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Bioengineering

केनोरहाब्डिस एलिगेंस के दीर्घकालिक विकास और इमेजिंग के लिए एक सरल माइक्रोफ्लुइडिक चिप

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

प्रोटोकॉल एक सरल माइक्रोफ्लुइडिक चिप डिजाइन और माइक्रोफैब्रिकेशन पद्धति का वर्णन करता है जिसका उपयोग 36 घंटे तक निरंतर खाद्य आपूर्ति की उपस्थिति में सी एलिगेंस को विकसित करने के लिए किया जाता है। विकास और इमेजिंग डिवाइस कई दिनों के लिए विकास के दौरान सेलुलर और उप-सेलुलर प्रक्रियाओं के आंतरायिक दीर्घकालिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को भी सक्षम बनाता है।

Abstract

केनोरहाब्डिस एलिगेंस (सी एलिगेंस) विकास और कोशिका जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली साबित हुई है। इन जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए अक्सर एक ही जानवर की दीर्घकालिक और बार-बार इमेजिंग की आवश्यकता होती है। अगर पैड पर किए गए पारंपरिक स्थिरीकरण विधियों से जुड़े लंबे समय तक पुनर्प्राप्ति समय का पशु स्वास्थ्य पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है, जिससे लंबे समय तक एक ही जानवर को बार-बार चित्रित करना अनुचित हो जाता है। यह पेपर एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप डिजाइन, निर्माण विधि, ऑन-चिप सी एलिगेंस संवर्धन प्रोटोकॉल, और व्यक्तिगत जानवरों में विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग के तीन उदाहरणों का वर्णन करता है। चिप, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन के साथ निर्मित और एक कवर ग्लास पर बंधी हुई, एक इलास्टोमेरिक झिल्ली का उपयोग करके ग्लास सब्सट्रेट पर जानवरों को स्थिर करती है जिसे नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके विक्षेपित किया जाता है। एलिगेंस का पूर्ण स्थिरीकरण एक एनेस्थेटिक-मुक्त तरीके से सेलुलर और उप-सेलुलर घटनाओं की मजबूत टाइम-लैप्स इमेजिंग को सक्षम बनाता है। एक बड़े क्रॉस-सेक्शन के साथ एक चैनल ज्यामिति जानवर को दो आंशिक रूप से सील किए गए अलगाव झिल्ली के भीतर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देती है जो निरंतर खाद्य आपूर्ति के साथ चैनल में वृद्धि की अनुमति देती है। इस सरल चिप का उपयोग करके, पीवीडी संवेदी न्यूरॉन्स में न्यूरोनल प्रक्रिया वृद्धि, वल्वल विकास और डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन जैसी विकासात्मक घटनाओं की इमेजिंग की जा सकती है, क्योंकि जानवर चैनल के अंदर बढ़ता है। दीर्घकालिक विकास और इमेजिंग चिप एक एकल दबाव रेखा, कोई बाहरी वाल्व नहीं, सस्ती तरल पदार्थ उपभोग्य सामग्रियों के साथ काम करती है, और मानक वर्म हैंडलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करती है जिसे आसानी से सी एलिगेंस का उपयोग करके अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

केनोरहाब्डिस एलिगेंस सेल बायोलॉजी, एजिंग, डेवलपमेंट बायोलॉजी और न्यूरोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव साबित हुआ है। इसके पारदर्शी शरीर, लघु जीवन चक्र, आसान रखरखाव, कोशिकाओं की एक परिभाषित संख्या, कई मानव जीनों के साथ होमोलॉजी और अच्छी तरह से अध्ययन किए गए आनुवंशिकी जैसे लाभों ने सी एलिगेंस को मौलिक जीव विज्ञान खोजों और लागू अनुसंधानदोनों के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बनने के लिए प्रेरित किया है। व्यक्तिगत जानवरों के बार-बार दीर्घकालिक अवलोकन से सेल की जैविक और विकासात्मक प्रक्रियाओं को समझना फायदेमंद साबित हो सकता है। पारंपरिक रूप से, सी एलिगेंस को एगर पैड पर एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया जाता है। जानवरों के स्वास्थ्य पर एनेस्थेटिक्स के प्रतिकूल प्रभाव एक ही जानवर के दीर्घकालिक और बार-बार आंतरायिक इमेजिंग के लिए एनेस्थेटाइज्ड जानवरों के उपयोग को सीमित करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति और नगण्य स्वास्थ्य खतरों के साथ सी एलिगेंस के एनेस्थेटिक-मुक्त फंसने के लिए उनका अनुकूलन एक ही जानवर की छोटी और लंबी अवधि में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करता है।

माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को सी एलिगेंस के 5 उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग 6,7,8, ट्रैपिंग और डिस्पेंसिंग9, ड्रग स्क्रीनिंग 10,11, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग 12 के साथ न्यूरॉन उत्तेजना और पशु12,13,14 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है। स्लाइडों पर स्थिरीकरण के लिए अल्ट्रा-पतली माइक्रोफ्लुइडिक शीटभी विकसित की गईहैं। एलिगेंस के दीर्घकालिक अध्ययन तरल संस्कृति में बढ़ने वाले जानवरों की कम-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उपयोग करके विकास, कैल्शियम गतिशीलता, उनके व्यवहार पर दवा के प्रभाव16,17,18,19, उनकी दीर्घायु औरउम्र बढ़ने 20 का निरीक्षण करने के लिए किए गए हैं। उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दीर्घकालिक अध्ययन सिनैप्टिक विकास21, न्यूरोनल पुनर्जनन22 और माइटोकॉन्ड्रियल जोड़23 का आकलन करने के लिए किए गए हैं। मल्टीचैनल उपकरणों24,25 में दीर्घकालिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और सेल भाग्य और भेदभाव का पता लगाने का काम किया गया है। कई सेलुलर और उप-सेलुलर घटनाएं कई घंटों के समय के पैमाने पर होती हैं और विवो में सेलुलर गतिशीलता को समझने की प्रक्रिया में सभी मध्यवर्ती चरणों को चिह्नित करने के लिए उनके विकास के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक ही व्यक्ति को फंसाने की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनोजेनेसिस, न्यूरोनल विकास और सेल माइग्रेशन जैसी जैविक प्रक्रिया की छवि बनाने के लिए, जानवर को कई समय बिंदुओं पर एक ही अभिविन्यास में स्थिर करने की आवश्यकता होती है। हमने पहले 36 घंटे से अधिक समय तक सी एलिगेंस की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स (टीआरएन) 23 के साथ माइटोकॉन्ड्रिया कहां जोड़ा जाता है।

यह पेपर बार-बार उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित पद्धति स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। एकल प्रवाह चैनल के साथ यह उपकरण, प्रति डिवाइस एक एकल जानवर की बार-बार इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त है। थ्रूपुट में सुधार करने और एक साथ कई जानवरों की छवि बनाने के लिए, कई उपकरणों को एक ही दबाव रेखा से जोड़ा जा सकता है, लेकिन प्रत्येक डिवाइस में एक ही जानवर को नियंत्रित करने वाले अलग-अलग तीन-तरफा कनेक्टर के साथ। डिजाइन उन अध्ययनों के लिए उपयोगी है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइम-लैप्स छवियों की मांग करते हैं जैसे कि पोस्ट-भ्रूण विकास प्रक्रियाएं, सेल माइग्रेशन, ऑर्गेनेल परिवहन, जीन अभिव्यक्ति अध्ययन, आदि। प्रौद्योगिकी कुछ अनुप्रयोगों जैसे जीवनकाल और उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए सीमित हो सकती है, जिन्हें कई देर से चरण के जानवरों के समानांतर विकास और इमेजिंग की आवश्यकता होती है। पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) इलास्टोमेर का उपयोग इस उपकरण को बनाने के लिए इसकी बायोस्टेबिलिटी26, बायोकम्पैटिबिलिटी27,28, गैस पारगम्यता29,30 और असमर्थ लोचदार मापांक 31 के कारण किया गया था। यह दो-परत उपकरण एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में निरंतर खाद्य आपूर्ति के साथ जानवरों के विकास और नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके पीडीएमएस झिल्ली संपीड़न के माध्यम से व्यक्तिगत सी एलिगेंस के फंसने की अनुमति देता है। यह उपकरण पहले प्रकाशित डिवाइस का एक विस्तार है जिसमें निरंतर खाद्य आपूर्ति 3 के तहत माइक्रोचैनल में एक ही जानवर को बढ़ने और इमेजिंग करने का लाभहै। अतिरिक्त अलगाव झिल्ली नेटवर्क और एक 2 मिमी चौड़ी ट्रैपिंग झिल्ली विकासशील जानवरों के कुशल स्थिरीकरण को सक्षम करती है। डिवाइस का उपयोग संवेदी पीवीडी न्यूरॉन्स में न्यूरोनल विकास, वल्वल विकास और डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन का निरीक्षण करने के लिए किया गया है। जानवर डिवाइस में प्रतिकूल स्वास्थ्य प्रभावों के बिना बढ़ते हैं और इसके विकास के दौरान एक ही जानवर में इमेजिंग उप-सेलुलर घटनाओं की सुविधा के लिए बार-बार स्थिर किया जा सकता है।

पूरे प्रोटोकॉल को पांच भागों में विभाजित किया गया है। भाग 1 विकास और इमेजिंग चिप के लिए डिवाइस निर्माण का वर्णन करता है। भाग 2 वर्णन करता है कि पीडीएमएस झिल्ली विक्षेपण के लिए एक दबाव प्रणाली कैसे स्थापित की जाए ताकि व्यक्तिगत सी एलिगेंस को स्थिर और अलग किया जा सके। भाग 3 बताता है कि डिवाइस इमेजिंग के लिए नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) प्लेट पर सी एलिगेंस को कैसे सिंक्रनाइज़ किया जाए। भाग 4 बताता है कि डिवाइस में एक जानवर को कैसे लोड किया जाए और कई दिनों तक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर जानवर को कैसे उगाया जाए। भाग 5 वर्णन करता है कि कई समय बिंदुओं पर एक व्यक्तिगत जानवर को कैसे स्थिर किया जाए, विभिन्न उद्देश्यों का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर किया जाए, और फिजी का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण किया जाए।

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Protocol

1. विकास और इमेजिंग डिवाइस का निर्माण

  1. SU8 मोल्ड निर्माण
    1. एक शब्द प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (या कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन सीएडी सॉफ्टवेयर) में आयताकार आकृतियों का उपयोग करके डिज़ाइन पैटर्न 1 (प्रवाह परत) और 2 (नियंत्रण परत) और पॉलिएस्टर-आधारित फिल्म पर 8 μm के न्यूनतम फीचर आकार के साथ लेजर प्लॉटर की मदद से फोटोमास्क प्रिंट करें (चित्रा 1)।
    2. सिलिकॉन वेफर्स को 2.5 सेमी × 2.5 सेमी टुकड़ों में काटें और उन्हें 1 मिनट के लिए 20% कोह के साथ साफ करें। वेफर्स को विआयनीकृत (डीआई) पानी में धो लें। प्रवाह और नियंत्रण परत के लिए प्रत्येक एक वेफर का उपयोग करें।
      चेतावनी: KOH संक्षारक है और इसे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
    3. टुकड़ों को 14 पीएसआई संपीड़ित नाइट्रोजन गैस के साथ सुखाएं और इसके बाद 4 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर निर्जलीकरण करें। अगले चरण पर जाने से पहले, दो टुकड़ों को कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
    4. सिलिकॉन के टुकड़ों में से एक लें और इसे स्पिन कोटर के चक पर रखें और वेफर को जगह पर रखने के लिए वैक्यूम चालू करें। सिलिकॉन टुकड़े पर, हेक्सामेथिलडिसिलिन (एचएमडीएस) के ~ 20 μL डालें और इसे 5 सेकंड के लिए 500 रोटेशन प्रति मिनट (आरपीएम) पर स्पिन कोटर का उपयोग करके कोट करें और इसके बाद 30 सेकंड के लिए 3,000 आरपीएम।
      चेतावनी: यह चरण पीले प्रकाश में किया जाना चाहिए। कमरे में सफेद बत्ती का इस्तेमाल न करें।
    5. ~ 40 μm (प्रवाह परत के लिए विशिष्ट; प्रारंभिक लार्वा चरण 1 से चरण 3 (L1 - L3) जानवरों की इमेजिंग के लिए उपयुक्त) की एक समान फोटोरेसिस्ट मोटाई प्राप्त करने के लिए, सिलिकॉन वेफर को ~ 1.5 एमएल नकारात्मक फोटोरेसिस्ट -1 के साथ 5 सेकंड के लिए 500 आरपीएम पर स्पिन कोटर का उपयोग करके और उसके बाद 30 सेकंड के लिए 2,000 आरपीएम पर कोट करें।
    6. नियंत्रण परत के लिए विशिष्ट ~ 40 μm की एक समान फोटोरेसिस्ट मोटाई प्राप्त करने के लिए दूसरे वेफर के साथ चरण 1.1.4 और 1.1.5 दोहराएं।
    7. वैकल्पिक रूप से, पुराने जानवरों के लिए प्रवाह परत की मोटाई को ~ 80 μm तक बढ़ाने के लिए, सिलिकॉन वेफर्स को ~ 1.5 एमएल नकारात्मक फोटोरेसिस्ट -2 के साथ 5 सेकंड के लिए 500 आरपीएम पर स्पिन कोटर का उपयोग करके कोट करें और इसके बाद 30 सेकंड के लिए 2,000 आरपीएम। यह मोटाई वयस्क जानवरों के लिए एल 3 चरण के लिए उपयुक्त है।
      सावधानी: स्पिन-लेपित परतों को किसी भी नुकसान से बचने के लिए सिलिकॉन वेफर्स को उनके किनारों से पकड़ें। इस चरण के दौरान सफेद रोशनी बंद रखें।
    8. फोटोरेसिस्ट-लेपित सिलिकॉन टुकड़ों (प्रवाह और नियंत्रण परतों के लिए) को 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर बेक करें, इसके बाद 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। पके हुए टुकड़ों को कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
      नोट: बेक्ड सिलिकॉन टुकड़ों को अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले एक दिन के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। अंधेरे में स्टोर करें और सफेद रोशनी के संपर्क में न आएं।
    9. यूवी लैंप के सामने फोटोरेसिस्ट-लेपित सतह के साथ यूवी इलुमिनेटर के एक्सपोजर स्टेज पर नरम-बेक्ड सिलिकॉन टुकड़े डालें। क्रमशः प्रवाह और नियंत्रण परतों को प्राप्त करने के लिए पैटर्न 1 और 2 के साथ फोटोमास्क के माध्यम से, 200 डब्ल्यू लैंप का उपयोग करके, 15 सेकंड के लिए यूवी के लिए दो टुकड़ों को अलग-अलग उजागर करें।
      सावधानी: सुरक्षा चश्मे पहनें और यूवी प्रकाश के प्रत्यक्ष संपर्क से बचें। इस चरण के दौरान कमरे में सफेद बत्ती चालू न करें।
    10. दो उजागर सिलिकॉन टुकड़ों को लेपित परत के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, इसके बाद क्रमशः 1 मिनट और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस। अगले चरण पर जाने से पहले टुकड़ों को कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
    11. 20 मिनट के लिए फोटोरेसिस्ट डेवलपर समाधान (आइसोप्रोपेनोल में डेवलपर का 1: 3 कमजोर पड़ना) में सिलिकॉन टुकड़ों को भिगोकर पैटर्न विकसित करें। एक बार पैटर्न दिखाई देने के बाद, टुकड़ों को शुद्ध आइसो-प्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) से धो लें और नाइट्रोजन गैस (14 पीएसआई) का उपयोग करके धीरे से सूखा दें।
      चेतावनी: मानव जोखिम से बचने के लिए इस रासायनिक उपचार के लिए एक अच्छी तरह से हवादार वातावरण का उपयोग करें। सुविधाओं को विकसित करने और आईपीए से धोने के बाद ही सफेद प्रकाश का उपयोग करें।
    12. सिलिकॉन के टुकड़ों को लेपित सतह के साथ एक डेसिकेटर में रखें। एक छोटे प्लास्टिक कप या ग्लास स्लाइड पर शुद्ध ट्राइक्लोरो (1 एच, 1 एच, 2 एच, 2 एच-परफ्लोरोक्टिल) सिलेन के 50 μL डालकर टुकड़ों को सिलेन वाष्प में उजागर करें। कप/स्लाइड को एक डेसिकेटर के अंदर रखें और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      सावधानी: सिलेन वाष्प के प्रत्यक्ष संपर्क से बचें। सिलेन वाष्प उपचार के लिए हमेशा एक सील कक्ष का उपयोग करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो विकसित सिलिकॉन टुकड़े अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले 1-2 दिनों के लिए संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  2. पीडीएमएस चिप निर्माण
    1. इलास्टोमेर बेस को 10: 1 अनुपात में इलाज एजेंट के साथ मिलाकर एक प्लास्टिक कप में पीडीएमएस बनाएं। सामग्री को 3 मिनट के लिए लगातार हिलाते हुए अच्छी तरह मिलाएं। मिश्रण पीडीएमएस मिश्रण में बहुत सारे हवा के बुलबुले पैदा करेगा।
    2. सभी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए पीडीएमएस 30 मिनट के लिए एक डेसिकेटर में मिलाएं।
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि सुविधाओं पर डालने से पहले पीडीएमएस मिश्रण से हवा के बुलबुले हटा दिए जाते हैं क्योंकि बुलबुले दोषपूर्ण और गैर-कार्यात्मक उपकरणों का कारण बन सकते हैं।
    3. पेट्री डिश में नियंत्रण परत (पैटर्न 2) के साथ सिलिकॉन वेफर्स रखें। धीरे से सिलिकॉन टुकड़े पर 5 मिमी मोटी पीडीएमएस मिश्रण परत डालें जो किसी भी बुलबुले के गठन से बचें।
    4. पीडीएमएस डालने की प्रक्रिया के दौरान बनने वाले अतिरिक्त बुलबुले को हटाने के लिए पीडीएमएस एक डेसिकेटर में मिश्रण करता है।
    5. वेफर को पकड़ने के लिए 200-500 मीटर टोर वैक्यूम दबाव लागू करने वाले स्पिनर चक पर प्रवाह परत (पैटर्न 1) के साथ सिलिकॉन वेफर रखें। सिलिकॉन वेफर पर ~ 1 एमएल पीडीएमएस डालें और इसे 5 सेकंड के लिए 500 आरपीएम पर स्पिन कोटर का उपयोग करके कोट करें और इसके बाद ~ 80 किमी मोटी परत प्राप्त करने के लिए 30 सेकंड के लिए 1,000 आरपीएम का उपयोग करें।
    6. स्पिन लेपित पीडीएमएस के साथ दो सिलिकॉन वेफर्स को बेक करें और 6 घंटे के लिए गर्म हवा संवहन ओवन में 50 डिग्री सेल्सियस पर पीडीएमएस परतों को डालें। बेकिंग के बाद, कमरे के तापमान पर टुकड़ों के ठंडा होने की प्रतीक्षा करें।
    7. एक तेज ब्लेड का उपयोग करके नियंत्रण परत (पैटर्न 2) के चारों ओर सिलिकॉन टुकड़े से 5 मिमी मोटी पीडीएमएस परत को काटें और इसे सिलिकॉन सब्सट्रेट से छील दें।
    8. पीडीएमएस ब्लॉक के जलाशय में हैरिस पंचर का उपयोग करके ~ 1 मिमी व्यास के दो छेदों को छिद्रित करें ताकि स्थिरीकरण चैनल और आइसोलेशन चैनल इनलेट्स को पीडीएमएस झिल्ली विक्षेपण के लिए गैस लाइनों से जोड़ा जा सके।
    9. सिलिकॉन टुकड़े को पैटर्न 1 (प्रवाह परत) पर स्पिन लेपित पीडीएमएस परत के साथ रखें, जिसमें पीडीएमएस-लेपित सतह प्लास्टिक ट्रे पर है। पैटर्न 2 (नियंत्रण परत) के साथ छिद्रित पीडीएमएस ब्लॉक को ट्रे पर मोल्डेड साइड के साथ रखें।
    10. प्लास्टिक ट्रे को प्लाज्मा क्लीनर के अंदर रखें और दो पीडीएमएस सतहों को कम वैक्यूम (200-600 मीटर) के तहत 2 मिनट के लिए 18 डब्ल्यू एयर प्लाज्मा में उजागर करें। वैक्यूम लागू करें जब तक कि कक्ष उज्ज्वल बैंगनी न हो जाए। प्लाज्मा रंग परिवर्तन देखने के लिए कम रोशनी में इस चरण को निष्पादित करें।
    11. दो प्लाज्मा-उपचारित ब्लॉकों को बाहर निकालें और पैटर्न 1 और 2 के प्लाज्मा-उपचारित सतहों को एक साथ दबाकर धीरे से ब्लॉकों को बांधें। एक गर्म हवा संवहन ओवन में 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर बंधे पैटर्न को बेक करें।
    12. बंधुआ डिवाइस को ओवन से बाहर निकालें। पैटर्न 1 और पैटर्न 2 के साथ सिलिकॉन वेफर से बंधे हुए डिवाइस को काटें, और हैरिस पंचर का उपयोग करके प्रवाह परत के इनलेट और आउटलेट जलाशयों में छिद्र लगाएं।
    13. बंधे पीडीएमएस ब्लॉक को प्लास्टिक ट्रे पर प्रवाह परत के साथ रखें। उसी ट्रे पर एक साफ कवर ग्लास (# 1.5) रखें। ब्लॉक और कवर ग्लास को 2 मिनट के लिए 18 डब्ल्यू एयर प्लाज्मा में उजागर करें। बैंगनी कक्ष देखने के लिए वैक्यूम दबाव समायोजित करें।
      नोट: प्लाज्मा रंग परिवर्तन देखने के लिए यह कदम कम रोशनी में किया जाना चाहिए। कवर ग्लास को साफ करने के लिए, इसे आईपीए के साथ धो लें और 14 पीएसआई पर नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके सूखा दें।
    14. कवर ग्लास के शीर्ष पर प्लाज्मा उजागर पीडीएमएस ब्लॉक रखें और 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में बंधुआ संरचना को बेक करें। भविष्य के किसी भी प्रयोग के लिए डिवाइस को एक साफ कक्ष में स्टोर करें।

2. पीडीएमएस झिल्ली प्राइमिंग

  1. डिवाइस लें और इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप पर रखें और टयूबिंग संलग्न करें। माइक्रो फ्लेक्स ट्यूब (आंतरिक व्यास ~ 5 मिमी, बाहरी व्यास ~ 8 मिमी) को एक छोर पर संपीड़ित नाइट्रोजन गैस लाइन से कनेक्ट करें। दूसरे छोर पर तीन-तरफ़ा कनेक्टर कनेक्ट करें। तीन-तरफा कनेक्टर्स के ट्यूब 1 और 2 क्रमशः जाल और अलग झिल्ली से जुड़े होंगे।
  2. तीन-तरफा स्टॉपकॉक के दो आउटलेट पोर्ट से दो माइक्रो फ्लेक्स ट्यूब (आंतरिक व्यास ~ 1.6 मिमी, बाहरी व्यास ~ 5 मिमी) कनेक्ट करें। दो ट्यूबों के दूसरे छोर को 8 मिमी लंबी 18 ग्राम सुई से कनेक्ट करें।
  3. इनलेट पोर्ट के माध्यम से माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एम 9 बफर के साथ प्रवाह परत भरें। सुई से जुड़े अंत के माध्यम से डीआई पानी के साथ दोनों ट्यूबों को भरें। दो सुइयों को छिद्रित छेद में डालें, क्रमशः अलग करने और फंसाने वाली झिल्ली को जोड़ते हैं।
  4. 14 पीएसआई पर नाइट्रोजन गैस नियामक खोलें और नियंत्रण परतों अर्थात् जाल और अलगाव झिल्ली में माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से पानी को डिवाइस में धकेलने के लिए ट्यूब 1 से तीन-तरफा वाल्व को चालू करें।
  5. दोनों चैनलों में किसी भी हवा की बूंद की उपस्थिति के बिना चैनल को पानी भरने तक प्रतीक्षा करें। एक बार जब चैनल पूरी तरह से पानी से भर जाते हैं, तो चैनलों को प्राइमेड माना जाता है।
  6. चैनलों को पानी से भरने और प्राइमेड होने के बाद तीन-तरफा स्टॉपकॉक का उपयोग करके दबाव छोड़ें। प्राइमिंग से प्रवाह परत में बुलबुले हो सकते हैं, प्रवाह चैनल के माध्यम से अतिरिक्त मीडिया प्रवाह करके बुलबुले को हटा सकते हैं।

एलिगेंस रखरखाव और सिंक्रनाइज़ेशन

नोट: सी एलिगेंस उपभेद: अध्ययन ने वल्वल विकास के लिए निम्नलिखित ट्रांसजेन पीएस 3239 (डीपीआई -20 (ई 1282) एसआईआईएस 49 IV [MH86p (dpy-20(+) + pJB100 (ZMP-1:: GFP)]) का उपयोग किया। मानक सी एलिगेंस संस्कृति और रखरखावप्रोटोकॉल का पालन किया गया था।

  1. नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) पेट्री प्लेटों पर सी एलिगेंस उगाएं, जिसमें ई कोलाई ओपी 50 22 डिग्री सेल्सियस पर खाद्य स्रोत के रूप में है। एलिगेंस उपभेदों को बार-बार कुछ हेर्मैफ्रोडाइट्स को स्थानांतरित करके या कुछ जानवरों के साथ थोड़ी मात्रा में एगर को ओपी 50 लॉन के साथ एक नई एनजीएम प्लेट में विभाजित करके बनाए रखें।
  2. 3-5 दिनों के बाद, पशु विकास और सी एलिगेंस अंडे के लिए एनजीएम प्लेट की जांच करें। ओपी 50 लॉन के साथ एक प्लेट से एक ताजा एनजीएम प्लेट में लगभग 30 अंडे एकत्र करें और स्थानांतरित करें।
  3. इमेजिंग के लिए जानवरों को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, प्लेट से हर 2 घंटे में सभी अनहैच किए गए अंडों को एक ताजा प्लेट में स्थानांतरित करें और उन्हें 22 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। प्रत्येक प्लेट पर लगभग 15-20 अंडे निकलेंगे।
  4. लार्वा 2 (एल 2) और लार्वा 3 (एल 3) चरणों के लिए अंडे देने के बाद क्रमशः 14-16 घंटे और 28-30 घंटे के बीच जानवरों को चुनें। इमेजिंग के लिए जानवरों को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में स्थानांतरित करें। दीर्घकालिक विकास और इमेजिंग प्रयोगों के लिए डिवाइस के अंदर जानवर को बनाए रखने के लिए अगले खंड में वर्णित खाद्य आपूर्ति जोड़ें।

4. विकास और इमेजिंग माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर एलिगेंस की वृद्धि

  1. कम आवर्धन (4x या 10x) पर अलगाव झिल्ली और स्थिरीकरण झिल्ली को जोड़ने के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप और व्यू पैटर्न 2 पर एक विकास और इमेजिंग माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस माउंट करें। सुनिश्चित करें कि चैनल स्वच्छ आसुत जल से भरे हुए हैं।
  2. 1 एम पोटेशियम साइट्रेट पीएच 6.0 के 10 एमएल, ट्रेस धातु समाधान के 10 एमएल, 1 एम सीएसीएल2 के 3 एमएल, 1 एम एमजीएसओ4 के 3 एमएल का उपयोग करके एस माध्यम का एक ताजा 1 एल समाधान तैयार करें। बाँझ परिस्थितियों में समाधान तैयार करें। एस माध्यम को स्वचालित न करें।
  3. प्रयोग से 10 मिनट पहले प्रवाह चैनल को विकास मीडिया (एस माध्यम) से भरें। प्रवाह चैनल में किसी भी हवा के बुलबुले से बचें। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त माध्यम प्रवाह करें।
  4. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एस माध्यम के 10 μL में एनजीएम प्लेट से आवश्यक विकास चरण से एक एकल जानवर चुनें और जानवर को इनलेट छेद के माध्यम से प्रवाह चैनल में धकेल दें।
  5. कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करके प्रवाह चैनल में पशु स्थिति की निगरानी करें। जानवर को धक्का देने के लिए इनलेट या आउटलेट के माध्यम से अतिरिक्त माध्यम प्रवाह करें और इसे दो अलगाव झिल्ली के बीच प्रतिबंधित प्रवाह चैनल के भीतर रखें।
  6. अलगाव चैनलों में 14 पीएसआई दबाव लागू करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक खोलें और झिल्ली को प्रवाह चैनल में नीचे धकेलें।
    नोट: झिल्ली आंशिक रूप से प्रवाह चैनल को सील करती है और दो अलगाव झिल्ली के बीच के क्षेत्र में पशु आंदोलन को प्रतिबंधित करती है।
  7. एल ब्रोथ के 250 एमएल (2.5 ग्राम बैक्टो-ट्रिप्टोन, 1.25 ग्राम बैक्टो-यीस्ट, एच 2ओ में 1.25 ग्राम एनएसीएल) को टीका लगाने के लिए एक धारीदार प्लेट से ई कोलाई ओपी 50 की एक एकल कॉलोनी का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर टीका कृत संस्कृति उगाएं।
  8. 1.5 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ओपी 50 के 500 μL का एलिकोट करें और स्टॉक और एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए स्टोर करें।
  9. 5 मिनट के लिए 1.3 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा OP50 संस्कृति को कम करें। पेलेट को 1 एमएल ताजा एस माध्यम (0.5 एक्स कमजोर पड़ने) के साथ घोलें और इसे 3-4 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर करें। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के अंदर सी एलिगेंस को खिलाने के लिए इस पतला ओपी 50 का उपयोग करें।
  10. प्रवाह चैनल में एस माध्यम के वाष्पीकरण को कम करने के लिए इनलेट और आउटलेट जलाशयों के शीर्ष पर एस माध्यम की एक बूंद छोड़ दें।
  11. पतला OP50 घोल को 10 μL माइक्रोपिपेट में लें। पिपेट से ओपी 50 समाधान से भरे माइक्रो टिप को निकालें और टिप को इनलेट जलाशय में दबाएं। फिर 10 μL खाद्य समाधान के साथ एक और माइक्रोपिपेट टिप रखें और इसे आउटलेट जलाशय में डालें।
  12. किसी भी हवा के अंतर के बिना खाद्य समाधानों की निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए उंगली का उपयोग करके दबाव लागू करने वाले टिप हेड को सील करें। हर दिन OP50 समाधान के साथ माइक्रोपिपेट टिप बदलें जो 3-4 दिनों से अधिक पुराना नहीं है।
  13. दोनों युक्तियों में अतिरिक्त 20-30 μL खाद्य समाधान भरें। प्रवाह चैनल में जानवर को धक्का देने के लिए ढाल को समायोजित करने और इमेजिंग के लिए ट्रैपिंग झिल्ली के नीचे जानवर की स्थिति को समायोजित करने के लिए माइक्रोपिपेट टिप से खाद्य समाधान जोड़ें या हटाएं।
  14. उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों का उपयोग करके प्रवाह चैनल में आंशिक रूप से बंद अलगाव झिल्ली के माध्यम से यह सुनिश्चित करने के लिए बैक्टीरिया के प्रवाह की निगरानी करें।
    नोट: बैक्टीरिया प्रवाह की अनुपस्थिति में, जानवर दो अलगाव झिल्ली के बीच प्रवाह चैनल में उपलब्ध बैक्टीरिया को खा सकते हैं। चैनल में कोई बैक्टीरिया या कोई प्रवाह मौजूद नहीं होने के मामले में, इनलेट और आउटलेट पर दो माइक्रोपिपेट युक्तियों को ताजा तैयार खाद्य आपूर्ति से भरे नए पिपेट युक्तियों के साथ बदलें।

एलिगेंस स्थिरीकरण और इमेजिंग

  1. सी. ट्रैपिंग झिल्ली के नीचे एलिगेंस स्थिरीकरण
    1. कम आवर्धन पर विकास चैनल में एक एकल जानवर का पता लगाएं। इनलेट और आउटलेट जलाशयों से जुड़े दो माइक्रोपिपेट युक्तियों में खाद्य समाधान ऊंचाइयों को समायोजित करें। प्रवाह चैनल में हाइड्रोस्टेटिक दबाव अंतर का उपयोग करके जानवर को आवश्यक दिशा में धक्का दें।
    2. फंसने वाली झिल्ली के केंद्र में जानवर को रखें और कम आवर्धन उद्देश्य (4x) का उपयोग करके अपने तैराकी व्यवहार की निगरानी करें।
    3. ट्रैप चैनल में धीरे-धीरे दबाव बढ़ाने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक को चालू करें। विकास चैनल की चारदीवारी के साथ एक सीधी मुद्रा में जाल झिल्ली के नीचे जानवर को स्थिर करें।
      सावधानी: जेड या यू मोड़ स्थिति में प्रवाह चैनल के पार जानवर को फंसाने से बचें। यह पशु शरीर को अधिक दबाव के साथ निचोड़ने का कारण बनता है और इसके स्वास्थ्य को स्थायी नुकसान पहुंचाता है।
  2. सी. एलिगेंस इमेजिंग और झिल्ली से रिलीज
    1. एक माइक्रोस्कोप चरण पर डिवाइस ले जाएं और लोड करें। उच्च-रिज़ॉल्यूशन उज्ज्वल क्षेत्र, विभेदक इमेजिंग कंट्रास्ट (डीआईसी), या फ्लोरेसेंस इमेजिंग (पूरक चित्रा 1) के लिए सभी आवश्यक ऑप्टिकल घटकों (उद्देश्य, प्रकाश स्रोत, प्रतिदीप्ति फिल्टर और एक डिटेक्टर) के साथ वांछित इमेजिंग सेटिंग्स पर एक उलटा माइक्रोस्कोप सेट करें।
    2. सेलुलर और उप-सेलुलर घटनाओं को पकड़ने के लिए एकल या कई टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस छवियां प्राप्त करें।
    3. एलिगेंस न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति छवियों को 60x, 1.4 संख्यात्मक एपर्चर (NA) उद्देश्य, 7% -10% लेजर शक्ति के साथ 488 nm तरंग दैर्ध्य लेजर, एक सीसीडी कैमरा, एक स्पिनिंग डिस्क माइक्रोस्कोप पर उनके विकास के कार्य के रूप में प्राप्त करें। माइक्रोस्कोप के साथ प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग करें और 4 फ्रेम प्रति सेकंड की गति से छवियां प्राप्त करें (पूरक चित्र 1)।
    4. छवियों के अधिग्रहण के बाद, ट्रैपिंग दबाव छोड़ें और कम आवर्धन - 4x और 10x पर जानवर की हरकत की निगरानी करें। झिल्ली को अलग करके परिभाषित क्षेत्र के भीतर जानवर को प्रतिबंधित रखें (प्रयोग के दौरान 14 पीएसआई के तहत रखा गया)।
    5. विकास चैनल में धीमी गति से गुरुत्वाकर्षण-संचालित खाद्य प्रवाह को जारी रखने के लिए दो माइक्रोपिपेट युक्तियों में खाद्य समाधान की मात्रा समायोजित करें। यह खाद्य प्रवाह इनलेट और आउटलेट (आमतौर पर 1-5 मिमी ऊंचाई अंतर) पर माइक्रोपिपेट्स में खाद्य समाधानों के स्तर को समायोजित करके प्राप्त किया जाता है।
    6. विकास चैनल में बैक्टीरिया के प्रवाह पैटर्न से एक उज्ज्वल क्षेत्र के तहत प्रवाह की कल्पना करें।
      नोट: प्रवाह की अनुपस्थिति में, जानवर उपलब्ध ओपी 50 बैक्टीरिया को खाता है, चैनल स्पष्ट दिखाई देता है, और जानवर कुछ घंटों तक भूखा रहता है। एक भूखा जानवर आमतौर पर उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस विकसित करता है, जो टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करते समय आसानी से देखा जा सकता है। इस तरह की घटनाओं का पशु शरीर विज्ञान पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है और प्रयोगों में इससे बचा गया था।
    7. एक पूर्व निर्धारित समय अंतराल के बाद चरण 5.2.1-5.2.3 को दोहराएं ताकि एक ही व्यक्ति की प्रतिदीप्ति / डीआईसी / उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को कई समय बिंदुओं पर प्राप्त किया जा सके।
    8. छवियों को एक ही व्यक्तिगत जानवर से कई वांछित समय बिंदुओं पर प्राप्त करने के बाद, अलगाव और फंसाने का दबाव छोड़ दें। चैनल को एम 9 बफर के साथ फ्लश करें और जानवर को इनलेट जलाशय के माध्यम से धक्का दें। जलाशय से जानवर को पुनर्प्राप्त करें और आगे की स्वास्थ्य निगरानी के लिए जानवर को एक ताजा एनजीएम प्लेट पर रखें।
    9. बैक्टीरिया को हटाने के लिए चैनल को एम 9 बफर के साथ कुछ बार फ्लश करें। प्रवाह चैनल को 70% एथिल अल्कोहल (आसुत पानी में पतला) के साथ कुल्ला करें। सिरिंज का उपयोग करके हवा को धक्का देकर चैनलों को सुखाएं। भविष्य में बार-बार उपयोग के लिए डिवाइस को सूखी धूल मुक्त जगह पर स्टोर करें।
  3. छवि विश्लेषण और आंकड़े
    1. टिफ़ छवि विश्लेषण के लिए FIJI ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। फिजी इमेजजे में डब्ल्यूडीआई 51 जानवरों से पीवीडी टाइम-लैप्स छवियों की खुली टिफ छवियां। जेड प्रोजेक्ट के > स्टैक्स > इमेज टैब का चयन करके प्राथमिक प्रक्रियाओं को दिखाते हुए जेड-प्लेन के ढेर से सर्वश्रेष्ठ विमान निकालें।
    2. छवियों की पूरी श्रृंखला को स्क्रीन करें और विशिष्ट छवि फ्रेम ढूंढें जो पशु छवि फ्रेम के अतिव्यापी वर्गों का उपयोग करके पूरी न्यूरोनल प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक कवर करते हैं। फ़िजी टूलबार से > सेल काउंटर का विश्लेषण > प्लगइन का चयन करें। यह विभिन्न शाखाओं को नंबर देने और प्रत्येक चयनित न्यूरॉन की गिनती रखने के लिए एक खिड़की खोलेगा।
    3. टाइप 1 > > काउंटर शुरू करें का चयन करें, फिर द्वितीयक शाखाओं को चिह्नित करें। फिर टाइप 2 का चयन करें और चतुर्धातुक चिह्नित करें, सभी शाखाओं की गिनती दिखाने वाली परिणाम विंडो पर क्लिक करें (पूरक चित्र 2)। यह विधि उन शाखाओं को प्रदर्शित करेगी जो पहले से गिने गए हैं।
    4. अगली अतिव्यापी छवि खोलें और शेष शाखाओं की गणना करें। यह प्रक्रिया दोहरी गिनती को रोकेगी और यह सुनिश्चित करेगी कि हर प्रक्रिया की गणना की जाए। सी एलिगेंस के शुरुआती लार्वा चरणों में मौजूद प्राथमिक शाखाओं की कुल संख्या की पहचान करें और गिनती करें। पुराने जानवरों में माध्यमिक और चतुर्धातुक प्रक्रियाओं के लिए छवियों के लिए समान विश्लेषण करें।
      नोट: वयस्क कई प्रक्रियाओं को दिखाते हैं जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों में इनरवेट करते हैं और गिनती करना मुश्किल हो सकता है। सुनिश्चित करें कि हर प्रक्रिया केवल एक बार गिनी जाती है।
    5. पीवीडी सेल बॉडी (सीबी) से पीवीसी सीबी तक एक खंडित रेखा खींचकर डब्ल्यूडीआई 51 जानवरों में पीवीडी सेल निकायों के बीच की दूरी की गणना करें। लार्वा 4 (एल 4) चरण के जानवरों के लिए, कोशिका निकाय बहुत दूर हैं और 60x उद्देश्य के साथ चित्रित होने पर एक ही फ्रेम में नहीं हैं।
    6. इमेजजे से स्टैक्स > जेड प्रोजेक्ट के > इमेज टैब का उपयोग करके सिर से पूंछ तक पूरे जानवर की लंबाई को कवर करने के लिए स्टैक से ओवरलैपिंग छवियों का चयन करें। पीवीडी और पीवीसी सीबी के बीच न्यूरोनल प्रक्रिया के साथ खंडित रेखाएं खींचें।
    7. इमेजजे का उपयोग करके सभी खंडित लाइनों के लिए लंबाई मापें > विश्लेषण > मापें। प्रत्येक समय बिंदु के लिए पीवीडी और पीवीसी सीबी के बीच कुल दूरी की गणना करने के लिए सभी खंडों के लिए लंबाई जोड़ें।
    8. JSIs609 जानवरों में TRN की न्यूरॉन लंबाई के लिए, फिजी में छवियों को लोड करें। कोशिका शरीर से पहले माइटोकॉन्ड्रियन के केन्द्रक तक पीछे के पार्श्व सूक्ष्मनलिकाएं (पीएलएम; घुलनशील जीएफपी के साथ दिखाई देने वाली) के साथ एक खंडित रेखा खींचें। पहली दूरी मान के लिए रेखा की लंबाई की गणना करें।
    9. पहले से दूसरे माइटोकॉन्ड्रियन के केंद्र से एक खंडित रेखा खींचें। न्यूरोनल प्रक्रिया की लंबाई के अंत तक माइटोकॉन्ड्रिया की प्रत्येक जोड़ी के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। कुल न्यूरोनल प्रक्रिया की लंबाई की गणना करने के लिए सभी लंबाई जोड़ें।
    10. सेल वंश विश्लेषण के लिए, फिजी में सभी वल्वल छवियों को लोड करें और कई जेड-प्लेन की टाइम-लैप्स छवियों से कोशिकाओं की सबसे अच्छी फोकस छवि निकालें।
    11. माध्य (SEM) की माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में डेटा का प्रतिनिधित्व करें। दो से अधिक नमूनों के लिए एक-तरफ़ा एनोवा या नमूनों की एक जोड़ी के लिए दो-नमूना टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व की गणना करें। पी-मान < 0.05 (*), पी-वैल्यू < 0.005 (*) और पी-वैल्यू > 0.05 (एनएस, महत्वपूर्ण नहीं) द्वारा महत्व को निरूपित करें।

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Representative Results

डिवाइस लक्षण वर्णन: विकास और इमेजिंग डिवाइस में अपरिवर्तनीय प्लाज्मा बॉन्डिंग का उपयोग करके एक साथ बंधे दो पीडीएमएस परतें होती हैं (चित्रा 1)। प्रवाह परत (पैटर्न 1) जो लंबाई में 10 मिमी और ऊंचाई में 40 μm या 80 μm है, हमें तरल संस्कृति में जानवर को विकसित करने की अनुमति देती है (चित्रा 1 ए)। ट्रैपिंग परत (पैटर्न 2) में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए जानवर को स्थिर करने के लिए 2 मिमी चौड़ी झिल्ली (चित्रा 1 बी) है। ट्रैपिंग परत के लिए मास्क लगातार इमेजिंग समय बिंदुओं के बीच प्रवाह चैनल के एक खंड के भीतर पशु आंदोलन को प्रतिबंधित करने के लिए अलगाव झिल्ली की एक जोड़ी भी बनाता है। डिवाइस की ट्रैपिंग झिल्ली हमारे पिछले इमेजिंग डिवाइस3 से अनुकूलित है। वर्तमान डिवाइस (चित्रा 1 सी, एल) में एक अलगाव झिल्ली को जोड़ना और कई समय बिंदुओं पर एक ही जानवर के कुशल स्थिरीकरण के लिए ट्रैपिंग झिल्ली की चौड़ाई में 2 मिमी की वृद्धि शामिल है।

डिवाइस का परीक्षण करने के लिए, ट्रैपिंग झिल्ली (चित्रा 1 डी, ई, और पूरक चित्रा 3) को जोड़ने वाले माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में साफ आसुत पानी भरा गया था और 14 पीएसआई नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके दबाव डाला गया था, जिसका उपयोग 2 मिमी मोटी पीडीएमएस झिल्ली (चित्रा 1 एच, के, एल) के तहत एक जानवर को फंसाने के लिए भी किया जाता है। एक एकल जानवर को माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एनजीएम प्लेट से उठाया गया और प्रवाह चैनल (चित्रा 1 एफ) में लोड किया गया। विकास चैनल एस मीडिया (चित्रा 1 एफ, जी, आई, जे) में पुन: निलंबित बैक्टीरिया से भरा था। दो अलगाव झिल्ली के बीच प्रवाह चैनल में जानवर की निगरानी करते हुए डिवाइस इनलेट और आउटलेट से जुड़े पिपेट टिप्स में मीडिया ऊंचाइयों को समायोजित करके इमेजिंग की अवधि के दौरान एक निरंतर प्रवाह बनाए रखा गया था। माइक्रोचैनल के अंदर जानवर के लिए एक स्वस्थ खाद्य स्रोत सुनिश्चित करने के लिए ताजा तैयार ओपी 50 समाधान को रोजाना माइक्रोपिपेट युक्तियों में भरा गया था। ताजा खाद्य स्रोत और गैस पारगम्य पीडीएमएस सामग्री माइक्रोचैनल30,29 के अंदर पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति सुनिश्चित करती है। डिवाइस में जानवरों के विकास को सेल-विशिष्ट मार्करों या मार्करों का उपयोग करके ट्रैक किया गया था जो विकास के दौरान सेल वंश या चर सेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाते हैं। जानवरों को 14 पीएसआई नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके ट्रैपिंग झिल्ली के नीचे स्थिर किया गया था और चैनल की दीवार के साथ एक सीधी स्थिति में कीड़े पकड़े गए थे। एनजीएम प्लेट23 की तुलना में माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर जानवर धीमी गति से बढ़ा।

दीर्घकालिक इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके सेल वंश अध्ययन: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर सी एलिगेंस के विकास का आकलन करने के लिए, हमने पीएस 3239 (जेडएमपी -1: जीएफपी) स्ट्रेन32 को निरंतर खाद्य आपूर्ति के साथ विकसित किया ताकि उनके विकास के विभिन्न समय बिंदुओं पर वल्वा विकास को ट्रैक किया जा सके। जेडएमपी -1 जिंक मेटालोप्रोटीज के लिए कोड करता है और एल 3 चरण में एंकर सेल में, एल 4 चरण में वुलडी और वल्ल कोशिकाओं में, और दिन 1 (1 डी) वयस्क जानवरों में वुला में व्यक्त होता है (चित्रा 2 ए)। अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन अस्थायी जीन विनियमन के एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है जहां एक ही जीन विकास के विभिन्न चरणों में विभिन्न कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। वल्वल विकास का निरीक्षण करने के लिए, जानवर को पहले स्थिर किया गया था और वल्वल क्षेत्र को एल 3 से वयस्क चरणों तक हर 8-10 घंटे में कई जेड विमानों में चित्रित किया गया था। ZMP-1:: GFP को विकास चरण (चित्रा 2B) के अनुसार विभिन्न वल्वल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर बढ़ने वाले जानवरों से वल्वल कोशिकाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस छवियां सामान्य वल्वल विकास का प्रदर्शन करती हैं और जेडएमपी -1:: जीएफपी अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण पूर्व रिपोर्ट32 के समान हैं।

दीर्घकालिक विकास और इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके न्यूरॉन विकास पर नज़र रखना: एक व्यक्तिगत जानवर से उप-सेलुलर इमेजिंग के लिए डिवाइस के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, दो मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन्स पीवीडी और टीआरएन के विकास की निगरानी की गई थी। दो पीवीडी न्यूरॉन्स में जीएफपी को व्यक्त करने वाले डब्ल्यूडीआई 51 को व्यक्त करने वाले एनसी 1686 स्ट्रेन का उपयोग34,36 किया गया था। प्रत्येक पीवीडी न्यूरॉन मेनोराह जैसी शाखित डेंड्राइटिक वास्तुकला को दर्शाता है जिसमें प्राथमिक (पीपी), द्वितीयक (एसपी), तृतीयक (टीपी), और चतुर्धातुक (क्यूपी) प्रक्रियाएं क्रमशः एल 2 (14-16 घंटे), लेट एल 2 (20-22 एच), एल 3 (24-26 एच), और एल 4 (36-42 एच) विकास चरणों में शामिल हैं (चित्रा 3)। पीवीडी कोशिका शरीर वल्वा के पीछे मौजूद है। यह एक अक्षतंतु और दो प्राथमिक डेंड्राइटिक प्रक्रियाओं को भेजता है जो एसपी और टीपी को जन्म देते हैं, जो बदले में क्यूपी डेंड्राइटिक शाखाओं को जन्म देते हैं जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों को आंतरिक करते हैं। लेट एल 3 और एल 4 चरण उच्च आर्बराइजेशन37,34 दिखाते हैं। हमने माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर एकल एनसी 1686 जानवरों को उगाया और उन्हें लगातार जीवाणु भोजन खिलाया। एल 2 के दौरान जानवरों को विकास के 1 डी चरण तक स्थिर किया गया था और पीवीडी न्यूरॉन्स को तीन आयामों में एसपी, टीपी और क्यूपी शाखाओं की संख्या की गणना करने के उद्देश्य से 60x, 1.3 NA तेल का उपयोग करके हर 8-12 घंटे में बार-बार चित्रित किया गया था। विकास के दौरान शाखाओं की सीमा में वृद्धि हुई जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है। कृमि विकास के विभिन्न चरणों में एसपी और क्यूपी की संख्या उम्र के साथ बढ़ी (चित्रा 4 ए) जैसा कि पूर्व अध्ययन37 में देखा गया है। एल 2 जानवरों ने डिवाइस का उपयोग करके मापा जाने पर 10 ± 3.8 (एन = 9) एसपी दिखाए, लेकिन कोई क्यूपी नहीं दिखाया (चित्रा 4 ए)। एलिगेंस को 3 एमएम लेवैमिसोल की एक बूंद में रखा गया, एक एनेस्थेटिक जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों और पक्षाघात के संकुचन का कारण बनता है, ताकि पशु आंदोलनों को कम करते हुए ऑर्गेनेल परिवहन पर प्रतिकूल प्रभाव को कम किया जा सके और पर्याप्त पक्षाघात हो सके, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग 3,4 के लिए आवश्यक है। एसपी मान (4 ± 1.6, एन = 25, पी = 0.15) काफी भिन्न नहीं थे जब एनजीएम प्लेटों पर उगाए गए समान मंचित जानवरों से मापा जाता था और एगर स्लाइड पर 3 एमएम लेवमिसोल का उपयोग करके चित्रित किया जाता था (चित्रा 4 बी)। डेटा से पता चलता है कि डिवाइस स्थिरीकरण जटिल न्यूरोनल आर्किटेक्चर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करता है और उनके विकास को प्रभावित नहीं करता है। एल 3 चरण के जानवरों में क्यूपी की एक छोटी संख्या होती है जो विकास के साथ संख्या में बढ़ जाती है। 1 डी वयस्कों ने डिवाइस में उगाए गए जानवरों में 67 ± 2.8 क्यूपी (एन = 5) दिखाए। पिछले अध्ययनों ने विकास के दौरान पीवीडी प्रक्रियाओं के गठन के साथ-साथ वापसी को आत्म-परिहार के रूप में जाना जाता है, जहां वे अपनी शाखा संख्या38 को कम करते हैं। हैचिंग के बाद 51 घंटे (1 डी) पर एसपी में कमी इस तरह के वापसी का परिणाम हो सकती है। एनजीएम प्लेटों पर बढ़ने वाले जानवरों और 3 एमएम लेवमिसोल का उपयोग करके चित्रित जानवरों ने विकास के तुलनीय चरणों के लिए एक समान शाखा संख्या प्रवृत्ति दिखाई (चित्रा 4 ए, बी)। इसके अलावा, दो पीवीसी सेल निकायों के बीच की दूरी, एक पूंछ में मौजूद है और दूसरा योनी के पास मौजूद है, क्योंकि वे डिवाइस में उगाए गए जानवरों या एनजीएम प्लेटों पर उगाए गए जानवरों में अलग हो जाते हैं (चित्रा 4 सी, डी)। इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, जानवर स्वस्थ रहे और इस लंबी अवधि में जानवरों को बार-बार झिल्ली के नीचे स्थिर करने के बाद भी अंडे दे सकते थे।

इस उपकरण का उपयोग करके, हम एक ही अभिविन्यास में जानवर को गतिहीन करने और बेहोश जीएफपी अभिव्यक्ति के साथ भी उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ समान न्यूरॉन और इसकी वास्तुकला की छवि बनाने में सक्षम थे। हमारी वृद्धि और स्थिरीकरण प्रौद्योगिकी की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, एल 3 से वयस्क तक टीआरएन के विकास को जेएसआई 609 (एमईसी -7 पी:: एमएलएस:: जीएफपी) जानवरों का उपयोग करके चित्रित किया गया था। पश्चवर्ती टीआरएन शरीर के पार्श्व पक्ष पर मौजूद होते हैं और इन्हें पीएलएमआर और पीएलएमएल नाम दिया जाता है जो जानवर के दाएं और बाएं पक्षों से मेल खाती है। हमने माइक्रोफ्लुइडिक चिप में बढ़ने वाले समान जानवरों की छवि बनाई और उन्हें 12-14 घंटे के अंतराल पर स्थिर किया। मोंटेज लगातार समय बिंदुओं पर संपूर्ण पीएलएमआर न्यूरोनल प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है जो माइटोकॉन्ड्रिया और न्यूरोनल प्रक्रिया (चित्रा 5 ए) दोनों को उजागर करता है। कुल न्यूरोनल प्रक्रिया की लंबाई की गणना की गई और 10.4 μm प्रति घंटे (चित्रा 5 बी) की ढलान के साथ वृद्धि पाई गई। न्यूरोनल प्रक्रिया की लंबाई में वृद्धि की यह दर ~ 10 μm / h 18,31,39,40,41 की पिछली रिपोर्ट से सहमत है। हमने बढ़ती प्रक्रिया में नए माइटोकॉन्ड्रिया के अतिरिक्त और सेल बॉडी के संबंध में सिनैप्टिक शाखा बिंदु स्थिति में परिवर्तन को भी देखा जैसा कि पहले बताया गयाथा।

Figure 1
चित्र 1: सी एलिगेंस के दीर्घकालिक विकास और इमेजिंग के लिए एक सरल माइक्रोफ्लुइडिक चिप। (ए) प्रवाह परत में एक पतली पीडीएमएस परत में 10 मिमी लंबा माइक्रोफ्लुइडिक चैनल (पैटर्न 1) होता है। (बी) ट्रैपिंग परत में थोक पीडीएमएस परत में 2 मिमी मोटी स्थिरीकरण चैनल और पतले अलगाव चैनलों की एक जोड़ी होती है। (सी) डिवाइस बनाने के लिए दो पीडीएमएस परतों को एक पतले कवर ग्लास के साथ एक साथ जोड़ा जाता है। (D, E) ट्रैपिंग और आइसोलेशन कंट्रोल चैनल संपीड़ित नाइट्रोजन (एन2) गैस के तहत विआयनीकृत (डीआई) पानी से भरे होते हैं। एलिगेंस को एनजीएम प्लेटों से उठाया जाता है और डिवाइस की प्रवाह परत के अंदर लोड किया जाता है। (छ) इनलेट और आउटलेट जलाशयों में दो माइक्रोपिपेट युक्तियों का उपयोग करके भोजन प्रदान किया जाता है। (एच) जानवर दो अलगाव चैनलों के भीतर स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र हैं और स्थिरीकरण झिल्ली के नीचे फंस गए हैं। (i) दो माइक्रोपिपेट युक्तियों के माध्यम से खाद्य आपूर्ति के साथ विकास और इमेजिंग डिवाइस की छवि। (जे, के) माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर एक स्वतंत्र रूप से चलने वाले और स्थिर सी एलिगेंस की छवियां। स्केल बार 1 मिमी (आई) और 200 μm (J, K) है। (एल) प्रवाह चैनल (एफसी), पीडीएमएस झिल्ली (एम), और नियंत्रण चैनल (सीसी) की ऊंचाइयों को दिखाने वाले डिवाइस क्रॉस-सेक्शन का योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डिवाइस के अंदर विकसित होने वाले सी एलिगेंस में वल्वल मार्कर की अभिव्यक्ति को ट्रैक करना। (ए) विकास के दौरान पीएस 3239 जानवरों में जेडएमपी -1 को व्यक्त करने वाली वल्वल कोशिकाओं का योजनाबद्ध: : जीएफपी। जीएफपी सिग्नल एल 3 चरण में एंकर सेल में, एल 4 चरण में वुलडी और वल्ल कोशिकाओं में और वयस्क 1 डी चरण में वुला कोशिकाओं में दिखाई देता है। (बी) पीएस 3239 जानवर की छवियां माइक्रोफ्लुइडिक चिप के अंदर बढ़ रही हैं और जेडएमपी -1 की फ्लोरेसेंस छवियों को पकड़ने के लिए हर 8-10 घंटे में स्थिर होती हैं: एल 3, एल 4, और 1 दिन (1 डी) वयस्क से वल्वल विकास के दौरान जीएफपी अभिव्यक्ति। संक्षिप्तरूप: एसी = एंकर सेल, ए = वुला, डी = वुल, ई = वुल। स्केल पट्टी 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पीवीडी न्यूरोनल विकास को ट्रैक करने के लिए व्यक्तिगत डब्ल्यूडीआई 51 सी एलिगेंस की इमेजिंग। (ए) एल 2 से एल 4 चरण तक पीवीडी न्यूरॉन विकास और डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन का योजनाबद्ध। हरा सर्कल पीवीडी सेल बॉडी (सीबी, पीला तीर) दिखाता है। डेंड्राइट सीबी के पूर्ववर्ती और पीछे दोनों पक्षों से एल 2 पर प्राथमिक प्रक्रियाओं (पीपी), देर से एल 2 के दौरान माध्यमिक प्रक्रियाओं (एसपी), एल 3 में तृतीयक प्रक्रियाओं (टीपी) और एल 4 चरणों के दौरान चतुर्धातुक प्रक्रियाओं (क्यूपी) के उद्भव को दर्शाते हैं। (बी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर बढ़ने वाले जानवरों से पीवीडी न्यूरॉन्स की छवियां। (सी) एनजीएम प्लेट पर उगाए गए जानवरों से पीवीडी न्यूरॉन्स की छवियां और 3 एमएम लेवमिसोल (लेव) के साथ स्थिर। स्केल पट्टी 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: उपकरण में उगाए गए जानवरों और एनजीएम प्लेटों पर उगाए गए जानवरों में पीवीडी विकास की तुलना। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर बढ़ने वाले समान जानवरों से द्वितीयक प्रक्रियाओं (एसपी) और चतुर्धातुक प्रक्रियाओं (क्यूपी) की औसत संख्या। मानों की गणना 16 घंटे (एल 2), 24 एच (एल 3), 36 एच (प्रारंभिक एल 4), 42 घंटे (देर से एल 4), और 51 घंटे (1 डी वयस्क) पर की जाती है। (बी) एनजीएम प्लेटों पर उगने वाले जानवरों के एक अलग बैच से एसपी और क्यूपी की औसत संख्या और 3 एमएम लेविसोल के साथ एनेस्थेटाइज्ड। (सी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में बढ़ने वाले एक ही जानवर से दो पीवीडी न्यूरोनल सेल निकायों के बीच औसत अलगाव। (डी) एनजीएम प्लेटों पर उगने वाले जानवरों के विभिन्न सेटों से औसत पृथक्करण और 3 एमएम लेवमिसोल के साथ एनेस्थेटाइज्ड। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है (एन ≥ 3 एमएम लेवमिसोल के लिए 10 और डिवाइस स्थिर जानवरों के लिए एन ≥ 6)। सांख्यिकीय महत्व की गणना एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा की जाती है और इसे पी-वैल्यू < 0.05 (*), पी-वैल्यू < 0.005 (**), और पी-वैल्यू > 0.05 (एनएस) के रूप में निरूपित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अंदर बढ़ने वाले जानवरों से टच रिसेप्टर न्यूरॉन्स (टीआरएन) की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग। सेल बॉडी (सीबी, एरो), सिनैप्टिक ब्रांच पॉइंट (बीपी, एरोहेड), और न्यूरॉन टिप (टिप, अप एरो) को लेबल किया जाता है। फिजी का उपयोग करके प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियन की न्यूरोनल प्रक्रिया और स्थिति का मैन्युअल रूप से पता लगाया जाता है। स्केल बार 10 μm है(B) विभिन्न इमेजिंग समय बिंदुओं पर औसत न्यूरोनल प्रक्रिया की लंबाई। डेटा को एसईएम (एन = 8) ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। सांख्यिकीय महत्व की गणना एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके की जाती है और इसे 0.005 (**) < पी-वैल्यू और 0.05 (एनएस) > पी-वैल्यू के रूप में निरूपित किया जाता है। एक प्रतिगमन समीकरण प्रति घंटे 10.4 μm न्यूरोनल प्रक्रिया बढ़ाव के ढलान के साथ फिट है, R2 = 0.9425। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: सी एलिगेंस के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के स्क्रीनशॉट। (ए) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक पैनल स्कैन गति, फ़िल्टर सेट और इमेजिंग के उद्देश्य को स्थापित करने के लिए हाइलाइट किए गए अनुभागों को दिखाता है। (बी) सॉफ्टवेयर का उपयोग तब पूर्ण लेजर शक्ति के 7% के साथ 488 एनएम लेजर चुनने के लिए किया जाता है। (सी) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक एकल छवि फ्रेम या टाइम-लैप्स छवियों की एक श्रृंखला ले सकता है और उन्हें भविष्य के विश्लेषण के लिए संग्रहीत कर सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: FIJI सॉफ्टवेयर के स्क्रीनशॉट जो WDIS51 जानवरों में पीवीडी शाखाओं की गिनती के लिए विश्लेषण चरणों को दिखाते हैं। (ए) फिजी इमेजजे सॉफ्टवेयर में खोली गई पीवीडी छवि दिखाता है और सेल काउंटर प्लगइन से लिंक करता है। (बी) एक छवि के लिए काउंटर शुरू करने के लिए सेल काउंटर विंडो। (सी) शामिल शाखाओं को चिह्नित करने और कई गिनती से बचने के लिए काउंटरों का चयन। (डी) परिणाम विंडो प्रत्येक श्रेणी के तहत शाखाओं की कुल संख्या दिखाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: विकास और इमेजिंग डिवाइस का योजनाबद्ध। बैक्टीरिया खाद्य समाधान (पीले) की विभिन्न मात्राओं से भरे दो माइक्रोपिपेट युक्तियां, नीचे की परत पर प्रवाह चैनल के इनलेट और आउटलेट पंच में डाली जाती हैं। युक्तियों में खाद्य समाधानों की ऊंचाइयों में अंतर समाधान को चैनल के अंदर प्रवाहित करने का कारण बनता है जो बदले में जानवर को इसके विकास के लिए बैक्टीरिया की आपूर्ति करता है। ट्रैपिंग और आइसोलेशन चैनल (नीले) आसुत पानी से भरे होते हैं और नाइट्रोजन गैस (14 पीएसआई पर सेट) आपूर्ति का उपयोग करके संपीड़ित होते हैं। आइसोलेशन चैनल हमेशा 14 पीएसआई से जुड़ा होता है। ट्रैपिंग झिल्ली पर दबाव तीन-तरफा कनेक्टर का उपयोग करके 0 (जानवर स्थानांतरित करने और खिलाने के लिए स्वतंत्र है) और 14 पीएसआई (जानवर को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए स्थिर किया जाता है) के बीच स्विच किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पेपर में, इसके विकास के दौरान एक एकल जानवर की निरंतर खाद्य आपूर्ति और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ बढ़ते सी एलिगेंस के लिए एक सरल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के निर्माण और उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह निर्माण प्रक्रिया सरल है और इसे गैर-बाँझ वातावरण में किया जा सकता है। निर्माण चरणों के दौरान धूल मुक्त वातावरण महत्वपूर्ण है। धूल के कणों की उपस्थिति से दो बॉन्डिंग सतहों के बीच अनुचित संपर्क होगा, जिसके परिणामस्वरूप उच्च दबाव आवेदन के दौरान डिवाइस का खराब संबंध और रिसाव होगा, जबकि सी एलिगेंस स्थिर हो जाते हैं। निर्मित सभी उपकरणों में से, 95% उपकरण प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। निर्माण या उपयोग के दौरान अनुचित संबंध के कारण उपकरणों की एक छोटी संख्या विफल (5%) हो जाती है। दुनिया भर के कई शैक्षणिक संस्थानों में उपलब्ध धूल मुक्त (> 1,000-ग्रेड क्लीन रूम) के अंदर निर्माण प्रक्रिया को पूरा करके बंधन में विफलता को कम किया जा सकता है। प्रवाह चैनल से जीवाणु भोजन को साफ करने और डिवाइस के पुन: उपयोग को सक्षम करने के लिए, हर प्रयोग के बाद इसके माध्यम से शराब प्रवाहित करके डिवाइस को फ्लश करें।

प्रोटोकॉल एक सरल डिजाइन के साथ एक लिथोग्राफी निर्माण प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है जिसे आसानी से सी एलिगेंस के विभिन्न विकास चरणों और आकारों के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस डिवाइस डिजाइन को विभिन्न प्रकार की विकासात्मक और उप-सेलुलर प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए प्रवाह और ट्रैपिंगपरतों 3 के आयामों को बढ़ाकर, ज़ेब्राफिश और ड्रोसोफिला जैसे अन्य मॉडल जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, प्रवाह परत चैनल की दो अलग-अलग ऊंचाइयों - 40 μm और 80 μm - का उपयोग सी एलिगेंस के विभिन्न विकास चरणों में सेलुलर और उप-सेलुलर विशेषताओं के पूर्ण स्थिरीकरण और ट्रैकिंग के लिए किया गया है, जैसा कि उनके शरीर के आकार के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए, पीवीडी संवेदी न्यूरॉन्स में डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन शुरुआती एल 2 चरणों में शुरू होता है और एल 4 चरण तक जारी रहता है। यह 40 μm उच्च प्रवाह परत के साथ एक उपकरण में चित्रित किया गया था। चूंकि पीवीडी न्यूरॉन्स डेंड्राइट बनाते हैं जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों को आंतरिक करते हैं, इसलिए 3 डी में प्रक्रियाओं को निर्धारित करने के लिए ऑप्टिकल सेक्शनिंग की आवश्यकता होती है। डेंड्राइटिक आर्बर्स के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए शरीर के व्यास से मेल खाने वाले डिवाइस के भीतर जानवरों के पूर्ण स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है। हालांकि, वल्वल विकास की निगरानी के लिए, वल्वल वंश को ट्रैक करने के लिए प्रवाह परत की 80 μm ऊंचाई का उपयोग किया गया था। टीआरएन लंबाई और माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग के लिए, हमने 40 μm प्रवाह परत मोटाई वाले उपकरणों का उपयोग करके L2 से L4 चरणों की छवि बनाई। गलत ऊंचाई वाले डिवाइस का उपयोग करने से स्थिरीकरण में कठिनाई होगी। उदाहरण के लिए, 80 μm प्रवाह परत ऊंचाई उपकरण के अंदर छोटे जानवर (L2 या प्रारंभिक L3 चरण) डिवाइस के अंदर जानवरों को फ्लिप करने की अनुमति देंगे और ट्रैपिंग झिल्ली के 14 psi दबाव के तहत होने के बाद भी अपूर्ण स्थिरीकरण दिखाएंगे। दूसरी ओर, बड़े शरीर के व्यास (देर से एल 4 से परे) वाले जानवर आसानी से 40 μm प्रवाह परत ऊंचाई वाले उपकरण के अंदर प्रवेश नहीं करते हैं। उच्च दबाव में छोटे उपकरणों में बड़े जानवरों को फंसाने से उनके शरीर को नुकसान हो सकता है। 40 μm प्रवाह परत के साथ वर्तमान डिवाइस का अनुप्रयोग सीमित है और बहुत युवा प्रारंभिक लार्वा चरण के जानवरों (जैसे कि हैचिंग के बाद 10 घंटे से कम उम्र के L1 चरण के जानवर) की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि वे झिल्ली के नीचे पूरी तरह से स्थिर नहीं होते हैं। छोटे शरीर के आकार के कारण, छोटे आकार के लार्वा जानवर चलते रहते हैं और कभी-कभी लेजर प्रकाश से उत्तेजित होने पर जाल से बच जाते हैं। एल 1 चरण के जानवरों के लिए, कोई 4x या 10x उद्देश्यों और लघु कैमरा एक्सपोज़र समय का उपयोग करके कम-रिज़ॉल्यूशन उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति इमेजिंग कर सकता है। वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, युवा लार्वा चरण सी एलिगेंस को पूरी तरह से स्थिर करने के लिए < 20 μm ऊंचाई के साथ एक नया प्रवाह परत उपकरण आवश्यक होगा।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके लंबे समय तक एक ही जानवर में विकास ता्मक घटनाओं को ट्रैक करने से ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि हो सकती है। हर टाइम-लैप्स इमेजिंग परख को सी एलिगेंस अध्ययनों से शारीरिक रूप से प्रासंगिक विकास संबंधी जानकारी के लिए उत्तेजना तीव्रता, एक्सपोजर समय, इमेजिंग समय अंतराल, पशु वसूली समय और भोजन की गुणवत्ता के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। हमने एल 4 चरणों से जानवरों का उपयोग करते समय विकास ता्मक अध्ययन के लिए > 3 घंटे के समय अंतराल का चयन किया है। डिवाइस सी एलिगेंस न्यूरॉन्स3,23 में ऑर्गेनेल परिवहन और वितरण जैसी अन्य गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अधिक लगातार छवियां (कुछ घंटों के लिए हर 5-10 मिनट) या प्रति सेकंड कई फ्रेम (< 1 घंटे के लिए) प्राप्त करने में सक्षम है। प्रारंभिक विकास चरणों के ट्रैपिंग और इमेजिंग के लिए अधिक सावधानीपूर्वक अवलोकन की आवश्यकता होती है क्योंकि पूर्ण वसूली के बिना कम समय के अंतराल के साथ बार-बार फंसने से उनके स्वास्थ्य पर असर पड़ सकता है। प्रयोगों के दौरान, यह पाया गया कि जिन जानवरों को प्रवाह परत में स्थानांतरित करने के लिए उच्च दबाव की आवश्यकता होती है, वे समय के साथ खराब स्वास्थ्य और अधिक ऑटोफ्लोरेसेंस दिखाते हैं। उच्च शरीर प्रतिदीप्ति वाले जानवर, जिन्हें उच्च तनाव स्तर से जुड़ा माना जाता है, इमेजिंग अध्ययन के लिए टाला गया था। अच्छे शरीर विज्ञान को बनाए रखने के लिए, जानवरों को चैनल की दीवार से सटे एक सीधी स्थिति में फंसाया गया था। चैनल की चौड़ाई के पार अपने शरीर के साथ जानवरों को स्थिर करने से बचा गया क्योंकि जानवर इस स्थिति में 14 पीएसआई दबाव के तहत अपने शरीर को निचोड़ने के बाद बीमार हो जाते हैं। तेल उद्देश्यों के साथ बार-बार इमेजिंग के दौरान एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात बनाए रखने के लिए, कवरस्लिप को हर समय बिंदु के बाद ठीक से साफ किया जाना चाहिए। डिवाइस की निर्माण प्रक्रिया और इसके आवेदन के दौरान विशेष देखभाल के बाद, एक ही उपकरण को कई इमेजिंग सत्रों में पुन: उपयोग किया जा सकता है।

यह उपकरण उत्परिवर्ती का उपयोग करके अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है जो एनेस्थेटिक्स के प्रति संवेदनशील हो सकता है। प्रस्तुत दृष्टिकोण लंबे समय तक जानवरों में रूपात्मक, कार्यात्मक और व्यवहार संबंधी दोषों के अवलोकन की सुविधा के लिए विकास और शरीर विज्ञान पर प्रतिकूल एनेस्थेटिक प्रभावों को समाप्त कर सकता है। डिवाइस को बनाना आसान है और सी एलिगेंस में दीर्घकालिक विकास / सेल जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में स्थापित किया जा सकता है, जिन्हें आंतरायिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

एसएम और एसपीके माइक्रोफ्लुइडिक विकास और इमेजिंग डिवाइस (पेटेंट आवेदन संख्या 640 / सीएचई / 2011) पर एक लंबित पेटेंट के लेखक हैं।

Acknowledgments

हम डीएसटी - सेंटर फॉर नैनो टेक्नोलॉजी द्वारा समर्थित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए सीआईएफएफ इमेजिंग सुविधा, एनसीबीएस को धन्यवाद देते हैं। एसआर /55 / एनएम -36-2005)। हम डीबीटी (एसपीके), सीएसआईआर-यूजीसी (जेडी), डीएसटी (एसएम), डीबीटी (एसएम), डीएई-प्रिज्म 12-आर एंड डी-आईएमएस-5.02.0202 (एसपीके और गौतम मेनन) द्वारा समर्थित स्पिनिंग डिस्क और एचएचएमआई-आईआईसीएस अनुदान संख्या 55007425 (एसपीके) से अनुसंधान वित्त पोषण का धन्यवाद करते हैं। HB101, PS3239, और WDIS51 उपभेदों को केनोरहाब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (CGC) द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। एस.पी.के. ने माइक नोनेट की प्रयोगशाला में JSIs609 बनाया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

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References

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