV-belysningens eksponeringsstadium med den fotoresisterede overflade vendt mod UV-lampen. Udsæt de to stykker separat for UV i 15 s ved hjælp af en 200 W lampe gennem en fotomaske med mønstre 1 og 2 for at få henholdsvis flow- og kontrollag.
      FORSIGTIG: Brug sikkerhedsbriller og undgå direkte udsættelse for UV-lys. Tænd ikke hvidt lys i rummet i denne fase.
    10. Bag de to udsatte siliciumstykker med belagt lag opad ved 65 °C efterfulgt af 95 °C i henholdsvis 1 min og 10 min. Afkøl stykkerne til stuetemperatur, inden du fortsætter til næste trin.
    11. Udvikl mønstrene ved at lægge siliciumstykkerne i blød i fotoresist-udvikleropløsningen (1:3 fortynding af udvikleren i isopropanol) i 20 min. Når mønsteret er synligt, skylles stykkerne med ren iso-propylalkohol (IPA) og blæses forsigtigt tørt med nitrogengas (14 psi).
      FORSIGTIG: Brug et godt ventileret miljø til denne kemiske behandling for at undgå menneskelig eksponering. Brug kun hvidt lys, når funktionerne er udviklet og skyllet med IPA.
    12. Opbevar siliciumstykkerne i en tørremiddel med den belagte overflade opad. Udsæt stykkerne for silandampe ved at hælde 50 μL ren trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan på en lille plastikkop eller et glasglas. Placer koppen / diaset inde i en tørremiddel og inkuber i 2 timer.
      FORSIGTIG: Undgå direkte eksponering for silandamp. Brug altid et forseglet kammer til silandampbehandling.
      BEMÆRK: Om nødvendigt kan de udviklede siliciumstykker opbevares i 1-2 dage, før de går videre til næste trin.
  2. Fremstilling af PDMS-chip
    1. Lav PDMS i en plastikkop ved at blande elastomerbasen med hærdningsmidlet i et forhold på 10: 1. Bland indholdet godt under konstant omrøring i 3 min. Blandingen vil skabe en masse luftbobler i PDMS-blandingen.
    2. Afgas PDMS-blandingen i en tørremiddel i 30 minutter for at fjerne alle luftbobler.
      FORSIGTIG: Sørg for, at luftbobler fjernes fra PDMS-blandingen, før den hældes på funktionerne, da bobler kan forårsage defekte og ikke-funktionelle enheder.
    3. Anbring siliciumskiverne med kontrollaget (mønster 2) i en petriskål. Hæld forsigtigt et 5 mm tykt PDMS-blandingslag på siliciumstykket for at undgå bobledannelse.
    4. Afgas PDMS-blandingen i en udtørring for at fjerne yderligere bobler, der dannes under PDMS-hældningsprocessen.
    5. Læg siliciumskiven med flowlag (mønster 1) på spinnerpatronen, der anvender 200-500 mTorr vakuumtryk for at holde waferen. Hæld ~ 1 ml PDMS på siliciumskiven og belæg den ved hjælp af en spin coater ved 500 o / min i 5 s efterfulgt af 1.000 o / min i 30 s for at få et ~ 80 μm tykt lag.
    6. Bag de to siliciumskiver med det spinbelagte PDMS og hæld PDMS-lag ved 50 °C i en varmluftskonvektionsovn i 6 timer. Efter bagning skal du vente på, at stykkerne køler ned ved stuetemperatur.
    7. Skær det 5 mm tykke PDMS-lag fra siliciumstykket omkring kontrollaget (mønster 2) med et skarpt blad, og skræl det af siliciumunderlaget.
    8. Stans to huller med ~ 1 mm diameter ved hjælp af en Harris-stanser ved PDMS-blokkens reservoir for at forbinde immobiliseringskanalen og isolationskanalindløbene til gasledningerne til PDMS-membranafbøjninger.
    9. Placer siliciumstykket med det spinbelagte PDMS-lag på mønster 1 (flowlag) med den PDMS-belagte overflade opad på en plastbakke. Opbevar den stansede PDMS-blok med mønster 2 (kontrollag) på bakken med støbt side opad.
    10. Opbevar plastbakken inde i en plasmarenser, og udsæt de to PDMS-overflader for 18 W luftplasma i 2 minutter under lavt vakuum (200-600 mTorr). Påfør vakuum, indtil kammeret bliver lyst violet. Udfør dette trin under svagt lys for at se plasmafarveændringen.
    11. Tag de to plasmabehandlede blokke ud og bind forsigtigt blokkene ved at trykke de plasmabehandlede overflader af mønster 1 og 2 sammen. Bag de bundne mønstre ved 50 °C i 2 timer i en varmluftskonvektionsovn.
    12. Tag den limede enhed ud af ovnen. Skær den limede enhed ud af siliciumskiven med mønster 1 og mønster 2, og stans huller i strømningslagets indløbs- og udløbsreservoirer ved hjælp af Harris-stanserne.
    13. Placer den bundne PDMS-blok med flowlaget opad på en plastikbakke. Opbevar et rent dækglas (# 1.5) på den samme bakke. Udsæt blokkene og dækglasset for 18 W luftplasma i 2 minutter. Juster vakuumtrykket for at se et violet kammer.
      BEMÆRK: Dette trin skal udføres i svagt lys for at se plasmafarveændringen. For at rengøre dækglasset skal du vaske det med IPA og føntørre med nitrogengas ved 14 psi.
    14. Anbring den plasmaeksponerede PDMS-blok oven på dækglasset, og bag den bundne struktur i en ovn ved 50 °C i 2 timer. Opbevar enheden i et rent kammer til ethvert fremtidigt eksperiment.

2. PDMS membran priming

  1. Tag enheden og læg den på et stereomikroskop og fastgør slangerne. Tilslut mikro flexrør (indvendig diameter ~ 5 mm, ydre diameter ~ 8 mm) til en komprimeret nitrogengasledning i den ene ende. Tilslut et trevejsstik i den anden ende. Rør 1 og 2 af trevejsstikkene vil blive forbundet til henholdsvis fælden og isoleringsmembranerne.
  2. Tilslut to mikro flexrør (indvendig diameter ~ 1,6 mm, ydre diameter ~ 5 mm) til de to udløbsporte på trevejs stophanen. Tilslut den anden ende af de to rør til en 8 mm lang 18 G nål.
  3. Fyld flowlaget med M9-buffer ved hjælp af en mikropipette gennem indløbsporten. Fyld begge rør med DI-vand gennem enden, der er forbundet til nålen. Indsæt de to nåle i de stansede huller, og forbind henholdsvis isolerings- og fangstmembranen.
  4. Åbn nitrogengasregulatoren ved 14 psi, og drej trevejsventilen fra rør 1 for at skubbe vandet ind i enheden gennem de mikrofluidiske kanaler i kontrollagene, nemlig fælden og isolationsmembranerne.
  5. Vent, indtil vand fylder kanalen uden tilstedeværelse af luftdråbe i begge kanaler. Når kanalerne er helt fyldt med vand, anses kanalerne for at være primet.
  6. Slip trykket ved hjælp af trevejs stophanen, når kanalerne er fyldt med vand og grundet. Priming kan føre til bobler i flowlaget, fjern boblerne ved at flyde yderligere medier gennem flowkanalen.

3. C. vedligeholdelse og synkronisering af elegans

BEMÆRK: C. elegans stammer: Undersøgelsen anvendte følgende transgener PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) til vulvaludvikling 32, jsIs609 (mec7p::MLS(mitokondrie matrixlokaliseringssignal)::GFP)33 til berøringsreceptorneuron (TRN) udvikling og mitokondrie transportbilleddannelse og wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) til at spore PVD-udvikling 34. Standard C. elegans kultur- og vedligeholdelsesprotokol blev fulgt35.

  1. C. elegans dyrkes på nematodevækstmediet (NGM) Petriplader med E. coli OP50 som fødekilde ved 22 °C. Vedligehold C. elegans-stammerne ved gentagne gange at overføre et par hermafroditter eller klumpe en lille mængde agar med et par dyr til en ny NGM-plade med en OP50-græsplæne.
  2. Efter 3-5 dage skal du kontrollere NGM-pladen for dyrevækst og C. elegans æg. Saml og overfør ca. 30 æg fra en tallerken til en frisk NGM-plade med OP50 græsplæne.
  3. For at synkronisere dyr til billeddannelse skal du overføre alle ikke-udklækkede æg fra pladen hver 2. time til en frisk plade og holde dem ved 22 °C. Ca. 15-20 æg klækkes på hver plade.
  4. Vælg dyrene mellem 14-16 timer og 28-30 timer efter udklækning til henholdsvis larve 2 (L2) og larve 3 (L3) stadier. Overfør dyrene til den mikrofluidiske enhed til billeddannelse. Tilføj fødevareforsyning som beskrevet i næste afsnit for at opretholde dyret inde i enheden til langsigtede vækst- og billeddannelseseksperimenter.

4. C. elegans vækst inde i vækst- og billeddannelsesmikrofluidanordningen

  1. Monter en vækst- og billeddannelsesmikrofluidisk enhed på et omvendt mikroskop og se mønster 2, efter tilslutning af isolationsmembranerne og immobiliseringsmembranen, ved lave forstørrelser (4x eller 10x). Sørg for, at kanalerne er fyldt med rent destilleret vand.
  2. Der fremstilles en frisk 1 L opløsning af S-medium ved anvendelse af 10 ml 1 M kaliumcitrat pH 6,0, 10 ml spormetalopløsning, 3 ml 1 M CaCl2, 3 ml 1 M MgSO4. Forbered opløsningen under sterile forhold. Autoklave ikke S-mediet.
  3. Fyld flowkanalen med vækstmedier (S-medium) 10 minutter før eksperimentet. Undgå luftbobler i flowkanalen. Flow yderligere medium, hvis det er nødvendigt for at fjerne luftbobler.
  4. Vælg et enkelt dyr fra det krævede udviklingsstadium fra en NGM-plade i 10 μL S-medium ved hjælp af en mikropipette, og skub dyret ind i strømningskanalen gennem indløbshullet.
  5. Overvåg dyrets position i flowkanalen ved hjælp af et lavt forstørrelsesmål. Flyd yderligere medium gennem indløbet eller udløbet for at skubbe dyret og placere det inden for strømningskanalen, der er begrænset mellem de to isolationsmembraner.
  6. Åbn trevejs stophanen for at påføre 14 psi-tryk i isolationskanalerne, og skub membranerne ned i strømningskanalen.
    BEMÆRK: Membranen forsegler delvist strømningskanalen og begrænser dyrets bevægelse til området mellem de to isolationsmembraner.
  7. Brug en enkelt koloni af E. coli OP50 fra en stribet plade til at inokulere 250 ml L bouillon (2,5 g bacto-tryptone, 1,25 g bacto-gær, 1,25 g NaCl i H2O). Dyrk den podede kultur natten over ved 37 °C.
  8. Aliquot 500 μL OP50-dyrkning i 1,5 ml sterile centrifugerør og opbevar bestanden og aliquoten i 2 uger ved 4 °C.
  9. Pellet ned OP50 kultur ved centrifugering ved 1,3 x g i 5 min. Opløs pelleten med 1 ml frisk S-medium (0,5x fortynding) og opbevar den ved stuetemperatur i 3-4 dage. Brug denne fortyndede OP50 til at fodre C. elegans inde i mikrofluidiske enheder.
  10. Efterlad en dråbe S-medium oven på indløbs- og udløbsreservoirerne for at reducere fordampningen af S-mediet i strømningskanalen.
  11. Der tages fortyndet OP50-opløsning i en 10 μL mikropipette. Fjern mikrospidsen fyldt med OP50-opløsningen fra pipetten, og tryk spidsen ind i indløbsbeholderen. Anbring derefter en anden mikropipettespids med 10 μL madopløsning og indsæt den i udløbsbeholderen.
  12. Forsegl spidshovedet, der anvender tryk ved hjælp af en finger for at sikre kontinuitet i fødevareopløsninger uden luftspalte. Skift mikropipettespidsen med OP50-opløsning hver dag, der ikke er ældre end 3-4 dage.
  13. Fyld yderligere 20-30 μL madopløsning i begge spidser. Tilsæt eller fjern foderopløsning til og fra mikropipettespidsen for at justere gradienten for at skubbe dyret i strømningskanalen og for at justere dyrets position under fangstmembranen til billeddannelse.
  14. Overvåg strømmen af bakterier for at sikre, at den er kontinuerlig gennem de delvist lukkede isolationsmembraner i strømningskanalen ved hjælp af lysfeltbilleder.
    BEMÆRK: I mangel af bakteriestrøm kan dyr spise de tilgængelige bakterier i strømningskanalen mellem de to isolationsmembraner. Hvis der ikke er bakterier eller ingen strømning i kanalen, skal du udskifte de to mikropipettespidser ved indløbet og udløbet med nye pipettespidser fyldt op med frisklavede fødevareforsyninger.

5. C. elegans immobilisering og billeddannelse

  1. C. elegans immobilisering under fangstmembranen
    1. Find et enkelt dyr i vækstkanalen ved lave forstørrelser. Juster madopløsningshøjderne i de to mikropipettespidser, der er forbundet med indløbs- og udløbsbeholderne. Skub dyret i den krævede retning ved hjælp af de hydrostatiske trykforskelle i strømningskanalen.
    2. Placer dyret i midten af fangstmembranen og overvåg dets svømmeadfærd ved hjælp af et lavt forstørrelsesmål (4x).
    3. Drej trevejs stophanen for langsomt at øge trykket i fældekanalen. Immobiliser dyret under fældemembranen i en lige kropsholdning langs vækstkanalens grænsevæg.
      FORSIGTIG: Undgå at fange dyret over strømningskanalen i en Z- eller U-bøjningsposition. Dette får dyrekroppen til at blive presset med større tryk og forårsager permanent skade på dets helbred.
  2. C. elegans billeddannelse og frigivelse fra membranen
    1. Bær og indlæs enheden på et mikroskoptrin. Opsæt et omvendt mikroskop ved de ønskede billeddannelsesindstillinger med alle de nødvendige optiske komponenter (objektiv, lyskilde, fluorescensfiltre og en detektor) til højopløseligt lysfelt, differentiel billeddannelseskontrast (DIC) eller fluorescensbilleddannelse (supplerende figur 1).
    2. Anskaf et enkelt eller flere time-lapse fluorescensbilleder for at fange cellulære og subcellulære hændelser.
    3. Få fluorescensbilleder af C. elegans neuroner som en funktion af deres udvikling ved hjælp af et 60x, 1,4 numerisk blænde (NA) mål, en 488 nm bølgelængde laser med 7% -10% lasereffekt, et CCD kamera, på et roterende skivemikroskop. Udfør time-lapse-billeddannelse ved hjælp af den software, der følger med mikroskopet, og opret billeder med en hastighed på 4 billeder i sekundet (supplerende figur 1).
    4. Efter erhvervelsen af billeder frigøres fangsttrykket og overvåger dyrets bevægelse ved lave forstørrelser - 4x og 10x. Hold dyret begrænset inden for det område, der er defineret ved at isolere membraner (holdes under 14 psi gennem hele forsøget).
    5. Juster mængden af fødevareopløsning i de to mikropipettespidser for at fortsætte en langsom tyngdekraftsdrevet fødevarestrøm i vækstkanalen. Denne fødestrøm opnås ved at justere niveauerne af fødevareopløsningerne i mikropipetter ved indløbet og udløbet (typisk 1-5 mm højdeforskel).
    6. Visualiser strømmen under et lyst felt fra bakteriens strømningsmønster i vækstkanalen.
      BEMÆRK: I mangel af strømning spiser dyret de tilgængelige OP50-bakterier, kanalen ser klar ud, og dyret sulter over et par timer. Et udsultet dyr udvikler typisk høj autofluorescens, der let kan observeres, når man erhverver time-lapse fluorescensbilleder. Sådanne hændelser har skadelige virkninger på dyrefysiologi og blev undgået i forsøgene.
    7. Trin 5.2.1-5.2.3 gentages efter et forudbestemt tidsinterval for at opnå fluorescens/DIC/lysfeltbilleder af den samme person på flere tidspunkter.
    8. Når billederne er erhvervet på flere ønskede tidspunkter fra det samme individuelle dyr, skal du slippe isolations- og fangsttrykket. Skyl kanalen med M9-buffer og skub dyret gennem indløbsreservoiret. Gendan dyret fra reservoiret, og læg dyret på en frisk NGM-plade til yderligere sundhedsovervågning.
    9. Skyl kanalen med M9-buffer et par gange for at fjerne bakterier. Skyl strømningskanalen med 70% ethylalkohol (fortyndet i destilleret vand). Tør kanalerne ved at skubbe luft ved hjælp af en sprøjte. Opbevar enheden på et tørt støvfrit sted til gentagen brug i fremtiden.
  3. Billedanalyse og statistik
    1. Brug FIJI ImageJ-software til tiff-billedanalyse. Åbn tiff-billeder af PVD-time-lapse-billederne fra wdIs51-dyrene i Fiji ImageJ. Udtræk de bedste planer fra stakken af z-planer, der viser de primære processer, ved at vælge fanen Billede > Stakke > Z-projekt.
    2. Screen hele billedserien og find specifikke billedrammer, der med succes dækker hele neuronale processer ved hjælp af overlappende sektioner af dyrebilledrammerne. Vælg Plugin > Analyser > celletæller fra FIJI-værktøjslinjen. Dette åbner et vindue til nummerering af forskellige grene og optælling af hver valgt neuron.
    3. Vælg Initialiser > tællere > Type1, og markér derefter de sekundære grene. Vælg derefter Type 2 og marker Kvartær, klik på Resultatvindue , der viser tællinger af alle grene (Supplerende figur 2). Denne metode viser de grene, der allerede er talt.
    4. Åbn det næste overlappende billede, og tæl de resterende grene. Denne proces forhindrer dobbelttælling og sikrer, at hver proces tælles. Identificer og tæl det samlede antal primære grene, der er til stede i de tidlige larvestadier af C. elegans. Udfør lignende analyse for billederne for sekundære og kvaternære processer hos ældre dyr.
      BEMÆRK: Voksne viser mange processer, der innerverer i kroppens vægmuskler og kan være vanskelige at tælle. Sørg for, at hver proces kun tælles én gang.
    5. Beregn afstanden mellem PVD-cellelegemerne i wdIs51-dyrene ved at tegne en segmenteret linje fra PVD-cellelegemet (CB) til PVC CB. For larve 4 (L4) stadiedyr er cellelegemerne langt fra hinanden og er ikke i samme ramme, når de afbildes med et 60x mål.
    6. Vælg overlappende billeder fra stak for at dække hele dyrelængden fra hoved til hale ved hjælp af fanen Billede > Stacks > Z-projekt fra ImageJ. Tegn segmenterede linjer langs neuronalprocessen mellem PVD- og PVC-CB'erne.
    7. Mål længderne for alle de segmenterede linjer ved hjælp af ImageJ > Analyser > måling. Tilføj længderne for alle segmenterne for at beregne den samlede afstand mellem PVD- og PVC-CB'er for hvert tidspunkt.
    8. For neuronlængde af TRN'er i jsIs609-dyr skal du indlæse billederne i Fiji. Tegn en segmenteret linje langs de bageste laterale mikrotubuli (PLM'er; synlige med opløselig GFP) fra cellelegemet til centroiden af den første mitokondrion. Beregn længden af linjen for den første afstandsværdi.
    9. Tegn en segmenteret linje fra midten af den første til den anden mitokondrion. Gentag denne proces for hvert par mitokondrier indtil slutningen af neuronal proceslængde. Tilføj alle længderne for at beregne den samlede neuronale proceslængde.
    10. Til celleafstamningsanalysen skal du indlæse alle vulvabillederne i Fiji og udtrække det bedste fokusbillede af cellerne fra time-lapse-billederne af flere z-planer.
    11. Repræsenter dataene som middel ± standardfejl for middelværdien (SEM). Beregn statistisk signifikans ved hjælp af envejs ANOVA for mere end to prøver eller en to-prøve t-test for et par prøver. Angiv signifikans med p-værdi < 0,05 (*), p-værdi < 0,005 (**) og p-værdi > 0,05 (ns, ikke signifikant).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering af enhed: Vækst- og billeddannelsesenheden består af to PDMS-lag bundet sammen (figur 1) ved hjælp af irreversibel plasmabinding. Strømningslaget (mønster 1), som er 10 mm langt og 40 μm eller 80 μm i højden, giver os mulighed for at dyrke dyret i flydende kultur (figur 1A). Fældelaget (mønster 2) har en 2 mm bred membran (figur 1B) til immobilisering af dyret til billeddannelse i høj opløsning. Masken til fangstlaget skaber også et par isolationsmembraner til begrænsning af dyrs bevægelse inden for et afsnit af strømningskanalen mellem successive billeddannelsestidspunkter. Enhedens fangstmembran er tilpasset fra vores tidligere billeddannelsesenhed3. Den nuværende anordning (figur 1C, L) inkluderer tilsætning af en isolationsmembran og en stigning i fangstmembranens bredde til 2 mm for effektiv immobilisering af det samme dyr over flere tidspunkter.

For at teste enheden blev rent destilleret vand fyldt i de mikrofluidiske kanaler, der forbinder fangstmembranerne (figur 1D, E og supplerende figur 3) og tryksat under tryk ved hjælp af 14 psi nitrogengas, der også bruges til at fange et dyr under en 2 mm tyk PDMS-membran (figur 1H, K, L). Et enkelt dyr blev plukket fra en NGM-plade ved hjælp af en mikropipette og lagt i strømningskanalen (figur 1F). Vækstkanalen var fyldt med bakterier resuspenderet i S-medier (figur 1F, G, I, J). Et konstant flow blev opretholdt under hele billeddannelsen ved at justere mediehøjderne i pipettespidserne, der var forbundet med enhedens indløb og udløb, mens dyret blev overvåget i strømningskanalen mellem de to isolationsmembraner. Frisklavet OP50-opløsning blev dagligt fyldt i mikropipettespidserne for at sikre en sund fødekilde til dyret inde i mikrokanalen. Frisk fødekilde og gasgennemtrængeligt PDMS-materiale sikrer tilstrækkelig iltforsyning inde i mikrokanalen30,29. Væksten af dyr i enheden blev sporet ved hjælp af enten cellespecifikke markører eller markører, der viser celleafstamning eller variable cellulære ekspressionsmønstre under udviklingen. Dyrene blev immobiliseret under fangstmembranen ved hjælp af 14 psi nitrogengas og holdt orme i en lige position langs kanalvæggen. Dyret voksede langsommere inde i den mikrofluidiske kanal sammenlignet med på en NGM-plade23.

Celleafstamningsundersøgelse ved hjælp af den langsigtede billeddannelsesenhed: For at vurdere C. elegans udvikling inde i den mikrofluidiske enhed voksede vi PS3239 (ZMP-1: : GFP) stammen32 med konstant fødevareforsyning for at spore vulvaudvikling på forskellige tidspunkter for deres vækst. ZMP-1 koder for en zinkmetalloprotease og udtrykker sig i ankercellen i L3-stadiet, i vulD- og vulE-celler i L4-stadiet og i vulA i dag 1 (1D) voksne dyr (figur 2A). Ændringerne i ekspressionsmønster repræsenterer et eksempel på tidsmæssig genregulering, hvor det samme gen udtrykkes i forskellige celler på forskellige udviklingsstadier. For at observere vulvaudvikling blev dyret først immobiliseret, og vulvaområdet blev derefter afbildet på tværs af flere z-planer hver 8-10 timer fra L3 og fremefter til voksne stadier. ZMP-1::GFP udtrykkes i forskellige vulvalceller i henhold til udviklingsstadiet (figur 2B). Fluorescensbillederne i høj opløsning af vulvacellerne fra dyrene, der vokser inde i den mikrofluidiske enhed, viser normal vulvaudvikling, og ZMP-1: : GFP-ekspression og lokalisering ligner tidligere rapporter32.

Sporing af neuronudvikling ved hjælp af langsigtet vækst- og billeddannelsesenhed: For at demonstrere brugen af enheden til subcellulær billeddannelse fra et individuelt dyr blev udviklingen af to mekanosensoriske neuroner PVD og TRN'er overvåget. NC1686-stammen, der udtrykker wdIs51, der udtrykker GFP i de to PVD-neuroner, blev brugt34,36. Hver PVD-neuron viser menorah-lignende forgrenet dendritisk arkitektur bestående af henholdsvis primære (PP), sekundære (SP), tertiære (TP) og kvaternære (QP) processer ved L2 (14-16 timer), sen L2 (20-22 timer), L3 (24-26 timer) og L4 (36-42 timer) udviklingsstadier (figur 3). PVD-cellelegemet er til stede bageste til vulvaen. Det sender en axon og to primære dendritiske processer, der giver anledning til SP og TP, som igen giver anledning til QP dendritiske grene, der inderverer kropsvægsmusklerne. Sene L3- og L4-stadier viser høj arborisering37,34. Vi dyrkede enkelte NC1686-dyr inde i mikrofluidenheden og fodrede dem kontinuerligt med bakteriel mad. Dyrene blev immobiliseret under L2 op til 1D-udviklingsstadiet, og PVD-neuronerne blev gentagne gange afbildet hver 8-12 timer ved hjælp af 60x, 1.3 NA-oliemål for at tælle antallet af SP-, TP- og QP-grene i tre dimensioner. Forgreningsomfanget steg under udviklingen som vist i figur 3B. Antallet af SP og QP på forskellige stadier af ormens udvikling steg med alderen (figur 4A), som det er set i tidligere studier37. L2-dyr viste 10 ± 3,8 (n = 9) SP'er, men ingen QP, målt ved hjælp af enheden (figur 4A). Vi placerede C. elegans i en dråbe på 3 mM levamisol, et bedøvelsesmiddel, der forårsager sammentrækning af kropsvægsmuskel og lammelse, for at minimere negative virkninger på organelletransport, samtidig med at dyrebevægelser reduceres og forårsager tilstrækkelig lammelse, der kræves til billeddannelse i høj opløsning 3,4. SP-værdierne (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) var ikke signifikant forskellige fra lignende iscenesatte dyr dyrket på NGM-plader og afbildet ved hjælp af 3 mM levamisol på en agar-dias (figur 4B). Dataene tyder på, at enhedens immobilisering muliggør billeddannelse i høj opløsning af komplekse neuronale arkitekturer og ikke påvirker deres udvikling. L3-stadiedyr har et lille antal QP, der stiger i antal med udviklingen. 1D voksne viste 67 ± 2,8 QP'er (n = 5) hos dyr dyrket i enheden. Tidligere undersøgelser har vist dannelsen såvel som en tilbagetrækning af PVD-processer under udvikling kendt som selvundgåelse, hvor de reducerer deres grental38. Reduktionen i SP ved 51 timer (1D) efter udklækning kan være resultatet af sådanne tilbagetrækninger. Dyr, der voksede på NGM-plader og afbildede ved hjælp af 3 mM levamisol, viste en lignende forgreningstalstendens for sammenlignelige udviklingsstadier (figur 4A, B). Endvidere øges afstanden mellem de to PVC-cellelegemer, den ene til stede i halen og den anden til stede nær vulvaen, når de bevæger sig fra hinanden hos dyr, der dyrkes i enheden eller dem, der dyrkes på NGM-plader (figur 4C, D). Gennem hele billeddannelsesprocessen forblev dyrene sunde og kunne lægge æg, selv efter at dyrene blev immobiliseret under membranen gentagne gange i løbet af denne lange periode.

Ved hjælp af denne enhed var vi i stand til at immobilisere dyret i samme retning og afbilde den identiske neuron og dens arkitektur med høj opløsning selv med svagt GFP-udtryk. For at demonstrere nytten af vores vækst- og immobiliseringsteknologi blev udviklingen af TRN'erne fra L3 til voksen afbildet ved hjælp af jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP) dyr. De bageste TRN'er er til stede på den laterale side af kroppen og kaldes PLMR og PLML, hvilket svarer til højre og venstre side af dyret. Vi forestillede os de samme dyr, der voksede i den mikrofluidiske chip og immobiliserede dem med 12-14 timers intervaller. Montagen repræsenterer hele PLMR-neuronprocessen på successive tidspunkter, der fremhæver både mitokondrier og neuronal proces (figur 5A). Den samlede neuronale proceslængde blev beregnet og viste sig at stige med en hældning på 10,4 μm pr. T (figur 5B). Denne stigningshastighed i neuronal proceslængde stemmer overens med en tidligere rapport på ~ 10 μm / h 18,31,39,40,41. Vi observerede også tilføjelsen af nye mitokondrier i vækstprocessen og ændringen i den synaptiske grenpunktposition i forhold til cellelegemet som rapporteret tidligere23.

Figure 1
Figur 1: En simpel mikrofluidisk chip til langsigtet vækst og billeddannelse af C. elegans. (A) Flowlaget består af en 10 mm lang mikrofluidkanal (mønster 1) i et tyndt PDMS-lag. (B) Fangstlaget består af en 2 mm tyk immobiliseringskanal og et par tynde isolationskanaler i PDMS-masselaget. (C) De to PDMS-lag er bundet sammen med et tyndt dækglas for at fremstille enheden. (D, E) Fangst- og isolationskontrolkanalerne er fyldt med deioniseret (DI) vand under komprimeret nitrogen (N2) gas. (F) Alderssynkroniserede C. elegans plukkes fra NGM-plader og indlæses inde i enhedens flowlag. (G) Fødevarer leveres ved hjælp af to mikropipettespidser ved indløbs- og udløbsreservoirerne. (H) Dyrene kan frit bevæge sig inden for de to isolationskanaler og er fanget under immobiliseringsmembranen. (I) Billede af vækst- og billeddannelsesenheden med fødevareforsyning gennem to mikropipettespidser. (J, K) Billeder af en frit bevægende og immobiliseret C. elegans inde i den mikrofluidiske kanal. Skalastangen er 1 mm (I) og 200 μm (J, K). (L) Skematisk af enhedens tværsnit, der viser højderne af flowkanalen (FC), PDMS-membranen (M) og kontrolkanalen (CC). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sporing af udtrykket af en vulvalmarkør i C. elegans , der udvikler sig inde i enheden. (A) Skematisk af vulvalceller, der udtrykker ZMP-1::GFP i PS3239-dyr under udvikling. GFP-signalet vises i ankercellen på L3-stadiet, i vulD- og vulE-cellerne på L4-stadiet og i vulA-celler på det voksne 1D-stadium. (B) Billeder af PS3239-dyr, der vokser inde i den mikrofluidiske chip og immobiliseres hver 8-10 time for at fange fluorescensbilleder af ZMP-1::GFP-ekspression under vulvaudvikling fra L3, L4 og 1 dag (1D) voksen. Forkortelser: AC = ankercelle, A = vulA, D = vulD, E = vulE. Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Billeddannelse af individuelle wdIs51 C. elegans til sporing af PVD neuronal udvikling. (A) Skematisk af PVD neuronvækst og dendritisk arborisering fra L2 til L4 fase. Grøn cirkel viser PVD-cellelegeme (CB, gul pil). Dendritterne viser fremkomsten af primære processer (PP) ved L2 fra både den forreste og bageste side af CB, sekundære processer (SP) i slutningen af L2, tertiære processer (TP) i L3 og kvaternære processer (QP) under L4-faser. (B) Billeder af PVD-neuroner fra dyr, der vokser inde i en mikrofluidisk enhed. (C) Billeder af PVD-neuroner fra dyr dyrket på en NGM-plade og immobiliseret med 3 mM levamisol (Lev). Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning af udviklingen i PVD hos dyrkede dyr og dyr dyrket på NGM-plader. (A) Det gennemsnitlige antal sekundære processer (SP) og kvaternære processer (QP) fra de samme dyr, der vokser inde i den mikrofluidiske enhed. Værdierne beregnes ved 16 timer (L2), 24 timer (L3), 36 timer (tidlig L4), 42 timer (sen L4) og 51 timer (1D voksen). (B) Det gennemsnitlige antal SP og QP fra et andet parti dyr, der vokser på NGM-plader og bedøves med 3 mM levamisol. (C) Gennemsnitlig adskillelse mellem de to PVD neuronale cellelegemer fra det samme dyr, der vokser i den mikrofluidiske enhed. (D) Gennemsnitlig adskillelse fra forskellige sæt dyr, der vokser på NGM-plader og bedøves med 3 mM levamisol. Data repræsenteret som gennemsnit ± SEM (n ≥ 10 for 3 mM levamisol og n ≥ 6 for enheder immobiliserede dyr). De statistiske signifikanser beregnes ved envejs ANOVA og betegnes som p-værdi < 0,05 (*), p-værdi < 0,005 (**) og p-værdi > 0,05 (ns). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Højopløsningsbilleddannelse af berøringsreceptorneuroner (TRN'er) fra dyr, der vokser inde i den mikrofluidiske enhed. (A) Montage af neuronale processer fra et enkelt dyr afbildet på forskellige tidspunkter. Cellelegemet (CB, pil), det synaptiske grenpunkt (BP, pilespids) og neuronspidsen (Tip, pil op) er mærket. Den neuronale proces og position af hver mitokondrion spores manuelt ved hjælp af Fiji. Skalabjælken er 10 μm. (B) Gennemsnitlig neuronal proceslængde på forskellige billeddannelsestidspunkter. Data repræsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 8). Den statistiske signifikans beregnes ved hjælp af envejs ANOVA og betegnes som p-værdi < 0,005 (**) og p-værdi > 0,05 (ns). En regressionsligning er egnet med en hældning på 10,4 μm neuronal procesforlængelse i timen, R2 = 0,9425. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Skærmbilleder af mikroskopindstillinger til fluorescensbilleddannelse af C. elegans. (A) Et panel af billedanalysesoftwaren viser de fremhævede sektioner til opsætning af scanningshastighed, filtersæt og mål for billeddannelse. (B) Softwaren bruges derefter til at vælge 488 nm laseren med 7% af den fulde lasereffekt. (C) Billedanalysesoftwaren kan tage en enkelt billedramme eller en række time-lapse-billeder og gemme dem til fremtidig analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Skærmbilleder af FIJI-software, der viser analysetrinnene til tælling af PVD-grene i wdIs51-dyr . (A) Viser PVD-billede åbnet i Fiji ImageJ-software og link til celletæller-pluginet. (B) Celletællervindue for at initialisere tælleren til et billede. (C) Valg af tællere til at markere grene, der er inkluderet, og for at undgå flere tællinger. (D) Resultatvindue, der viser det samlede antal filialer under hver kategori. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Skematisk over vækst- og billeddannelsesenheden. To mikropipettespidser, fyldt med forskellige mængder bakteriefødeopløsning (gul), indsættes i indløbs- og udløbsstansene i strømningskanalen i bundlaget. Forskellen i højderne af fødevareopløsninger i spidserne får opløsningen til at strømme inde i kanalen, som igen leverer bakterier til dyret for dets vækst. Fangst- og isoleringskanalerne (blå) fyldes med destilleret vand og komprimeres ved hjælp af en nitrogengas (indstillet til 14 psi) forsyning. Isolationskanalen er altid forbundet til 14 psi. Trykket på fangstmembranen skiftes mellem 0 (dyret er frit at bevæge sig og fodre) og 14 psi (dyr immobiliseres til billeddannelse i høj opløsning) ved hjælp af et trevejsstik. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir er en protokol til fremstilling og brug af en simpel mikrofluidisk enhed til dyrkning af C. elegans med konstant fødevareforsyning og højopløsningsbilleddannelse af et enkelt dyr under dets udvikling blevet beskrevet. Denne fremstillingsproces er enkel og kan udføres i et ikke-sterilt miljø. Et støvfrit miljø er kritisk under fabrikationstrin. Tilstedeværelsen af støvpartikler ville føre til forkert kontakt mellem de to bindingsflader, hvilket resulterer i dårlig binding og lækage af enheden under højtrykspåføring, mens C. elegans immobiliseres. Ud af alle de fremstillede enheder er 95% af enhederne egnede til eksperimenter. Et lille antal enheder fejler (5%) på grund af upassende limning under fabrikation eller brug. Fejl i limning kan reduceres ved at udføre fremstillingsprocessen inde i et støvfrit (> 1.000-grade renrum), der er tilgængeligt på flere akademiske institutioner rundt om i verden. For at rense bakteriel mad fra flowkanalen og muliggøre genbrug af enheden skal du skylle enheden ved at strømme alkohol gennem den efter hvert eksperiment.

Protokollen demonstrerer en litografifremstillingsproces med et simpelt design, der let kan ændres til forskellige udviklingsstadier og størrelser af C. elegans. Desuden kan dette enhedsdesign tilpasses andre modelorganismer som zebrafisk og Drosophila ved at øge dimensionerne af strømmen og fange lag3 for at observere en række udviklings- og subcellulære processer. I denne protokol er to forskellige højder af flowlagskanalen - 40 μm og 80 μm - blevet brugt til fuldstændig immobilisering og sporing af cellulære og subcellulære træk i forskellige udviklingsstadier af C. elegans alt efter deres kropsstørrelser. For eksempel begynder dendritisk arborisering i PVD-sensoriske neuroner i de tidlige L2-stadier og fortsætter op til L4-stadiet. Dette blev afbildet i en enhed med et 40 μm højt flowlag. Da PVD-neuronerne danner dendritter, der innerverer kropsvægsmuskler, kræver det optisk sektionering for at kvantificere processerne i 3D. Den kvantitative analyse af dendritiske arbors kræver fuldstændig immobilisering af dyrene i enheden, der matcher kropsdiameteren. Til overvågning af vulvaudvikling blev 80 μm højde af strømningslag imidlertid brugt til at spore vulvallinjerne. Til TRNs længde og mitokondrier billeddannelse afbildede vi L2 til L4 trin ved hjælp af enheder med 40 μm flowlagtykkelse. Brug af en enhed med den forkerte højde vil medføre vanskeligheder med immobilisering. For eksempel vil små dyr (L2 eller tidlige L3-stadier) inde i en 80 μm flowlaghøjdeanordning tillade dyrvending inde i enheden og vise ufuldstændig immobilisering, selv efter at fangstmembranen er under 14 psi-tryk. På den anden side kommer dyr med store kropsdiametre (ud over sen L4) ikke let ind i en enhed med 40 μm flowlagshøjde. Fangst af store dyr i små enheder under højt tryk kan beskadige deres krop. Anvendelsen af den nuværende enhed med et 40 μm strømningslag er begrænset og ikke egnet til højopløsningsbilleddannelse af meget unge dyr i det tidlige larvestadie (såsom L1-stadiedyr yngre end 10 timer efter udklækning), da de ikke er fuldstændig immobiliseret under membranen. På grund af små kropsstørrelser fortsætter larvedyrene i lille størrelse med at bevæge sig og undslipper lejlighedsvis fælden, når de er begejstrede med laserlys. For L1-scenedyr kan man udføre lysfelt- eller fluorescensbilleddannelse med lav opløsning ved hjælp af 4x eller 10x mål og korte kameraeksponeringstider. Som en alternativ tilgang vil en ny flowlagsanordning med < højde på 20 μm være nødvendig for fuldstændigt at immobilisere unge larvetrin C. elegans.

Sporing af udviklingsfænomener hos det samme dyr over en lang tidsskala ved hjælp af højopløsningsfluorescensbilleddannelse kan resultere i øget autofluorescens. Hvert time-lapse-billeddannelsesassay kræver optimering af excitationsintensitet, eksponeringstid, billeddannelsestidsinterval, dyregendannelsestid og fødevarekvalitet for fysiologisk relevant udviklingsinformation fra C. elegans-undersøgelser. Vi har valgt > tidsinterval på 3 timer til udviklingsstudier, når vi bruger dyr fra L4-stadier og fremefter. Enheden er i stand til at erhverve hyppigere billeder (hvert 5-10 minut i et par timer) eller flere billeder i sekundet (i < 1 time) for at studere andre dynamiske processer såsom organelletransport og distribution i C. elegans neuroner 3,23. Fældefangst og billeddannelse af tidlige udviklingsstadier kræver mere omhyggelig observation, da gentagen fældefangst med korte tidsintervaller uden fuldstændig genopretning kan påvirke deres helbred. Under forsøg blev det konstateret, at dyr, der krævede højt tryk for at flytte dem ind i strømningslaget, viser dårligt helbred og mere autofluorescens over tid. Dyr med høj kropsfluorescens, der vides at være forbundet med et højt stressniveau, blev undgået til billeddannelsesundersøgelser. For at opretholde god fysiologi blev dyr fanget i en lige position ved siden af kanalvæggen. Immobilisering af dyrene med deres krop over kanalbredden blev undgået, da dyr bliver syge, efter at deres krop er presset under 14 psi-tryk i denne position. For at opretholde et godt signal-støj-forhold under gentagen billeddannelse med oliemål skal dækslippet rengøres korrekt efter hvert tidspunkt. Efter særlig omhu under fremstillingsprocessen for enheden og dens anvendelse kunne de samme enheder genbruges over flere billeddannelsessessioner.

Denne enhed kan være nyttig til undersøgelser ved hjælp af mutanter, der kan være følsomme over for anæstetika. Den præsenterede tilgang kan eliminere negative bedøvelseseffekter på vækst og fysiologi for at lette observation af morfologiske, funktionelle og adfærdsmæssige defekter hos dyr over en lang periode. Enheden er let at fremstille og kan konfigureres i ethvert laboratorium til at løse langsigtede udviklings- / cellebiologiske spørgsmål i C. elegans , der kræver intermitterende højopløsningsbilleddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. og S.P.K. er forfattere til et verserende patent på mikrofluidisk vækst- og billeddannelsesenhed (patentansøgningsnummer 640/CHE/2011).

Acknowledgments

Vi takker CIFF imaging facility, NCBS for brug af de konfokale mikroskoper støttet af DST - Center for Nanoteknologi (nr. SR/55/NM-36-2005). Vi takker forskningsmidler fra DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), spinningskive understøttet af DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK og Gautam Menon) og HHMI-IECS-tilskudsnummer 55007425 (SPK). HB101, PS3239 og wdIs51 stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. lavede jsIs609 i Mike Nonets laboratorium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Bioengineering udgave 182 C. elegans mikrofluidisk chip on-chip vækst langsigtet billeddannelse neuronal billeddannelse vulva celle afstamning
En simpel mikrofluidisk chip til langsigtet vækst og billeddannelse af <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter