Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En enkel mikrofluidisk chip for langsiktig vekst og avbildning av Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Protokollen beskriver en enkel mikrofluidisk chipdesign og mikrofabrikasjonsmetodikk som brukes til å dyrke C. elegans i nærvær av kontinuerlig matforsyning i opptil 36 timer. Vekst- og bildebehandlingsenheten muliggjør også intermitterende langsiktig høyoppløselig avbildning av cellulære og subcellulære prosesser under utvikling i flere dager.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vist seg å være et verdifullt modellsystem for å studere utviklings- og cellebiologiske prosesser. Å forstå disse biologiske prosessene krever ofte langsiktig og gjentatt avbildning av det samme dyret. Lang gjenopprettingstid forbundet med konvensjonelle immobiliseringsmetoder gjort på agarputer har skadelige effekter på dyrehelsen, noe som gjør det upassende å gjentatte ganger avbilde det samme dyret over lange perioder. Dette papiret beskriver en mikrofluidisk chipdesign, fabrikasjonsmetode, on-chip C. elegans dyrkingsprotokoll og tre eksempler på langsiktig bildebehandling for å studere utviklingsprosesser hos individuelle dyr. Brikken, produsert med polydimetylsiloksan og bundet på et dekselglass, immobiliserer dyr på et glasssubstrat ved hjelp av en elastomer membran som avbøyes ved hjelp av nitrogengass. Fullstendig immobilisering av C. elegans muliggjør robust time-lapse-avbildning av cellulære og subcellulære hendelser på en bedøvelsesfri måte. En kanalgeometri med stort tverrsnitt gjør at dyret kan bevege seg fritt innenfor to delvis forseglede isolasjonsmembraner som tillater vekst i kanalen med kontinuerlig matforsyning. Ved hjelp av denne enkle brikken kan avbildning av utviklingsfenomener som nevronprosessvekst, vulvalutvikling og dendritisk arborisering i PVD-sensoriske nevroner, etter hvert som dyret vokser inne i kanalen, utføres. Den langsiktige vekst- og bildebrikken opererer med en enkelt trykkledning, ingen eksterne ventiler, billige fluidiske forbruksvarer, og benytter standard ormhåndteringsprotokoller som enkelt kan tilpasses av andre laboratorier ved hjelp av C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans har vist seg å være en kraftig modellorganisme for å studere cellebiologi, aldring, utviklingsbiologi og nevrobiologi. Fordeler som gjennomsiktig kropp, kort livssyklus, enkelt vedlikehold, et definert antall celler, homologi med flere menneskelige gener og godt studert genetikk har ført til at C. elegans har blitt en populær modell både for grunnleggende biologiske funn og anvendt forskning 1,2. Å forstå cellens biologiske og utviklingsprosesser fra gjentatt langsiktig observasjon av individuelle dyr kan vise seg å være gunstig. Konvensjonelt er C. elegans bedøvet på agarputer og avbildet under mikroskopet. Bivirkninger av anestetika på dyrs helse begrenser bruken av bedøvede dyr for langsiktig og gjentatt intermitterende avbildning av samme dyr 3,4. Nylige fremskritt innen mikrofluidiske teknologier og deres tilpasning for bedøvelsesfri fangst av C. elegans med ubetydelige helsefarer muliggjør høyoppløselig avbildning av det samme dyret over kort og lang tid.

Mikrofluidiske chips er designet for C. elegans'5 høy gjennomstrømningsscreening 6,7,8, fangst og dispensering9, narkotikascreening 10,11, nevronstimulering med høyoppløselig bildebehandling 12 og høyoppløselig avbildning av dyret 12,13,14. Ultratynne mikrofluidiske ark for immobilisering på lysbilder er også utviklet15. Langsiktige studier av C. elegans har blitt utført ved hjelp av lavoppløselige bilder av dyr som vokser i flytende kultur for å observere vekst, kalsiumdynamikk, narkotikaeffekter på deres oppførsel16,17,18,19, deres levetid og aldring20. Langsiktige studier ved bruk av høyoppløselig mikroskopi har blitt utført for å vurdere synaptisk utvikling21, neuronal regenerering 22 og mitokondriell addisjon23. Langsiktig høyoppløselig bildebehandling og sporing av celleskjebne og differensiering er gjort i flerkanalsenheter24,25. Flere cellulære og subcellulære hendelser forekommer over tidsskalaene på flere timer og krever fangst av samme individ på forskjellige tidspunkter under utviklingen for å karakterisere alle mellomliggende trinn i prosessen for å forstå cellulær dynamikk in vivo. For å avbilde biologisk prosess som organogenese, nevronutvikling og cellemigrasjon, må dyret immobiliseres i samme retning på flere tidspunkter. Vi har tidligere publisert en protokoll for høyoppløselig avbildning av C. elegans i over 36 timer for å bestemme hvor mitokondrier tilsettes langs berøringsreseptorneuronene (TRN)23.

Dette papiret gir en protokoll for å etablere en mikrofluidikkbasert metodikk for gjentatt høyoppløselig bildebehandling. Denne enheten, med en enkelt strømningskanal, er best egnet for gjentatt avbildning av et enkelt dyr per enhet. For å forbedre gjennomstrømningen og avbildet mange dyr samtidig, kan flere enheter kobles til samme trykkledning, men med separate treveiskontakter som styrer et enkelt dyr i hver enhet. Designet er nyttig for studier som krever høyoppløselige time-lapse-bilder som postembryonale utviklingsprosesser, cellemigrasjon, organell transport, genuttrykksstudier, etc. Teknologien kan være begrensende for noen applikasjoner som levetid og aldringsstudier som krever parallell vekst og avbildning av mange senfasedyr. Polydimetylsiloksan (PDMS) elastomer ble brukt til fremstilling av denne enheten på grunn av biostabilitet26, biokompatibilitet 27,28, gasspermeablilitet 29,30 og justerbar elastisk modul 31. Denne tolagsinnretningen tillater vekst av dyr med kontinuerlig matforsyning i en mikrofluidisk kanal og fangst av individuelle C. elegans via PDMS-membrankompresjon ved bruk av nitrogengass. Denne enheten er en utvidelse av den tidligere publiserte enheten med fordelen av å dyrke og avbilde det samme dyret i mikrokanalen under en kontinuerlig matforsyning3. Det ekstra isolasjonsmembrannettverket og en 2 mm bred fangstmembran muliggjør effektiv immobilisering av utviklende dyr. Enheten har blitt brukt til å observere nevronutvikling, vulvalutvikling og dendritisk arborisering i sensoriske PVD-nevroner. Dyrene vokser uten negative helseeffekter i enheten og kan gjentatte ganger immobiliseres for å lette avbildning av subcellulære hendelser i samme dyr under utviklingen.

Hele protokollen er delt inn i fem deler. Del 1 beskriver enhetsfabrikasjon for vekst- og bildebrikken. Del 2 beskriver hvordan man setter opp et trykksystem for PDMS-membranavbøyningen for å immobilisere og isolere individuelle C. eleganer. Del 3 beskriver hvordan du synkroniserer C. elegans på en nematode vekstmedium (NGM) plate for enhetsavbildning. Del 4 beskriver hvordan du laster et enkelt dyr i enheten og vokser dyret inne i mikrofluidisk enhet i flere dager. Del 5 beskriver hvordan man immobiliserer et enkelt dyr på flere tidspunkter, tar bilder med høy oppløsning ved hjelp av forskjellige mål, og analyserer bildene ved hjelp av Fiji.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabrikasjon av vekst- og bildebehandlingsenhet

  1. SU8 mugg fabrikasjon
    1. Design mønstre 1 (flytlag) og 2 (kontrolllag) ved hjelp av rektangulære former i et tekstbehandlingsprogram (eller en datamaskinstøttet design CAD-programvare) og skriv ut fotomaskene ved hjelp av en laserplotter med en minimum funksjonsstørrelse på 8 μm på polyesterbasert film (figur 1).
    2. Skjær silikonskiver i 2,5 cm × 2,5 cm stykker og rengjør dem med 20% KOH i 1 min. Skyll waferne i avionisert (DI) vann. Bruk én wafer hver for flyten og kontrolllaget.
      FORSIKTIG: KOH er etsende og bør håndteres med forsiktighet.
    3. Tørk bitene med 14 psi komprimert nitrogengass etterfulgt av dehydrering på en kokeplate ved 120 °C i 4 timer. Før du går videre til neste trinn, avkjøl de to stykkene ned til romtemperatur.
    4. Ta en av silisiumbitene og legg den på chucken til en spinnbelegger og slå på vakuumet for å holde waferen på plass. På silisiumstykket legger du ~ 20 μL heksametyldisilane (HMDS) og belegger den med spinnbelegget ved 500 rotasjon per min (rpm) i 5 s etterfulgt av 3,000 o / min i 30 s.
      FORSIKTIG: Dette trinnet skal utføres i gult lys. Ikke bruk hvitt lys i rommet.
    5. For å få en jevn fotoresisttykkelse på ~ 40 μm (spesifikk for strømningslaget, egnet for avbildning av dyr i tidlig larvestadium 1 til stadium 3 (L1 - L3), belegg silisiumskiven med ~ 1,5 ml negativ fotoresist-1 ved hjelp av en spinnbelegger ved 500 o / min i 5 s etterfulgt av 2,000 o / min i 30 s.
    6. Gjenta trinn 1.1.4 og 1.1.5 med den andre waferen for å oppnå en jevn fotoresisttykkelse på ~ 40 μm som er spesifikk for kontrolllaget.
    7. Alternativt, for å øke tykkelsen på strømningslaget til ~ 80 μm for eldre dyr, belegg silisiumskiver med ~ 1,5 ml negativ fotoresist-2 ved å bruke spinnbeleggeren ved 500 o / min i 5 s etterfulgt av 2,000 o / min i 30 s. Denne tykkelsen er egnet for L3-scenen til voksne dyr.
      FORSIKTIG: Hold silisiumskivene ved siden av dem for å unngå skade på de spinnbelagte lagene. Hold hvite lys slått av i løpet av dette trinnet.
    8. Stek de fotoresistbelagte silisiumbitene (for strømnings- og kontrolllag) på en kokeplate ved 65 °C i 1 min etterfulgt av 95 °C i 10 min. Avkjøl de bakte bitene til romtemperatur.
      MERK: De bakte silisiumbitene kan lagres i en dag før du går videre til neste trinn. Oppbevares i mørket og skal ikke utsettes for hvitt lys.
    9. Sett mykbakte silisiumstykker på eksponeringstrinnet til UV-belysningen med den fotoresistbelagte overflaten vendt mot UV-lampen. Utsett de to delene separat for UV i 15 s, ved hjelp av en 200 W lampe, gjennom en fotomaske med mønster 1 og 2 for å få henholdsvis flyt og kontrolllag.
      FORSIKTIG: Bruk vernebriller og unngå direkte eksponering for UV-lys. Ikke slå på hvitt lys i rommet i løpet av dette stadiet.
    10. Stek de to eksponerte silikonbitene med belagt lag vendt opp, ved 65 °C etterfulgt av 95 °C i henholdsvis 1 og 10 min. Avkjøl bitene til romtemperatur før du går videre til neste trinn.
    11. Utvikle mønstrene ved å suge silisiumbitene i fotoresistutviklerløsningen (1: 3 fortynning av utvikleren i isopropanol) i 20 minutter. Når mønsteret er synlig, skyll bitene med ren iso-propylalkohol (IPA) og tørk forsiktig med nitrogengass (14 psi).
      FORSIKTIG: Bruk et godt ventilert miljø for denne kjemiske behandlingen for å unngå menneskelig eksponering. Bruk hvitt lys først etter at funksjonene er utviklet og skyllet med IPA.
    12. Hold silisiumbitene i en tørkemaskin med den belagte overflaten vendt opp. Utsett bitene for silandamp ved å helle 50 μL ren triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan på en liten plastkopp eller et glassglass. Plasser koppen/lysbildet inne i en tørkemaskin og rug i 2 timer.
      FORSIKTIG: Unngå direkte eksponering for silandamp. Bruk alltid et forseglet kammer for silandampbehandling.
      MERK: Om nødvendig kan de utviklede silisiumbitene lagres i 1-2 dager før du går videre til neste trinn.
  2. Fabrikasjon av PDMS-brikker
    1. Lag PDMS i en plastkopp ved å blande elastomerbasen med herdemiddelet i et 10: 1-forhold. Bland innholdet godt ved å røre konstant i 3 minutter. Blandingen vil skape mange luftbobler i PDMS-blandingen.
    2. Degas PDMS blandes i en tørkemaskin i 30 minutter for å fjerne alle luftbobler.
      FORSIKTIG: Forsikre deg om at luftbobler fjernes fra PDMS-blandingen før den helles på funksjonene, siden bobler kan forårsake defekte og ikke-funksjonelle enheter.
    3. Plasser silikonskivene med kontrolllaget (mønster 2) i en petriskål. Hell forsiktig et 5 mm tykt PDMS-blandingslag på silisiumstykket og unngå bobledannelse.
    4. Degas PDMS blandes i en tørkemaskin for å fjerne ytterligere bobler som dannes under PDMS-helleprosessen.
    5. Plasser silisiumskiven med strømningslag (mønster 1) på spinneren chuck med 200-500 mTorr vakuumtrykk for å holde waferen. Hell ~ 1 ml PDMS på silisiumskiven og belegg den med en spinnbelegger ved 500 o / min i 5 s etterfulgt av 1,000 o / min i 30 s for å få et ~ 80 μm tykt lag.
    6. Stek de to silisiumskivene med spinnbelagt PDMS og hell PDMS-lag ved 50 °C i varmluftskonveksjonsovn i 6 timer. Etter steking, vent til bitene er avkjølt ved romtemperatur.
    7. Klipp det 5 mm tykke PDMS-laget fra silisiumstykket rundt kontrolllaget (mønster 2) med et skarpt blad og skrell det av fra silisiumsubstratet.
    8. Punch to hull med ~ 1 mm diameter ved hjelp av en Harris puncher ved reservoaret til PDMS-blokken for å koble immobiliseringskanalen og isolasjonskanalinntakene til gassledningene for PDMS-membranavbøyninger.
    9. Plasser silikonstykket med det spinnbelagte PDMS-laget på mønster 1 (strømningslag), med den PDMS-belagte overflaten vendt opp, på et plastbrett. Hold den stansede PDMS-blokken med mønster 2 (kontrolllag) på skuffen med støpt side vendt opp.
    10. Hold plastbrettet inne i en plasmarenser og utsett de to PDMS-overflatene for 18 W luftplasma i 2 minutter under lavt vakuum (200-600 mTorr). Påfør vakuum til kammeret blir lyst fiolett. Utfør dette trinnet under svakt lys for å se plasmafargeendringen.
    11. Ta ut de to plasmabehandlede blokkene og bind blokkene forsiktig ved å presse de plasmabehandlede overflatene i mønster 1 og 2 sammen. Stek de limte mønstrene ved 50 °C i 2 timer i varmluftskonveksjonsovn.
    12. Ta den limte enheten ut av ovnen. Klipp den limte enheten ut av silisiumskive med mønster 1 og mønster 2, og slå hull i innløps- og utløpsreservoarene til strømningslaget ved hjelp av Harris puncher.
    13. Plasser den limte PDMS-blokken med strømningslaget vendt opp på et plastbrett. Oppbevar et rent dekselglass (#1.5) på samme brett. Utsett blokkene og dekselglasset til 18 W luftplasma i 2 minutter. Juster vakuumtrykket for å se et fiolett kammer.
      MERK: Dette trinnet bør gjøres i svakt lys for å se plasmafargeendringen. For å rengjøre dekselglasset, vask det med IPA og tørk med nitrogengass ved 14 psi.
    14. Plasser den plasmaeksponerte PDMS-blokken på toppen av dekselglasset og stek den bundne strukturen i en ovn ved 50 °C i 2 timer. Oppbevar enheten i et rent kammer for fremtidige eksperimenter.

2. PDMS membran grunning

  1. Ta enheten og sett den på et stereomikroskop og fest slangene. Koble mikrofleksrør (indre diameter ~ 5 mm, ytre diameter ~ 8 mm) til en komprimert nitrogengassledning i den ene enden. Koble til en treveiskontakt i den andre enden. Rør 1 og 2 av treveiskontaktene vil være koblet til henholdsvis fellen og isolerende membraner.
  2. Koble to mikrofleksrør (indre diameter ~ 1,6 mm, ytre diameter ~ 5 mm) til de to utløpsportene på treveis stoppekranen. Koble den andre enden av de to rørene til en 8 mm lang 18 G nål.
  3. Fyll strømningslaget med M9-bufferen ved hjelp av en mikropipette gjennom innløpsporten. Fyll begge rørene med DI-vann gjennom enden som er koblet til nålen. Sett de to nålene inn i hullene, og koble henholdsvis isolasjons- og fangstmembranen.
  4. Åpne nitrogengassregulatoren ved 14 psi og vri treveisventilen fra rør 1 for å skyve vannet inn i enheten gjennom mikrofluidiske kanaler i kontrolllagene, nemlig felle- og isolasjonsmembranene.
  5. Vent til vann fyller kanalen uten tilstedeværelse av luftdråper i begge kanalene. Når kanalene er fullstendig fylt med vann, anses kanalene for å være primet.
  6. Slipp trykket ved hjelp av treveis stoppekranen når kanalene er fylt med vann og primet. Grunning kan føre til bobler i strømningslaget, fjern boblene ved å strømme flere medier gjennom strømningskanalen.

3. C. elegans vedlikehold og synkronisering

MERK: C. elegans-stammer: Studien brukte følgende transgener PS3239 (dpy-20 (e1282) syIs49 IV [MH86p (dpy-20 (+) + pJB100 (ZMP-1: : GFP)]) for vulvalutvikling 32, jsIs609 (mec7p: : MLS (mitokondriell matriselokaliseringssignal): : GFP) 33 for berøringsreseptornevron (TRN) utvikling og mitokondritransportavbildning, og wdIs51 (F49H12.4: : GFP + unc-119 (+) for å spore PVD-utvikling 34. Standard C. elegans kultur- og vedlikeholdsprotokoll ble fulgt35.

  1. Dyrk C. elegans på nematode vekstmedium (NGM) petriplater med E. coli OP50 som matkilde ved 22 °C. Oppretthold C. elegans-stammene ved gjentatte ganger å overføre noen få hermafroditter eller klumpe en liten mengde agar med noen få dyr til en ny NGM-plate med en OP50-plen.
  2. Etter 3-5 dager, sjekk NGM-platen for dyrevekst og C. elegans egg. Samle og overfør ca. 30 egg fra en tallerken til en fersk NGM-tallerken med OP50-plen.
  3. For å synkronisere dyr for avbildning, overfør alle uklipte egg fra tallerkenen hver 2. time til en ny tallerken og hold dem ved 22 ° C. Omtrent 15-20 egg klekkes på hver tallerken.
  4. Plukk dyrene mellom 14-16 timer og 28-30 timer etter klekking for henholdsvis larve 2 (L2) og larve 3 (L3) stadier. Overfør dyrene til mikrofluidisk enhet for avbildning. Legg til matforsyning som beskrevet i neste avsnitt for å opprettholde dyret inne i enheten for langsiktige vekst- og bildeeksperimenter.

4. C. elegans vekst inne i vekst og bildebehandling mikrofluidic enhet

  1. Monter en vekst- og bildebehandlingsmikrofluidisk enhet på et omvendt mikroskop og visningsmønster 2, etter tilkobling av isolasjonsmembranene og immobiliseringsmembranen, ved lave forstørrelser (4x eller 10x). Sørg for at kanalene er fylt med rent destillert vann.
  2. Forbered en frisk 1-liters løsning av S-medium ved bruk av 10 ml 1 M kaliumcitrat pH 6,0, 10 ml spormetallløsning, 3 ml 1 M CaCl2, 3 ml 1 M MgSO4. Forbered løsningen under sterile forhold. Ikke autoklav S-mediet.
  3. Fyll strømningskanalen med vekstmedier (S medium) 10 min før eksperimentet. Unngå luftbobler i strømningskanalen. Flyt ekstra medium om nødvendig for å fjerne luftbobler.
  4. Velg et enkelt dyr fra det nødvendige utviklingsstadiet fra en NGM-plate i 10 μL S-medium ved hjelp av en mikropipette og skyv dyret inn i strømningskanalen gjennom innløpshullet.
  5. Overvåk dyrets posisjon i strømningskanalen ved hjelp av et lavt forstørrelsesmål. Flyt ytterligere medium gjennom innløpet eller utløpet for å skyve dyret og plassere det innenfor strømningskanalen som er begrenset mellom de to isolasjonsmembranene.
  6. Åpne treveis stoppekranen for å påføre 14 psi trykk i isolasjonskanalene og skyv membranene ned i strømningskanalen.
    MERK: Membranen forsegler delvis strømningskanalen og begrenser dyrs bevegelse til regionen mellom de to isolasjonsmembranene.
  7. Bruk en enkelt koloni av E. coli OP50 fra en stripet plate for å inokulere 250 ml L buljong (2,5 g bacto-trypton, 1,25 g bacto-gjær, 1,25 g NaCl i H2O). Dyrk den inokulerte kulturen over natten ved 37 °C.
  8. Aliquot 500 μL OP50 kultur i 1,5 ml sterile sentrifugerør og oppbevar lageret og aliquot i 2 uker ved 4 °C.
  9. Pellet ned OP50-kulturen ved sentrifugering ved 1,3 x g i 5 min. Oppløs pelleten med 1 ml ferskt S-medium (0,5x fortynning) og oppbevar den ved romtemperatur i 3-4 dager. Bruk denne fortynnede OP50 til å mate C. elegans inne i mikrofluidiske enheter.
  10. La en dråpe S-medium ligge på toppen av innløps- og utløpsreservoarene for å redusere fordampningen av S-mediet i strømningskanalen.
  11. Ta fortynnet OP50 oppløsning i en 10 μL mikropipette. Fjern mikrospissen fylt med OP50-oppløsningen fra pipetten og trykk spissen inn i innløpsreservoaret. Legg deretter en annen mikropipettespiss med 10 μL matoppløsning og sett den inn i utløpsbeholderen.
  12. Forsegl spisshodet med en finger for å sikre kontinuitet i matløsninger uten luftspalte. Bytt mikropipettespissen med OP50-oppløsning som ikke er eldre enn 3-4 dager hver dag.
  13. Fyll ytterligere 20-30 μL matløsning i begge spissene. Tilsett eller fjern matoppløsning til og fra mikropipettespissen for å justere gradienten for å skyve dyret i strømningskanalen og for å justere dyrets posisjon under fangstmembranen for avbildning.
  14. Overvåk strømmen av bakterier for å sikre at den er kontinuerlig gjennom de delvis lukkede isolasjonsmembranene i strømningskanalen ved hjelp av lysfeltbilder.
    MERK: I fravær av bakteriestrøm, kan dyr spise de tilgjengelige bakteriene i strømningskanalen mellom de to isolasjonsmembranene. Hvis det ikke er bakterier eller ingen strømning i kanalen, bytter du ut de to mikropipettespissene ved innløpet og utløpet med nye pipettespisser fylt opp med nylagde matforsyninger.

5. C. elegans immobilisering og bildebehandling

  1. C. elegans immobilisering under fangstmembranen
    1. Finn et enkelt dyr i vekstkanalen ved lave forstørrelser. Juster høydene for næringsmiddelløsningen i de to mikropipettespissene som er koblet til innløps- og utløpsreservoarene. Skyv dyret i ønsket retning ved hjelp av de hydrostatiske trykkforskjellene i strømningskanalen.
    2. Plasser dyret i midten av fangstmembranen og overvåk svømmeoppførselen ved hjelp av et lavt forstørrelsesmål (4x).
    3. Vri treveis stoppekranen for å øke trykket i fellekanalen sakte. Immobiliser dyret under fellemembranen i en rett stilling langs vekstkanalgrenseveggen.
      FORSIKTIG: Unngå å fange dyret over strømningskanalen i en Z- eller U-bøyeposisjon. Dette fører til at dyrekroppen blir presset med større trykk og forårsaker permanent skade på helsen.
  2. C. elegans avbildning og frigjøring fra membranen
    1. Bær og last enheten på et mikroskopstadium. Sett opp et omvendt mikroskop ved de ønskede bildeinnstillingene med alle nødvendige optiske komponenter (objektiv, lyskilde, fluorescensfiltre og en detektor) for høyoppløselig lyst felt, differensialbildekontrast (DIC) eller fluorescensavbildning (supplerende figur 1).
    2. Skaff deg en enkelt eller flere time-lapse fluorescensbilder for å fange cellulære og subcellulære hendelser.
    3. Oppnå fluorescensbilder av C. elegans-nevroner som en funksjon av deres utvikling ved hjelp av et 60x, 1,4 numerisk blenderåpning (NA) mål, en 488 nm bølgelengdelaser med 7% -10% lasereffekt, et CCD-kamera, på et spinnskivemikroskop. Utfør time-lapse-avbildning ved hjelp av programvaren som følger med mikroskopet, og få bilder med en hastighet på 4 bilder per sekund (supplerende figur 1).
    4. Etter oppkjøpet av bilder, slipp fangsttrykket og overvåk dyrets bevegelse ved lave forstørrelser - 4x og 10x. Hold dyret begrenset innenfor regionen definert ved å isolere membraner (holdt under 14 psi gjennom hele forsøket).
    5. Juster volumet av matoppløsningen i de to mikropipettespissene for å fortsette en langsom tyngdekraftdrevet matstrøm i vekstkanalen. Denne matstrømmen oppnås ved å justere nivåene av matløsningene i mikropipetter ved innløpet og utløpet (vanligvis 1-5 mm høydeforskjell).
    6. Visualiser strømmen under et lyst felt fra strømningsmønsteret til bakteriene i vekstkanalen.
      MERK: I fravær av strømning spiser dyret de tilgjengelige OP50-bakteriene, kanalen virker klar, og dyret sulter over noen timer. Et sultet dyr utvikler vanligvis høy autofluorescens, lett observerbar når man får time-lapse fluorescensbilder. Slike hendelser har skadelige effekter på dyrefysiologi og ble unngått i forsøkene.
    7. Gjenta trinn 5.2.1-5.2.3 etter et forhåndsbestemt tidsintervall for å få fluorescens/ DIC/lysfeltbilder av samme person ved flere tidspunkter.
    8. Etter at bildene er anskaffet på flere ønskede tidspunkter fra samme individuelle dyr, slipper du isolasjons- og fangsttrykket. Skyll kanalen med M9-buffer og skyv dyret gjennom innløpsreservoaret. Gjenopprett dyret fra reservoaret og legg dyret på en ny NGM-plate for videre helseovervåking.
    9. Skyll kanalen med M9-buffer noen ganger for å fjerne bakterier. Skyll strømningskanalen med 70% etylalkohol (fortynnet i destillert vann). Tørk kanalene ved å skyve luft ved hjelp av en sprøyte. Oppbevar enheten på et tørt støvfritt sted for gjentatt bruk i fremtiden.
  3. Bildeanalyse og statistikk
    1. Bruk FIJI ImageJ-programvare for tiff-bildeanalyse. Åpne tiff bilder av PVD time-lapse bilder fra wdIs51 dyr i Fiji ImageJ. Trekk ut de beste planene fra stakken med z-plan som viser de primære prosessene, ved å velge Bilde-fanen > Stakker > Z-prosjekt.
    2. Skjerm hele serien av bilder og finn spesifikke bilderammer som vellykket dekker hele nevronprosessene ved hjelp av overlappende deler av dyrebilderammene. Velg Plugin > Analyze > Cell Counter fra FIJI-verktøylinjen. Dette vil åpne et vindu for nummerering av forskjellige grener og holde telling av hvert valgt nevron.
    3. Velg Initialiser > tellere > Type1, og merk deretter sekundærgrenene. Velg deretter Type 2 og merk Kvartær, klikk på Resultatvindu som viser antall grener (Tilleggsfigur 2). Denne metoden vil vise grenene som allerede er talt.
    4. Åpne det neste overlappende bildet og tell de gjenværende grenene. Denne prosessen vil forhindre dobbelttelling og sikre at hver prosess telles. Identifiser og tell det totale antall primære grener som er tilstede i de tidlige larvestadiene av C. elegans. Utfør lignende analyse for bildene for sekundære og kvartære prosesser hos eldre dyr.
      MERK: Voksne viser mange prosesser som innerverer i kroppsveggmuskler og kan være vanskelig å telle. Sørg for at hver prosess bare telles én gang.
    5. Beregn avstanden mellom PVD-cellelegemene i wdIs51-dyrene ved å tegne en segmentert linje fra PVD-cellelegemet (CB) til PVC CB. For larvedyr 4 (L4) er cellelegemene langt fra hverandre og er ikke i samme ramme når de avbildes med et 60x mål.
    6. Velg overlappende bilder fra stabelen for å dekke hele dyrelengden fra hode til hale ved hjelp av Bilde-fanen > Stabler > Z-prosjekt fra ImageJ. Tegn segmenterte linjer langs nevronprosessen mellom PVD og PVC CBs.
    7. Mål lengdene for alle de segmenterte linjene ved hjelp av ImageJ > Analyser > Mål. Legg til lengdene for alle segmentene for å beregne den totale avstanden mellom PVD og PVC CB for hvert tidspunkt.
    8. For nevronlengde av TRNs i jsIs609 dyr, last inn bildene i Fiji. Tegn en segmentert linje langs de bakre laterale mikrotubuli (PLM; synlig med løselig GFP) fra cellekroppen til sentroiden til den første mitokondrionen. Beregn lengden på linjen for den første avstandsverdien.
    9. Tegn en segmentert linje fra midten av den første til den andre mitokondrionen. Gjenta denne prosessen for hvert par mitokondrier til slutten av nevronprosessens lengde. Legg til alle lengdene for å beregne den totale nevronale prosesslengden.
    10. For cellelinjeanalysen laster du inn alle vulvalbildene på Fiji og trekker ut det beste fokusbildet av cellene fra time-lapse-bildene av flere z-plan.
    11. Representer dataene som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Beregn statistisk signifikans ved hjelp av enveis ANOVA for mer enn to utvalg eller en to-utvalgs t-test for et par utvalg. Angi signifikans med p-verdi < 0,05 (*), p-verdi < 0,005 (**) og p-verdi > 0,05 (ns, ikke signifikant).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enhet karakterisering: Vekst- og bildebehandlingsenheten består av to PDMS-lag bundet sammen (figur 1) ved hjelp av irreversibel plasmabinding. Strømningslaget (mønster 1) som er 10 mm i lengde og 40 μm eller 80 μm i høyden gjør at vi kan dyrke dyret i flytende kultur (figur 1A). Fangstlaget (mønster 2) har en 2 mm bred membran (figur 1B) for immobilisering av dyret for høyoppløselig avbildning. Masken for fangstlaget lager også et par isolasjonsmembraner for å begrense dyrs bevegelse innenfor en del av strømningskanalen mellom påfølgende bildebehandlingstidspunkter. Fangstmembranen til enheten er tilpasset fra vår forrige bildebehandlingsenhet3. Den nåværende enheten (figur 1C, L) inkluderer tillegg av en isolasjonsmembran og en økning i bredden på fangstmembranen til 2 mm for effektiv immobilisering av det samme dyret over flere tidspunkter.

For å teste enheten ble rent destillert vann fylt i de mikrofluidiske kanalene som forbinder fangstmembranene (figur 1D, E og supplerende figur 3) og trykksatt med 14 psi nitrogengass, også brukt til å fange et dyr under en 2 mm tykk PDMS-membran (figur 1H, K, L). Et enkelt dyr ble plukket fra en NGM-plate ved hjelp av en mikropipette og lastet inn i strømningskanalen (figur 1F). Vekstkanalen ble fylt med bakterier resuspendert i S-medier (figur 1F, G, I, J). En konstant strøm ble opprettholdt gjennom hele bildeperioden ved å justere mediehøydene i pipettespissene som var koblet til enhetens innløp og utløp mens du overvåket dyret i strømningskanalen mellom de to isolasjonsmembranene. Nylaget OP50-oppløsning ble fylt i mikropipettespissene daglig for å sikre en sunn matkilde for dyret inne i mikrokanalen. Fersk matkilde og gasspermeabelt PDMS-materiale sikrer tilstrekkelig oksygentilførsel inne i mikrokanalen30,29. Veksten av dyr i enheten ble sporet ved å bruke enten cellespesifikke markører eller markører som viser cellelinje eller variable cellulære uttrykksmønstre under utvikling. Dyrene ble immobilisert under fangstmembranen ved hjelp av 14 psi nitrogengass og holdt ormer i rett stilling langs kanalveggen. Dyret vokste langsommere inne i den mikrofluidiske kanalen sammenlignet med på en NGM-plate23.

Cellelinjestudie ved hjelp av langtidsbildeenheten: For å vurdere C. elegans utvikling inne i mikrofluidic enheten, vokste vi PS3239 (ZMP-1: : GFP) stamme32 med konstant matforsyning for å spore vulva utvikling på ulike tidspunkter av veksten. ZMP-1 koder for en sinkmetalloprotease og uttrykker seg i ankercellen i L3-trinnet, i vulD- og vulE-celler i L4-stadiet og i vulA hos dag 1 (1D) voksne dyr (figur 2A). Endringene i ekspresjonsmønster representerer et eksempel på tidsmessig genregulering der det samme genet uttrykkes i forskjellige celler på forskjellige utviklingsstadier. For å observere vulval utvikling ble dyret først immobilisert og vulvalområdet ble deretter avbildet over flere z-fly hver 8-10 timer fra L3 og utover til voksne stadier. ZMP-1: GFP uttrykkes i forskjellige vulvalceller i henhold til utviklingsstadiet (figur 2B). De høyoppløselige fluorescensbildene av vulvalcellene fra dyrene som vokser inne i mikrofluidisk enhet, viser normal vulval utvikling og ZMP-1: GFP-uttrykk og lokalisering ligner tidligere rapporter32.

Sporing av nevronutvikling ved hjelp av langsiktig vekst- og bildebehandlingsenhet: For å demonstrere bruken av enheten for subcellulær avbildning fra et enkelt dyr, ble utviklingen av to mekanosensoriske nevroner PVD og TRN overvåket. NC1686-stammen som uttrykker wdIs51 som uttrykker GFP i de to PVD-nevronene, ble brukt34,36. Hver PVD-nevron viser menorah-lignende forgrenet dendritisk arkitektur som består av primære (PP), sekundære (SP), tertiære (TP) og kvartære (QP) prosesser ved henholdsvis L2 (14-16 timer), sen L2 (20-22 h), L3 (24-26 h) og L4 (36-42 timer) utviklingsstadier (figur 3). PVD-cellelegemet er tilstede bakre til vulva. Den sender ut en akson og to primære dendrittiske prosesser som gir opphav til SP og TP, som igjen gir opphav til QP dendrittiske grener som innerverer kroppsveggmuskulaturen. Sene L3- og L4-stadier viser høy arborisering37,34. Vi dyrket enkelt NC1686 dyr inne i mikrofluidisk enhet og matet dem kontinuerlig med bakteriemat. Dyrene ble immobilisert under L2 opp til 1D-utviklingsstadiet, og PVD-nevronene ble gjentatte ganger avbildet hver 8-12 time ved bruk av 60x, 1,3 NA oljemål for å telle antall SP-, TP- og QP-grener i tre dimensjoner. Omfanget av forgrening økte under utviklingen som vist i figur 3B. Antall SP og QP på ulike stadier av ormeutviklingen økte med alderen (figur 4A) som det er sett i tidligere studier37. L2-dyr viste 10 ± 3,8 (n = 9) SPs, men ingen QP, målt med apparatet (figur 4A). Vi plasserte C. elegans i en dråpe på 3 mM levamisol, et bedøvelsesmiddel som forårsaker sammentrekning av kroppsveggmuskel og lammelse, for å minimere negative effekter på organelltransport samtidig som det reduserer dyrebevegelser og forårsaker tilstrekkelig lammelse, som kreves for høyoppløselig bildebehandling 3,4. SP-verdiene (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) var ikke signifikant forskjellige når de ble målt fra lignende iscenesatte dyr dyrket på NGM-plater og avbildet med 3 mM levamisol på en agarsklie (figur 4B). Dataene antyder at enhetens immobilisering muliggjør høyoppløselig avbildning av komplekse nevronarkitekturer og ikke påvirker deres utvikling. L3-trinndyr har et lite antall QP som øker i antall med utvikling. 1D-voksne viste 67 ± 2,8 QP (n = 5) hos dyr dyrket i enheten. Tidligere studier har vist dannelsen samt en tilbaketrekning av PVD-prosesser under utvikling kjent som selvunngåelse, hvor de reduserer grennummer38. Reduksjonen i SP ved 51 timer (1D) etter klekking kan være et resultat av slike tilbaketrekninger. Dyr som vokste på NGM-plater og avbildet med 3 mM levamisol viste en lignende forgreningstalltrend for sammenlignbare utviklingsstadier (figur 4A, B). Videre øker avstanden mellom de to PVC-cellelegemene, en tilstede i halen og den andre tilstede nær vulvaen, når de beveger seg fra hverandre hos dyr dyrket i enheten eller de som vokser på NGM-plater (figur 4C, D). Gjennom avbildningsprosessen forble dyrene sunne og kunne legge egg selv etter at dyrene ble immobilisert under membranen gjentatte ganger i løpet av denne lange perioden.

Ved hjelp av denne enheten var vi i stand til å immobilisere dyret i samme retning og avbilde det identiske nevronet og dets arkitektur med høy oppløsning selv med svakt GFP-uttrykk. For å demonstrere nytten av vår vekst- og immobiliseringsteknologi, ble utviklingen av TRN-ene fra L3 til voksen avbildet ved hjelp av jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP)-dyr. De bakre TRN-ene er tilstede på den laterale siden av kroppen og kalles PLMR og PLML som tilsvarer høyre og venstre side av dyret. Vi avbildet de samme dyrene som vokste i mikrofluidikkbrikken og immobiliserte dem med 12-14 timers intervaller. Montasjen representerer hele PLMR-nevronprosessen ved suksessive tidspunkter som fremhever både mitokondrier og nevronprosessen (figur 5A). Den totale nevronale prosesslengden ble beregnet og funnet å øke med en helling på 10,4 μm per time (figur 5B). Denne økningen i nevronprosessens lengde stemmer overens med en tidligere rapport på ~ 10 μm / t 18,31,39,40,41. Vi observerte også tilsetning av nye mitokondrier i vekstprosessen og endringen i synaptisk grenpunktposisjon i forhold til cellekroppen som rapportert tidligere23.

Figure 1
Figur 1: En enkel mikrofluidisk brikke for langsiktig vekst og avbildning av C. elegans. (A) Strømningslaget består av en 10 mm lang mikrofluidisk kanal (mønster 1) i et tynt PDMS-lag. (B) Overlappingslaget består av en 2 mm tykk immobiliseringskanal og et par tynne isolasjonskanaler i bulk PDMS-laget. (C) De to PDMS-lagene er bundet sammen sammen med et tynt dekselglass for å lage enheten. (D, E) Fangst- og isolasjonskontrollkanalene er fylt med avionisert (DI) vann, under komprimert nitrogen (N2) gass. (F) Alderssynkroniserte C. elegans plukkes fra NGM-plater og lastes inne i strømningslaget på enheten. (G) Mat leveres ved hjelp av to mikropipettespisser ved innløps- og utløpsreservoarene. (H) Dyrene er frie til å bevege seg innenfor de to isolasjonskanalene og er fanget under immobiliseringsmembranen. (I) Bilde av vekst- og bildebehandlingsenheten med matforsyning gjennom to mikropipettespisser. (J, K) Bilder av en fritt bevegelig og immobilisert C. elegans inne i mikrofluidic kanalen. Skalastangen er 1 mm (I) og 200 μm (J, K). (L) Skjematisk av enhetens tverrsnitt som viser høydene til strømningskanalen (FC), PDMS-membranen (M) og kontrollkanalen (CC). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Spore uttrykket av en vulvalmarkør i C. elegans som utvikler seg inne i enheten. (A) Skjematisk av vulvalceller som uttrykker ZMP-1: GFP i PS3239 dyr under utvikling. GFP-signalet vises i ankercellen på L3-stadiet, i vulD- og vulE-cellene på L4-stadiet, og i vulA-celler på det voksne 1D-stadiet. (B) Bilder av PS3239-dyr som vokser inne i mikrofluidikkbrikken og immobiliseres hver 8.-10. time for å ta fluorescensbilder av ZMP-1::GFP-uttrykk under vulvalutvikling fra L3, L4 og 1 dag (1D) voksen. Forkortelser: AC = ankercelle, A = vulA, D = vulD, E = vulE. Skalaen er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Avbildning av individuelle wdIs51 C. elegans for å spore PVD-nevronutvikling. (A) Skjematisk av PVD-nevronvekst og dendritisk arborisering fra L2 til L4-stadium. Grønn sirkel viser PVD-cellelegemet (CB, gul pil). Dendrittene viser fremveksten av primære prosesser (PP) ved L2 fra både fremre og bakre side av CB, sekundære prosesser (SP) under sen L2, tertiære prosesser (TP) i L3 og kvartære prosesser (QP) under L4-stadier. (B) Bilder av PVD-nevroner fra dyr som vokser inne i en mikrofluidisk enhet. (C) Bilder av PVD-nevroner fra dyr dyrket på en NGM-plate og immobilisert med 3 mM levamisol (Lev). Skalaen er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning av PVD-utvikling i enhetsdyrkede dyr og dyr dyrket på NGM-plater. (A) Gjennomsnittlig antall sekundære prosesser (SP) og kvaternære prosesser (QP) fra de samme dyrene som vokser inne i mikrofluidisk enhet. Verdiene beregnes ved 16 timer (L2), 24 timer (L3), 36 timer (tidlig L4), 42 timer (sen L4) og 51 timer (1D voksen). (B) Gjennomsnittlig antall SP og QP fra en annen gruppe dyr som vokser på NGM-plater og bedøves med 3 mM levamisol. (C) Gjennomsnittlig separasjon mellom de to PVD-nevroncellelegemene fra det samme dyret som vokser i mikrofluidisk enhet. (D) Gjennomsnittlig separasjon fra forskjellige sett med dyr som vokser på NGM-plater og bedøves med 3 mM levamisol. Data representert som gjennomsnitt ± SEM (n ≥ 10 for 3 mM levamisol og n ≥ 6 for immobiliserte enhetsdyr). De statistiske signifikansene beregnes med enveis ANOVA og betegnes som p-verdi < 0,05 (*), p-verdi < 0,005 (**) og p-verdi > 0,05 (ns). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Høyoppløselig avbildning av berøringsreseptornevroner (TRN) fra dyr som vokser inne i mikrofluidisk enhet. (A) Montasje av nevronale prosesser fra et enkelt dyr avbildet på forskjellige tidspunkter. Cellelegemet (CB, pil), det synaptiske grenpunktet (BP, pilspiss) og nevronspissen (Tip, up arrow) er merket. Nevronprosessen og posisjonen til hver mitokondrion spores manuelt ved hjelp av Fiji. Skalastang er 10 μm. (B) Gjennomsnittlig nevronal prosesslengde ved forskjellige bildetidspunkter. Data representert som gjennomsnitt ± SEM (n = 8). Statistisk signifikans beregnes med enveis ANOVA og betegnes som p-verdi < 0,005 (**) og p-verdi > 0,05 (ns). En regresjonsligning er egnet med en helling på 10,4 μm nevronal prosessforlengelse per time, R2 = 0,9425. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Skjermbilder av mikroskopinnstillinger for fluorescensavbildning av C. elegans. (A) Et panel i bildeanalyseprogramvaren viser de uthevede seksjonene for å sette opp skannehastigheten, filtersettet og målet for bildebehandling. (B) Programvaren brukes deretter til å velge 488 nm laser med 7% av full lasereffekt. (C) Bildeanalyseprogramvaren kan ta en enkelt bilderamme eller en serie med time-lapse-bilder og lagre dem for fremtidig analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Skjermbilder av FIJI-programvare som viser analysetrinnene for telling av PVD-grener hos wdIs51-dyr . (A) Viser PVD bildet åpnet i Fiji ImageJ programvare og link til cellen telleren plugin. (B) Celletellervindu for å initialisere telleren for et bilde. (C) Valg av tellere for å markere grener som er inkludert og for å unngå flere tellinger. (D) Resultatvindu som viser totalt antall grener under hver kategori. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Skjematisk for vekst- og bildebehandlingsenheten. To mikropipettespisser, fylt med forskjellige mengder bakteriematløsning (gul), settes inn i innløps- og utløpsstansene i strømningskanalen i bunnlaget. Forskjellen i høyden på matløsninger i spissene fører til at løsningen strømmer inne i kanalen som igjen leverer bakterier til dyret for vekst. Fangst- og isolasjonskanalene (blå) fylles med destillert vann og komprimeres ved hjelp av en nitrogengass (satt til 14 psi) tilførsel. Isolasjonskanalen er alltid koblet til 14 psi. Trykket på fangstmembranen byttes mellom 0 (dyret er fritt til å bevege seg og mate) og 14 psi (dyret er immobilisert for høyoppløselig avbildning) ved hjelp av en treveiskontakt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papiret er det beskrevet en protokoll for fremstilling og bruk av en enkel mikrofluidisk enhet for dyrking av C. elegans med konstant matforsyning og høyoppløselig avbildning av et enkelt dyr under utviklingen. Denne fabrikasjonsprosessen er enkel og kan gjøres i et ikke-sterilt miljø. Et støvfritt miljø er kritisk under fabrikasjonstrinn. Tilstedeværelsen av støvpartikler vil føre til feil kontakt mellom de to bindingsflatene, noe som resulterer i dårlig binding og lekkasje av enheten under høytrykkspåføring mens C. elegans er immobilisert. Av alle enhetene som er produsert, er 95% av enhetene egnet for eksperimenter. Et lite antall enheter svikter (5%) på grunn av upassende liming under fabrikasjon eller bruk. Svikt i liming kan reduseres ved å utføre fabrikasjonsprosessen inne i et støvfritt (> 1000-graders rent rom) tilgjengelig ved flere akademiske institusjoner over hele verden. For å rense bakteriemat fra strømningskanalen og aktivere gjenbruk av enheten, skyll enheten ved å strømme alkohol gjennom den etter hvert eksperiment.

Protokollen demonstrerer en litografifabrikasjonsprosess med en enkel design som lett kan modifiseres for forskjellige utviklingsstadier og størrelser av C. elegans. Videre kan denne enhetsdesignen tilpasses for andre modellorganismer som sebrafisk og Drosophila, ved å øke dimensjonene til strømmen og fange lag3 for å observere en rekke utviklings- og subcellulære prosesser. I denne protokollen har to forskjellige høyder av strømningslagkanalen - 40 μm og 80 μm - blitt brukt til fullstendig immobilisering og sporing av cellulære og subcellulære egenskaper i forskjellige utviklingsstadier av C. elegans som passer for deres kroppsstørrelser. For eksempel begynner dendritisk arborisering i PVD-sensoriske nevroner i de tidlige L2-stadiene og fortsetter opp til L4-scenen. Dette ble avbildet i en enhet med et 40 μm høyt strømningslag. Siden PVD-nevronene danner dendritter som innerverer kroppsveggmuskler, krever det optisk seksjonering for å kvantifisere prosessene i 3D. Den kvantitative analysen av dendritiske arbors krever fullstendig immobilisering av dyrene i enheten som samsvarer med kroppsdiameteren. For overvåking av vulvalutvikling ble imidlertid 80 μm høyde av strømningslag brukt til å spore vulvallinjene. For TRNs lengde og mitokondrieravbildning avbildet vi L2 til L4-trinn ved hjelp av enheter med 40 μm strømningslagtykkelse. Bruk av en enhet med feil høyde vil føre til vanskeligheter med immobilisering. For eksempel vil små dyr (L2 eller tidlige L3-stadier) inne i en 80 μm strømningslaghøydeanordning tillate dyreflipping inne i enheten og vise ufullstendig immobilisering selv etter at fangstmembranen er under 14 psi trykk. På den annen side kommer dyr med store kroppsdiametre (utover sen L4) ikke lett inn i en enhet med 40 μm strømningslaghøyde. Fangst av store dyr i små enheter under høyt trykk kan skade kroppen. Påføringen av den nåværende enheten med et 40 μm strømningslag er begrenset og ikke egnet for høyoppløselig avbildning av svært unge dyr i tidlig larvestadium (for eksempel L1-trinndyr yngre enn 10 timer etter klekking), da de ikke er helt immobilisert under membranen. På grunn av små kroppsstørrelser fortsetter de små larvedyrene å bevege seg og unnslipper av og til fellen når de er begeistret med laserlys. For L1-scenedyr kan man utføre lavoppløselig lysfelt- eller fluorescensavbildning ved hjelp av 4x eller 10x mål og korte kameraeksponeringstider. Som en alternativ tilnærming vil en ny strømningslagsanordning med < 20 μm høyde være nødvendig for å fullstendig immobilisere unge larvetrinn C. elegans.

Sporing av utviklingsfenomener i samme dyr over en lang tidsskala ved hjelp av høyoppløselig fluorescensavbildning kan resultere i økt autofluorescens. Hver time-lapse imaging assay krever optimalisering av eksitasjonsintensitet, eksponeringstid, avbildningstidsintervall, dyrs restitusjonstid og matkvalitet for fysiologisk relevant utviklingsinformasjon fra C. elegans-studier. Vi har valgt > 3 timers tidsintervall for utviklingsstudier ved bruk av dyr fra L4-stadier og utover. Enheten er i stand til å skaffe hyppigere bilder (hvert 5-10 min i noen timer) eller flere bilder per sekund (i < 1 time) for å studere andre dynamiske prosesser som organell transport og distribusjon i C. elegans nevroner 3,23. Fangst og avbildning av tidlige utviklingsstadier krever mer nøye observasjon, da gjentatt fangst med korte tidsintervaller uten fullstendig gjenoppretting kan påvirke helsen. Under forsøk ble det funnet at dyr som krevde høyt trykk for å flytte dem inn i strømningslaget, viser dårlig helse og mer autofluorescens over tid. Dyr med høy kroppsfluorescens, kjent for å være assosiert med et høyt stressnivå, ble unngått for avbildningsstudier. For å opprettholde god fysiologi ble dyrene fanget i en rett stilling ved siden av kanalveggen. Immobilisering av dyrene med kroppen over kanalbredden ble unngått siden dyr blir syke etter at kroppen deres er presset under 14 psi trykk i denne stillingen. For å opprettholde et godt signal-til-støy-forhold under gjentatt avbildning med oljemål, bør dekslet rengjøres ordentlig etter hvert tidspunkt. Etter spesiell forsiktighet under fabrikasjonsprosessen av enheten og dens anvendelse, kan de samme enhetene gjenbrukes over flere bildebehandlingsøkter.

Denne enheten kan være nyttig for studier ved hjelp av mutanter som kan være følsomme for anestetika. Tilnærmingen som presenteres kan eliminere uønskede bedøvelseseffekter på vekst og fysiologi for å lette observasjon av morfologiske, funksjonelle og atferdsdefekter hos dyr over en lang periode. Enheten er enkel å fremstille og kan settes opp i ethvert laboratorium for å løse langsiktige utviklings- / cellebiologiske spørsmål i C. elegans som krever intermitterende høyoppløselig bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. og S.P.K. er forfattere av et ventende patent på mikrofluidisk vekst- og bildebehandlingsenhet (Patentsøknadsnummer 640/CHE/2011).

Acknowledgments

Vi takker CIFF imaging facility, NCBS for bruk av konfokale mikroskoper støttet av DST - Senter for nanoteknologi (No. SR/55/NM-36-2005). Vi takker forskningsfinansiering fra DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), spinning disc støttet av DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK og Gautam Menon), og HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK). HB101, PS3239 og wdIs51 stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. laget jsIs609 i Mike Nonets laboratorium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Bioengineering utgave 182 C. elegans mikrofluidisk chip on-chip vekst langsiktig bildebehandling neuronal imaging vulva celle avstamning
En enkel mikrofluidisk chip for langsiktig vekst og avbildning av <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter