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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Il protocollo descrive una semplice progettazione di chip microfluidici e una metodologia di microfabbricazione utilizzata per coltivare C. elegans in presenza di una fornitura continua di cibo fino a 36 ore. Il dispositivo di crescita e imaging consente inoltre l'imaging intermittente ad alta risoluzione a lungo termine dei processi cellulari e subcellulari durante lo sviluppo per diversi giorni.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha dimostrato di essere un valido sistema modello per lo studio dei processi biologici dello sviluppo e cellulare. La comprensione di questi processi biologici richiede spesso immagini a lungo termine e ripetute dello stesso animale. I lunghi tempi di recupero associati ai metodi di immobilizzazione convenzionali eseguiti su cuscinetti di agar hanno effetti dannosi sulla salute degli animali rendendo inappropriato visualizzare ripetutamente lo stesso animale per lunghi periodi di tempo. Questo articolo descrive la progettazione di chip microfluidici, il metodo di fabbricazione, il protocollo di coltura di C. elegans su chip e tre esempi di imaging a lungo termine per studiare i processi di sviluppo nei singoli animali. Il chip, fabbricato con polidimetilsilossano e legato su un vetro di copertura, immobilizza gli animali su un substrato di vetro utilizzando una membrana elastomerica che viene deviata usando azoto gassoso. L'immobilizzazione completa di C. elegans consente una solida imaging time-lapse di eventi cellulari e subcellulari in modo privo di anestesia. Una geometria del canale con un'ampia sezione trasversale consente all'animale di muoversi liberamente all'interno di due membrane di isolamento parzialmente sigillate che consentono la crescita nel canale con un continuo apporto di cibo. Utilizzando questo semplice chip, è possibile eseguire l'imaging di fenomeni di sviluppo come la crescita del processo neuronale, lo sviluppo vulvare e l'arborizzazione dendritica nei neuroni sensoriali PVD, mentre l'animale cresce all'interno del canale. Il chip di crescita e imaging a lungo termine funziona con una singola linea di pressione, senza valvole esterne, materiali di consumo fluidici economici e utilizza protocolli standard di gestione dei vermi che possono essere facilmente adattati da altri laboratori che utilizzano C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans ha dimostrato di essere un potente organismo modello per studiare la biologia cellulare, l'invecchiamento, la biologia dello sviluppo e la neurobiologia. Vantaggi come il suo corpo trasparente, il breve ciclo di vita, la facilità di manutenzione, un numero definito di cellule, l'omologia con diversi geni umani e la genetica ben studiata hanno portato C. elegans a diventare un modello popolare sia per le scoperte di biologia fondamentale che per la ricerca applicata 1,2. Comprendere i processi biologici e di sviluppo delle cellule dall'osservazione ripetuta a lungo termine dei singoli animali può rivelarsi utile. Convenzionalmente, C. elegans viene anestetizzato su cuscinetti di agar e ripreso al microscopio. Gli effetti avversi degli anestetici sulla salute degli animali limitano l'uso di animali anestetizzati per l'imaging intermittente a lungo termine e ripetuto dello stesso animale 3,4. I recenti progressi nelle tecnologie microfluidiche e il loro adattamento per l'intrappolamento senza anestesia di C. elegans con rischi trascurabili per la salute consentono l'imaging ad alta risoluzione dello stesso animale per un breve e lungo periodo di tempo.

I chip microfluidici sono stati progettati per lo screening ad alta produttività di C. elegans'5 6,7,8, l'intrappolamento e l'erogazione 9, lo screening farmacologico 10,11, la stimolazione neuronale con imaging ad alta risoluzione 12 e l'imaging ad alta risoluzione dell'animale 12,13,14. Sono stati sviluppati anche fogli microfluidici ultrasottili per l'immobilizzazione su vetrini15. Studi a lungo termine su C. elegans sono stati condotti utilizzando immagini a bassa risoluzione di animali che crescono in coltura liquida per osservare la crescita, la dinamica del calcio, gli effetti dei farmaci sul loro comportamento16,17,18,19, la loro longevità e l'invecchiamento20. Sono stati condotti studi a lungo termine utilizzando microscopia ad alta risoluzione per valutare lo sviluppo sinaptico21, la rigenerazione neuronale 22 e l'aggiunta mitocondriale23. L'imaging ad alta risoluzione a lungo termine e il tracciamento del destino cellulare e della differenziazione sono stati effettuati in dispositivi multicanale24,25. Diversi eventi cellulari e subcellulari si verificano su scale temporali di diverse ore e richiedono l'intrappolamento dello stesso individuo in diversi punti temporali durante il loro sviluppo per caratterizzare tutte le fasi intermedie del processo per comprendere le dinamiche cellulari in vivo. Per visualizzare il processo biologico come l'organogenesi, lo sviluppo neuronale e la migrazione cellulare, l'animale deve essere immobilizzato nello stesso orientamento in più punti temporali. Abbiamo precedentemente pubblicato un protocollo per l'imaging ad alta risoluzione di C. elegans per oltre 36 ore per determinare dove vengono aggiunti i mitocondri lungo i neuroni del recettore tattile (TRN)23.

Questo documento fornisce un protocollo per stabilire una metodologia basata sulla microfluidica per l'imaging ripetuto ad alta risoluzione. Questo dispositivo, con un singolo canale di flusso, è più adatto per l'imaging ripetuto di un singolo animale per dispositivo. Per migliorare la produttività e l'immagine di molti animali contemporaneamente, è possibile collegare più dispositivi alla stessa linea di pressione, ma con connettori a tre vie separati che controllano un singolo animale in ciascun dispositivo. Il design è utile per studi che richiedono immagini time-lapse ad alta risoluzione come processi di sviluppo post-embrionali, migrazione cellulare, trasporto di organelli, studi di espressione genica, ecc. La tecnologia potrebbe essere limitante per alcune applicazioni come la durata della vita e gli studi sull'invecchiamento che richiedono una crescita parallela e l'imaging di molti animali in fase avanzata. L'elastomero di polidimetilsilossano (PDMS) è stato utilizzato per fabbricare questo dispositivo grazie alla sua biostabilità26, biocompatibilità 27,28, permeabilità ai gas 29,30 e modulo elastico sintonizzabile 31. Questo dispositivo a due strati consente la crescita di animali con alimentazione continua in un canale microfluidico e l'intrappolamento di singoli C. elegans tramite compressione a membrana PDMS utilizzando azoto gassoso. Questo dispositivo è un'estensione del dispositivo precedentemente pubblicato con il vantaggio di crescere e visualizzare lo stesso animale nel microcanale sotto una fornitura continua di cibo3. La rete aggiuntiva di membrane di isolamento e una membrana di intrappolamento larga 2 mm consentono un'immobilizzazione efficiente degli animali in via di sviluppo. Il dispositivo è stato utilizzato per osservare lo sviluppo neuronale, lo sviluppo vulvare e l'arborizzazione dendritica nei neuroni PVD sensoriali. Gli animali crescono senza effetti avversi sulla salute nel dispositivo e possono essere ripetutamente immobilizzati per facilitare l'imaging di eventi subcellulari nello stesso animale durante il suo sviluppo.

L'intero protocollo è diviso in cinque parti. La Parte 1 descrive la fabbricazione del dispositivo per il chip di crescita e imaging. La Parte 2 descrive come impostare un sistema di pressione per la deflessione della membrana PDMS per immobilizzare e isolare i singoli C. elegans. La Parte 3 descrive come sincronizzare C. elegans su una piastra NGM (nematode growth medium) per l'imaging del dispositivo. La Parte 4 descrive come caricare un singolo animale nel dispositivo e far crescere l'animale all'interno del dispositivo microfluidico per diversi giorni. La Parte 5 descrive come immobilizzare un singolo animale in più punti temporali, catturare immagini ad alta risoluzione utilizzando obiettivi diversi e analizzare le immagini utilizzando le Fiji.

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Protocol

1. Fabbricazione di dispositivi di crescita e imaging

  1. Fabbricazione di stampi SU8
    1. Progettare i modelli 1 (strato di flusso) e 2 (strato di controllo) utilizzando forme rettangolari in un software di elaborazione testi (o un software CAD di progettazione assistita da computer) e stampare le fotomaschere con l'aiuto di un plotter laser con una dimensione minima di 8 μm su pellicola a base di poliestere (Figura 1).
    2. Tagliare i wafer di silicone in pezzi da 2,5 cm × 2,5 cm e pulirli con KOH al 20% per 1 minuto. Risciacquare i wafer in acqua deionizzata (DI). Utilizzare un wafer ciascuno per il flusso e il livello di controllo.
      ATTENZIONE: KOH è corrosivo e deve essere maneggiato con cura.
    3. Asciugare i pezzi con azoto gassoso compresso a 14 psi seguito da disidratazione su piastra calda a 120 °C per 4 ore. Prima di procedere al passaggio successivo, raffreddare i due pezzi a temperatura ambiente.
    4. Prendi uno dei pezzi di silicone e mettilo sul mandrino di un rivestimento di rotazione e accendi il vuoto per tenere il wafer in posizione. Sul pezzo di silicio, mettere ~ 20 μL di esametildisilano (HMDS) e rivestirlo usando lo spin coater a 500 rotazione al minuto (rpm) per 5 s seguito da 3.000 giri / min per 30 s.
      ATTENZIONE: questo passaggio deve essere eseguito in luce gialla. Non usare la luce bianca nella stanza.
    5. Per ottenere uno spessore fotoresist uniforme di ~ 40 μm (specifico per lo strato di flusso; adatto per l'imaging di animali dallo stadio larvale iniziale 1 allo stadio 3 (L1 - L3), rivestire il wafer di silicio con ~ 1,5 ml di fotoresist-1 negativo utilizzando uno spin coater a 500 giri / min per 5 s seguito da 2.000 giri / min per 30 s.
    6. Ripetere i passaggi 1.1.4 e 1.1.5 con il secondo wafer per ottenere uno spessore fotoresist uniforme di ~40 μm specifico per lo strato di controllo.
    7. In alternativa, per aumentare lo spessore dello strato di flusso a ~ 80 μm per gli animali più anziani, rivestire i wafer di silicio con ~ 1,5 ml di fotoresist-2 negativo utilizzando lo spin coater a 500 giri / min per 5 s seguito da 2.000 giri / min per 30 s. Questo spessore è adatto per lo stadio L3 agli animali adulti.
      ATTENZIONE: Tenere i wafer di silicio sui lati per evitare danni agli strati rivestiti di rotazione. Tenere spente le luci bianche durante questo passaggio.
    8. Cuocere i pezzi di silicone rivestiti di fotoresist (per gli strati di flusso e controllo) su una piastra calda a 65 °C per 1 minuto seguita da 95 °C per 10 minuti. Raffreddare i pezzi cotti a temperatura ambiente.
      NOTA: I pezzi di silicone cotto possono essere conservati per un giorno prima di procedere alla fase successiva. Conservare al buio e non esporre alla luce bianca.
    9. Posizionare pezzi di silicone cotti morbidi sullo stadio di esposizione dell'illuminatore UV con la superficie rivestita in fotoresist rivolta verso la lampada UV. Esporre i due pezzi separatamente ai raggi UV per 15 s, utilizzando una lampada da 200 W, attraverso una fotomaschera con motivi 1 e 2 per ottenere rispettivamente il flusso e gli strati di controllo.
      ATTENZIONE: Indossare occhiali di sicurezza ed evitare l'esposizione diretta ai raggi UV. Non accendere la luce bianca nella stanza durante questa fase.
    10. Cuocere i due pezzi di silicone esposti con lo strato rivestito rivolto verso l'alto, a 65 °C seguito da 95 °C per 1 min e 10 min rispettivamente. Raffreddare i pezzi a temperatura ambiente prima di procedere al passaggio successivo.
    11. Sviluppare i modelli immergendo i pezzi di silicio nella soluzione di sviluppo photoresist (diluizione 1:3 dello sviluppatore in isopropanolo) per 20 minuti. Una volta che il motivo è visibile, sciacquare i pezzi con alcool isopropilico puro (IPA) e asciugare delicatamente con azoto gassoso (14 psi).
      ATTENZIONE: Utilizzare un ambiente ben ventilato per questo trattamento chimico per evitare l'esposizione umana. Utilizzare la luce bianca solo dopo che le caratteristiche sono state sviluppate e risciacquate con alcool isopropilico.
    12. Tenere i pezzi di silicio in un essiccatore con la superficie rivestita rivolta verso l'alto. Esporre i pezzi ai vapori di silano versando 50 μL di tricloro puro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano su un piccolo bicchiere di plastica o un vetrino. Posizionare la tazza/vetrino all'interno di un essiccatore e incubare per 2 ore.
      ATTENZIONE: Evitare l'esposizione diretta al vapore silano. Utilizzare sempre una camera sigillata per il trattamento con vapori silanici.
      NOTA: Se necessario, i pezzi di silicio sviluppati possono essere conservati per 1-2 giorni prima di procedere alla fase successiva.
  2. Fabbricazione di chip PDMS
    1. Preparare PDMS in un bicchiere di plastica mescolando la base di elastomero con l'agente polimerizzante in un rapporto 10: 1. Mescolare bene il contenuto mescolando continuamente per 3 minuti. La miscelazione creerà molte bolle d'aria nella miscela PDMS.
    2. Degasare la miscela PDMS in un essiccatore per 30 minuti per rimuovere tutte le bolle d'aria.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dalla miscela PDMS prima che venga versata sulle caratteristiche poiché le bolle possono causare dispositivi difettosi e non funzionanti.
    3. Posizionare i wafer di silicio con lo strato di controllo (modello 2) in una capsula di Petri. Versare delicatamente uno strato di miscela PDMS di 5 mm di spessore sul pezzo di silicio evitando la formazione di bolle.
    4. Degasare la miscela PDMS in un essiccatore per rimuovere le bolle aggiuntive che si formano durante il processo di versamento PDMS.
    5. Posizionare il wafer di silicio con strato di flusso (modello 1) sul mandrino dello spinner applicando una pressione del vuoto di 200-500 mTorr per trattenere il wafer. Versare ~ 1 mL di PDMS sul wafer di silicio e rivestirlo usando uno spin coater a 500 giri / min per 5 s seguito da 1.000 giri / min per 30 s per ottenere uno strato spesso ~ 80 μm.
    6. Cuocere i due wafer di silicio con il PDMS rivestito di spin e versare gli strati PDMS a 50 °C in un forno a convezione ad aria calda per 6 h. Dopo la cottura, attendere che i pezzi si raffreddino a temperatura ambiente.
    7. Tagliare lo strato PDMS spesso 5 mm dal pezzo di silicio attorno allo strato di controllo (modello 2) utilizzando una lama affilata e staccarlo dal substrato di silicio.
    8. Perforare due fori di ~ 1 mm di diametro utilizzando un perforatore Harris nel serbatoio del blocco PDMS per collegare il canale di immobilizzazione e le prese del canale di isolamento alle tubazioni del gas per le deflessioni della membrana PDMS.
    9. Posizionare il pezzo di silicone con lo strato PDMS rivestito di spin sul modello 1 (strato di flusso), con la superficie rivestita PDMS rivolta verso l'alto, su un vassoio di plastica. Tenere il blocco PDMS perforato con pattern 2 (strato di controllo) sul vassoio con il lato stampato rivolto verso l'alto.
    10. Tenere il vassoio di plastica all'interno di un detergente al plasma ed esporre le due superfici PDMS a plasma d'aria da 18 W per 2 minuti in basso vuoto (200-600 mTorr). Applicare il vuoto fino a quando la camera diventa viola brillante. Eseguire questo passaggio in condizioni di scarsa illuminazione per vedere il cambiamento di colore del plasma.
    11. Estrarre i due blocchi trattati al plasma e legarli delicatamente premendo insieme le superfici trattate al plasma dei modelli 1 e 2. Cuocere i modelli incollati a 50 °C per 2 ore in forno a convezione ad aria calda.
    12. Estrarre il dispositivo incollato dal forno. Tagliare il dispositivo incollato dal wafer di silicio con pattern 1 e pattern 2 e perforare i fori nei serbatoi di ingresso e uscita dello strato di flusso utilizzando il perforatore Harris.
    13. Posizionare il blocco PDMS incollato con lo strato di flusso rivolto verso l'alto su un vassoio di plastica. Tenere un bicchiere di copertura pulito (# 1.5) sullo stesso vassoio. Esporre i blocchi e il vetro di copertura al plasma d'aria da 18 W per 2 min. Regolare la pressione del vuoto per vedere una camera viola.
      NOTA: questo passaggio deve essere eseguito in condizioni di scarsa illuminazione per vedere il cambiamento di colore del plasma. Per pulire il vetro di copertura, lavarlo con alcool isopropilico e asciugare con azoto gassoso a 14 psi.
    14. Posizionare il blocco PDMS esposto al plasma sopra il vetro di copertura e cuocere la struttura incollata in forno a 50 °C per 2 ore. Conservare il dispositivo in una camera bianca per eventuali esperimenti futuri.

2. Adescamento della membrana PDMS

  1. Prendi il dispositivo e mettilo su uno stereomicroscopio e attacca i tubi. Collegare il tubo micro flex (diametro interno ~ 5 mm, diametro esterno ~ 8 mm) a una linea di gas azoto compresso su un'estremità. Collegare un connettore a tre vie all'altra estremità. I tubi 1 e 2 dei connettori a tre vie saranno collegati rispettivamente alla trappola e alle membrane isolanti.
  2. Collegare due microtubi flessibili (diametro interno ~1,6 mm, diametro esterno ~5 mm) alle due porte di uscita del rubinetto di arresto a tre vie. Collegare l'altra estremità dei due tubi a un ago da 18 G lungo 8 mm.
  3. Riempire lo strato di flusso con tampone M9 utilizzando una micropipetta attraverso la porta di ingresso. Riempire entrambi i tubi con acqua DI attraverso l'estremità collegata all'ago. Inserire i due aghi nei fori perforati, collegando rispettivamente la membrana isolante e quella intrappolante.
  4. Aprire il regolatore del gas azoto a 14 psi e ruotare la valvola a tre vie dal tubo 1 per spingere l'acqua nel dispositivo attraverso i canali microfluidici negli strati di controllo, vale a dire la trappola e le membrane di isolamento.
  5. Attendere che l'acqua riempia il canale senza la presenza di alcuna goccia d'aria in entrambi i canali. Una volta che i canali sono completamente riempiti d'acqua, i canali sono considerati adescati.
  6. Rilasciare la pressione utilizzando il rubinetto a tre vie una volta che i canali sono stati riempiti d'acqua e adescati. L'adescamento può portare a bolle nello strato di flusso, rimuovere le bolle facendo scorrere mezzi aggiuntivi attraverso il canale di flusso.

3. Manutenzione e sincronizzazione di C. elegans

NOTA: Ceppi di C. elegans: Lo studio ha utilizzato i seguenti transgeni PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) per lo sviluppo vulvare 32, jsIs609 (mec7p::MLS(segnale di localizzazione della matrice mitocondriale)::GFP)33 per lo sviluppo del neurone del recettore tattile (TRN) e l'imaging del trasporto dei mitocondri, e wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) per tracciare lo sviluppo PVD34. Il protocollo standard di coltura e mantenimento di C. elegans è stato seguito35.

  1. Coltivare C. elegans sul terreno di crescita dei nematodi (NGM) piastre di Petri con E. coli OP50 come fonte di cibo a 22 °C. Mantenere i ceppi di C. elegans trasferendo ripetutamente alcuni ermafroditi o tagliando una piccola quantità di agar con alcuni animali su una nuova piastra NGM con un prato OP50.
  2. Dopo 3-5 giorni, controllare la piastra NGM per la crescita animale e le uova di C. elegans. Raccogliere e trasferire circa 30 uova da un piatto a un piatto NGM fresco con prato OP50.
  3. Per sincronizzare gli animali per l'imaging, trasferire tutte le uova non schiuse dalla piastra ogni 2 ore a una piastra fresca e mantenerle a 22 °C. Circa 15-20 uova si schiuderanno su ogni piatto.
  4. Scegli gli animali tra 14-16 h e 28-30 h dopo la schiusa rispettivamente per gli stadi larvali 2 (L2) e larvali 3 (L3). Trasferire gli animali al dispositivo microfluidico per l'imaging. Aggiungere cibo come descritto nella sezione successiva per mantenere l'animale all'interno del dispositivo per esperimenti di crescita e imaging a lungo termine.

4. Crescita di C. elegans all'interno del dispositivo microfluidico di crescita e imaging

  1. Montare un dispositivo microfluidico di crescita e imaging su un microscopio invertito e visualizzare il modello 2, dopo aver collegato le membrane di isolamento e la membrana di immobilizzazione, a bassi ingrandimenti (4x o 10x). Assicurarsi che i canali siano riempiti con acqua distillata pulita.
  2. Preparare una soluzione fresca da 1 L di terreno S utilizzando 10 ml di citrato di potassio 1 M pH 6,0, 10 mL di soluzione di metalli in tracce, 3 ml di 1 M CaCl2, 3 mL di 1 M MgSO4. Preparare la soluzione in condizioni sterili. Non autoclavare il mezzo S.
  3. Riempire il canale di flusso con il mezzo di crescita (S medium) 10 minuti prima dell'esperimento. Evitare bolle d'aria nel canale di flusso. Far scorrere il mezzo aggiuntivo se necessario per rimuovere le bolle d'aria.
  4. Prelevare un singolo animale dalla fase di sviluppo richiesta da una piastra NGM in 10 μL di mezzo S utilizzando una micropipetta e spingere l'animale nel canale di flusso attraverso il foro di ingresso.
  5. Monitorare la posizione dell'animale nel canale di flusso utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. Far scorrere il mezzo aggiuntivo attraverso l'ingresso o l'uscita per spingere l'animale e posizionarlo all'interno del canale di flusso ristretto tra le due membrane di isolamento.
  6. Aprire il rubinetto di arresto a tre vie per applicare una pressione di 14 psi nei canali di isolamento e spingere le membrane verso il basso nel canale di flusso.
    NOTA: La membrana sigilla parzialmente il canale di flusso e limita il movimento degli animali alla regione tra le due membrane di isolamento.
  7. Utilizzare una singola colonia di E. coli OP50 da una piastra striata per inoculare 250 ml di brodo L (2,5 g bacto-triptone, 1,25 g bacto-lievito, 1,25 g NaCl in H2O). Coltivare la coltura inoculata durante la notte a 37 °C.
  8. Aliquot 500 μL di coltura OP50 in provette sterili da centrifuga da 1,5 mL e conservare il materiale madre e l'aliquota per 2 settimane a 4 °C.
  9. Pellet in coltura OP50 mediante centrifugazione a 1,3 x g per 5 min. Sciogliere il pellet con 1 mL di terreno S fresco (diluizione 0,5x) e conservarlo a temperatura ambiente per 3-4 giorni. Utilizzare questo OP50 diluito per alimentare C. elegans all'interno di dispositivi microfluidici.
  10. Lasciare una goccia di mezzo S sopra i serbatoi di ingresso e uscita per ridurre l'evaporazione del mezzo S nel canale di flusso.
  11. Assumere una soluzione di OP50 diluita in una micropipetta da 10 μL. Rimuovere la micropunta riempita con la soluzione OP50 dalla pipetta e inserire la punta nel serbatoio di ingresso. Quindi posizionare un'altra punta di micropipetta con 10 μL di soluzione alimentare e inserirla nel serbatoio di uscita.
  12. Sigillare la testa della punta esercitando pressione utilizzando un dito per garantire la continuità delle soluzioni alimentari senza alcun traferro. Cambiare la punta della micropipetta con la soluzione OP50 ogni giorno che non è più vecchia di 3-4 giorni.
  13. Riempire altri 20-30 μL di soluzione alimentare in entrambe le punte. Aggiungere o rimuovere la soluzione alimentare da e verso la punta della micropipetta per regolare il gradiente per spingere l'animale nel canale di flusso e per regolare la posizione dell'animale sotto la membrana di intrappolamento per l'imaging.
  14. Monitorare il flusso di batteri per assicurarsi che sia continuo attraverso le membrane di isolamento parzialmente chiuse nel canale di flusso utilizzando immagini a campo chiaro.
    NOTA: In assenza di flusso batterico, gli animali potrebbero mangiare i batteri disponibili nel canale di flusso tra le due membrane di isolamento. In caso di assenza di batteri o di flusso nel canale, sostituire le due punte delle micropipette all'ingresso e all'uscita con nuove punte per pipette riempite con alimenti preparati al momento.

5. Immobilizzazione e imaging di C. elegans

  1. Immobilizzazione di C. elegans sotto la membrana di intrappolamento
    1. Individua un singolo animale nel canale di crescita a bassi ingrandimenti. Regolare le altezze della soluzione alimentare nelle due punte di micropipette collegate ai serbatoi di ingresso e di uscita. Spingere l'animale nella direzione richiesta utilizzando le differenze di pressione idrostatica nel canale di flusso.
    2. Posizionare l'animale al centro della membrana di intrappolamento e monitorare il suo comportamento di nuoto utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (4x).
    3. Ruotare il rubinetto a tre vie per aumentare lentamente la pressione nel canale di trappola. Immobilizzare l'animale sotto la membrana della trappola in una postura diritta lungo la parete di confine del canale di crescita.
      ATTENZIONE: Evitare di intrappolare l'animale attraverso il canale di flusso in posizione di piegatura Z o U. Ciò fa sì che il corpo animale venga schiacciato con una maggiore pressione e provoca danni permanenti alla sua salute.
  2. C. elegans imaging e rilascio dalla membrana
    1. Trasportare e caricare il dispositivo su un palcoscenico per microscopio. Impostare un microscopio invertito con le impostazioni di imaging desiderate con tutti i componenti ottici necessari (obiettivo, sorgente luminosa, filtri a fluorescenza e un rilevatore) per il campo luminoso ad alta risoluzione, il contrasto di imaging differenziale (DIC) o l'imaging a fluorescenza (Figura supplementare 1).
    2. Acquisire una o più immagini di fluorescenza time-lapse per catturare eventi cellulari e subcellulari.
    3. Acquisire immagini di fluorescenza dei neuroni di C. elegans in funzione del loro sviluppo utilizzando un obiettivo 60x, apertura numerica 1,4 (NA), un laser a lunghezza d'onda 488 nm con potenza laser 7% -10%, una camera CCD, su un microscopio a disco rotante. Eseguire l'imaging time-lapse utilizzando il software fornito con il microscopio e acquisire immagini a una velocità di 4 fotogrammi al secondo (Figura supplementare 1).
    4. Dopo l'acquisizione delle immagini, rilasciare la pressione di intrappolamento e monitorare la locomozione dell'animale a bassi ingrandimenti - 4x e 10x. Mantenere l'animale limitato all'interno della regione definita da membrane isolanti (mantenute sotto i 14 psi per tutto l'esperimento).
    5. Regolare il volume della soluzione alimentare nelle due punte delle micropipette per continuare un lento flusso di cibo guidato dalla gravità nel canale di crescita. Questo flusso di cibo è ottenuto regolando i livelli delle soluzioni alimentari in micropipette all'ingresso e all'uscita (tipicamente 1-5 mm di differenza di altezza).
    6. Visualizza il flusso sotto un campo luminoso dal modello di flusso dei batteri nel canale di crescita.
      NOTA: In assenza di flusso, l'animale mangia i batteri OP50 disponibili, il canale appare libero e l'animale muore di fame per alcune ore. Un animale affamato sviluppa tipicamente un'alta autofluorescenza, facilmente osservabile quando si acquisiscono immagini di fluorescenza time-lapse. Tali eventi hanno effetti dannosi sulla fisiologia animale e sono stati evitati negli esperimenti.
    7. Ripetere i passaggi 5.2.1-5.2.3 dopo un intervallo di tempo predeterminato per acquisire immagini a fluorescenza/DIC/campo luminoso dello stesso individuo in più punti temporali.
    8. Dopo che le immagini sono state acquisite in più punti temporali desiderati dallo stesso singolo animale, rilasciare l'isolamento e la pressione di intrappolamento. Lavare il canale con tampone M9 e spingere l'animale attraverso il serbatoio di ingresso. Recuperare l'animale dal serbatoio e posizionarlo su una piastra NGM fresca per un ulteriore monitoraggio della salute.
    9. Lavare il canale con tampone M9 alcune volte per rimuovere i batteri. Risciacquare il canale di flusso con alcool etilico al 70% (diluito in acqua distillata). Asciugare i canali spingendo l'aria con una siringa. Conservare il dispositivo in un luogo asciutto e privo di polvere per un uso ripetuto in futuro.
  3. Analisi delle immagini e statistiche
    1. Utilizzare il software FIJI ImageJ per l'analisi delle immagini tiff. Immagini tiff aperte delle immagini time-lapse PVD degli animali wdIs51 in Fiji ImageJ. Estrarre i piani migliori dalla pila di piani z che mostrano i processi primari selezionando la scheda Immagine > Stacks > progetto Z.
    2. Esamina l'intera serie di immagini e trova fotogrammi di immagini specifici che coprono con successo l'intero processo neuronale utilizzando sezioni sovrapposte dei fotogrammi delle immagini animali. Selezionare Plugin > Analyze > Cell Counter dalla barra degli strumenti delle FIJI. Questo aprirà una finestra per numerare diversi rami e tenere un conteggio di ogni neurone selezionato.
    3. Selezionare Inizializza contatori > > Type1, quindi contrassegnare i rami secondari. Quindi selezionare Tipo 2 e contrassegnare Quaternario, fare clic sulla finestra Risultati che mostra i conteggi di tutti i rami (Figura supplementare 2). Questo metodo visualizzerà i rami già contati.
    4. Apri l'immagine sovrapposta successiva e conta i rami rimanenti. Questo processo impedirà il doppio conteggio e garantirà che ogni processo venga conteggiato. Identificare e contare il numero totale di rami primari presenti nelle prime fasi larvali di C. elegans. Eseguire analisi simili per le immagini per i processi secondari e quaternari negli animali più anziani.
      NOTA: Gli adulti mostrano molti processi che innervano i muscoli della parete corporea e possono essere difficili da contare. Assicurati che ogni processo venga conteggiato una sola volta.
    5. Calcolare la distanza tra i corpi cellulari PVD negli animali wdIs51 tracciando una linea segmentata dal corpo cellulare PVD (CB) al PVC CB. Per gli animali allo stadio larvale 4 (L4), i corpi cellulari sono molto distanti e non sono nello stesso fotogramma quando vengono ripresi con un obiettivo 60x.
    6. Seleziona le immagini sovrapposte dalla pila per coprire l'intera lunghezza dell'animale dalla testa alla coda utilizzando la scheda Immagine > Stacks > Z project di ImageJ. Disegna linee segmentate lungo il processo neuronale tra i CB PVD e PVC.
    7. Misurare le lunghezze di tutte le linee segmentate utilizzando ImageJ > Analizza > misura. Aggiungi le lunghezze per tutti i segmenti per calcolare la distanza totale tra PVD e PVC CB per ogni punto temporale.
    8. Per la lunghezza dei neuroni dei TRN negli animali jsIs609 , caricare le immagini nelle Fiji. Tracciare una linea segmentata lungo i microtubuli laterali posteriori (PLM; visibili con GFP solubile) dal corpo cellulare al centroide del primo mitocondrio. Calcolare la lunghezza della linea per il primo valore di distanza.
    9. Disegna una linea segmentata dal centro del primo al secondo mitocondrio. Ripeti questo processo per ogni coppia di mitocondri fino alla fine della lunghezza del processo neuronale. Aggiungi tutte le lunghezze per calcolare la lunghezza totale del processo neuronale.
    10. Per l'analisi della linea cellulare, caricare tutte le immagini vulvali nelle Fiji ed estrarre la migliore immagine a fuoco delle cellule dalle immagini time-lapse di più piani z.
    11. Rappresentare i dati come media ± errore standard della media (SEM). Calcola la significatività statistica utilizzando ANOVA unidirezionale per più di due campioni o un test t a due campioni per una coppia di campioni. Indica la significatività con il valore p < 0,05 (*), il valore p < 0,005 (**) e il valore p > 0,05 (ns, non significativo).

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Representative Results

Caratterizzazione del dispositivo: Il dispositivo di crescita e imaging è costituito da due strati PDMS legati insieme (Figura 1) utilizzando legami plasmatici irreversibili. Lo strato di flusso (modello 1) che è lungo 10 mm e alto 40 μm o 80 μm ci consente di coltivare l'animale in coltura liquida (Figura 1A). Lo strato di cattura (modello 2) ha una membrana larga 2 mm (Figura 1B) per immobilizzare l'animale per l'imaging ad alta risoluzione. La maschera per lo strato di intrappolamento crea anche una coppia di membrane di isolamento per limitare il movimento degli animali all'interno di una sezione del canale di flusso tra i successivi punti temporali di imaging. La membrana di intrappolamento del dispositivo è adattata dal nostro precedente dispositivo di imaging3. Il dispositivo attuale (Figura 1C,L) include l'aggiunta di una membrana di isolamento e un aumento della larghezza della membrana di intrappolamento a 2 mm per l'immobilizzazione efficiente dello stesso animale su più punti temporali.

Per testare il dispositivo, l'acqua distillata pulita è stata riempita nei canali microfluidici che collegano le membrane di intrappolamento (Figura 1D, E e Figura supplementare 3) e pressurizzata utilizzando 14 psi di azoto gassoso, utilizzato anche per intrappolare un animale sotto una membrana PDMS spessa 2 mm (Figura 1H, K, L). Un singolo animale è stato prelevato da una piastra NGM utilizzando una micropipetta e caricato nel canale di flusso (Figura 1F). Il canale di crescita è stato riempito con batteri risospesi in S media (Figura 1F,G,I,J). Un flusso costante è stato mantenuto per tutta la durata dell'imaging regolando le altezze dei fluidi nelle punte delle pipette collegate all'ingresso e all'uscita del dispositivo e monitorando l'animale nel canale di flusso tra le due membrane di isolamento. La soluzione OP50 appena preparata è stata riempita quotidianamente nelle punte delle micropipette per garantire una fonte di cibo sana per l'animale all'interno del microcanale. La fonte di alimenti freschi e il materiale PDMS permeabile ai gas garantiscono un sufficiente apporto di ossigeno all'interno del microcanale30,29. La crescita degli animali nel dispositivo è stata monitorata utilizzando marcatori specifici della cellula o marcatori che mostrano la linea cellulare o modelli di espressione cellulare variabili durante lo sviluppo. Gli animali sono stati immobilizzati sotto la membrana di intrappolamento usando gas azoto 14 psi e tenendo i vermi in posizione diritta lungo la parete del canale. L'animale è cresciuto più lentamente all'interno del canale microfluidico rispetto a una piastra NGM23.

Studio della linea cellulare utilizzando il dispositivo di imaging a lungo termine: Per valutare lo sviluppo di C. elegans all'interno del dispositivo microfluidico, abbiamo coltivato il ceppo PS3239 (ZMP-1::GFP)32 con una fornitura costante di cibo per monitorare lo sviluppo della vulva in diversi momenti della loro crescita. ZMP-1 codifica per una metalloproteasi di zinco ed esprime nella cellula di ancoraggio nello stadio L3, nelle cellule vulD e vulE nello stadio L4 e in vulA nel giorno 1 (1D) animali adulti (Figura 2A). I cambiamenti nel modello di espressione rappresentano un esempio di regolazione genica temporale in cui lo stesso gene è espresso in cellule diverse in diversi stadi di sviluppo. Per osservare lo sviluppo vulvare, l'animale è stato prima immobilizzato e la regione vulvare è stata quindi ripresa su più piani z ogni 8-10 ore da L3 in poi fino agli stadi adulti. ZMP-1::GFP è espresso in diverse cellule vulvali a seconda dello stadio di sviluppo (Figura 2B). Le immagini di fluorescenza ad alta risoluzione delle cellule vulvali degli animali che crescono all'interno del dispositivo microfluidico dimostrano il normale sviluppo vulvare e l'espressione e la localizzazione di ZMP-1::GFP sono simili ai precedenti rapporti32.

Monitoraggio dello sviluppo dei neuroni utilizzando un dispositivo di crescita e imaging a lungo termine: Per dimostrare l'uso del dispositivo per l'imaging subcellulare da un singolo animale, è stato monitorato lo sviluppo di due neuroni meccanosensoriali PVD e TRN. Il ceppo NC1686 che esprime wdIs51 che esprime GFP nei due neuroni PVD è stato utilizzato34,36. Ogni neurone PVD mostra un'architettura dendritica ramificata simile a una menorah che comprende processi primari (PP), secondari (SP), terziari (TP) e quaternari (QP) rispettivamente negli stadi di sviluppo L2 (14-16 h), L2 tardivo (20-22 h), L3 (24-26 h) e L4 (36-42 h) (Figura 3). Il corpo cellulare PVD è presente posteriormente alla vulva. Invia un assone e due processi dendritici primari che danno origine a SP e TP, che a loro volta danno origine a rami dendritici QP che innervano i muscoli della parete del corpo. Gli stadi tardivi L3 e L4 mostrano un'arborizzazione elevata37,34. Abbiamo coltivato singoli animali NC1686 all'interno del dispositivo microfluidico e li abbiamo nutriti continuamente con cibo batterico. Gli animali sono stati immobilizzati durante la fase di sviluppo L2 fino a 1D e i neuroni PVD sono stati ripetutamente ripresi ogni 8-12 ore utilizzando 60x, 1,3 NA obiettivo di olio per contare il numero di rami SP, TP e QP in tre dimensioni. L'entità della ramificazione è aumentata durante lo sviluppo, come mostrato nella Figura 3B. Il numero di SP e QP nelle diverse fasi dello sviluppo del verme è aumentato con l'età (Figura 4A), come è stato visto in studi precedenti37. Gli animali L2 hanno mostrato 10 ± 3,8 (n = 9) SP ma nessun QP, quando misurati utilizzando il dispositivo (Figura 4A). Abbiamo inserito C. elegans in una goccia di 3 mM levamisole, un anestetico che provoca la contrazione del muscolo della parete corporea e la paralisi, per ridurre al minimo gli effetti avversi sul trasporto degli organelli, riducendo i movimenti degli animali e causando una paralisi sufficiente, necessaria per l'imaging ad alta risoluzione 3,4. I valori SP (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) non erano significativamente diversi quando misurati da animali simili allevati su piastre NGM e ripresi utilizzando 3 mM di levamisolo su un vetrino di agar (Figura 4B). I dati suggeriscono che l'immobilizzazione del dispositivo consente l'imaging ad alta risoluzione di architetture neuronali complesse e non influisce sul loro sviluppo. Gli animali in stadio L3 hanno un piccolo numero di QP che aumenta di numero con lo sviluppo. Gli adulti 1D hanno mostrato 67 ± 2,8 QP (n = 5) negli animali cresciuti nel dispositivo. Studi precedenti hanno dimostrato la formazione e una retrazione dei processi PVD durante lo sviluppo noto come auto-evitamento, dove riducono il loro numero di rami38. La riduzione di SP a 51 h (1D) dopo la schiusa potrebbe essere il risultato di tali retrazioni. Gli animali che crescono su piastre NGM e ripresi utilizzando levamisolo 3 mM hanno mostrato una tendenza simile al numero di ramificazioni per stadi di sviluppo comparabili (Figura 4A,B). Inoltre, la distanza tra i due corpi cellulari in PVC, uno presente nella coda e il secondo presente vicino alla vulva, aumenta man mano che si allontanano negli animali cresciuti nel dispositivo o in quelli cresciuti su piastre NGM (Figura 4C, D). Durante tutto il processo di imaging, gli animali sono rimasti sani e hanno potuto deporre le uova anche dopo che gli animali sono stati immobilizzati sotto la membrana ripetutamente per questo lungo periodo.

Usando questo dispositivo, siamo stati in grado di immobilizzare l'animale nello stesso orientamento e visualizzare lo stesso neurone e la sua architettura ad alta risoluzione anche con una debole espressione GFP. Per dimostrare l'utilità della nostra tecnologia di crescita e immobilizzazione, lo sviluppo dei TRN da L3 ad adulti è stato ripreso utilizzando animali jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP). I TRN posteriori sono presenti sul lato laterale del corpo e sono chiamati PLMR e PLML che corrispondono ai lati destro e sinistro dell'animale. Abbiamo ripreso gli stessi animali che crescono nel chip microfluidico e li abbiamo immobilizzati a intervalli di 12-14 ore. Il montaggio rappresenta l'intero processo neuronale PLMR in punti temporali successivi evidenziando sia i mitocondri che il processo neuronale (Figura 5A). La lunghezza totale del processo neuronale è stata calcolata ed è risultata aumentare con una pendenza di 10,4 μm per h (Figura 5B). Questo tasso di aumento della lunghezza del processo neuronale concorda con un precedente rapporto di ~10 μm/h 18,31,39,40,41. Abbiamo anche osservato l'aggiunta di nuovi mitocondri nel processo di crescita e il cambiamento nella posizione del punto di ramificazione sinaptica rispetto al corpo cellulare come riportato in precedenza23.

Figure 1
Figura 1: Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di C. elegans. (A) Lo strato di flusso è costituito da un canale microfluidico lungo 10 mm (modello 1) in un sottile strato PDMS. (B) Lo strato di intrappolamento è costituito da un canale di immobilizzazione spesso 2 mm e da una coppia di canali di isolamento sottili nello strato PDMS alla rinfusa. (C) I due strati PDMS sono legati insieme insieme a un sottile vetro di copertura per realizzare il dispositivo. (D, E) I canali di controllo dell'intrappolamento e dell'isolamento sono riempiti con acqua deionizzata (DI), sotto azoto compresso (N2) gassoso. (F) I C. elegans sincronizzati per età vengono prelevati dalle piastre NGM e caricati all'interno dello strato di flusso del dispositivo. (G) Il cibo viene fornito utilizzando due punte di micropipette nei serbatoi di ingresso e di uscita. (H) Gli animali sono liberi di muoversi all'interno dei due canali di isolamento e sono intrappolati sotto la membrana di immobilizzazione. (I) Immagine del dispositivo di crescita e imaging con alimentazione alimentare attraverso due punte di micropipette. (J, K) Immagini di un C. elegans che si muove liberamente e immobilizzato all'interno del canale microfluidico. La barra della scala è di 1 mm (I) e 200 μm (J, K). (L) Schema della sezione trasversale del dispositivo che mostra le altezze del canale di flusso (FC), della membrana PDMS (M) e del canale di controllo (CC). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Tracciamento dell'espressione di un marcatore vulvare in C. elegans che si sviluppa all'interno del dispositivo. (A) Schema delle cellule vulvali che esprimono ZMP-1::GFP negli animali PS3239 durante lo sviluppo. Il segnale GFP appare nella cella di ancoraggio allo stadio L3, nelle cellule vulD e vulE allo stadio L4 e nelle cellule vulA allo stadio 1D adulto. (B) Immagini di animali PS3239 che crescono all'interno del chip microfluidico e immobilizzati ogni 8-10 ore per catturare immagini di fluorescenza dell'espressione di ZMP-1::GFP durante lo sviluppo vulvare da L3, L4 e 1 giorno (1D) adulto. Abbreviazioni: AC = cella di ancoraggio, A = vulA, D = vulD, E = vulE. La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Imaging di singoli wdIs51 C. elegans per monitorare lo sviluppo neuronale PVD. (A) Schema della crescita dei neuroni PVD e dell'arborizzazione dendritica dallo stadio L2 a L4. Il cerchio verde mostra il corpo della cellula PVD (CB, freccia gialla). I dendriti mostrano l'emergere di processi primari (PP) a L2 sia dal lato anteriore che posteriore del CB, processi secondari (SP) durante la tarda L2, processi terziari (TP) in L3 e processi quaternari (QP) durante gli stadi L4. (B) Immagini di neuroni PVD di animali che crescono all'interno di un dispositivo microfluidico. (C) Immagini di neuroni PVD di animali cresciuti su una piastra NGM e immobilizzati con 3 mM di levamisolo (Lev). La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Confronto dello sviluppo di PVD in animali cresciuti con dispositivi e animali cresciuti su piastre NGM. (A) Il numero medio di processi secondari (SP) e processi quaternari (QP) degli stessi animali che crescono all'interno del dispositivo microfluidico. I valori sono calcolati a 16 h (L2), 24 h (L3), 36 h (L4 precoce), 42 h (L4 tardivo) e 51 h (1D adulto). (B) Il numero medio di SP e QP provenienti da un diverso lotto di animali che crescono su piastre NGM e anestetizzati con 3 mM di levamisolo. (C) Separazione media tra i due corpi cellulari neuronali PVD dallo stesso animale che cresce nel dispositivo microfluidico. (D) Separazione media da diversi gruppi di animali che crescono su piastre NGM e anestetizzati con 3 mM di levamisolo. Dati rappresentati come media ± SEM (n ≥ 10 per il levamisolo 3 mM e n ≥ 6 per gli animali immobilizzati dal dispositivo). Le rilevanze statistiche sono calcolate da ANOVA unidirezionale e indicate come valore p < 0,05 (*), valore p < 0,005 (**) e valore p > 0,05 (ns). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Imaging ad alta risoluzione dei neuroni del recettore tattile (TRN) da animali che crescono all'interno del dispositivo microfluidico. (A) Montaggio di processi neuronali da un singolo animale ripreso in momenti diversi. Il corpo cellulare (CB, freccia), il punto di diramazione sinaptica (BP, punta di freccia) e la punta del neurone (Tip, freccia su) sono etichettati. Il processo neuronale e la posizione di ciascun mitocondrio vengono tracciati manualmente utilizzando le Fiji. La barra della scala è di 10 μm. (B) Lunghezza media del processo neuronale in diversi punti temporali di imaging. Dati rappresentati come media ± SEM (n = 8). La significatività statistica è calcolata utilizzando ANOVA unidirezionale e indicata come valore p < 0,005 (**) e valore p > 0,05 (ns). Un'equazione di regressione è adatta con una pendenza di 10,4 μm di allungamento del processo neuronale all'ora, R2 = 0,9425. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Schermate delle impostazioni del microscopio per l'imaging a fluorescenza di C. elegans. (A) Un pannello del software di analisi delle immagini mostra le sezioni evidenziate per impostare la velocità di scansione, il set di filtri e l'obiettivo per l'imaging. (B) Il software viene quindi utilizzato per scegliere il laser a 488 nm con il 7% della potenza laser completa. (C) Il software di analisi delle immagini può prendere un singolo fotogramma o una serie di immagini time-lapse e memorizzarle per analisi future. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Schermate del software FIJI che mostrano le fasi di analisi per il conteggio dei rami PVD negli animali wdIs51 . (A) Mostra l'immagine PVD aperta nel software Fiji ImageJ e il collegamento al plug-in del contatore di celle. (B) Finestra del contatore di celle per inizializzare il contatore per un'immagine. (C) Selezione dei contatori per contrassegnare i rami inclusi ed evitare il conteggio multiplo. (D) Finestra dei risultati che mostra il numero totale di filiali in ciascuna categoria. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Schema del dispositivo di crescita e imaging. Due punte di micropipette, riempite con diversi volumi di soluzione alimentare batterica (gialla), vengono inserite nei punzoni di ingresso e uscita del canale di flusso nello strato inferiore. La differenza nelle altezze delle soluzioni alimentari nelle punte fa sì che la soluzione fluisca all'interno del canale che a sua volta fornisce batteri all'animale per la sua crescita. I canali di intrappolamento e isolamento (blu) vengono riempiti con acqua distillata e compressi utilizzando una fornitura di azoto gassoso (fissato a 14 psi). Il canale di isolamento è sempre collegato a 14 psi. La pressione sulla membrana di intrappolamento viene commutata tra 0 (l'animale è libero di muoversi e nutrirsi) e 14 psi (l'animale è immobilizzato per l'imaging ad alta risoluzione) utilizzando un connettore a tre vie. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

In questo articolo, è stato descritto un protocollo per la fabbricazione e l'uso di un semplice dispositivo microfluidico per la crescita di C. elegans con costante approvvigionamento di cibo e imaging ad alta risoluzione di un singolo animale durante il suo sviluppo. Questo processo di fabbricazione è semplice e può essere eseguito in un ambiente non sterile. Un ambiente privo di polvere è fondamentale durante le fasi di fabbricazione. La presenza di particelle di polvere porterebbe a un contatto improprio tra le due superfici di legame, con conseguente scarso incollaggio e perdita del dispositivo durante l'applicazione ad alta pressione mentre C. elegans è immobilizzato. Di tutti i dispositivi fabbricati, il 95% dei dispositivi sono adatti per esperimenti. Un piccolo numero di dispositivi si guasta (5%) a causa di un legame inappropriato durante la fabbricazione o l'uso. Il fallimento nell'incollaggio può essere ridotto eseguendo il processo di fabbricazione all'interno di una camera bianca priva di polvere (> camera bianca di 1.000 gradi) disponibile presso diverse istituzioni accademiche in tutto il mondo. Per pulire il cibo batterico dal canale di flusso e consentire il riutilizzo del dispositivo, sciacquare il dispositivo facendo scorrere alcol attraverso di esso dopo ogni esperimento.

Il protocollo dimostra un processo di fabbricazione della litografia con un design semplice che può essere facilmente modificato per diverse fasi di sviluppo e dimensioni di C. elegans. Inoltre, il design di questo dispositivo può essere adattato per altri organismi modello come zebrafish e Drosophila, aumentando le dimensioni del flusso e intrappolando gli strati3 per osservare una varietà di processi di sviluppo e subcellulari. In questo protocollo, due diverse altezze del canale dello strato di flusso - 40 μm e 80 μm - sono state utilizzate per l'immobilizzazione completa e il tracciamento delle caratteristiche cellulari e subcellulari in diversi stadi di sviluppo di C. elegans come appropriato per le loro dimensioni corporee. Ad esempio, l'arborizzazione dendritica nei neuroni sensoriali PVD inizia nelle prime fasi L2 e continua fino allo stadio L4. Questo è stato ripreso in un dispositivo con uno strato di flusso elevato di 40 μm. Poiché i neuroni PVD formano dendriti che innervano i muscoli della parete del corpo, è necessario il sezionamento ottico per quantificare i processi in 3D. L'analisi quantitativa delle pergole dendritiche richiede l'immobilizzazione completa degli animali all'interno del dispositivo che corrisponde al diametro corporeo. Tuttavia, per monitorare lo sviluppo vulvare, è stata utilizzata un'altezza di 80 μm dello strato di flusso per tracciare le linee vulvari. Per la lunghezza dei TRN e l'imaging dei mitocondri, abbiamo ripreso gli stadi da L2 a L4 utilizzando dispositivi con uno spessore dello strato di flusso di 40 μm. L'utilizzo di un dispositivo con l'altezza sbagliata causerà difficoltà nell'immobilizzazione. Ad esempio, piccoli animali (L2 o primi stadi L3) all'interno di un dispositivo di altezza dello strato di flusso di 80 μm consentiranno agli animali di capovolgersi all'interno del dispositivo e mostreranno un'immobilizzazione incompleta anche dopo che la membrana di intrappolamento è sotto pressione di 14 psi. D'altra parte, gli animali con grandi diametri corporei (oltre la fine di L4) non entrano facilmente all'interno di un dispositivo con un'altezza dello strato di flusso di 40 μm. Intrappolare animali di grandi dimensioni in piccoli dispositivi ad alta pressione può danneggiare il loro corpo. L'applicazione del dispositivo attuale con uno strato di flusso di 40 μm è limitata e non adatta per l'imaging ad alta risoluzione di animali larvali molto giovani (come gli animali allo stadio L1 di età inferiore a 10 ore dopo la schiusa) in quanto non sono completamente immobilizzati sotto la membrana. A causa delle piccole dimensioni del corpo, gli animali larvali di piccole dimensioni continuano a muoversi e occasionalmente sfuggono alla trappola quando sono eccitati con la luce laser. Per gli animali in stadio L1, è possibile eseguire immagini a campo luminoso o fluorescenza a bassa risoluzione utilizzando obiettivi 4x o 10x e brevi tempi di esposizione della fotocamera. Come approccio alternativo, sarà necessario un nuovo dispositivo di strato di flusso con < altezza di 20 μm per immobilizzare completamente i giovani stadi larvali C. elegans.

Il monitoraggio dei fenomeni di sviluppo nello stesso animale su una lunga scala temporale utilizzando l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione può comportare un aumento dell'autofluorescenza. Ogni test di imaging time-lapse richiede l'ottimizzazione dell'intensità di eccitazione, del tempo di esposizione, dell'intervallo di tempo di imaging, del tempo di recupero degli animali e della qualità del cibo per informazioni sullo sviluppo fisiologicamente rilevanti dagli studi di C. elegans. Abbiamo selezionato > intervallo di tempo di 3 ore per studi sullo sviluppo quando si utilizzano animali dagli stadi L4 in poi. Il dispositivo è in grado di acquisire immagini più frequenti (ogni 5-10 minuti per alcune ore) o più fotogrammi al secondo (per < 1 ora) per studiare altri processi dinamici come il trasporto e la distribuzione degli organelli nei neuroni C. elegans 3,23. L'intrappolamento e l'imaging delle prime fasi di sviluppo richiedono un'osservazione più attenta poiché l'intrappolamento ripetuto con brevi intervalli di tempo senza recupero completo può influire sulla loro salute. Durante gli esperimenti, è stato riscontrato che gli animali che hanno richiesto un'alta pressione per spostarli nello strato di flusso mostrano cattive condizioni di salute e più autofluorescenza nel tempo. Gli animali con alta fluorescenza corporea, noti per essere associati a un alto livello di stress, sono stati evitati per gli studi di imaging. Per mantenere una buona fisiologia, gli animali sono stati intrappolati in una posizione diritta adiacente alla parete del canale. L'immobilizzazione degli animali con il loro corpo attraverso la larghezza del canale è stata evitata poiché gli animali si ammalano dopo che il loro corpo è schiacciato sotto una pressione di 14 psi in questa posizione. Per mantenere un buon rapporto segnale-rumore durante le immagini ripetute con obiettivi a olio, il vetrino di copertura deve essere pulito correttamente dopo ogni punto temporale. A seguito di particolare attenzione durante il processo di fabbricazione del dispositivo e la sua applicazione, gli stessi dispositivi potrebbero essere riutilizzati in diverse sessioni di imaging.

Questo dispositivo potrebbe essere utile per studi che utilizzano mutanti che potrebbero essere sensibili agli anestetici. L'approccio presentato può eliminare gli effetti anestetici avversi sulla crescita e sulla fisiologia per facilitare l'osservazione dei difetti morfologici, funzionali e comportamentali negli animali per un lungo periodo. Il dispositivo è facile da fabbricare e può essere installato in qualsiasi laboratorio per affrontare questioni biologiche a lungo termine sullo sviluppo / cellulare in C. elegans che richiedono imaging intermittente ad alta risoluzione.

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Disclosures

S.M. e S.P.K. sono autori di un brevetto in corso sul dispositivo di crescita e imaging microfluidico (numero di domanda di brevetto 640/CHE/2011).

Acknowledgments

Si ringrazia CIFF imaging facility, NCBS per l'utilizzo dei microscopi confocali supportati dal DST - Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005). Ringraziamo i finanziamenti per la ricerca di DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disco rotante supportato da DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK e Gautam Menon) e HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK). I ceppi HB101, PS3239 e wdIs51 sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). S.P.K. ha realizzato jsIs609 nel laboratorio di Mike Nonet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingegneria Numero 182 C. elegans chip microfluidico crescita su chip imaging a lungo termine imaging neuronale linea cellulare vulva
Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

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