Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוכיחו את עצמם כמערכת מודל רבת ערך לחקר תהליכים התפתחותיים וביולוגיים של תאים. הבנת תהליכים ביולוגיים אלה דורשת לעתים קרובות הדמיה ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותה חיה. לזמני התאוששות ארוכים הקשורים לשיטות אימוביליזציה קונבנציונליות המבוצעות על רפידות אגר יש השפעות מזיקות על בריאות בעלי החיים, ולכן אין זה ראוי לדמות שוב ושוב את אותה חיה לאורך תקופות זמן ארוכות. מאמר זה מתאר תכנון שבב מיקרופלואידי, שיטת ייצור, פרוטוקול גידול C. elegans על השבב, ושלוש דוגמאות להדמיה ארוכת טווח לחקר תהליכים התפתחותיים בחיות בודדות. השבב, המיוצר עם פולידימתילסילוקסן ומלוכד על זכוכית כיסוי, משתק בעלי חיים על מצע זכוכית באמצעות קרום אלסטומרי המוסט באמצעות גז חנקן. אימוביליזציה מלאה של C. elegans מאפשרת הדמיה חזקה בהילוך מהיר של אירועים תאיים ותת-תאיים באופן נטול הרדמה. גיאומטריית תעלה עם חתך רוחב גדול מאפשרת לבעל החיים לנוע בחופשיות בתוך שני ממברנות בידוד אטומות חלקית המאפשרות צמיחה בתעלה עם אספקת מזון רציפה. באמצעות שבב פשוט זה, ניתן לבצע הדמיה של תופעות התפתחותיות כגון גדילת תהליכים עצביים, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירונים החושיים PVD, כאשר החיה גדלה בתוך התעלה. שבב הגידול וההדמיה לטווח ארוך פועל עם קו לחץ יחיד, ללא שסתומים חיצוניים, חומרים מתכלים נוזליים זולים, ומשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בתולעים הניתנים להתאמה בקלות על ידי מעבדות אחרות באמצעות C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans הוכיח את עצמו כאורגניזם מודל רב עוצמה לחקר ביולוגיה של התא, הזדקנות, ביולוגיה התפתחותית ונוירוביולוגיה. יתרונות כגון גופו השקוף, מחזור חיים קצר, תחזוקה קלה, מספר מוגדר של תאים, הומולוגיה עם מספר גנים אנושיים וגנטיקה שנחקרה היטב הובילו לכך ש- C. elegans הפך למודל פופולרי הן לתגליות ביולוגיות בסיסיות והן למחקר יישומי 1,2. הבנת התהליכים הביולוגיים וההתפתחותיים של התא מתצפיות ארוכות טווח חוזרות ונשנות על בעלי חיים בודדים יכולה להתברר כמועילה. באופן קונבנציונלי, C. elegans מורדם על רפידות אגר ומצולם תחת מיקרוסקופ. השפעות שליליות של חומרי הרדמה על בריאותם של בעלי חיים מגבילות את השימוש בבעלי חיים מורדמים להדמיה לסירוגין ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותו בעל חיים 3,4. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיות והתאמתן ללכידה ללא הרדמה של C. elegans עם סכנות בריאותיות זניחות מאפשרות הדמיה ברזולוציה גבוהה של אותו בעל חיים לאורך זמן קצר וארוך.

שבבים מיקרופלואידיים תוכננו עבור C. elegans'5 סינון תפוקה גבוהה 6,7,8, לכידה וחלוקה9, בדיקת סמים 10,11, גירוי נוירונים עם הדמיה ברזולוציה גבוהה 12, והדמיה ברזולוציה גבוהה שלהחיה 12,13,14. יריעות מיקרופלואידיות דקות במיוחד לאימוביליזציה בשקופיות פותחו גםהן 15. מחקרים ארוכי טווח של C. elegans בוצעו באמצעות תמונות ברזולוציה נמוכה של בעלי חיים הגדלים בתרבית נוזלית כדי לבחון גדילה, דינמיקה של סידן, השפעות סמים על התנהגותם16,17,18,19, אריכות ימיהם והזדקנותם20. מחקרים ארוכי טווח המשתמשים במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה בוצעו כדי להעריך את ההתפתחות הסינפטית21, התחדשות עצבית22 ותוספת מיטוכונדריאלית23. הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה ומעקב אחר גורל התא והתמיינותו נעשו במכשירים רב-ערוציים24,25. מספר אירועים תאיים ותת-תאיים מתרחשים על פני סקאלות זמן של מספר שעות ודורשים לכידה של אותו אדם בנקודות זמן שונות במהלך התפתחותם כדי לאפיין את כל שלבי הביניים בתהליך כדי להבין את הדינמיקה התאית in vivo. כדי לדמות תהליכים ביולוגיים כמו אורגנוגנזה, התפתחות עצבית ונדידת תאים, החיה צריכה להיות משותקת באותו כיוון בכמה נקודות זמן. פרסמנו בעבר פרוטוקול להדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans במשך יותר מ-36 שעות כדי לקבוע היכן מוסיפים מיטוכונדריה לאורך תאי העצב של קולטני המגע (TRNs)23.

מאמר זה מספק פרוטוקול לביסוס מתודולוגיה מבוססת מיקרופלואידיקה להדמיה חוזרת ונשנית ברזולוציה גבוהה. מכשיר זה, עם ערוץ זרימה יחיד, מתאים ביותר להדמיה חוזרת ונשנית של חיה בודדת לכל מכשיר. כדי לשפר את התפוקה ולצלם בעלי חיים רבים בו-זמנית, ניתן לחבר התקנים מרובים לאותו קו לחץ, אך עם מחברים תלת-כיווניים נפרדים השולטים על חיה אחת בכל מכשיר. העיצוב שימושי למחקרים הדורשים תמונות ברזולוציה גבוהה של קיטועי זמן כגון תהליכים התפתחותיים פוסט-עובריים, נדידת תאים, הובלת אברונים, מחקרי ביטוי גנים ועוד. הטכנולוגיה עשויה להיות מגבילה עבור יישומים מסוימים כגון מחקרי תוחלת חיים והזדקנות הדורשים גדילה והדמיה מקבילים של בעלי חיים רבים בשלב מאוחר. אלסטומר פולידימתילסילוקסן (PDMS) שימש לייצור מכשיר זה בשל יציבותו הביולוגית26, תאימות ביולוגית 27,28, חדירות גז 29,30, ומודולוס אלסטי הניתן לכוונון 31. התקן דו-שכבתי זה מאפשר צמיחה של בעלי חיים עם אספקת מזון רציפה בתעלה מיקרופלואידית ולכידה של C. elegans בודדים באמצעות דחיסת ממברנת PDMS באמצעות גז חנקן. מכשיר זה הוא הרחבה של המכשיר שפורסם בעבר עם היתרון של גידול והדמיה של אותה חיה במיקרו-ערוץ תחת אספקת מזון רציפה3. רשת ממברנות הבידוד הנוספת וממברנת לכידה ברוחב 2 מ"מ מאפשרות אימוביליזציה יעילה של בעלי חיים מתפתחים. המכשיר שימש לצפייה בהתפתחות עצבית, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירוני PVD חושיים. בעלי החיים גדלים ללא השפעות בריאותיות שליליות במכשיר וניתן לשתק אותם שוב ושוב כדי להקל על הדמיית אירועים תת-תאיים באותה חיה במהלך התפתחותה.

הפרוטוקול כולו מחולק לחמישה חלקים. חלק 1 מתאר ייצור מכשירים עבור שבב הגידול וההדמיה. חלק 2 מתאר כיצד להקים מערכת לחץ עבור סטיית ממברנת PDMS כדי לשתק ולבודד C. elegans בודדים. חלק 3 מתאר כיצד לסנכרן C. elegans על צלחת מדיום גידול נמטודה (NGM) להדמיית מכשירים. חלק 4 מתאר כיצד לטעון חיה בודדת במכשיר ולגדל את החיה בתוך המכשיר המיקרופלואידי במשך מספר ימים. חלק 5 מתאר כיצד לשתק חיה בודדת בנקודות זמן מרובות, לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות שונות ולנתח את התמונות באמצעות פיג'י.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור של מכשיר גידול והדמיה

  1. ייצור עובש SU8
    1. עצבו תבניות 1 (שכבת זרימה) ו-2 (שכבת בקרה) באמצעות צורות מלבניות בתוכנת עיבוד תמלילים (או בתוכנת CAD לתכנון בעזרת מחשב) והדפיסו את מסכות הצילום בעזרת מתווה לייזר עם גודל תכונה מינימלי של 8 מיקרומטר על סרט מבוסס פוליאסטר (איור 1).
    2. חותכים פרוסות סיליקון לחתיכות של 2.5 ס"מ × 2.5 ס"מ ומנקים אותן עם 20% KOH למשך דקה אחת. שטפו את הוופלים במים שעברו דה-יוניזציה (DI). השתמש בפרוסה אחת כל אחת עבור הזרימה ושכבת הבקרה.
      אזהרה: KOH הוא קורוזיבי ויש לטפל בו בזהירות.
    3. יבשו את החלקים עם גז חנקן דחוס 14 psi ואחריו התייבשות על צלחת חמה בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. לפני שממשיכים לשלב הבא, מצננים את שתי החלקים לטמפרטורת החדר.
    4. קח את אחת מחתיכות הסיליקון ושים אותה על צ'אק של מעיל ספין והפעל את הוואקום כדי להחזיק את הוופל במקום. על חתיכת הסיליקון, שים ~ 20 μL של הקסמתיל-דיסילן (HMDS) וצפה אותו באמצעות מעיל הסיבוב ב 500 סיבוב לדקה (סל"ד) במשך 5 שניות ואחריו 3,000 סל"ד במשך 30 שניות.
      התראה: שלב זה צריך להתבצע באור צהוב. אין להשתמש באור לבן בחדר.
    5. כדי לקבל עובי פוטורסיסט אחיד של ~ 40 מיקרומטר (ספציפי לשכבת הזרימה; מתאים להדמיה מוקדמת של זחלים שלב 1 עד שלב 3 (L1 - L3) בעלי חיים), מצפים את פרוסת הסיליקון עם ~ 1.5 מ"ל של פוטורסיסט-1 שלילי באמצעות מעיל ספין ב 500 סל"ד במשך 5 שניות ואחריו 2,000 סל"ד במשך 30 שניות.
    6. חזור על שלבים 1.1.4 ו- 1.1.5 עם הוופל השני כדי לקבל עובי פוטורסיסט אחיד של ~ 40 מיקרומטר ספציפי לשכבת הבקרה.
    7. לחלופין, כדי להגדיל את עובי שכבת הזרימה ל~80 מיקרומטר עבור בעלי חיים מבוגרים יותר, מצפים פרוסות סיליקון עם ~1.5 מ"ל של פוטורסיסט-2 שלילי באמצעות מעיל הסיבוב ב-500 סל"ד למשך 5 שניות ואחריו 2,000 סל"ד למשך 30 שניות. עובי זה מתאים לשלב L3 לבעלי חיים בוגרים.
      אזהרה: החזיקו את פרוסות הסיליקון בצדדים כדי למנוע נזק לשכבות המצופות בספין. השאר את האורות הלבנים כבויים במהלך שלב זה.
    8. אופים את חתיכות הסיליקון המצופות בפוטורסיסט (לשכבות זרימה ובקרה) על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ואחריה 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מצננים את החתיכות האפויות לטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן לאחסן את חתיכות הסיליקון האפויות למשך יום אחד לפני שממשיכים לשלב הבא. יש לאחסן בחושך ולא לחשוף לאור לבן.
    9. הניחו חתיכות סיליקון רכות על במת החשיפה של תאורת ה- UV כאשר המשטח המצופה בפוטורסיסטים פונה למנורת ה- UV. חשוף את שני החלקים בנפרד ל- UV למשך 15 שניות, באמצעות מנורה של 200 וואט, באמצעות מסיכת צילום עם תבניות 1 ו- 2 כדי לקבל שכבות זרימה ובקרה, בהתאמה.
      אזהרה: יש להרכיב משקפי מגן ולהימנע מחשיפה ישירה לאור UV. אין להדליק אור לבן בחדר בשלב זה.
    10. אופים את שני חלקי הסיליקון החשופים עם שכבה מצופה הפונה כלפי מעלה, בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ואחריה 95 מעלות צלזיוס למשך דקה ו-10 דקות בהתאמה. מצננים את החלקים לטמפרטורת החדר לפני שממשיכים לשלב הבא.
    11. פתח את התבניות על ידי השריית חתיכות הסיליקון בתמיסת מפתח הפוטורסיסט (דילול 1:3 של המפתח באיזופרופנול) למשך 20 דקות. ברגע שהתבנית נראית לעין, יש לשטוף את החלקים באלכוהול איזו-פרופיל טהור (IPA) ולייבש בעדינות באמצעות גז חנקן (14 psi).
      התראה: השתמש בסביבה מאווררת היטב לטיפול כימי זה כדי למנוע חשיפה לבני אדם. השתמש באור לבן רק לאחר פיתוח התכונות ושטיפתן באמצעות IPA.
    12. יש לשמור את חתיכות הסיליקון במייבש כאשר המשטח המצופה פונה כלפי מעלה. חשוף את החלקים לאדי סילאן על ידי מזיגת 50 μL של טריכלורו טהור (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן על פלסטיק קטנה או מגלשת זכוכית. מניחים את הגביע/מחליק בתוך חומר ייבוש ודוגרים במשך שעתיים.
      אזהרה: יש להימנע מחשיפה ישירה לאדי סילאן. יש להשתמש תמיד בתא אטום לטיפול באדי סילאן.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לאחסן את חתיכות הסיליקון שפותחו למשך 1-2 ימים לפני שתמשיך לשלב הבא.
  2. ייצור שבבי PDMS
    1. הכינו PDMS בכוס פלסטיק על ידי ערבוב בסיס האלסטומר עם חומר הריפוי ביחס של 10:1. מערבבים היטב את התוכן על ידי ערבוב מתמיד במשך 3 דקות. הערבוב ייצור הרבה בועות אוויר בתערובת PDMS.
    2. דגה את תערובת PDMS במייבש למשך 30 דקות כדי להסיר את כל בועות האוויר.
      התראה: ודא כי בועות אוויר מוסרות מתערובת PDMS לפני ששפכו אותן על התכונות, שכן בועות עלולות לגרום להתקנים פגומים ולא פונקציונליים.
    3. מניחים את פרוסות הסיליקון עם שכבת הבקרה (דוגמה 2) בצלחת פטרי. יש לשפוך בעדינות שכבת תערובת PDMS בעובי 5 מ"מ על חתיכת הסיליקון ולהימנע מהיווצרות בועות.
    4. דגה את תערובת PDMS במייבש כדי להסיר בועות נוספות הנוצרות במהלך תהליך המזיגה של PDMS.
    5. הניחו את פרוסת הסיליקון עם שכבת זרימה (תבנית 1) על צ'אק המסתובב תוך הפעלת לחץ ואקום של 200-500 mTorr כדי להחזיק את הוופל. יוצקים ~ 1 מ"ל של PDMS על פרוסת הסיליקון ומצפים אותה באמצעות מעיל ספין ב 500 סל"ד במשך 5 שניות ואחריו 1,000 סל"ד במשך 30 שניות כדי לקבל שכבה בעובי ~ 80 מיקרומטר.
    6. אופים את שני פרוסות הסיליקון בעזרת PDMS מצופה ספין ושופכים שכבות PDMS בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס בתנור הסעה באוויר חם למשך 6 שעות. לאחר האפייה, המתינו עד שהחתיכות יתקררו בטמפרטורת החדר.
    7. חותכים את שכבת ה-PDMS בעובי 5 מ"מ מחתיכת הסיליקון סביב שכבת הבקרה (תבנית 2) באמצעות להב חד ומקלפים אותה ממצע הסיליקון.
    8. נקב שני חורים בקוטר ~ 1 מ"מ באמצעות מנקב האריס במאגר של בלוק PDMS כדי לחבר את ערוץ האימוביליזציה וכניסות תעלת הבידוד לקווי הגז עבור סטיות ממברנת PDMS.
    9. הנח את חתיכת הסיליקון עם שכבת PDMS מצופה ספין על תבנית 1 (שכבת זרימה), כאשר המשטח המצופה PDMS פונה כלפי מעלה, על מגש פלסטיק. שמור את בלוק ה-PDMS המנוקב עם תבנית 2 (שכבת בקרה) על המגש כשהצד המעוצב פונה כלפי מעלה.
    10. שמרו את מגש הפלסטיק בתוך חומר ניקוי פלזמה וחשפו את שני משטחי ה-PDMS לפלזמה אווירית של 18 וואט למשך 2 דקות תחת ואקום נמוך (200-600 mTorr). יש למרוח את הוואקום עד שהתא הופך לסגול בהיר. בצע שלב זה תחת תאורה חלשה כדי לראות את צבע הפלזמה משתנה.
    11. הוציאו את שני הבלוקים שטופלו בפלזמה וקשרו בעדינות את הבלוקים על ידי לחיצה על המשטחים המטופלים בפלזמה של תבניות 1 ו-2 יחד. אופים את התבניות המלוכדות בחום של 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים בתנור הסעה עם אוויר חם.
    12. הוציאו את המכשיר הדחוס מהתנור. חותכים את המכשיר המחובר מתוך פרוסת סיליקון עם תבנית 1 ותבנית 2, ומנקבים חורים במאגרי הכניסה והיציאה של שכבת הזרימה באמצעות מנקב האריס.
    13. הניחו את בלוק ה-PDMS המחובר כששכבת הזרימה פונה כלפי מעלה על מגש פלסטיק. שמרו על זכוכית כיסוי נקייה (#1.5) על אותו מגש. חשוף את הבלוקים ואת זכוכית הכיסוי לפלזמה אוויר של 18 W למשך 2 דקות. התאם את לחץ הוואקום כדי לראות תא סגול.
      הערה: שלב זה צריך להיעשות בתאורה חלשה כדי לראות את שינוי צבע הפלזמה. כדי לנקות את זכוכית הכיסוי, יש לשטוף אותה עם IPA ולייבש באמצעות גז חנקן ב-14 psi.
    14. מניחים את גוש ה-PDMS החשוף בפלזמה על גבי זכוכית הכיסוי ואופים את המבנה המלוכד בתנור בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. אחסן את ההתקן בתא נקי לכל ניסוי עתידי.

2. פרימה של ממברנת PDMS

  1. קח את המכשיר ושים אותו על סטריאומיקרוסקופ וחבר את הצינורות. חבר צינור מיקרו פלקס (קוטר פנימי ~ 5 מ"מ, קוטר חיצוני ~ 8 מ"מ) לקו גז חנקן דחוס בקצה אחד. חבר מחבר תלת-כיווני בקצה השני. צינורות 1 ו -2 של המחברים התלת-כיווניים יחוברו לממברנות המלכודת והבידוד, בהתאמה.
  2. חבר שני צינורות מיקרו פלקס (קוטר פנימי ~ 1.6 מ"מ, קוטר חיצוני ~ 5 מ"מ) לשתי יציאות היציאה של הפקק התלת-כיווני. חבר את הקצה השני של שני הצינורות למחט באורך 8 מ"מ 18 גרם.
  3. מלא את שכבת הזרימה במאגר M9 באמצעות מיקרופיפטה דרך פתח הכניסה. ממלאים את שני הצינורות במי DI דרך הקצה המחובר למחט. הכנס את שתי המחטים לתוך החורים המנוקבים, המחברים את קרום הבידוד והלכידה, בהתאמה.
  4. פתח את וסת גז החנקן ב 14 psi וסובב את השסתום התלת-כיווני מצינור 1 כדי לדחוף את המים לתוך המכשיר דרך התעלות המיקרופלואידיות בשכבות הבקרה כלומר, קרום המלכודת והבידוד.
  5. המתן עד שהמים ימלאו את הערוץ ללא נוכחות של טיפות אוויר בשני הערוצים. ברגע שהתעלות מתמלאות לחלוטין במים, התעלות נחשבות לפרימיות.
  6. שחררו את הלחץ באמצעות ה-stopcock התלת-כיווני ברגע שהתעלות מתמלאות במים ומוכנות מראש. פרימינג יכול להוביל לבועות בשכבת הזרימה, להסיר את הבועות על ידי הזרמת מדיה נוספת דרך ערוץ הזרימה.

3. ג. אלגנס תחזוקה וסנכרון

הערה: C. elegans זנים: המחקר השתמש בעקבות טרנסגנים PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) לפיתוח הפות 32, jsIs609 (mec7p::MLS (אות לוקליזציה של מטריצה מיטוכונדריאלית)::GFP)33 לפיתוח נוירון קולטן מגע (TRN) והדמיית הובלת מיטוכונדריה, ו-wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) כדי לעקוב אחר פיתוח PVD34. תקן C. elegans תרבות ופרוטוקול תחזוקה היה אחריו35.

  1. לגדל C. elegans על מדיום צמיחת נמטודה (NGM) צלחות פטרי עם E. coli OP50 כמקור מזון ב 22 מעלות צלזיוס. שמרו על זני C. elegans על ידי העברה חוזרת ונשנית של כמה הרמפרודיטים או חיתוך כמות קטנה של אגר עם כמה בעלי חיים לצלחת NGM חדשה עם מדשאה OP50.
  2. לאחר 3-5 ימים, בדוק את צלחת NGM לצמיחת בעלי חיים וביצי C. elegans. לאסוף ולהעביר כ-30 ביצים מצלחת לצלחת NGM טרייה עם מדשאה OP50.
  3. כדי לסנכרן בעלי חיים להדמיה, העבירו את כל הביצים שלא נקטפו מהצלחת כל שעתיים לצלחת טרייה ושמרו עליהן בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. כ-15-20 ביצים יבקעו בכל צלחת.
  4. בחרו את בעלי החיים בין 14-16 שעות ל-28-30 שעות לאחר הבקיעה לשלבי זחל 2 (L2) וזחל 3 (L3), בהתאמה. העבירו את בעלי החיים למכשיר המיקרופלואידי להדמיה. הוסף אספקת מזון כמתואר בסעיף הבא כדי לשמור על החיה בתוך המכשיר לניסויי גדילה והדמיה ארוכי טווח.

4. C . elegans צמיחה בתוך מכשיר הגידול וההדמיה המיקרופלואידי

  1. הרכיבו מכשיר מיקרופלואידי לגידול והדמיה על מיקרוסקופ הפוך וצפו בתבנית 2, לאחר חיבור קרומי הבידוד וקרום האימוביליזציה, בהגדלה נמוכה (4x או 10x). ודאו שהתעלות מלאות במים מזוקקים ונקיים.
  2. הכן תמיסה טרייה של 1 ליטר של מדיום S באמצעות 10 מ"ל של 1 M אשלגן ציטראט pH 6.0, 10 מ"ל של תמיסת מתכות קורט, 3 מ"ל של 1 M CaCl2, 3 מ"ל של 1 M MgSO4. הכן את הפתרון בתנאים סטריליים. אין לבצע אוטוקלב של מדיום ה-S.
  3. מלא את ערוץ הזרימה במדיית גדילה (S בינונית) 10 דקות לפני הניסוי. הימנע מבועות אוויר בערוץ הזרימה. זרימה מדיום נוסף במידת הצורך כדי להסיר בועות אוויר.
  4. בחר חיה בודדת משלב ההתפתחות הנדרש מצלחת NGM במדיום S של 10 μL באמצעות מיקרופיפטה ודחף את החיה לתעלת הזרימה דרך חור הכניסה.
  5. עקוב אחר מיקום בעלי החיים בערוץ הזרימה באמצעות מטרת הגדלה נמוכה. הזרימו מדיום נוסף דרך הכניסה או היציאה כדי לדחוף את החיה ולמקם אותה בתוך תעלת הזרימה המוגבלת בין שני קרומי הבידוד.
  6. פתח את הסטופק התלת-כיווני כדי להפעיל לחץ של 14 psi בתעלות הבידוד ולדחוף את הממברנות למטה לתוך תעלת הזרימה.
    הערה: הממברנה אוטמת חלקית את תעלת הזרימה ומגבילה את תנועת בעלי החיים לאזור שבין שני ממברנות הבידוד.
  7. השתמש במושבה אחת של E. coli OP50 מצלחת פסים כדי לחסן 250 מ"ל של מרק L (2.5 גרם באקטו-טריפטון, 1.25 גרם לקטו-שמרים, 1.25 גרם NaCl ב- H2O). לגדל את התרבות מחוסנת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  8. Aliquot 500 μL של תרבית OP50 לתוך צינורות צנטריפוגה סטריליים 1.5 מ"ל ולאחסן את המלאי ואת aliquot במשך 2 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. גלולה למטה תרבות OP50 על ידי צנטריפוגה ב 1.3 x גרם במשך 5 דקות. ממיסים את הכדור ב-1 מ"ל של S בינוני טרי (דילול פי 0.5) ומאחסנים אותו בטמפרטורת החדר למשך 3-4 ימים. השתמש ב- OP50 המדולל הזה כדי להזין C. elegans בתוך התקנים מיקרופלואידיים.
  10. השאירו טיפה של מדיום S על גבי מאגרי הכניסה והיציאה כדי להפחית את האידוי של מדיום S בערוץ הזרימה.
  11. קח תמיסת OP50 מדוללת במיקרופיפטה של 10 μL. הסר את קצה המיקרו המלא בתמיסת OP50 מהפיפטה והכנס את הקצה למאגר הכניסה. לאחר מכן מניחים עוד קצה micropipette עם 10 μL של תמיסת מזון ולהכניס אותו לתוך מאגר מוצא.
  12. אטמו את ראש הקצה והפעילו לחץ באמצעות אצבע כדי להבטיח המשכיות של תמיסות מזון ללא מרווח אוויר. החלף את קצה המיקרופיפטה בתמיסת OP50 בכל יום שאינו עולה על 3-4 ימים.
  13. מלאו 20-30 מיקרוליטר נוספים של תמיסת מזון בשני הקצוות. הוסף או הסר תמיסת מזון אל קצה המיקרופיפטה וממנו כדי להתאים את השיפוע לדחוף את החיה בתעלת הזרימה ולהתאים את מיקום החיה מתחת לקרום הלכידה לצורך הדמיה.
  14. נטר את זרימת החיידקים כדי לוודא שהיא רציפה דרך קרומי הבידוד הסגורים חלקית בתעלת הזרימה באמצעות תמונות שדה בהיר.
    הערה: בהיעדר זרימת חיידקים, בעלי חיים עשויים לאכול את החיידקים הזמינים בתעלת הזרימה שבין שני ממברנות הבידוד. במקרה שאין חיידקים או אין זרימה בתעלה, החליפו את שני קצוות המיקרופיפטה בכניסה ובשקע בקצות פיפטה חדשים מלאים באספקת מזון טרי.

5. C. elegans אימוביליזציה והדמיה

  1. C. אימוביליזציה של elegans מתחת לקרום הלכידה
    1. אתרו בעל חיים בודד בערוץ הגדילה בהגדלה נמוכה. התאם את גובה תמיסת המזון בשני קצוות המיקרופיפטה המחוברים למאגרי הכניסה והיציאה. דחפו את החיה בכיוון הנדרש באמצעות הפרשי הלחץ ההידרוסטטיים בתעלת הזרימה.
    2. מקמו את בעל החיים במרכז קרום הלכידה ועקבו אחר התנהגות השחייה שלו באמצעות מטרת הגדלה נמוכה (4x).
    3. סובב את הפקק התלת-כיווני כדי להגביר את הלחץ בתעלת המלכודת באיטיות. לשתק את החיה מתחת לקרום המלכודת בתנוחה ישרה לאורך קיר גבול תעלת הצמיחה.
      התראה: הימנע מלכידה של החיה על פני ערוץ הזרימה במצב כיפוף Z או U. זה גורם לגוף החיה להידחק בלחץ גדול יותר וגורם נזק בלתי הפיך לבריאותו.
  2. C. elegans הדמיה ושחרור מהממברנה
    1. לשאת ולהעמיס את המכשיר על במת מיקרוסקופ. הגדר מיקרוסקופ הפוך בהגדרות ההדמיה הרצויות עם כל הרכיבים האופטיים הדרושים (מטרה, מקור אור, מסנני פלואורסצנציה וגלאי) לשדה בהיר ברזולוציה גבוהה, ניגודיות הדמיה דיפרנציאלית (DIC) או הדמיה פלואורסצנטית (איור משלים 1).
    2. רכשו תמונה פלואורסצנטית בודדת או מספר תמונות של קיטועי זמן כדי ללכוד אירועים תאיים ותת-תאיים.
    3. קבל תמונות פלואורסצנטיות של נוירונים C. elegans כפונקציה של התפתחותם באמצעות מטרה של צמצם מספרי (NA) של 60x, 1.4, לייזר באורך גל של 488 ננומטר עם כוח לייזר של 7%-10%, מצלמת CCD, על מיקרוסקופ דיסק מסתובב. בצע הדמיה בהילוך מהיר באמצעות התוכנה המסופקת עם המיקרוסקופ וקבל תמונות במהירות של 4 פריימים לשנייה (איור משלים 1).
    4. לאחר רכישת תמונות, לשחרר את לחץ ההשמנה ולפקח על התנועה של החיה בהגדלה נמוכה - 4x ו 10x. יש להגביל את בעל החיים בתוך האזור המוגדר על ידי ממברנות מבודדות (המוחזקות מתחת ל-14 psi לאורך כל הניסוי).
    5. התאם את נפח תמיסת המזון בשני קצוות המיקרופיפטה כדי להמשיך זרימת מזון איטית המונעת על ידי כוח הכבידה בערוץ הצמיחה. זרימת מזון זו מתקבלת על ידי התאמת רמות תמיסות המזון במיקרופיפטים בכניסה ובשקע (בדרך כלל הפרש גובה של 1-5 מ"מ).
    6. דמיינו את הזרימה תחת שדה בהיר מתבנית הזרימה של החיידקים בתעלת הגדילה.
      הערה: בהיעדר זרימה, החיה אוכלת את חיידקי OP50 הזמינים, התעלה נראית צלולה, והחיה גוועת ברעב במשך כמה שעות. בעל חיים מורעב מפתח בדרך כלל אוטופלואורסצנטיות גבוהה, הניתנת לצפייה בקלות בעת רכישת תמונות פלואורסצנטיות בהילוך מהיר. לאירועים כאלה יש השפעות מזיקות על הפיזיולוגיה של בעלי חיים והם נמנעו בניסויים.
    7. חזור על שלבים 5.2.1-5.2.3 לאחר מרווח זמן מוגדר מראש כדי להשיג תמונות פלואורסצנציה/ DIC/שדה בהיר של אותו אדם בנקודות זמן מרובות.
    8. לאחר שהתמונות נרכשות במספר נקודות זמן רצויות מאותה חיה בודדת, שחררו את לחץ הבידוד והלכידה. שטפו את התעלה עם חיץ M9 ודחפו את החיה דרך מאגר הכניסה. החזירו את החיה מהמאגר והניחו את החיה על צלחת NGM טרייה לניטור בריאותי נוסף.
    9. שטפו את התעלה עם מאגר M9 כמה פעמים כדי להסיר חיידקים. שוטפים את תעלת הזרימה ב-70% אלכוהול אתילי (מדולל במים מזוקקים). ייבשו את התעלות על ידי דחיפת אוויר באמצעות מזרק. יש לאחסן את המכשיר במקום יבש ללא אבק לשימוש חוזר בעתיד.
  3. ניתוח תמונות וסטטיסטיקה
    1. השתמש בתוכנת FIJI ImageJ לניתוח תמונות tiff. תמונות טיף פתוחות של תמונות קיטועי זמן PVD מחיות wdIs51 בפיג'י ImageJ. חלץ את המישורים הטובים ביותר מאוסף מישורי z המציגים את התהליכים העיקריים על-ידי בחירה בכרטיסייה Image > פרוייקט 'אוספים' >- Z.
    2. סנן את כל סדרת התמונות ומצא מסגרות תמונה ספציפיות המכסות בהצלחה את כל התהליכים העצביים באמצעות חלקים חופפים של מסגרות התמונה של בעלי החיים. בחר תוסף > נתח מונה תאים > מסרגל הכלים של FIJI. פעולה זו תפתח חלון למספור ענפים שונים ולשמירה על ספירה של כל נוירון שנבחר.
    3. בחר אתחל מונים > > Type1 ולאחר מכן סמן את הענפים המשניים. לאחר מכן בחר סוג 2 וסמן רבעוני, לחץ על חלון תוצאות המציג ספירות של כל הענפים (איור משלים 2). שיטה זו תציג את הענפים שכבר נספרו.
    4. פתחו את התמונה החופפת הבאה וספרו את הענפים הנותרים. תהליך זה ימנע ספירה כפולה ויבטיח שכל תהליך ייספר. זהה וספור את המספר הכולל של ענפים ראשוניים הנמצאים בשלבי הזחל המוקדמים של C. elegans. בצע ניתוח דומה עבור התמונות עבור תהליכים משניים ורבעוניים בבעלי חיים מבוגרים יותר.
      הערה: מבוגרים מראים תהליכים רבים שמתעבעים בשרירי דופן הגוף ויכולים להיות קשים לספירה. ודא שכל תהליך נספר פעם אחת בלבד.
    5. חשב את המרחק בין גופי תאי ה-PVD בחיות wdIs51 על-ידי שרטוט קו מקוטע מגוף תא ה-PVD (CB) ל-PVC CB. עבור חיות שלב זחל 4 (L4), גופי התאים רחוקים זה מזה ואינם נמצאים באותה מסגרת כאשר הם מצולמים עם מטרה של פי 60.
    6. בחרו תמונות חופפות מהאוסף כדי לכסות את כל אורך החיה מראש ועד הזנב באמצעות הכרטיסייה 'תמונה' > הפרויקט 'אוספים' >-Z מ-ImageJ. ציירו קווים מקוטעים לאורך התהליך העצבי בין ה-PVD ל-PVC CBs.
    7. מדוד את האורכים של כל הקווים המפולחים באמצעות ImageJ > נתח > מדידה. הוסף את האורכים עבור כל המקטעים כדי לחשב את המרחק הכולל בין CBs PVD ו- PVC עבור כל נקודת זמן.
    8. עבור אורך תאי עצב של TRNs בחיות jsIs609 , טען את התמונות בפיג'י. ציירו קו מקוטע לאורך המיקרוטובולים הלטרליים האחוריים (PLMs; נראים עם GFP מסיס) מגוף התא ועד למרכז המיטוכונדריה הראשון. חישוב אורך הקו עבור ערך המרחק הראשון.
    9. ציירו קו מקוטע ממרכז המיטוכונדריה הראשונה לשנייה. חזור על תהליך זה עבור כל זוג מיטוכונדריה עד סוף אורך התהליך העצבי. הוסף את כל האורכים כדי לחשב את אורך התהליך העצבי הכולל.
    10. לצורך ניתוח שושלת התאים, טען את כל תמונות הפות בפיג'י וחלץ את תמונת המיקוד הטובה ביותר של התאים מתמונות קיטועי הזמן של מישורי z מרובים.
    11. הצג את הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). חשב מובהקות סטטיסטית באמצעות ANOVA חד-כיווני עבור יותר משתי דגימות או מבחן t של שתי דגימות עבור זוג דגימות. ציין משמעות לפי ערך p < 0.05 (*), ערך p < 0.005 (**) וערך p > 0.05 (ns, לא משמעותי).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון מכשיר: מכשיר הגדילה וההדמיה מורכב משתי שכבות PDMS המחוברות זו לזו (איור 1) באמצעות מליטה פלזמה בלתי הפיכה. שכבת הזרימה (תבנית 1) שאורכה 10 מ"מ וגובהה 40 מיקרומטר או 80 מיקרומטר מאפשרת לנו לגדל את החיה בתרבית נוזלית (איור 1A). לשכבת הלכידה (תבנית 2) יש קרום ברוחב 2 מ"מ (איור 1B) לשיתוק החיה לצורך הדמיה ברזולוציה גבוהה. המסכה של שכבת הלכידה יוצרת גם זוג קרומי בידוד להגבלת תנועת בעלי חיים בתוך מקטע של תעלת הזרימה בין נקודות זמן עוקבות של הדמיה. קרום ההשמנה של המכשיר מותאם ממכשיר ההדמיה הקודם שלנו3. ההתקן הנוכחי (איור 1C,L) כולל תוספת של קרום בידוד והגדלת רוחב קרום הלכידה ל-2 מ"מ לצורך אימוביליזציה יעילה של אותה חיה על פני מספר נקודות זמן.

כדי לבחון את המכשיר, מים מזוקקים נקיים מולאו בתעלות המיקרופלואידיות המחברות בין ממברנות הלכידה (איור 1D,E ואיור משלים 3) והופעלו בלחץ באמצעות גז חנקן 14 psi, המשמש גם ללכידת חיה תחת קרום PDMS בעובי 2 מ"מ (איור 1H,K,L). חיה בודדת נקטפה מצלחת NGM באמצעות מיקרופיפטה והועמסה לתעלת הזרימה (איור 1F). ערוץ הגדילה התמלא בחיידקים שהוחזרו במדיית S (איור 1F,G,I,J). זרימה קבועה נשמרה לאורך כל משך ההדמיה על ידי התאמת גובה המדיה בקצות הפיפטה המחוברים לכניסת המכשיר ולשקע תוך ניטור החיה בתעלת הזרימה בין שני קרומי הבידוד. תמיסת OP50 טרייה מולאה בקצות המיקרופיפטה מדי יום כדי להבטיח מקור מזון בריא לחיה בתוך המיקרו-ערוץ. מקור מזון טרי וחומר PDMS חדיר לגז מבטיחים אספקת חמצן מספקת בתוך המיקרו-ערוץ30,29. מעקב אחר גדילת בעלי חיים במכשיר נעשה באמצעות סמנים ספציפיים לתא או סמנים המציגים שושלת תאים או דפוסי ביטוי תאיים משתנים במהלך ההתפתחות. בעלי החיים היו משותקים מתחת לקרום הלכידה באמצעות גז חנקן 14 psi והחזקת תולעים במצב ישר לאורך דופן התעלה. החיה גדלה לאט יותר בתוך התעלה המיקרופלואידית בהשוואה לצלחת NGM23.

מחקר שושלת תאים באמצעות מכשיר הדמיה לטווח ארוך: כדי להעריך את התפתחות C. elegans בתוך המכשיר המיקרופלואידי, הגדלנו את זןPS3239 (ZMP-1::GFP) עם אספקת מזון קבועה כדי לעקוב אחר התפתחות הפות בנקודות זמן שונות של צמיחתם. ZMP-1 מקודד עבור אבץ מטאלופרוטאז ומתבטא בתא העוגן בשלב L3, בתאי vulD ו-vulE בשלב L4, וב-vulA בחיות בוגרות ביום 1 (1D) (איור 2A). השינויים בדפוס הביטוי מייצגים דוגמה לוויסות גנים טמפורלי שבו אותו גן מתבטא בתאים שונים בשלבי התפתחות שונים. כדי לצפות בהתפתחות הפות, החיה הושתקה תחילה ואזור הפות צולם על פני מספר מישורי z כל 8-10 שעות מ-L3 ואילך ועד לשלבים בוגרים. ZMP-1::GFP מתבטא בתאי פות שונים בהתאם לשלב ההתפתחותי (איור 2B). התמונות הפלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה של תאי הפות מבעלי החיים הגדלים בתוך המכשיר המיקרופלואידי מדגימות התפתחות פות תקינה וביטוי ולוקליזציה של ZMP-1::GFP דומים לדיווחים קודמים32.

מעקב אחר התפתחות נוירונים באמצעות מכשיר גדילה והדמיה לטווח ארוך: כדי להדגים את השימוש במכשיר להדמיה תת-תאית מבעל חיים בודד, בוצע מעקב אחר התפתחותם של שני נוירונים מכנו-חושיים PVD ו-TRNs. הזן NC1686 המבטא את wdIs51 המבטא GFP בשני תאי העצב PVD היה בשימוש34,36. כל נוירון PVD מראה ארכיטקטורה דנדריטית מסועפת דמוית מנורה המורכבת מתהליכים ראשוניים (PP), משניים (SP), שלישוניים (TP) ורבעוניים (QP) ב-L2 (14-16 שעות), L2 מאוחר (20-22 שעות), L3 (24-26 שעות) ו-L4 (36-42 שעות), בהתאמה (איור 3). גוף תא ה-PVD נמצא אחורית לפות. הוא שולח אקסון אחד ושני תהליכים דנדריטיים עיקריים שמולידים SP ו-TP, שבתורם מולידים ענפים דנדריטיים של QP שמעוררים את שרירי דופן הגוף. שלבים מאוחרים L3 ו- L4 מראים סבוריזציה גבוהה37,34. גידלנו חיות בודדות מדגם NC1686 בתוך המכשיר המיקרופלואידי והאכלנו אותן ברציפות במזון חיידקי. בעלי החיים היו משותקים במהלך L2 עד שלב 1D של התפתחות, והנוירונים PVD צולמו שוב ושוב כל 8-12 שעות באמצעות 60x, 1.3 NA שמן המטרה לספור את מספר ענפי SP, TP ו- QP בשלושה ממדים. היקף ההסתעפות עלה במהלך ההתפתחות כפי שניתן לראות באיור 3B. המספרים של SP ו-QP בשלבים שונים של התפתחות התולעת עלו עם הגיל (איור 4A) כפי שראינו במחקרים קודמים37. חיות L2 הראו 10 ± 3.8 (n = 9) SPs אך ללא QP, כאשר נמדדו באמצעות המכשיר (איור 4A). מיקמנו C. elegans בטיפה של 3 mM levamisole, חומר הרדמה שגורם להתכווצות שריר דופן הגוף ושיתוק, כדי למזער את ההשפעות השליליות על הובלת אברונים תוך הפחתת תנועות בעלי חיים וגרימת שיתוק מספיק, הנדרש להדמיה ברזולוציה גבוהה 3,4. ערכי SP (4 ± 1.6, n = 25, p = 0.15) לא היו שונים באופן משמעותי כאשר נמדדו מחיות בשלבים דומים שגודלו על לוחות NGM והצטלמו באמצעות 3 mM levamisole בשקופית אגר (איור 4B). הנתונים מצביעים על כך שאימוביליזציה של המכשיר מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורות עצביות מורכבות ואינה משפיעה על התפתחותן. לחיות שלב L3 יש מספר קטן של QP שגדל במספרו עם ההתפתחות. מבוגרים חד-ממדיים הראו 67 ± 2.8 QPs (n = 5) בבעלי חיים שגדלו במכשיר. מחקרים קודמים הראו היווצרות כמו גם נסיגה של תהליכי PVD במהלך הפיתוח המכונה הימנעות עצמית, שם הם מפחיתים את מספר הענפים שלהם38. הירידה ב-SP ב-51 שעות (1D) לאחר הבקיעה יכולה להיות תוצאה של נסיגות כאלה. בעלי חיים שגדלו על לוחות NGM והצטלמו באמצעות לבאמיזול של 3 mM הראו מגמת הסתעפות דומה עבור שלבי התפתחות דומים (איור 4A,B). יתר על כן, המרחק בין שני גופי תאי ה-PVC, אחד נוכח בזנב והשני ליד הפות, גדל ככל שהם מתרחקים זה מזה בחיות שגדלו במכשיר או באלה שגדלו על צלחות NGM (איור 4C,D). לאורך כל תהליך ההדמיה, בעלי החיים נשארו בריאים ויכלו להטיל ביצים גם לאחר שהחיות היו משותקות מתחת לממברנה שוב ושוב במשך תקופה ארוכה זו.

באמצעות מכשיר זה, הצלחנו לשתק את החיה באותו כיוון ולדמיין את אותו נוירון ואת הארכיטקטורה שלו ברזולוציה גבוהה אפילו עם הבעת GFP קלושה. כדי להדגים את התועלת של טכנולוגיית הצמיחה והאימוביליזציה שלנו, הפיתוח של ה-TRNs מ-L3 לבוגרים צולם באמצעות חיות jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP). ה- TRNs האחוריים נמצאים בצד הצדדי של הגוף ונקראים PLMR ו- PLML המתאימים לצד הימני והשמאלי של החיה. דמיינו את אותן חיות שגדלות בשבב המיקרופלואידי ושיתקנו אותן במרווחים של 12-14 שעות. המונטאז' מייצג את כל התהליך העצבי של PLMR בנקודות זמן עוקבות, ומדגיש הן את המיטוכונדריה והן את התהליך העצבי (איור 5A). אורך התהליך העצבי הכולל חושב ונמצא כי הוא גדל עם שיפוע של 10.4 מיקרומטר לשעה (איור 5B). קצב זה של עלייה באורך התהליך העצבי מסכים עם דו"ח קודם של ~ 10 מיקרומטר לשעה 18,31,39,40,41. ראינו גם את התוספת של מיטוכונדריה חדשה בתהליך הגידול ואת השינוי במיקום נקודת ההסתעפות הסינפטית ביחס לגוף התא כפי שדווח קודםלכן 23.

Figure 1
איור 1: שבב מיקרופלואידי פשוט לצמיחה והדמיה ארוכי טווח של C. elegans. (A) שכבת הזרימה מורכבת מתעלה מיקרופלואידית באורך 10 מ"מ (תבנית 1) בשכבת PDMS דקה. (B) שכבת ההשמנה מורכבת מערוץ אימוביליזציה בעובי 2 מ"מ וזוג ערוצי בידוד דקים בשכבת PDMS בתפזורת. (C) שתי שכבות ה-PDMS מלוכדות יחד יחד עם זכוכית כיסוי דקה ליצירת המכשיר. (ד, ה) תעלות בקרת הלכידה והבידוד מלאות במים שעברו דה-יוניזציה (DI), תחת גז חנקן דחוס (N2). (F) C. elegans מסונכרנים לגיל נקטפים מלוחות NGM ונטענים בתוך שכבת הזרימה של המכשיר. (G) המזון מסופק באמצעות שני קצוות מיקרופיפט במאגרי הכניסה והיציאה. (H) בעלי החיים חופשיים לנוע בתוך שתי תעלות הבידוד והם לכודים מתחת לממברנת האימוביליזציה. (I) תמונה של מכשיר הגידול וההדמיה עם אספקת מזון דרך שני קצוות מיקרו-פיפטה. (י, ק) תמונות של C. elegans הנעים בחופשיות ומשותקים בתוך הערוץ המיקרופלואידי. סרגל קנה המידה הוא 1 מ"מ (I) ו- 200 מיקרומטר (J, K). (L) סכמת חתך רוחב של ההתקן המציגה את הגבהים של ערוץ הזרימה (FC), קרום PDMS (M) וערוץ הבקרה (CC). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מעקב אחר הביטוי של סמן פות ב-C. elegans המתפתח בתוך המכשיר. (A) סכמטי של תאי פות המבטאים ZMP-1::GFP בחיות PS3239 במהלך ההתפתחות. אות ה-GFP מופיע בתא העוגן בשלב L3, בתאי ה-vulD וה-vulE בשלב L4, ובתאי ה-vulA בשלב ה-1D הבוגר. (B) תמונות של חיית PS3239 הגדלה בתוך השבב המיקרופלואידי ומשותקת כל 8-10 שעות כדי ללכוד תמונות פלואורסצנטיות של ZMP-1::ביטוי GFP במהלך התפתחות הפות מ-L3, L4 ומבוגר ביום אחד (1D). קיצורים: AC = תא עוגן, A = vulA, D = vulD, E = vulE. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה של wdIs51 C. elegans בודדים כדי לעקוב אחר התפתחות עצבית PVD. (A) סכמת של גדילת נוירונים PVD וארבוריזציה דנדריטית משלב L2 עד L4. עיגול ירוק מראה גוף תא PVD (CB, חץ צהוב). הדנדריטים מראים את הופעתם של תהליכים ראשוניים (PP) ב-L2 הן מהצד הקדמי והן מהצד האחורי של ה-CB, תהליכים משניים (SP) בשלהי L2, תהליכים שלישוניים (TP) ב-L3, ותהליכים רבעוניים (QP) בשלבי L4. (B) תמונות של נוירוני PVD מבעלי חיים הגדלים בתוך מכשיר מיקרופלואידי. (C) תמונות של נוירונים PVD מבעלי חיים הגדלים על צלחת NGM ומשותקים עם 3 mM levamisole (לב). סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: השוואה של התפתחות PVD בחיות שגודלו במכשירים ובבעלי חיים שגודלו על לוחות NGM. (A) המספר הממוצע של תהליכים משניים (SP) ותהליכים רבעוניים (QP) מאותן חיות הגדלות בתוך המכשיר המיקרופלואידי. הערכים מחושבים ב-16 שעות (L2), 24 שעות (L3), 36 שעות (L4 מוקדם), 42 שעות (L4 מאוחר) ו-51 שעות (מבוגר 1D). (B) המספר הממוצע של SP ו-QP מקבוצה אחרת של בעלי חיים הגדלים על צלחות NGM ומרדימים עם 3 mM levamisole. (C) הפרדה ממוצעת בין שני גופי התאים העצביים PVD מאותה חיה שגדלה במכשיר המיקרופלואידי. (D) הפרדה ממוצעת מקבוצות שונות של בעלי חיים הגדלים על צלחות NGM ומרדימים עם 3 mM levamisole. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM (n ≥ 10 עבור 3 mM levamisole ו- n ≥ 6 עבור בעלי חיים משותקים של מכשירים). המובהקות הסטטיסטית מחושבת על ידי ANOVA חד-כיווני ומסומנת כערך p < 0.05 (*), ערך p < 0.005 (**) וערך p > 0.05 (ns). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים של קולטני מגע (TRN) מחיות שגדלות בתוך המכשיר המיקרופלואידי. (A) מונטאז' של תהליכים עצביים מבעל חיים בודד שצולם בזמנים שונים. גוף התא (CB, חץ), נקודת ההסתעפות הסינפטית (BP, ראש חץ) וקצה תא העצב (טיפ, חץ למעלה) מסומנים. התהליך העצבי והמיקום של כל מיטוכונדריה נמצאים במעקב ידני באמצעות פיג'י. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. (B) אורך תהליך עצבי ממוצע בנקודות זמן שונות של הדמיה. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM (n = 8). המובהקות הסטטיסטית מחושבת באמצעות ANOVA חד-כיווני ומסומנת כערך p < 0.005 (**) וערך p > 0.05 (ns). משוואת רגרסיה מתאימה עם שיפוע של התארכות תהליך עצבי של 10.4 מיקרומטר לשעה, R2=0.9425. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: צילומי מסך של הגדרות מיקרוסקופ להדמיית פלואורסצנציה של C. elegans. (A) פאנל של תוכנת ניתוח התמונות מציג את החלקים המודגשים להגדרת מהירות הסריקה, ערכת הסינון והמטרה להדמיה. (B) לאחר מכן התוכנה משמשת לבחירת לייזר 488 ננומטר עם 7% מעוצמת הלייזר המלאה. (C) תוכנת ניתוח התמונות יכולה לקחת מסגרת תמונה בודדת או סדרה של תמונות בהילוך מהיר ולאחסן אותן לניתוח עתידי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: צילומי מסך של תוכנת פיג'י המציגים את שלבי הניתוח לספירת ענפי PVD בחיות wdIs51 . (A) מציג תמונת PVD שנפתחה בתוכנת פיג'י ImageJ וקישור לתוסף מונה התאים. (B) חלון מונה תאים כדי לאתחל את המונה עבור תמונה. (ג) בחירת מונים לסימון ענפים הכלולים ולמניעת ספירה מרובה. (D) חלון תוצאות המציג את המספר הכולל של סניפים תחת כל קטגוריה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: סכמטי של מכשיר הגידול וההדמיה. שני קצוות מיקרו-פיפטה, מלאים בנפחים שונים של תמיסת מזון לחיידקים (צהוב), מוכנסים לפתחי הכניסה והיציאה של תעלת הזרימה בשכבה התחתונה. ההבדל בגבהים של תמיסות המזון בקצוות גורם לתמיסה לזרום בתוך התעלה אשר בתורה מספקת חיידקים לחיה לצורך צמיחתה. תעלות הלכידה והבידוד (כחול) מלאות במים מזוקקים ונדחסות באמצעות אספקת גז חנקן (שנקבע על 14 psi). ערוץ הבידוד מחובר תמיד ל-14 psi. הלחץ על קרום הלכידה עובר בין 0 (בעל החיים חופשי לנוע ולהאכיל) לבין 14 psi (החיה משותקת לצורך הדמיה ברזולוציה גבוהה) באמצעות מחבר תלת-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה תואר פרוטוקול לייצור ושימוש בהתקן מיקרופלואידי פשוט לגידול C. elegans עם אספקת מזון קבועה והדמיה ברזולוציה גבוהה של חיה בודדת במהלך התפתחותה. תהליך ייצור זה הוא פשוט וניתן לעשות זאת בסביבה לא סטרילית. סביבה נטולת אבק היא קריטית במהלך שלבי הייצור. נוכחותם של חלקיקי אבק תוביל למגע לא תקין בין שני משטחי ההדבקה, וכתוצאה מכך להדבקה ודליפה לקויה של המכשיר במהלך יישום בלחץ גבוה בעוד C. elegans משותקים. מתוך כל המכשירים המיוצרים, 95% מהמכשירים מתאימים לניסויים. מספר קטן של מכשירים נכשלים (5%) עקב הדבקה לא מתאימה במהלך הייצור או השימוש. ניתן לצמצם את הכשל בהדבקה על ידי ביצוע תהליך הייצור בתוך חדר נקי ללא אבק (> 1,000 דרגות נקיות) הזמין במספר מוסדות אקדמיים ברחבי העולם. כדי לנקות מזון חיידקי מתעלת הזרימה ולאפשר שימוש חוזר במכשיר, שטפו את המכשיר על ידי הזרמת אלכוהול דרכו לאחר כל ניסוי.

הפרוטוקול מדגים תהליך ייצור ליתוגרפיה עם עיצוב פשוט שניתן לשנות בקלות לשלבי התפתחות וגדלים שונים של C. elegans. יתר על כן, ניתן להתאים את תכנון המכשיר הזה לאורגניזמי מודל אחרים כמו דגי זברה ודרוזופילה, על ידי הגדלת ממדי הזרימה ולכידת שכבות3 כדי לצפות במגוון תהליכים התפתחותיים ותת-תאיים. בפרוטוקול זה, שני גבהים שונים של ערוץ שכבת הזרימה - 40 מיקרומטר ו-80 מיקרומטר - שימשו לאימוביליזציה מלאה ולמעקב אחר תכונות תאיות ותת-תאיות בשלבי התפתחות שונים של C. elegans בהתאם לגודל גופם. לדוגמה, הארבוריזציה הדנדריטית בתאי העצב התחושתיים PVD מתחילה בשלבים המוקדמים של L2 וממשיכה עד לשלב L4. זה צולם במכשיר עם שכבת זרימה גבוהה של 40 מיקרומטר. כאשר תאי העצב PVD יוצרים דנדריטים שמנפחים את שרירי דופן הגוף, זה דורש חתך אופטי כדי לכמת את התהליכים בתלת-ממד. הניתוח הכמותי של ארבורים דנדריטיים דורש אימוביליזציה מלאה של בעלי החיים בתוך המכשיר התואם את קוטר הגוף. עם זאת, לניטור התפתחות הפות, נעשה שימוש בגובה 80 מיקרומטר של שכבת הזרימה כדי לעקוב אחר שושלות הפות. עבור אורך TRNs והדמיית מיטוכונדריה, דמיינו שלבים L2 עד L4 באמצעות התקנים בעובי שכבת זרימה של 40 מיקרומטר. שימוש במכשיר עם גובה לא נכון יגרום לקושי באימוביליזציה. לדוגמה, בעלי חיים קטנים (L2 או שלבים מוקדמים של L3) בתוך מכשיר בגובה שכבת זרימה של 80 מיקרומטר יאפשרו היפוך בעלי חיים בתוך המכשיר ויציגו אימוביליזציה לא שלמה גם לאחר שקרום הלכידה נמצא מתחת ללחץ של 14 psi. מצד שני, בעלי חיים עם קוטרי גוף גדולים (מעבר ל-L4 המאוחר) לא נכנסים בקלות לתוך מכשיר עם גובה שכבת זרימה של 40 מיקרומטר. לכידת בעלי חיים גדולים במכשירים קטנים בלחץ גבוה עלולה להזיק לגופם. היישום של המכשיר הנוכחי עם שכבת זרימה של 40 מיקרומטר מוגבל ואינו מתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה של חיות שלב זחל מוקדמות צעירות מאוד (כגון חיות שלב L1 הצעירות מ -10 שעות לאחר הבקיעה) מכיוון שהן אינן משותקות לחלוטין מתחת לממברנה. בשל גודל הגוף הקטן, חיות הזחל בגודל קטן ממשיכות לנוע ומדי פעם נמלטות מהמלכודת כשהן מתרגשות מאור לייזר. עבור חיות שלב L1, ניתן לבצע שדה בהיר ברזולוציה נמוכה או הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מטרות 4x או 10x וזמני חשיפה קצרים למצלמה. כגישה חלופית, יהיה צורך במכשיר שכבת זרימה חדש בגובה < 20 מיקרומטר כדי לשתק לחלוטין את שלב הזחל הצעיר C. elegans.

מעקב אחר תופעות התפתחותיות של אותה חיה על פני ציר זמן ארוך באמצעות הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה יכול לגרום לעלייה ב-autofluorescence. כל בדיקת הדמיה בהילוך מהיר דורשת אופטימיזציה של עוצמת העירור, זמן החשיפה, מרווח זמן ההדמיה, זמן ההתאוששות של בעלי החיים ואיכות המזון לקבלת מידע התפתחותי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ממחקרי C. elegans. בחרנו מרווח זמן > של 3 שעות למחקרים התפתחותיים בעת שימוש בבעלי חיים משלבי L4 ואילך. המכשיר מסוגל לרכוש תמונות תכופות יותר (כל 5-10 דקות למשך כמה שעות) או מספר פריימים לשנייה (במשך < 1 שעות) כדי לחקור תהליכים דינמיים אחרים כגון הובלת אברונים והפצה בנוירונים C. elegans 3,23. לכידה והדמיה של שלבי התפתחות מוקדמים דורשים התבוננות זהירה יותר, שכן השמנה חוזרת ונשנית עם מרווחי זמן קצרים ללא החלמה מלאה עלולה להשפיע על בריאותם. במהלך ניסויים, נמצא כי בעלי חיים שדרשו לחץ גבוה כדי להעביר אותם לשכבת הזרימה מראים בריאות לקויה ויותר אוטו-פלואורסצנטיות לאורך זמן. בעלי חיים עם פלואורסצנטיות גבוהה בגוף, הידועים כקשורים לרמת סטרס גבוהה, נמנעו ממחקרי הדמיה. כדי לשמור על פיזיולוגיה טובה, בעלי חיים נלכדו במצב ישר הסמוך לקיר התעלה. השתקת בעלי החיים עם גופם לרוחב התעלה נמנעה מכיוון שבעלי חיים חולים לאחר שגופם נלחץ תחת לחץ של 14 psi בתנוחה זו. כדי לשמור על יחס אות לרעש טוב במהלך הדמיה חוזרת ונשנית עם מטרות שמן, יש לנקות את הכיסוי כראוי לאחר כל נקודת זמן. לאחר טיפול מיוחד במהלך תהליך הייצור של המכשיר ויישומו, ניתן היה לעשות שימוש חוזר באותם מכשירים במשך מספר מפגשי הדמיה.

מכשיר זה עשוי להיות שימושי למחקרים המשתמשים במוטנטים שעשויים להיות רגישים לחומרי הרדמה. הגישה המוצגת יכולה למנוע השפעות הרדמה שליליות על גדילה ופיזיולוגיה כדי להקל על תצפית על פגמים מורפולוגיים, תפקודיים והתנהגותיים בבעלי חיים לאורך תקופה ארוכה. המכשיר קל לייצור וניתן להתקין אותו בכל מעבדה כדי לענות על שאלות התפתחותיות/ביולוגיות ארוכות טווח ב-C. elegans הדורשות הדמיה ברזולוציה גבוהה לסירוגין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. ו- S.P.K. הם מחברים של פטנט ממתין על מכשיר הגידול וההדמיה המיקרופלואידי (בקשת פטנט מספר 640/CHE/2011).

Acknowledgments

אנו מודים למתקן ההדמיה CIFF, NCBS על השימוש במיקרוסקופים הקונפוקליים הנתמכים על ידי שעון הקיץ - המרכז לננוטכנולוגיה (לא. SR/55/NM-36-2005). אנו מודים למימון מחקר מ- DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), דיסק מסתובב הנתמך על ידי DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK וגאוטם מנון), ומענק HHMI-IECS מספר 55007425 (SPK). זנים HB101, PS3239 ו-wdIs51 סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). S.P.K. ייצרה את jsIs609 במעבדה של מייק נונט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 182 C. elegans שבב מיקרופלואידי צמיחה על השבב הדמיה ארוכת טווח הדמיה עצבית שושלת תאי הפות
שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter