Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ett enkelt mikrofluidiskt chip för långsiktig tillväxt och avbildning av Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Protokollet beskriver en enkel mikrofluidisk chipdesign och mikrofabrikationsmetodik som används för att odla C. elegans i närvaro av en kontinuerlig livsmedelsförsörjning i upp till 36 timmar. Tillväxt- och bildbehandlingsenheten möjliggör också intermittent långsiktig högupplöst avbildning av cellulära och subcellulära processer under utveckling i flera dagar.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har visat sig vara ett värdefullt modellsystem för att studera utvecklings- och cellbiologiska processer. Att förstå dessa biologiska processer kräver ofta långvarig och upprepad avbildning av samma djur. Långa återhämtningstider i samband med konventionella immobiliseringsmetoder gjorda på agarkuddar har skadliga effekter på djurhälsan vilket gör det olämpligt att upprepade gånger avbilda samma djur under långa tidsperioder. Detta papper beskriver en mikrofluidisk chipdesign, tillverkningsmetod, on-chip C. elegans odlingsprotokoll och tre exempel på långsiktig avbildning för att studera utvecklingsprocesser hos enskilda djur. Chipet, tillverkat med polydimetylsiloxan och bundet på ett täckglas, immobiliserar djur på ett glassubstrat med hjälp av ett elastomermembran som avböjs med hjälp av kvävgas. Fullständig immobilisering av C. elegans möjliggör robust time-lapse-avbildning av cellulära och subcellulära händelser på ett bedövningsfritt sätt. En kanalgeometri med ett stort tvärsnitt gör det möjligt för djuret att röra sig fritt inom två delvis förseglade isoleringsmembran som möjliggör tillväxt i kanalen med kontinuerlig mattillförsel. Med hjälp av detta enkla chip kan avbildning av utvecklingsfenomen som neuronal processtillväxt, vulvalutveckling och dendritisk arborisering i PVD-sensoriska neuroner, när djuret växer inuti kanalen, utföras. Det långsiktiga tillväxt- och bildchipet arbetar med en enda tryckledning, inga externa ventiler, billiga flytande förbrukningsvaror och använder standardprotokoll för maskhantering som enkelt kan anpassas av andra laboratorier som använder C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans har visat sig vara en kraftfull modellorganism för att studera cellbiologi, åldrande, utvecklingsbiologi och neurobiologi. Fördelar som dess transparenta kropp, korta livscykel, enkelt underhåll, ett definierat antal celler, homologi med flera mänskliga gener och välstuderad genetik har lett till att C. elegans blivit en populär modell både för grundläggande biologiska upptäckter och tillämpad forskning 1,2. Att förstå cellens biologiska och utvecklingsprocesser från upprepad långtidsobservation av enskilda djur kan visa sig vara fördelaktigt. Konventionellt bedövas C. elegans på agarkuddar och avbildas under mikroskopet. Negativa effekter av anestetika på djurens hälsa begränsar användningen av bedövade djur för långvarig och upprepad intermittent avbildning av samma djur 3,4. De senaste framstegen inom mikrofluidisk teknik och deras anpassning för anestesifri fångst av C. elegans med försumbara hälsorisker möjliggör högupplöst avbildning av samma djur under en kort och lång tidsperiod.

Mikrofluidiska chips har utformats för C. elegans'5 high throughput screening 6,7,8, trapping and dispensing9, drug screening 10,11, neuronstimulering med högupplöst avbildning 12 och högupplöst avbildning av djuret 12,13,14. Ultratunna mikrofluidiska ark för immobilisering på glidbanor har också utvecklats15. Långtidsstudier av C. elegans har utförts med hjälp av lågupplösta bilder av djur som växer i flytande kultur för att observera tillväxt, kalciumdynamik, läkemedelseffekter på deras beteende16,17,18,19, deras livslängd och åldrande20. Långtidsstudier med högupplöst mikroskopi har utförts för att bedöma synaptisk utveckling21, neuronal regenerering 22 och mitokondriell addition23. Långvarig högupplöst avbildning och spårning av cellöde och differentiering har gjorts i flerkanaliga enheter24,25. Flera cellulära och subcellulära händelser inträffar under tidsskalorna på flera timmar och kräver att samma individ fångas vid olika tidpunkter under deras utveckling för att karakterisera alla mellanliggande steg i processen för att förstå cellulär dynamik in vivo. För att avbilda biologisk process som organogenes, neuronal utveckling och cellmigration måste djuret immobiliseras i samma riktning vid flera tidpunkter. Vi har tidigare publicerat ett protokoll för högupplöst avbildning av C. elegans i över 36 timmar för att bestämma var mitokondrier tillsätts längs beröringsreceptorneuronerna (TRN)23.

Detta dokument tillhandahåller ett protokoll för att upprätta en mikrofluidikbaserad metod för upprepad högupplöst avbildning. Denna enhet, med en enda flödeskanal, passar bäst för upprepad avbildning av ett enda djur per enhet. För att förbättra genomströmningen och avbilda många djur samtidigt kan flera enheter anslutas till samma tryckledning men med separata trevägskontakter som styr ett enda djur i varje enhet. Designen är användbar för studier som kräver högupplösta time-lapse-bilder som post-embryonala utvecklingsprocesser, cellmigration, organelltransport, genuttrycksstudier etc. Tekniken kan vara begränsande för vissa applikationer som livslängds- och åldrandestudier som kräver parallell tillväxt och avbildning av många djur i sent stadium. Polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer användes för att tillverka denna anordning på grund av dess biostabilitet26, biokompatibilitet 27,28, gaspermeablilitet 29,30 och avstämbar elastisk modul 31. Denna tvåskiktsanordning möjliggör tillväxt av djur med kontinuerlig matförsörjning i en mikrofluidisk kanal och fångst av enskilda C. elegans via PDMS-membrankompression med användning av kvävgas. Denna enhet är en förlängning av den tidigare publicerade enheten med fördelen att odla och avbilda samma djur i mikrokanalen under en kontinuerlig matförsörjning3. Det extra isoleringsmembrannätverket och ett 2 mm brett fångstmembran möjliggör effektiv immobilisering av utvecklande djur. Enheten har använts för att observera neuronal utveckling, vulvalutveckling och dendritisk arborisering i sensoriska PVD-neuroner. Djuren växer utan negativa hälsoeffekter i enheten och kan upprepas immobiliseras för att underlätta avbildning av subcellulära händelser hos samma djur under dess utveckling.

Hela protokollet är uppdelat i fem delar. Del 1 beskriver enhetstillverkning för tillväxt- och bildchipet. Del 2 beskriver hur man ställer in ett trycksystem för PDMS-membranavböjning för att immobilisera och isolera enskilda C. elegans. Del 3 beskriver hur man synkroniserar C. elegans på en nematodtillväxtmedium (NGM) platta för avbildning av enheter. Del 4 beskriver hur man laddar ett enda djur i enheten och odlar djuret inuti mikrofluidikanordningen i flera dagar. Del 5 beskriver hur man immobiliserar ett enskilt djur vid flera tidpunkter, tar högupplösta bilder med olika mål och analyserar bilderna med Fiji.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillverkning av tillväxt- och bildåtergivningsapparat

  1. SU8 mögel tillverkning
    1. Designa mönster 1 (flödeslager) och 2 (kontrollskikt) med rektangulära former i ett ordbehandlingsprogram (eller ett datorstödd design-CAD-programvara) och skriv ut fotomaskerna med hjälp av en laserplotter med en minsta funktionsstorlek på 8 μm på polyesterbaserad film (figur 1).
    2. Skär kiselskivor i 2,5 cm × 2,5 cm bitar och rengör dem med 20% KOH i 1 min. Skölj skivorna i avjoniserat (DI) vatten. Använd en skiva vardera för flödet och kontrollskiktet.
      VARNING: KOH är frätande och bör hanteras varsamt.
    3. Torka bitarna med 14 psi komprimerad kvävgas följt av uttorkning på en värmeplatta vid 120 °C i 4 timmar. Innan du fortsätter till nästa steg, kyla ner de två bitarna till rumstemperatur.
    4. Ta en av kiselbitarna och lägg den på chucken på en spinnbeläggning och sätt på vakuumet för att hålla skivan på plats. Lägg ~ 20 μL hexametyldisilan (HMDS) på kiselbiten och täck den med spinnbeläggningen vid 500 rotation per min (rpm) i 5 s följt av 3 000 rpm i 30 s.
      VARNING: Detta steg bör utföras i gult ljus. Använd inte vitt ljus i rummet.
    5. För att få en enhetlig fotoresisttjocklek på ~ 40 μm (specifikt för flödesskiktet; lämplig för avbildning av tidiga larvsteg 1 till steg 3 (L1 - L3) djur), täck kiselskivan med ~ 1,5 ml negativ fotoresist-1 med en spinnbeläggning vid 500 rpm i 5 s följt av 2 000 rpm i 30 s.
    6. Upprepa steg 1.1.4 och 1.1.5 med den andra skivan för att få en enhetlig fotoresisttjocklek på ~ 40 μm som är specifik för kontrollskiktet.
    7. Alternativt, för att öka flödesskiktets tjocklek till ~ 80 μm för äldre djur, täck kiselskivor med ~ 1,5 ml negativ fotoresist-2 med hjälp av spinnbeläggningen vid 500 rpm i 5 s följt av 2 000 rpm i 30 s. Denna tjocklek är lämplig för L3-scenen till vuxna djur.
      VARNING: Håll kiselskivorna vid sidorna för att undvika skador på de spinnbelagda skikten. Håll vita lampor släckta under detta steg.
    8. Grädda de fotoresistbelagda kiselbitarna (för flödes- och kontrollskikt) på en kokplatta vid 65 °C i 1 min följt av 95 °C i 10 min. Kyl de bakade bitarna till rumstemperatur.
      OBS: De bakade kiselbitarna kan förvaras i en dag innan du fortsätter till nästa steg. Förvara i mörkret och utsätt inte för vitt ljus.
    9. Sätt mjukbakade kiselbitar på UV-belysningens exponeringsstadium med den fotoresistbelagda ytan mot UV-lampan. Utsätt de två bitarna separat för UV i 15 s, med en 200 W lampa, genom en fotomask med mönster 1 respektive 2 för att få flödes- respektive kontrollskikt.
      VARNING: Använd skyddsglasögon och undvik direkt exponering för UV-ljus. Slå inte på vitt ljus i rummet under detta skede.
    10. Grädda de två exponerade kiselbitarna med ett belagt lager uppåt, vid 65 °C följt av 95 °C i 1 min respektive 10 min. Kyl bitarna till rumstemperatur innan du fortsätter till nästa steg.
    11. Utveckla mönstren genom att blötlägga kiselbitarna i fotoresistutvecklarlösningen (1:3 utspädning av utvecklaren i isopropanol) i 20 minuter. När mönstret är synligt, skölj bitarna med ren iso-propylalkohol (IPA) och föna försiktigt med kvävgas (14 psi).
      VARNING: Använd en väl ventilerad miljö för denna kemiska behandling för att undvika exponering av människor. Använd vitt ljus först efter att funktioner har utvecklats och sköljts med IPA.
    12. Förvara kiselbitarna i en exsickator med den belagda ytan uppåt. Utsätt bitarna för silanångor genom att hälla 50 μL ren triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl) silan på en liten plastkopp eller en glasskiva. Placera koppen/glidbanan inuti en exsickator och inkubera i 2 timmar.
      VARNING: Undvik direkt exponering för silanånga. Använd alltid en förseglad kammare för behandling av silanånga.
      OBS: Vid behov kan de utvecklade kiselbitarna förvaras i 1-2 dagar innan du fortsätter till nästa steg.
  2. PDMS-chip tillverkning
    1. Gör PDMS i en plastkopp genom att blanda elastomerbasen med härdningsmedlet i förhållandet 10: 1. Blanda innehållet väl genom att omröra hela tiden i 3 minuter. Blandningen kommer att skapa många luftbubblor i PDMS-blandningen.
    2. Avgasa PDMS-blandningen i en exsickator i 30 minuter för att ta bort alla luftbubblor.
      VARNING: Se till att luftbubblor tas bort från PDMS-blandningen innan den hälls på funktionerna eftersom bubblor kan orsaka defekta och icke-funktionella enheter.
    3. Placera kiselskivorna med kontrollskiktet (mönster 2) i en petriskål. Häll försiktigt ett 5 mm tjockt PDMS-blandningsskikt på kiselbiten och undvik bubbelbildning.
    4. Avgasa PDMS-blandningen i en exsickator för att avlägsna ytterligare bubblor som bildas under PDMS-hällningsprocessen.
    5. Placera kiselskivan med flödesskikt (mönster 1) på spinnchucken och applicera 200-500 mTorr vakuumtryck för att hålla skivan. Häll ~ 1 ml PDMS på kiselskivan och belägg den med en spinnbeläggning vid 500 rpm i 5 s följt av 1,000 rpm i 30 s för att få ett ~ 80 μm tjockt lager.
    6. Grädda de två kiselskivorna med den spinnbelagda PDMS och häll PDMS-lagren vid 50 °C i en varmluftskonvektionsugn i 6 timmar. Efter bakning, vänta tills bitarna har svalnat vid rumstemperatur.
    7. Skär det 5 mm tjocka PDMS-skiktet från kiselbiten runt kontrollskiktet (mönster 2) med ett vasst blad och dra av det från kiselsubstratet.
    8. Stansa två hål med ~ 1 mm diameter med en Harris-puncher vid behållaren i PDMS-blocket för att ansluta immobiliseringskanalen och isoleringskanalinloppen till gasledningarna för PDMS-membranböjningar.
    9. Placera kiselbiten med det spinnbelagda PDMS-skiktet på mönstret 1 (flödesskiktet), med den PDMS-belagda ytan uppåt, på en plastbricka. Håll det stansade PDMS-blocket med mönster 2 (kontrollskikt) på brickan med gjuten sida uppåt.
    10. Förvara plastbrickan inuti en plasmarengörare och utsätt de två PDMS-ytorna för 18 W luftplasma i 2 minuter under lågt vakuum (200-600 mTorr). Applicera vakuum tills kammaren blir ljusviolett. Utför detta steg under svagt ljus för att se plasmafärgförändringen.
    11. Ta ut de två plasmabehandlade blocken och bind försiktigt blocken genom att trycka ihop de plasmabehandlade ytorna i mönster 1 och 2. Grädda de bundna mönstren vid 50 °C i 2 timmar i varmluftsugn.
    12. Ta ut den bundna enheten ur ugnen. Skär den bundna enheten ur kiselskiva med mönster 1 och mönster 2 och stansa hål i flödesskiktets inlopps- och utloppsbehållare med Harris puncher.
    13. Placera det bundna PDMS-blocket med flödesskiktet uppåt på en plastbricka. Förvara ett rent täckglas (#1.5) på samma bricka. Utsätt blocken och täckglaset för 18 W luftplasma i 2 minuter. Justera vakuumtrycket för att se en violett kammare.
      OBS: Detta steg bör göras i svagt ljus för att se plasmafärgen förändras. För att rengöra täckglaset, tvätta det med IPA och föna med kvävgas vid 14 psi.
    14. Placera det plasmaexponerade PDMS-blocket ovanpå täckglaset och baka den bundna strukturen i en ugn vid 50 °C i 2 timmar. Förvara enheten i en ren kammare för framtida experiment.

2. PDMS-membran grundning

  1. Ta enheten och lägg den på ett stereomikroskop och fäst slangarna. Anslut mikroflexrör (innerdiameter ~ 5 mm, ytterdiameter ~ 8 mm) till en komprimerad kvävgasledning i ena änden. Anslut en trevägskontakt i andra änden. Rör 1 och 2 av trevägskontakterna kommer att anslutas till fällan respektive isoleringsmembranen.
  2. Anslut två mikroflexrör (innerdiameter ~ 1,6 mm, ytterdiameter ~ 5 mm) till de två utloppsportarna på trevägsstoppkranen. Anslut den andra änden av de två rören till en 8 mm lång 18 G nål.
  3. Fyll flödesskiktet med M9-buffert med en mikropipett genom inloppsporten. Fyll båda rören med DI-vatten genom änden som är ansluten till nålen. Sätt in de två nålarna i de stansade hålen och anslut respektive isolerings- och fångstmembranet.
  4. Öppna kvävgasregulatorn vid 14 psi och vrid trevägsventilen från rör 1 för att trycka in vattnet i enheten genom de mikrofluidiska kanalerna i kontrollskikten, nämligen fällan och isoleringsmembranen.
  5. Vänta tills vatten fyller kanalen utan att det finns någon luftdroppe i båda kanalerna. När kanalerna är helt fyllda med vatten anses kanalerna vara grundade.
  6. Släpp trycket med hjälp av trevägsstoppkranen när kanalerna är fyllda med vatten och grundade. Priming kan leda till bubblor i flödesskiktet, ta bort bubblorna genom att strömma ytterligare media genom flödeskanalen.

3. C. elegans underhåll och synkronisering

OBS: C. elegans-stammar: Studien som används efter transgener PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) för vulvalutveckling 32, jsIs609 (mec7p::MLS(mitokondriell matrislokaliseringssignal)::GFP)33 för utveckling av beröringsreceptorneuron (TRN) och mitokondritransportavbildning, och wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) för att spåra PVD-utveckling 34. Standard C. elegans kultur- och underhållsprotokoll följdes35.

  1. Odla C. elegans på nematodtillväxtmediet (NGM) petriplattor med E. coli OP50 som födokälla vid 22 °C. Behåll C. elegans-stammarna genom att upprepade gånger överföra några hermafroditer eller dela en liten mängd agar med några djur till en ny NGM-platta med en OP50-gräsmatta.
  2. Efter 3-5 dagar, kontrollera NGM-plattan för djurtillväxt och C. elegans ägg. Samla och överför cirka 30 ägg från en tallrik till en färsk NGM-tallrik med OP50 gräsmatta.
  3. För att synkronisera djur för avbildning, överför alla oskadade ägg från plattan var 2: e timme till en ny tallrik och håll dem vid 22 ° C. Cirka 15-20 ägg kläcks på varje tallrik.
  4. Plocka djuren mellan 14-16 h och 28-30 h efter kläckning för larv 2 (L2) respektive larv 3 (L3). Överför djuren till mikrofluidikanordningen för avbildning. Lägg till matförsörjning enligt beskrivningen i nästa avsnitt för att behålla djuret inuti enheten för långsiktiga tillväxt- och avbildningsexperiment.

4. C. elegans tillväxt inuti tillväxt- och avbildningsmikrofluidikanordningen

  1. Montera en tillväxt- och bildmikrofluidisk enhet på ett inverterat mikroskop och visa mönster 2, efter anslutning av isoleringsmembranen och immobiliseringsmembranet, vid låga förstoringar (4x eller 10x). Se till att kanalerna är fyllda med rent destillerat vatten.
  2. Bered en ny 1 L lösning av S-medium med användning av 10 ml 1 M kaliumcitrat pH 6,0, 10 ml spårmetalllösning, 3 ml 1 MCaCl2, 3 ml 1 M MgSO4. Förbered lösningen under sterila förhållanden. Autoklavera inte S-mediet.
  3. Fyll flödeskanalen med tillväxtmedia (S-medium) 10 min före experimentet. Undvik luftbubblor i flödeskanalen. Flöda ytterligare medium om det behövs för att ta bort luftbubblor.
  4. Välj ett enda djur från det önskade utvecklingsstadiet från en NGM-platta i 10 μL S-medium med hjälp av en mikropipett och tryck in djuret i flödeskanalen genom inloppshålet.
  5. Övervaka djurets position i flödeskanalen med ett lågt förstoringsmål. Flöda ytterligare medium genom inloppet eller utloppet för att trycka på djuret och placera det i flödeskanalen som är begränsad mellan de två isoleringsmembranen.
  6. Öppna trevägsstoppkranen för att applicera 14 psi-tryck i isoleringskanalerna och tryck ner membranen i flödeskanalen.
    OBS: Membranet tätar delvis flödeskanalen och begränsar djurrörelsen till regionen mellan de två isoleringsmembranen.
  7. Använd en enda koloni av E. coli OP50 från en strimmig platta för att inokulera 250 ml L buljong (2,5 g bakto-trypton, 1,25 g baktojäst, 1,25 g NaCl iH2O). Odla den inokulerade kulturen över natten vid 37 °C.
  8. Alikvotera 500 μl OP50-kulturen i 1,5 ml sterila centrifugrör och lagra buljongen och alikvoten i 2 veckor vid 4 °C.
  9. Pelletera ner OP50-kulturen genom centrifugering vid 1,3 x g i 5 min. Lös upp pelleten med 1 ml färskt S-medium (0,5x utspädning) och förvara den vid rumstemperatur i 3-4 dagar. Använd denna utspädda OP50 för att mata C. elegans inuti mikrofluidiska enheter.
  10. Lämna en droppe S-medium ovanpå inlopps- och utloppsbehållarna för att minska avdunstningen av S-mediet i flödeskanalen.
  11. Ta utspädd OP50-lösning i en 10 μl mikropipett. Ta bort mikrospetsen fylld med OP50-lösningen från pipetten och tryck in spetsen i inloppsbehållaren. Placera sedan en annan mikropipettspets med 10 μL matlösning och sätt in den i utloppsbehållaren.
  12. Försegla spetshuvudet med tryck med ett finger för att säkerställa kontinuitet i livsmedelslösningar utan luftspalt. Byt mikropipettspetsen med OP50-lösning varje dag som inte är äldre än 3-4 dagar.
  13. Fyll ytterligare 20-30 μL matlösning i båda spetsarna. Tillsätt eller ta bort matlösning till och från mikropipettspetsen för att justera lutningen för att trycka djuret i flödeskanalen och för att justera djurets position under fångstmembranet för avbildning.
  14. Övervaka flödet av bakterier för att säkerställa att det är kontinuerligt genom de delvis slutna isoleringsmembranen i flödeskanalen med hjälp av ljusfältsbilder.
    OBS: I avsaknad av bakterieflöde kan djur äta de tillgängliga bakterierna i flödeskanalen mellan de två isoleringsmembranen. Om det inte finns några bakterier eller inget flöde i kanalen, byt ut de två mikropipettspetsarna vid inloppet och utloppet med nya pipettspetsar fyllda med nyberedda livsmedel.

5. C. elegans immobilisering och avbildning

  1. C. elegans immobilisering under fångstmembranet
    1. Leta reda på ett enda djur i tillväxtkanalen vid låga förstoringar. Justera matlösningens höjder i de två mikropipettspetsarna som är anslutna till inlopps- och utloppsbehållarna. Tryck djuret i önskad riktning med hjälp av de hydrostatiska tryckskillnaderna i flödeskanalen.
    2. Placera djuret i mitten av fångstmembranet och övervaka dess simbeteende med hjälp av ett lågt förstoringsmål (4x).
    3. Vrid trevägsstoppkranen för att öka trycket i fällkanalen långsamt. Immobilisera djuret under fällmembranet i en rak hållning längs tillväxtkanalens gränsvägg.
      VARNING: Undvik att fånga djuret över flödeskanalen i ett Z- eller U-böjläge. Detta gör att djurkroppen pressas med större tryck och orsakar permanent skada på dess hälsa.
  2. C. elegans avbildning och frisättning från membranet
    1. Bär och ladda enheten på ett mikroskopsteg. Ställ in ett inverterat mikroskop vid önskade bildinställningar med alla nödvändiga optiska komponenter (mål, ljuskälla, fluorescensfilter och en detektor) för högupplöst ljusfält, differentiell bildkontrast (DIC) eller fluorescensavbildning (kompletterande figur 1).
    2. Skaffa en eller flera time-lapse fluorescensbilder för att fånga cellulära och subcellulära händelser.
    3. Förvärva fluorescensbilder av C. elegans-neuroner som en funktion av deras utveckling med hjälp av ett 60x, 1.4 numeriskt bländare (NA) -mål, en 488 nm våglängdslaser med 7% -10% lasereffekt, en CCD-kamera, på ett snurrande skivmikroskop. Utför time-lapse-avbildning med hjälp av programvaran som medföljer mikroskopet och skaffa bilder med en hastighet av 4 bilder per sekund (kompletterande figur 1).
    4. Efter förvärv av bilder, släpp fångsttrycket och övervaka djurets rörelse vid låga förstoringar - 4x och 10x. Håll djuret begränsat inom det område som definieras genom att isolera membran (hålls under 14 psi under hela experimentet).
    5. Justera volymen av matlösning i de två mikropipettspetsarna för att fortsätta ett långsamt gravitationsdrivet matflöde i tillväxtkanalen. Detta matflöde erhålls genom att justera nivåerna av livsmedelslösningarna i mikropipetter vid inloppet och utloppet (vanligtvis 1-5 mm höjdskillnad).
    6. Visualisera flödet under ett ljust fält från bakteriens flödesmönster i tillväxtkanalen.
      OBS: I avsaknad av flöde äter djuret de tillgängliga OP50-bakterierna, kanalen verkar klar och djuret svälter under några timmar. Ett utsvultet djur utvecklar vanligtvis hög autofluorescens, lätt observerbar när man förvärvar fluorescensbilder med tidsfördröjning. Sådana händelser har skadliga effekter på djurens fysiologi och undviks i experimenten.
    7. Upprepa steg 5.2.1-5.2.3 efter ett förutbestämt tidsintervall för att få fluorescens-/DIC/ljusfältsbilder av samma individ vid flera tidpunkter.
    8. När bilderna har förvärvats vid flera önskade tidpunkter från samma enskilda djur, släpp isoleringen och fångsttrycket. Spola kanalen med M9-buffert och tryck djuret genom inloppsbehållaren. Återställ djuret från behållaren och placera djuret på en ny NGM-platta för ytterligare hälsoövervakning.
    9. Spola kanalen med M9-buffert några gånger för att ta bort bakterier. Skölj flödeskanalen med 70% etylalkohol (utspädd i destillerat vatten). Torka kanalerna genom att trycka på luft med en spruta. Förvara enheten på en torr dammfri plats för upprepad användning i framtiden.
  3. Bildanalys och statistik
    1. Använd FIJI ImageJ-programvaran för tiff-bildanalys. Öppna tiff-bilder av PVD-tidsfördröjningsbilderna från wdIs51-djuren i Fiji ImageJ. Extrahera de bästa planen från stacken med z-plan som visar de primära processerna genom att välja fliken Bild > Stacks > Z-projektet.
    2. Screena hela bildserien och hitta specifika bildramar som framgångsrikt täcker hela neuronala processer med överlappande delar av djurbildramarna. Välj Plugin > Analysera > cellräknare från FIJI-verktygsfältet. Detta öppnar ett fönster för att numrera olika grenar och hålla ett antal av varje vald neuron.
    3. Välj Initiera > räknare > Typ1 och markera sedan de sekundära grenarna. Välj sedan Typ 2 och markera Kvartär, klicka på Resultatfönster som visar antal av alla grenar (kompletterande bild 2). Den här metoden visar de grenar som redan räknas.
    4. Öppna nästa överlappande bild och räkna de återstående grenarna. Denna process förhindrar dubbelräkning och säkerställer att varje process räknas. Identifiera och räkna det totala antalet primära grenar som finns i de tidiga larvstadierna av C. elegans. Utför liknande analyser för bilderna för sekundära och kvartära processer hos äldre djur.
      OBS: Vuxna visar många processer som innerverar i kroppsväggsmuskler och kan vara svåra att räkna. Se till att varje process bara räknas en gång.
    5. Beräkna avståndet mellan PVD-cellkropparna i wdIs51-djuren genom att rita en segmenterad linje från PVD-cellkroppen (CB) till PVC CB. För larv 4 (L4) stadiumdjur är cellkropparna långt ifrån varandra och är inte i samma ram när de avbildas med ett 60x-mål.
    6. Välj överlappande bilder från stapeln för att täcka hela djurlängden från huvud till svans med hjälp av fliken Bild > Stacks > Z-projekt från ImageJ. Rita segmenterade linjer längs den neuronala processen mellan PVD och PVC CBs.
    7. Mät längderna för alla segmenterade linjer med ImageJ > Analysera > mått. Lägg till längderna för alla segment för att beräkna det totala avståndet mellan PVD och PVC CBs för varje tidpunkt.
    8. För neuronlängd av TRN i jsIs609-djur , ladda bilderna i Fiji. Rita en segmenterad linje längs de bakre laterala mikrotubuli (PLM; synlig med löslig GFP) från cellkroppen till centroiden hos den första mitokondrion. Beräkna linjens längd för det första avståndsvärdet.
    9. Rita en segmenterad linje från mitten av den första till den andra mitokondrion. Upprepa denna process för varje par mitokondrier till slutet av neuronal processlängd. Lägg till alla längder för att beräkna den totala neuronala processlängden.
    10. För celllinjeanalysen, ladda alla vulvalbilder i Fiji och extrahera den bästa fokusbilden av cellerna från time-lapse-bilderna av flera z-plan.
    11. Representera data som medelvärde ± medelfel (SEM). Beräkna statistisk signifikans med hjälp av envägs ANOVA för mer än två prover eller ett två-prov t-test för ett par prover. Ange signifikans med p-värde < 0,05 (*), p-värde < 0,005 (**) och p-värde > 0,05 (ns, ej signifikant).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karakterisering av enheten: Tillväxt- och avbildningsanordningen består av två PDMS-lager bundna ihop (figur 1) med irreversibel plasmabindning. Flödesskiktet (mönster 1) som är 10 mm långt och 40 μm eller 80 μm i höjd gör att vi kan odla djuret i flytande kultur (Figur 1A). Fångstskiktet (mönster 2) har ett 2 mm brett membran (figur 1B) för immobilisering av djuret för högupplöst avbildning. Masken för svällningsskiktet skapar också ett par isoleringsmembran för att begränsa djurrörelser inom en del av flödeskanalen mellan på varandra följande avbildningstidpunkter. Enhetens fångstmembran är anpassat från vår tidigare bildbehandlingsenhet3. Den aktuella anordningen (figur 1C,L) inkluderar tillsats av ett isoleringsmembran och en ökning av fångstmembranets bredd till 2 mm för effektiv immobilisering av samma djur över flera tidpunkter.

För att testa anordningen fylldes rent destillerat vatten i de mikrofluidiska kanalerna som förbinder fångstmembranen (figur 1D,E och kompletterande figur 3) och trycksattes med 14 psi kvävgas, som också användes för att fånga ett djur under ett 2 mm tjockt PDMS-membran (figur 1H,K,L). Ett enda djur plockades från en NGM-platta med hjälp av en mikropipett och laddades in i flödeskanalen (figur 1F). Tillväxtkanalen fylldes med bakterier som återsuspenderades i S-media (figur 1F, G, I, J). Ett konstant flöde upprätthölls under hela avbildningstiden genom att justera mediehöjderna i pipettspetsarna som var anslutna till enhetens inlopp och utlopp medan djuret övervakades i flödeskanalen mellan de två isoleringsmembranen. Nyberedd OP50-lösning fylldes i mikropipettspetsarna dagligen för att säkerställa en hälsosam matkälla för djuret inuti mikrokanalen. Färsk matkälla och gasgenomsläppligt PDMS-material säkerställer tillräcklig syretillförsel inuti mikrokanalen30,29. Tillväxten av djur i enheten spårades med hjälp av antingen cellspecifika markörer eller markörer som visar cellinje eller variabla cellulära uttrycksmönster under utvecklingen. Djuren immobiliserades under fångstmembranet med 14 psi kvävgas och höll maskar i rakt läge längs kanalväggen. Djuret växte långsammare inuti den mikrofluidiska kanalen jämfört med på en NGM-platta23.

Celllinjestudie med hjälp av den långsiktiga bildbehandlingsenheten: För att bedöma C. elegans utveckling inuti den mikrofluidiska enheten växte vi PS3239 (ZMP-1: : GFP) stam32 med konstant matförsörjning för att spåra vulvautveckling vid olika tidpunkter för deras tillväxt. ZMP-1 kodar för en zinkmetalloproteas och uttrycker sig i ankarcellen i L3-steget, i vulD- och vulE-celler i L4-stadiet och i vulA i dag 1 (1D) vuxna djur (figur 2A). Förändringarna i uttrycksmönstret är ett exempel på temporal genreglering där samma gen uttrycks i olika celler i olika utvecklingsstadier. För att observera vulvalutveckling immobiliserades djuret först och vulvalregionen avbildades sedan över flera z-plan var 8-10: e timme från L3 och framåt till vuxna stadier. ZMP-1::GFP uttrycks i olika vulvalceller beroende på utvecklingsstadiet (figur 2B). De högupplösta fluorescensbilderna av vulvalcellerna från djuren som växer inuti den mikrofluidiska enheten visar normal vulvalutveckling och ZMP-1: : GFP-uttryck och lokalisering liknar tidigare rapporter32.

Spårning av neuronutveckling med hjälp av långsiktig tillväxt- och bildbehandlingsenhet: För att demonstrera användningen av enheten för subcellulär avbildning från ett enskilt djur övervakades utvecklingen av två mekanosensoriska neuroner PVD och TRN. NC1686-stammen som uttrycker wdIs51 som uttrycker GFP i de två PVD-neuronerna användes34,36. Varje PVD-neuron visar menorahliknande grenad dendritisk arkitektur bestående av primära (PP), sekundära (SP), tertiära (TP) och kvartära (QP) processer vid L2 (14-16 h), sen L2 (20-22 h), L3 (24-26 h) respektive L4 (36-42 h) utvecklingsstadier (Figur 3). PVD-cellkroppen är närvarande bakom vulva. Det skickar ut en axon och två primära dendritiska processer som ger upphov till SP och TP, vilket i sin tur ger upphov till QP dendritiska grenar som innerverar kroppsväggsmusklerna. Sena L3- och L4-stadier visar hög arborisering37,34. Vi odlade enstaka NC1686-djur inuti mikrofluidikanordningen och matade dem kontinuerligt med bakteriell mat. Djuren immobiliserades under L2 upp till 1D-utvecklingsstadiet och PVD-neuronerna avbildades upprepade gånger var 8-12: e timme med 60x, 1,3 NA-oljemål för att räkna antalet SP-, TP- och QP-grenar i tre dimensioner. Förgreningens omfattning ökade under utvecklingen, vilket framgår av figur 3B. Antalet SP och QP i olika stadier av maskutvecklingen ökade med åldern (figur 4A) vilket har setts i tidigare studier37. L2-djur uppvisade 10 ± 3,8 (n = 9) SPs men ingen QP, när de mättes med hjälp av enheten (figur 4A). Vi placerade C. elegans i en droppe på 3 mM levamisol, ett bedövningsmedel som orsakar sammandragning av kroppsväggsmuskel och förlamning, för att minimera negativa effekter på organelltransport samtidigt som djurrörelser minskar och orsakar tillräcklig förlamning, vilket krävs för högupplöst avbildning 3,4. SP-värdena (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) skilde sig inte signifikant när de mättes från liknande iscensatta djur som odlades på NGM-plattor och avbildades med 3 mM levamisol på en agarglas (figur 4B). Data tyder på att enhetens immobilisering möjliggör högupplöst avbildning av komplexa neuronala arkitekturer och påverkar inte deras utveckling. L3-stegsdjur har ett litet antal QP som ökar i antal med utveckling. 1D vuxna visade 67 ± 2,8 QP (n = 5) hos djur som odlas i enheten. Tidigare studier har visat bildandet såväl som en indragning av PVD-processer under utveckling som kallas självundvikande, där de minskar sina grennummer38. Minskningen av SP vid 51 h (1D) efter kläckning kan vara resultatet av sådana indragningar. Djur som växte på NGM-plattor och avbildades med 3 mM levamisol visade en liknande förgreningstalstrend för jämförbara utvecklingsstadier (figur 4A,B). Vidare ökar avståndet mellan de två PVC-cellkropparna, en närvarande i svansen och den andra närvarande nära vulva, när de rör sig isär hos djur som odlas i enheten eller de som odlas på NGM-plattor (figur 4C,D). Under hela avbildningsprocessen förblev djuren friska och kunde lägga ägg även efter att djuren immobiliserades under membranet upprepade gånger under denna långa period.

Med hjälp av denna enhet kunde vi immobilisera djuret i samma riktning och avbilda den identiska neuronen och dess arkitektur med hög upplösning även med svagt GFP-uttryck. För att demonstrera nyttan av vår tillväxt- och immobiliseringsteknik avbildades utvecklingen av TRN från L3 till vuxen med jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP) djur. De bakre TRN finns på kroppens laterala sida och heter PLMR och PLML vilket motsvarar djurets högra och vänstra sida. Vi avbildade samma djur som växte i mikrofluidikchipet och immobiliserade dem med 12-14 timmars mellanrum. Montaget representerar hela PLMR-neuronprocessen vid successiva tidpunkter som belyser både mitokondrier och den neuronala processen (figur 5A). Den totala neuronala processlängden beräknades och visade sig öka med en lutning på 10,4 μm per h (figur 5B). Denna ökningshastighet i neuronal processlängd överensstämmer med en tidigare rapport på ~ 10 μm / h 18,31,39,40,41. Vi observerade också tillsatsen av nya mitokondrier i odlingsprocessen och förändringen i den synaptiska grenpunktspositionen med avseende på cellkroppen som rapporterats tidigare23.

Figure 1
Figur 1: Ett enkelt mikrofluidiskt chip för långsiktig tillväxt och avbildning av C. elegans. (A) Flödesskiktet består av en 10 mm lång mikrofluidisk kanal (mönster 1) i ett tunt PDMS-skikt. (B) Svällningsskiktet består av en 2 mm tjock immobiliseringskanal och ett par tunna isoleringskanaler i det stora PDMS-skiktet. (C) De två PDMS-skikten är bundna tillsammans med ett tunt täckglas för att göra enheten. (D, E) Kanalerna för fångst- och isoleringskontroll är fyllda med avjoniserat (DI) vatten under komprimerad kvävgas (N2). (F) Ålderssynkroniserade C. elegans plockas från NGM-plattor och laddas inuti enhetens flödesskikt. (G) Livsmedel tillhandahålls med hjälp av två mikropipettspetsar vid inlopps- och utloppsreservoarerna. (H) Djuren är fria att röra sig inom de två isoleringskanalerna och fångas under immobiliseringsmembranet. (I) Bild av tillväxt- och bildbehandlingsanordningen med matförsörjning genom två mikropipettspetsar. (J, K) Bilder av en fritt rörlig och immobiliserad C. elegans inuti den mikrofluidiska kanalen. Skalstången är 1 mm (I) och 200 μm (J, K). L) Schema över anordningens tvärsnitt som visar höjderna på flödeskanalen (FC), PDMS-membranet (M) och kontrollkanalen (CC). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Spåra uttrycket av en vulvalmarkör i C. elegans som utvecklas inuti enheten. (A) Schematisk bild av vulvalceller som uttrycker ZMP-1::GFP hos PS3239-djur under utveckling. GFP-signalen visas i ankarcellen vid L3-steget, i vulD- och vulE-cellerna vid L4-stadiet och i vulA-celler vid det vuxna 1D-stadiet. (B) Bilder av PS3239-djur som växer inuti mikrofluidikchipet och immobiliseras var 8-10: e timme för att fånga fluorescensbilder av ZMP-1: GFP-uttryck under vulvalutveckling från L3, L4 och 1 dag (1D) vuxen. Förkortningar: AC = ankarcell, A = vulA, D = vulD, E = vulE. Skalfältet är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Avbildning av enskilda wdIs51 C. elegans för att spåra PVD-neuronal utveckling . (A) Schematisk av PVD-neurontillväxt och dendritisk arborisering från L2 till L4-stadium. Grön cirkel visar PVD-cellkropp (CB, gul pil). Dendriterna visar framväxten av primära processer (PP) vid L2 från både den främre och bakre sidan av CB, sekundära processer (SP) under sen L2, tertiära processer (TP) i L3 och kvartära processer (QP) under L4-steg. (B) Bilder av PVD-neuroner från djur som växer inuti en mikrofluidisk anordning. (C) Bilder av PVD-neuroner från djur som odlats på en NGM-platta och immobiliserats med 3 mM levamisol (Lev). Skalfältet är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Jämförelse av PVD-utveckling hos enhetsodlade djur och djur som odlas på NGM-plattor. (A) Det genomsnittliga antalet sekundära processer (SP) och kvartära processer (QP) från samma djur som växer inuti mikrofluidikanordningen. Värdena beräknas vid 16 h (L2), 24 h (L3), 36 h (tidig L4), 42 h (sen L4) och 51 h (1D vuxen). B) Det genomsnittliga antalet SP och QP från ett annat parti djur som växer på NGM-plattor och bedövas med 3 mM levamisol. (C) Genomsnittlig separation mellan de två PVD-neuronala cellkropparna från samma djur som växer i mikrofluidikanordningen. D) Genomsnittlig separation från olika uppsättningar djur som växer på NGM-plattor och bedövas med 3 mM levamisol. Data representerade som medelvärde ± SEM (n ≥ 10 för 3 mM levamisol och n ≥ 6 för immobiliserade djur som är immobiliserade för enheter). De statistiska signifikanserna beräknas med enkelriktad ANOVA och betecknas som p-värde < 0,05 (*), p-värde < 0,005 (**) och p-värde > 0,05 (ns). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Högupplöst avbildning av beröringsreceptorneuroner (TRN) från djur som växer inuti den mikrofluidiska enheten. (A) Montage av neuronala processer från ett enda djur som avbildas vid olika tidpunkter. Cellkroppen (CB, pil), den synaptiska grenpunkten (BP, pilspetsen) och neuronspetsen (Spets, uppåtpil) är märkta. Den neuronala processen och positionen för varje mitokondrion spåras manuellt med hjälp av Fiji. Skalstången är 10 μm. (B) Genomsnittlig neuronal processlängd vid olika avbildningstidpunkter. Data representerade som medelvärde ± SEM (n = 8). Den statistiska signifikansen beräknas med hjälp av enkelriktad ANOVA och betecknas som p-värde < 0,005 (**) och p-värde > 0,05 (ns). En regressionsekvation passar med en lutning på 10,4 μm neuronal processförlängning per timme, R2 = 0,9425. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Skärmdumpar av mikroskopinställningar för fluorescensavbildning av C. elegans. (A) En panel i bildanalysprogramvaran visar de markerade avsnitten för att ställa in skanningshastighet, filteruppsättning och mål för avbildning. (B) Programvaran används sedan för att välja 488 nm laser med 7% av den fulla lasereffekten. (C) Bildanalysprogramvaran kan ta en enda bildram eller en serie time-lapse-bilder och lagra dem för framtida analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Skärmbilder av FIJI-programvara som visar analysstegen för att räkna PVD-grenar i wdIs51-djur . (A) Visar PVD-bild som öppnats i Fiji ImageJ-programvaran och länk till cellräknarens plugin. (B) Cellräknarfönster för att initiera räknaren för en bild. (C) Val av räknare för att markera grenar som ingår och för att undvika flerfaldigt räkning. (D) Resultatfönster som visar det totala antalet filialer under varje kategori. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Schematisk bild av tillväxt- och bildbehandlingsanordningen. Två mikropipettspetsar, fyllda med olika volymer av bakteriematlösning (gul), sätts in i flödeskanalens inlopps- och utloppsstansar i bottenskiktet. Skillnaden i höjden på matlösningar i spetsarna gör att lösningen flyter inuti kanalen som i sin tur levererar bakterier till djuret för dess tillväxt. Fångst- och isoleringskanalerna (blå) fylls med destillerat vatten och komprimeras med hjälp av en kvävgasförsörjning (inställd på 14 psi). Isoleringskanalen är alltid ansluten till 14 psi. Trycket på fångstmembranet växlas mellan 0 (djuret är fritt att röra sig och mata) och 14 psi (djuret immobiliseras för högupplöst avbildning) med hjälp av en trevägskontakt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta dokument beskrivs ett protokoll för tillverkning och användning av en enkel mikrofluidisk anordning för odling av C. elegans med konstant matförsörjning och högupplöst avbildning av ett enda djur under dess utveckling. Denna tillverkningsprocess är enkel och kan göras i en icke-steril miljö. En dammfri miljö är avgörande under tillverkningsstegen. Närvaron av dammpartiklar skulle leda till felaktig kontakt mellan de två bindningsytorna, vilket resulterar i dålig bindning och läckage av enheten under högtrycksapplikation medan C. elegans immobiliseras. Av alla tillverkade enheter är 95% av enheterna lämpliga för experiment. Ett litet antal enheter misslyckas (5%) på grund av olämplig bindning under tillverkning eller användning. Fel i limning kan minskas genom att utföra tillverkningsprocessen i ett dammfritt (> renrum av 1,000-klass) tillgängligt vid flera akademiska institutioner runt om i världen. För att rengöra bakteriemat från flödeskanalen och möjliggöra återanvändning av enheten, spola enheten genom att strömma alkohol genom den efter varje experiment.

Protokollet visar en litografitillverkningsprocess med en enkel design som enkelt kan modifieras för olika utvecklingsstadier och storlekar av C. elegans. Vidare kan denna enhetsdesign anpassas för andra modellorganismer som zebrafisk och Drosophila, genom att öka dimensionerna av flödet och fånga lager3 för att observera en mängd olika utvecklings- och subcellulära processer. I detta protokoll har två olika höjder av flödesskiktskanalen - 40 μm och 80 μm - använts för fullständig immobilisering och spårning av cellulära och subcellulära funktioner i olika utvecklingsstadier av C. elegans som är lämpliga för deras kroppsstorlekar. Till exempel börjar den dendritiska arboriseringen i PVD-sensoriska neuroner i de tidiga L2-stadierna och fortsätter upp till L4-scenen. Detta avbildades i en enhet med ett 40 μm högt flödesskikt. Eftersom PVD-neuronerna bildar dendriter som innerverar kroppsväggsmuskler kräver det optisk sektionering för att kvantifiera processerna i 3D. Den kvantitativa analysen av dendritiska arbors kräver fullständig immobilisering av djuren i enheten som matchar kroppsdiametern. För att övervaka vulvalutvecklingen användes dock 80 μm flödesskiktets höjd för att spåra vulvallinjerna. För TRNs längd och mitokondrier avbildning, avbildade vi L2 till L4 steg med hjälp av enheter med 40 μm flödesskikttjocklek. Att använda en enhet med fel höjd kommer att orsaka svårigheter vid immobilisering. Till exempel kommer små djur (L2 eller tidiga L3-steg) inuti en 80 μm flödesskikthöjdsanordning att tillåta djurvändning inuti enheten och visa ofullständig immobilisering även efter att fångstmembranet är under 14 psi tryck. Å andra sidan kommer djur med stora kroppsdiametrar (utöver sen L4) inte lätt in i en enhet med 40 μm flödesskikthöjd. Att fånga stora djur i små enheter under högt tryck kan skada kroppen. Appliceringen av den nuvarande anordningen med ett flödesskikt på 40 μm är begränsad och inte lämplig för högupplöst avbildning av mycket unga djur i tidigt larvstadium (såsom djur i L1-stadiet yngre än 10 timmar efter kläckning) eftersom de inte är helt immobiliserade under membranet. På grund av små kroppsstorlekar fortsätter de små larvdjuren att röra sig och flyr ibland från fällan när de är upphetsade med laserljus. För L1-stegsdjur kan man utföra lågupplöst ljusfälts- eller fluorescensavbildning med 4x eller 10x mål och korta kameraexponeringstider. Som ett alternativt tillvägagångssätt kommer en ny flödesskiktsanordning med < 20 μm höjd att vara nödvändig för att helt immobilisera unga larvstadium C. elegans.

Att spåra utvecklingsfenomen hos samma djur över en lång tidsskala med hjälp av högupplöst fluorescensavbildning kan resultera i ökad autofluorescens. Varje time-lapse-avbildningsanalys kräver optimering av excitationsintensitet, exponeringstid, bildtidsintervall, djuråtervinningstid och matkvalitet för fysiologiskt relevant utvecklingsinformation från C. elegans-studier. Vi har valt > tidsintervall på 3 timmar för utvecklingsstudier vid användning av djur från L4-stadier och framåt. Enheten kan förvärva mer frekventa bilder (var 5-10 min i några timmar) eller flera bilder per sekund (i < 1 h) för att studera andra dynamiska processer såsom organelltransport och distribution i C. elegans neuroner 3,23. Fångst och avbildning av tidiga utvecklingsstadier kräver noggrannare observation eftersom upprepad fångst med korta tidsintervaller utan fullständig återhämtning kan påverka deras hälsa. Under experiment visade det sig att djur som krävde högt tryck för att flytta dem in i flödesskiktet visar dålig hälsa och mer autofluorescens över tiden. Djur med hög kroppsfluorescens, kända för att vara associerade med en hög stressnivå, undviks för avbildningsstudier. För att upprätthålla god fysiologi fångades djuren i ett rakt läge intill kanalväggen. Immobilisering av djuren med kroppen över kanalbredden undviks eftersom djur blir sjuka efter att deras kropp pressats under 14 psi-tryck i denna position. För att upprätthålla ett bra signal-brusförhållande under upprepad avbildning med oljemål bör täckglaset rengöras ordentligt efter varje tidpunkt. Efter särskild försiktighet under tillverkningsprocessen för enheten och dess tillämpning kan samma enheter återanvändas under flera bildsessioner.

Denna enhet kan vara användbar för studier med mutanter som kan vara känsliga för anestetika. Det presenterade tillvägagångssättet kan eliminera negativa bedövningseffekter på tillväxt och fysiologi för att underlätta observation av morfologiska, funktionella och beteendemässiga defekter hos djur under en lång period. Enheten är lätt att tillverka och kan ställas in i vilket laboratorium som helst för att ta itu med långsiktiga utvecklings- / cellbiologiska frågor i C. elegans som kräver intermittent högupplöst avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. och S.P.K. är författare till ett pågående patent på den mikrofluidiska tillväxt- och bildbehandlingsanordningen (patentansökningsnummer 640/CHE/2011).

Acknowledgments

Vi tackar CIFF imaging facility, NCBS för användningen av konfokalmikroskopen som stöds av DST - Centre for Nanotechnology (nr. SR/55/NM-36-2005). Vi tackar forskningsfinansiering från DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), snurrskiva som stöds av DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK och Gautam Menon) och HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK). HB101-, PS3239- och wdIs51-stammarna tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. gjorde jsIs609 i Mike Nonets laboratorium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Bioengineering Utgåva 182 C. elegans mikrofluidiskt chip on-chip tillväxt långsiktig avbildning neuronal avbildning vulva celllinje
Ett enkelt mikrofluidiskt chip för långsiktig tillväxt och avbildning av <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter