Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans), gelişimsel ve hücre biyolojik süreçlerini incelemek için değerli bir model sistem olduğunu kanıtlamıştır. Bu biyolojik süreçleri anlamak genellikle aynı hayvanın uzun süreli ve tekrarlanan görüntülenmesini gerektirir. Agar pedleri üzerinde yapılan geleneksel immobilizasyon yöntemleriyle ilişkili uzun iyileşme süreleri, hayvan sağlığı üzerinde zararlı etkilere sahiptir ve aynı hayvanı uzun süre boyunca tekrar tekrar görüntülemeyi uygun hale getirmez. Bu yazıda mikroakışkan çip tasarımı, üretim yöntemi, çip üzerinde C. elegans kültürleme protokolü ve bireysel hayvanlarda gelişimsel süreçleri incelemek için üç uzun vadeli görüntüleme örneği açıklanmaktadır. Polidimetilsiloksan ile imal edilen ve bir kapak camına bağlanan çip, azot gazı kullanılarak saptırılan elastomerik bir membran kullanarak hayvanları bir cam substrat üzerinde hareketsiz hale getirir. C. elegans'ın tamamen immobilizasyonu, hücresel ve hücre altı olayların anesteziz bir şekilde sağlam bir hızlandırılmış görüntülenmesini sağlar. Büyük bir kesitli bir kanal geometrisi, hayvanın kısmen kapatılmış iki izolasyon membranı içinde serbestçe hareket etmesini sağlayarak sürekli bir gıda kaynağı ile kanalda büyümeye izin verir. Bu basit çipi kullanarak, hayvan kanalın içinde büyüdükçe, PVD duyusal nöronlarında nöronal süreç büyümesi, vulval gelişim ve dendritik arborizasyon gibi gelişimsel olayların görüntülenmesi gerçekleştirilebilir. Uzun vadeli büyüme ve görüntüleme çipi, tek bir basınç hattı ile çalışır, harici valf içermez, ucuz akışkan sarf malzemeleri kullanır ve C. elegans kullanan diğer laboratuvarlar tarafından kolayca uyarlanabilen standart sonsuz taşıma protokollerini kullanır.

Introduction

Caenorhabditis elegans, hücre biyolojisini, yaşlanmayı, gelişim biyolojisini ve nörobiyolojiyi incelemek için güçlü bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır. Şeffaf gövdesi, kısa yaşam döngüsü, kolay bakımı, tanımlanmış sayıda hücre, birkaç insan genine sahip homoloji ve iyi çalışılmış genetiği gibi avantajlar, C. elegans'ın hem temel biyoloji keşifleri hem de uygulamalı araştırmalar için popüler bir model haline gelmesine yol açmıştır 1,2. Hücrenin biyolojik ve gelişimsel süreçlerini, bireysel hayvanların tekrarlanan uzun vadeli gözlemlerinden anlamak, faydalı olabilir. Geleneksel olarak, C. elegans agar pedleri üzerinde anestezi altına alınır ve mikroskop altında görüntülenir. Anesteziklerin hayvan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri, aynı hayvanın uzun süreli ve tekrarlanan aralıklı görüntülemesi için anestezi uygulanan hayvanların kullanımını sınırlandırmaktadır 3,4. Mikroakışkan teknolojilerdeki son gelişmeler ve ihmal edilebilir sağlık tehlikeleri olan C. elegans'ın anestezik olmayan tuzaklanması için adaptasyonları, aynı hayvanın kısa ve uzun bir süre boyunca yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Mikroakışkan çipler, C. elegans'ın 5 yüksek verimli tarama 6,7,8, yakalama ve dağıtma9, ilaç taraması10,11, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile nöron stimülasyonu 12 ve hayvanın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi 12,13,14 için tasarlanmıştır. Slaytlarda immobilizasyon için ultra ince mikroakışkan levhalar da geliştirilmiştir15. C. elegans'ın uzun vadeli çalışmaları, sıvı kültüründe büyüyen hayvanların düşük çözünürlüklü görüntüleri kullanılarak büyümeyi, kalsiyum dinamiklerini, davranışları üzerindeki ilaç etkilerini16,17,18,19, uzun ömürlülüklerini ve20 yaşlarını gözlemlemek için gerçekleştirilmiştir. Sinaptik gelişimi değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanan uzun süreli çalışmalar21, nöronal rejenerasyon22 ve mitokondriyal ilaveyi23 olarak değerlendirmiştir. Çok kanallı cihazlarda uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve hücre kaderi ve farklılaşmasının takibi24,25 olarak yapılmıştır. Birkaç hücresel ve hücre altı olay, birkaç saatlik zaman ölçeklerinde meydana gelir ve hücresel dinamikleri in vivo anlamak için süreçteki tüm ara adımları karakterize etmek için gelişimleri sırasında aynı bireyin farklı zaman noktalarında yakalanmasını gerektirir. Organogenez, nöronal gelişim ve hücre göçü gibi biyolojik süreçleri görüntülemek için, hayvanın birden fazla zaman noktasında aynı yönde hareketsiz hale getirilmesi gerekir. Daha önce, dokunma reseptör nöronları (TRN'ler) boyunca mitokondrilerin nereye eklendiğini belirlemek için 36 saatten fazla C. elegans'ın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için bir protokol yayınlamıştık23.

Bu makale, tekrarlanan yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mikroakışkan tabanlı bir metodoloji oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Tek bir akış kanalına sahip bu cihaz, cihaz başına tek bir hayvanın tekrarlanan görüntülenmesi için en uygun olanıdır. Verimi artırmak ve aynı anda birçok hayvanı görüntülemek için, aynı basınç hattına birden fazla cihaz bağlanabilir, ancak her cihazda tek bir hayvanı kontrol eden ayrı üç yönlü konektörlerle bağlanabilir. Tasarım, embriyonik sonrası gelişimsel süreçler, hücre göçü, organel taşınması, gen ekspresyon çalışmaları gibi yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüler gerektiren çalışmalar için kullanışlıdır. Teknoloji, birçok geç evre hayvanın paralel büyümesini ve görüntülenmesini gerektiren yaşam süresi ve yaşlanma çalışmaları gibi bazı uygulamalar için sınırlayıcı olabilir. Polidimetilsiloksan (PDMS) elastomeri, biyostabilitesi26, biyouyumluluk27,28, gaz geçirgenliği 29,30 ve ayarlanabilir elastik modülü 31 nedeniyle bu cihazın üretimi için kullanılmıştır. Bu iki katmanlı cihaz, mikroakışkan bir kanalda sürekli gıda tedariki olan hayvanların büyümesine ve azot gazı kullanılarak PDMS membran sıkıştırması yoluyla bireysel C. elegans'ın yakalanmasına izin verir. Bu cihaz, sürekli bir gıda kaynağı altında mikrokanalda aynı hayvanı büyütme ve görüntüleme avantajı ile daha önce yayınlanmış cihazın bir uzantısıdır3. Ek izolasyon membran ağı ve 2 mm genişliğinde bir yakalama membranı, gelişmekte olan hayvanların verimli bir şekilde immobilizasyonunu sağlar. Cihaz, duyusal PVD nöronlarında nöronal gelişimi, vulval gelişimi ve dendritik arborizasyonu gözlemlemek için kullanılmıştır. Hayvanlar, cihazda olumsuz sağlık etkileri olmadan büyür ve gelişimi sırasında aynı hayvandaki hücre altı olayların görüntülenmesini kolaylaştırmak için tekrar tekrar hareketsiz hale getirilebilir.

Tüm protokol beş bölüme ayrılmıştır. Bölüm 1, büyüme ve görüntüleme çipi için cihaz imalatını açıklamaktadır. Bölüm 2, bireysel C. elegans'ı hareketsiz hale getirmek ve izole etmek için PDMS membran sapması için bir basınç sisteminin nasıl kurulacağını açıklamaktadır. Bölüm 3, cihaz görüntüleme için bir nematod büyüme ortamı (NGM) plakası üzerinde C. elegans'ın nasıl senkronize edileceğini açıklamaktadır. Bölüm 4, cihaza tek bir hayvanın nasıl yükleneceğini ve hayvanın birkaç gün boyunca mikroakışkan cihazın içinde nasıl yetiştirileceğini açıklar. Bölüm 5, bireysel bir hayvanın birden fazla zaman noktasında nasıl hareketsiz hale getirileceğini, farklı hedefler kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntülerin nasıl yakalanacağını ve Fiji'yi kullanarak görüntülerin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Büyüme ve görüntüleme cihazının imalatı

  1. SU8 kalıp imalatı
    1. Bir kelime işlem yazılımında (veya bilgisayar destekli bir tasarım CAD yazılımında) dikdörtgen şekiller kullanarak 1 (akış katmanı) ve 2 (kontrol katmanı) desenlerini tasarlayın ve fotomaskeleri, polyester tabanlı film üzerinde minimum 8 μm özellik boyutuna sahip bir lazer plotter yardımıyla yazdırın (Şekil 1).
    2. Silikon gofretleri 2,5 cm × 2,5 cm'lik parçalar halinde kesin ve 1 dakika boyunca% 20 KOH ile temizleyin. Gofretleri deiyonize (DI) suda durulayın. Akış ve kontrol katmanı için her biri bir gofret kullanın.
      DİKKAT: KOH aşındırıcıdır ve dikkatle kullanılmalıdır.
    3. Parçaları 14 psi sıkıştırılmış azot gazı ile kurutun ve ardından 4 saat boyunca 120 °C'de bir sıcak plakada dehidrasyon yapın. Bir sonraki adıma geçmeden önce, iki parçayı oda sıcaklığına soğutun.
    4. Silikon parçalardan birini alın ve bir sıkma kaplayıcının mandren üzerine koyun ve gofreti yerinde tutmak için vakumu açın. Silikon parçasına, ~ 20 μL hekzametildisila (HMDS) koyun ve spin kaplayıcıyı kullanarak 5 s için dakikada 500 rotasyonda (rpm) ve ardından 30 s için 3.000 rpm ile kaplayın.
      DİKKAT: Bu adım sarı ışıkta yapılmalıdır. Odada beyaz ışık kullanmayın.
    5. ~40 μm'lik düzgün bir fotodirenç kalınlığı elde etmek için (akış katmanına özgü; erken larva aşama 1 ila aşama 3 (L1 - L3) hayvanlarını görüntülemek için uygundur), silikon gofreti ~ 1.5 mL negatif fotorezist-1 ile kaplayın, 5 s için 500 rpm'de bir spin kaplayıcı ve ardından 30 s için 2.000 rpm ile kaplayın.
    6. Kontrol katmanına özgü ~40 μm'lik düzgün bir fotodirenç kalınlığı elde etmek için ikinci gofretle 1.1.4 ve 1.1.5 adımlarını tekrarlayın.
    7. Alternatif olarak, yaşlı hayvanlar için akış tabakasının kalınlığını ~80 μm'ye çıkarmak için, silikon gofretleri ~1.5 mL negatif fotorezist-2 ile kaplayın, spin kaplayıcıyı 5 s için 500 rpm'de ve ardından 30 s için 2.000 rpm'de kullanın. Bu kalınlık yetişkin hayvanlara L3 aşaması için uygundur.
      DİKKAT: Spin kaplı tabakaların zarar görmesini önlemek için silikon gofretleri yanlarından tutun. Bu adımda beyaz ışıkları kapalı tutun.
    8. Fotodirenç kaplı silikon parçaları (akış ve kontrol katmanları için) sıcak bir plaka üzerinde 1 dakika boyunca 65 ° C'de ve ardından 10 dakika boyunca 95 ° C'de pişirin. Pişmiş parçaları oda sıcaklığına soğutun.
      NOT: Pişmiş silikon parçalar bir sonraki adıma geçmeden önce bir gün saklanabilir. Karanlıkta saklayın ve beyaz ışığa maruz bırakmayın.
    9. UV aydınlatıcısının pozlama aşamasına, UV lambasına bakan fotodirenç kaplı yüzeyle yumuşak pişmiş silikon parçalar koyun. İki parçayı, sırasıyla akış ve kontrol katmanları elde etmek için 200 W'lık bir lamba kullanarak, desen 1 ve 2'ye sahip bir fotomaske aracılığıyla 15 saniye boyunca ayrı ayrı UV'ye maruz bırakın.
      DİKKAT: Güvenlik gözlükleri takın ve UV ışığına doğrudan maruz kalmaktan kaçının. Bu aşamada odadaki beyaz ışığı açmayın.
    10. Açıkta kalan iki silikon parçayı, kaplanmış tabakası yukarı bakacak şekilde, sırasıyla 65 ° C'de ve ardından 95 ° C'de sırasıyla 1 dakika ve 10 dakika pişirin. Bir sonraki adıma geçmeden önce parçaları oda sıcaklığına soğutun.
    11. Silikon parçalarını fotodirenç geliştirici çözeltisine (geliştiricinin izopropanolde 1: 3 seyreltilmesi) 20 dakika bekleterek desenleri geliştirin. Desen göründüğünde, parçaları saf izo-propil alkol (IPA) ile durulayın ve azot gazı (14 psi) kullanarak hafifçe kurutun.
      DİKKAT: İnsan maruziyetini önlemek için bu kimyasal işlem için iyi havalandırılan bir ortam kullanın. Beyaz ışığı yalnızca özellikler geliştirildikten ve IPA ile durulandıktan sonra kullanın.
    12. Silikon parçalarını, kaplanmış yüzey yukarı bakacak şekilde bir kurutucuda tutun. Küçük bir plastik kap veya cam bir slayt üzerine 50 μL saf trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan dökerek parçaları silan buharlarına maruz bırakın. Bardağı / kaydırağı bir kurutucunun içine yerleştirin ve 2 saat boyunca inkübe edin.
      DİKKAT: Silan buharına doğrudan maruz kalmaktan kaçının. Silan buharı arıtımı için daima kapalı bir oda kullanın.
      NOT: Gerekirse, geliştirilen silikon parçalar bir sonraki adıma geçmeden önce 1-2 gün saklanabilir.
  2. PDMS çip imalatı
    1. Elastomer tabanı kürleme maddesi ile 10: 1 oranında karıştırarak PDMS'yi plastik bir kapta yapın. İçeriği 3 dakika boyunca sürekli karıştırarak iyice karıştırın. Karıştırma, PDMS karışımında çok fazla hava kabarcığı oluşturacaktır.
    2. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için PDMS karışımını bir kurutucuda 30 dakika boyunca gazdan arındırın.
      DİKKAT: Kabarcıklar arızalı ve işlevsel olmayan cihazlara neden olabileceğinden, hava kabarcıklarının özelliklere dökülmeden önce PDMS karışımından çıkarıldığından emin olun.
    3. Silikon gofretleri kontrol tabakasıyla (desen 2) bir Petri kabına yerleştirin. Herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için silikon parça üzerine 5 mm kalınlığında bir PDMS karışım tabakasını yavaşça dökün.
    4. PDMS döküm işlemi sırasında oluşan ek kabarcıkları gidermek için PDMS karışımını bir kurutucuda gazdan arındırın.
    5. Silikon gofreti, gofreti tutmak için 200-500 mTorr vakum basıncı uygulayarak akış katmanlı (desen 1) iplikçi mandren üzerine yerleştirin. Silikon gofret üzerine ~1 mL PDMS dökün ve ~80 μm kalınlığında bir tabaka elde etmek için 5 s boyunca 500 rpm'de bir spin kaplayıcı ve ardından 30 s için 1.000 rpm kullanarak kaplayın.
    6. İki silikon gofreti spin kaplı PDMS ile pişirin ve PDMS katmanlarını 50 °C'de sıcak hava konveksiyonlu fırında 6 saat boyunca dökün. Pişirdikten sonra, parçaların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
    7. 5 mm kalınlığındaki PDMS tabakasını kontrol tabakasının etrafındaki silikon parçadan (desen 2) keskin bir bıçak kullanarak kesin ve silikon substrattan soyun.
    8. PDMS membran sapmaları için immobilizasyon kanalını ve izolasyon kanalı girişlerini gaz hatlarına bağlamak üzere PDMS bloğunun rezervuarında bir Harris zımba kullanarak ~ 1 mm çapında iki delik açın.
    9. Silikon parçayı, spin kaplı PDMS tabakası ile desen 1 (akış katmanı) üzerinde, PDMS kaplı yüzey yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye yerleştirin. Delikli PDMS bloğunu, kalıplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde tepside desen 2 (kontrol katmanı) ile tutun.
    10. Plastik tepsiyi bir plazma temizleyicinin içinde tutun ve iki PDMS yüzeyini düşük vakum (200-600 mTorr) altında 2 dakika boyunca 18 W hava plazmasına maruz bırakın. Oda parlak mora dönene kadar vakum uygulayın. Plazma renginin değiştiğini görmek için bu adımı düşük ışık altında gerçekleştirin.
    11. Plazma ile işlenmiş iki bloğu çıkarın ve desen 1 ve 2'nin plazma ile işlenmiş yüzeylerine birlikte bastırarak blokları yavaşça bağlayın. Yapıştırılmış desenleri sıcak hava konveksiyonlu fırında 50 °C'de 2 saat pişirin.
    12. Yapıştırılan cihazı fırından çıkarın. Bağlı cihazı desen 1 ve desen 2 ile silikon gofretten kesin ve Harris zımbayı kullanarak akış katmanının giriş ve çıkış rezervuarlarındaki delikleri delin.
    13. Bağlı PDMS bloğunu, akış tabakası yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye yerleştirin. Aynı tepside temiz bir kapak camı (#1,5) bulundurun. Blokları ve kapak camını 2 dakika boyunca 18 W hava plazmasına maruz bırakın. Menekşe bir oda görmek için vakum basıncını ayarlayın.
      NOT: Bu adım, plazma renginin değiştiğini görmek için düşük ışıkta yapılmalıdır. Kapak camını temizlemek için IPA ile yıkayın ve 14 psi'de azot gazı kullanarak fön ile kurutun.
    14. Plazmaya maruz kalan PDMS bloğunu kapak camının üzerine yerleştirin ve yapıştırılmış yapıyı 2 saat boyunca 50 ° C'de bir fırında pişirin. Gelecekteki herhangi bir deney için cihazı temiz bir odada saklayın.

2. PDMS membran astarlama

  1. Cihazı alın ve bir stereomikroskop üzerine koyun ve tüpleri takın. Mikro esnek boruyu (iç çap ~5 mm, dış çap ~8 mm) bir uçtaki sıkıştırılmış azot gazı hattına bağlayın. Diğer uca üç yönlü bir konektör bağlayın. Üç konektörlerin 1 ve 2 numaralı tüpleri, sırasıyla tuzak ve izolasyon membranlarına bağlanacaktır.
  2. İki mikro esnek boruyu (iç çap ~1,6 mm, dış çap ~5 mm) üç yönlü durdurmanın iki çıkış portuna bağlayın. İki tüpün diğer ucunu 8 mm uzunluğunda 18 G iğneye bağlayın.
  3. Giriş portundan bir mikropipet kullanarak akış katmanını M9 tamponuyla doldurun. Her iki tüpü de iğneye bağlı uçtan DI suyuyla doldurun. İki iğneyi sırasıyla izolasyon ve yakalama membranını bağlayarak delinmiş deliklere yerleştirin.
  4. Azot gazı regülatörünü 14 psi'de açın ve suyu kontrol katmanlarındaki mikroakışkan kanallardan, yani tuzak ve izolasyon membranlarından cihaza itmek için üç vanayı tüp 1'den çevirin.
  5. Her iki kanalda da herhangi bir hava damlacığı bulunmadan suyun kanalı doldurmasını bekleyin. Kanallar tamamen suyla doldurulduktan sonra, kanalların astarlanmış olduğu kabul edilir.
  6. Kanallar suyla doldurulduktan ve astarlandıktan sonra üç yönlü stopcock'u kullanarak basıncı serbest bırakın. Astarlama, akış katmanında kabarcıklara yol açabilir, akış kanalından ek ortam akıtarak kabarcıkları çıkarın.

3. C. elegans bakım ve senkronizasyon

NOT: C. elegans suşları: Çalışmada vulvalgelişimi 32 için PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]), PVD gelişimini izlemek için jsIs609 (mec7p::MLS(mitokondriyal matriks lokalizasyon sinyali)::GFP)33 transgenleri ve PVD gelişimini izlemek için wdIs51 (F49H12.4::GFP + unc-119(+)) kullanılmıştır. Standart C. elegans kültür ve bakım protokolü35 izlendi.

  1. C. elegans'ı nematod büyüme ortamı (NGM) Petri plakaları üzerinde 22 ° C'de besin kaynağı olarak E. coli OP50 ile büyütün. C. elegans suşlarını, birkaç hermafroditi tekrar tekrar aktararak veya birkaç hayvanla az miktarda agar'ı OP50 çimli yeni bir NGM plakasına parçalayarak koruyun.
  2. 3-5 gün sonra, hayvan büyümesi ve C. elegans yumurtaları için NGM plakasını kontrol edin. Bir plakadan yaklaşık 30 yumurta toplayın ve OP50 çimli taze bir NGM plakasına aktarın.
  3. Hayvanları görüntüleme için senkronize etmek için, yumurtadan çıkmamış tüm yumurtaları her 2 saatte bir plakadan taze bir tabağa aktarın ve 22 ° C'de tutun. Her plakada yaklaşık 15-20 yumurta yumurtadan çıkacaktır.
  4. Larva 2 (L2) ve larva 3 (L3) aşamaları için yumurtadan çıktıktan sonra hayvanları sırasıyla 14-16 saat ve 28-30 saat arasında seçin. Hayvanları görüntüleme için mikroakışkan cihaza aktarın. Uzun vadeli büyüme ve görüntüleme deneyleri için hayvanı cihazın içinde tutmak üzere bir sonraki bölümde açıklandığı gibi gıda arzı ekleyin.

4. C. elegans büyüme ve görüntüleme mikroakışkan cihaz içinde büyüme

  1. Bir büyüme ve görüntüleme mikroakışkan cihazını ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edin ve izolasyon membranlarını ve immobilizasyon membranını bağladıktan sonra, düşük büyütmelerde (4x veya 10x) desen 2'yi görüntüleyin. Kanalların temiz damıtılmış suyla doldurulduğundan emin olun.
  2. 10 mL 1 M potasyum sitrat pH 6.0, 10 mL eser metal çözeltisi, 3 mL 1 M CaCl2, 3 mL 1 M MgSO4 kullanarak taze bir 1 L S ortamı çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi steril koşullar altında hazırlayın. S ortamını otoklav yapmayın.
  3. Denemeden 10 dakika önce akış kanalını büyüme ortamı (S ortamı) ile doldurun. Akış kanalında hava kabarcıklarından kaçının. Hava kabarcıklarını gidermek için gerekirse ek ortam akıtın.
  4. Bir mikropipet kullanarak 10 μL S ortamındaki bir NGM plakasından gerekli gelişim aşamasından tek bir hayvan seçin ve hayvanı giriş deliğinden akış kanalına itin.
  5. Düşük büyütme hedefi kullanarak akış kanalındaki hayvan konumunu izleyin. Hayvanı itmek ve iki izolasyon membranı arasında kısıtlanmış akış kanalı içinde konumlandırmak için giriş veya çıkıştan ek ortam akıtın.
  6. İzolasyon kanallarına 14 psi basınç uygulamak için üç yönlü durdurma musluğunu açın ve membranları akış kanalına doğru itin.
    NOT: Membran, akış kanalını kısmen kapatır ve hayvan hareketini iki izolasyon membranı arasındaki bölgeye kısıtlar.
  7. 250 mL L Et suyu aşılamak için çizgili bir plakadan tek bir E. coli OP50 kolonisi kullanın (2.5 g bakto-tripton, 1.25 g bakto-maya, H2 O'da1.25g NaCl). Aşılanmış kültürü bir gecede 37 ° C'de büyütün.
  8. OP50 kültürünün Aliquot 500 μL'si 1,5 mL steril santrifüj tüplerine dönüşür ve stoğu ve alikotu 4 °C'de 2 hafta boyunca saklar.
  9. OP50 kültürünü 5 dakika boyunca 1,3 x g'de santrifüjleme ile toplayın. Peleti 1 mL taze S ortamı (0.5x seyreltme) ile çözün ve 3-4 gün boyunca oda sıcaklığında saklayın. Bu seyreltilmiş OP50'yi mikroakışkan cihazların içinde C. eleganları beslemek için kullanın.
  10. S ortamının akış kanalındaki buharlaşmasını azaltmak için giriş ve çıkış rezervuarlarının üzerine bir damla S ortamı bırakın.
  11. Seyreltilmiş OP50 çözeltisini 10 μL'lik bir mikropipet içinde alın. OP50 çözeltisiyle doldurulmuş mikro ucu pipetten çıkarın ve ucu giriş haznesine bastırarak takın. Ardından, 10 μL gıda çözeltisi içeren başka bir mikropipet ucu yerleştirin ve çıkış haznesine yerleştirin.
  12. Gıda çözeltilerinin hava boşluğu olmadan sürekliliğini sağlamak için parmağınızı kullanarak basınç uygulayarak uç kafasını kapatın. Mikropipet ucunu OP50 çözeltisi ile 3-4 günden eski olmayan her gün değiştirin.
  13. Her iki uca da ilave 20-30 μL gıda çözeltisi doldurun. Mikropipet ucuna yiyecek çözeltisi ekleyin veya çıkarın ve degradeyi hayvanı akış kanalına itecek şekilde ayarlayın ve görüntüleme için yakalama zarının altındaki hayvanın konumunu ayarlayın.
  14. Parlak alan görüntülerini kullanarak akış kanalındaki kısmen kapalı izolasyon membranları boyunca sürekli olduğundan emin olmak için bakteri akışını izleyin.
    NOT: Bakteri akışının yokluğunda, hayvanlar iki izolasyon zarı arasındaki akış kanalındaki mevcut bakterileri yiyebilir. Kanalda bakteri olmaması veya akış olmaması durumunda, giriş ve çıkıştaki iki mikropipet ucunu, taze hazırlanmış gıda malzemeleriyle doldurulmuş yeni pipet uçlarıyla değiştirin.

5. C. elegans immobilizasyon ve görüntüleme

  1. C. elegans yakalama membranı altında immobilizasyon
    1. Büyüme kanalında tek bir hayvanı düşük büyütmelerde bulun. Giriş ve çıkış rezervuarlarına bağlı iki mikropipet ucundaki gıda çözeltisi yüksekliklerini ayarlayın. Akış kanalındaki hidrostatik basınç farklarını kullanarak hayvanı istenen yönde itin.
    2. Hayvanı yakalama zarının merkezine yerleştirin ve düşük büyütme hedefi (4x) kullanarak yüzme davranışını izleyin.
    3. Tuzak kanalındaki basıncı yavaşça artırmak için üç yönlü durdurma musluğunu çevirin. Hayvanı, tuzak zarının altında, büyüme kanalı sınır duvarı boyunca düz bir duruşta hareketsiz hale getirin.
      DİKKAT: Hayvanı akış kanalı boyunca Z veya U büküm pozisyonunda tutsak etmekten kaçının. Bu, hayvan vücudunun daha fazla basınçla sıkılmasına neden olur ve sağlığına kalıcı zarar verir.
  2. C. elegans görüntüleme ve membrandan serbest bırakma
    1. Cihazı mikroskop aşamasına taşıyın ve yükleyin. Yüksek çözünürlüklü parlak alan, diferansiyel görüntüleme kontrastı (DIC) veya floresan görüntüleme (Ek Şekil 1) için gerekli tüm optik bileşenlerle (objektif, ışık kaynağı, floresan filtreleri ve bir dedektör) istenen görüntüleme ayarlarında ters çevrilmiş bir mikroskop kurun.
    2. Hücresel ve hücre altı olayları yakalamak için tek veya birkaç hızlandırılmış floresan görüntüsü elde edin.
    3. C. elegans nöronlarının floresan görüntülerini, dönen bir disk mikroskobunda 60x, 1.4 sayısal açıklık (NA) hedefi, % 7-10 lazer gücüne sahip 488 nm dalga boyu lazeri, bir CCD kamera kullanarak gelişimlerinin bir fonksiyonu olarak elde edin. Mikroskopla birlikte verilen yazılımı kullanarak hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin ve saniyede 4 kare hızında görüntüler elde edin (Ek Şekil 1).
    4. Görüntülerin elde edilmesinden sonra, tuzak basıncını serbest bırakın ve hayvanın hareketini düşük büyütmelerde izleyin - 4x ve 10x. Hayvanı, membranları izole ederek tanımlanan bölgede sınırlı tutun (deney boyunca 14 psi'nin altında tutulur).
    5. Büyüme kanalında yavaş bir yerçekimi kaynaklı gıda akışına devam etmek için iki mikropipet ucundaki gıda çözeltisinin hacmini ayarlayın. Bu gıda akışı, giriş ve çıkıştaki mikropipetlerdeki gıda çözeltilerinin seviyelerinin ayarlanmasıyla elde edilir (tipik olarak 1-5 mm yükseklik farkı).
    6. Büyüme kanalındaki bakterilerin akış modelinden parlak bir alan altındaki akışı görselleştirin.
      NOT: Akış yokluğunda, hayvan mevcut OP50 bakterilerini yer, kanal net görünür ve hayvan birkaç saat içinde aç kalır. Açlıktan ölen bir hayvan tipik olarak yüksek otofloresan geliştirir, hızlandırılmış floresan görüntüleri elde edildiğinde kolayca gözlemlenebilir. Bu tür olayların hayvan fizyolojisi üzerinde zararlı etkileri vardır ve deneylerde kaçınılmıştır.
    7. Aynı kişinin birden çok zaman noktasında floresan/DIC/parlak alan görüntülerini elde etmek için önceden belirlenmiş bir zaman aralığından sonra 5.2.1-5.2.3 arasındaki adımları yineleyin.
    8. Görüntüler aynı bireysel hayvandan istenen birden fazla zaman noktasında elde edildikten sonra, izolasyonu ve yakalama basıncını serbest bırakın. Kanalı M9 tamponuyla yıkayın ve hayvanı giriş rezervuarından geçirin. Hayvanı rezervuardan kurtarın ve daha fazla sağlık izlemesi için hayvanı taze bir NGM plakasına yerleştirin.
    9. Bakterileri uzaklaştırmak için kanalı birkaç kez M9 tamponuyla yıkayın. Akış kanalını% 70 etil alkol ile durulayın (damıtılmış suda seyreltilmiş). Bir şırınga kullanarak havayı iterek kanalları kurulayın. Gelecekte tekrar tekrar kullanmak üzere cihazı kuru tozsuz bir yerde saklayın.
  3. Görüntü analizi ve istatistikleri
    1. Tiff görüntü analizi için FIJI ImageJ yazılımını kullanın. Fiji ImageJ'de wdIs51 hayvanlarından PVD hızlandırılmış görüntülerin tiff görüntülerini açın. Görüntü sekmesini seçerek birincil işlemleri gösteren z-düzlemleri yığınından en iyi düzlemleri ayıklayın > Z projesi > Yığınlar'ı seçin.
    2. Tüm görüntü serisini tarayın ve hayvan görüntü çerçevelerinin üst üste binen bölümlerini kullanarak tüm nöronal süreçleri başarıyla kapsayan belirli görüntü çerçevelerini bulun. FIJI araç çubuğundan Eklenti > > Hücre Sayacını Analiz Et'i seçin. Bu, farklı dalları numaralandırmak ve seçilen her nöronun sayısını tutmak için bir pencere açacaktır.
    3. Type1> > Sayaçları Başlat'ı seçin, sonra ikincil dalları işaretleyin. Ardından Tür 2'yi seçin ve Kuvaterner'i işaretleyin, tüm dalların sayılarını gösteren Sonuçlar penceresine tıklayın (Ek Şekil 2). Bu yöntem, zaten sayılan dalları görüntüler.
    4. Çakışan bir sonraki görüntüyü açın ve kalan dalları sayın. Bu işlem çift sayımı önleyecek ve her işlemin sayılmasını sağlayacaktır. C. elegans'ın erken larva aşamalarında bulunan toplam birincil dal sayısını tanımlayın ve sayın. Yaşlı hayvanlarda ikincil ve kuaterner süreçler için görüntüler için benzer analizler yapın.
      NOT: Yetişkinler, vücut duvarı kaslarında innerve olan birçok süreç gösterir ve sayılması zor olabilir. Her işlemin yalnızca bir kez sayıldığından emin olun.
    5. PVD hücre gövdesinden (CB) PVC CB'ye parçalanmış bir çizgi çizerek wdIs51 hayvanlarındaki PVD hücre gövdeleri arasındaki mesafeyi hesaplayın. Larva 4 (L4) evre hayvanları için, hücre gövdeleri birbirinden çok uzaktır ve 60x objektifle görüntülendiğinde aynı çerçevede değildir.
    6. ImageJ'den Yığınlar > Z projesi > Görüntü sekmesini kullanarak baştan kuyruğa tüm hayvan uzunluğunu kapsayacak şekilde yığından üst üste binen görüntüleri seçin. PVD ve PVC CB'ler arasındaki nöronal süreç boyunca parçalı çizgiler çizin.
    7. ImageJ > Analiz > Measure'ı kullanarak tüm segmentlere ayrılmış çizgilerin uzunluklarını ölçün. Her zaman noktası için PVD ve PVC CB'ler arasındaki toplam mesafeyi hesaplamak üzere tüm segmentlerin uzunluklarını ekleyin.
    8. jsIs609 hayvanlarında TRN'lerin nöron uzunluğu için, görüntüleri Fiji'ye yükleyin. Arka lateral mikrotübüller (PLM'ler; çözünür GFP ile görülebilir) boyunca hücre gövdesinden ilk mitokondrinin merkezine kadar parçalı bir çizgi çizin. İlk mesafe değeri için çizginin uzunluğunu hesaplayın.
    9. Birinci mitokondrinin merkezinden ikinci mitokondriye kadar parçalı bir çizgi çizin. Bu işlemi, nöronal süreç uzunluğunun sonuna kadar her bir mitokondri çifti için tekrarlayın. Toplam nöronal süreç uzunluğunu hesaplamak için tüm uzunlukları ekleyin.
    10. Hücre soyağacı analizi için, Fiji'deki tüm vulval görüntüleri yükleyin ve hücrelerin en iyi odak görüntüsünü, birden fazla z-düzleminin hızlandırılmış görüntülerinden çıkarın.
    11. Verileri ortalamanın standart hatası (SEM) ± olarak temsil edin. İkiden fazla numune için tek yönlü ANOVA veya bir çift numune için iki örneklemli bir t-testi kullanarak istatistiksel anlamlılığı hesaplayın. Anlamlılığı p değeri 0,05 (*), p değeri 0,005 (**) < ve p değeri 0,05 (ns, anlamlı değil) < > belirtin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cihaz karakterizasyonu: Büyüme ve görüntüleme cihazı, geri dönüşümsüz plazma bağı kullanılarak birbirine bağlanmış iki PDMS katmanından oluşur (Şekil 1). 10 mm uzunluğunda ve 40 μm veya 80 μm yüksekliğinde olan akış tabakası (desen 1), hayvanı sıvı kültürde büyütmemizi sağlar (Şekil 1A). Yakalama tabakası (desen 2), yüksek çözünürlüklü görüntüleme için hayvanı hareketsiz hale getirmek için 2 mm genişliğinde bir zara (Şekil 1B) sahiptir. Yakalama tabakasının maskesi ayrıca, ardışık görüntüleme zaman noktaları arasındaki akış kanalının bir bölümünde hayvan hareketini kısıtlamak için bir çift izolasyon zarı oluşturur. Cihazın yakalama zarı, önceki görüntüleme cihazımızdanuyarlanmıştır 3. Mevcut cihaz (Şekil 1C, L), aynı hayvanın birden fazla zaman noktasında verimli bir şekilde hareketsiz hale getirilmesi için bir izolasyon membranının eklenmesini ve tuzak membranının genişliğinin 2 mm'ye çıkarılmasını içerir.

Cihazı test etmek için, tuzak membranlarını birbirine bağlayan mikroakışkan kanallara temiz damıtılmış su dolduruldu (Şekil 1D, E ve Ek Şekil 3) ve 14 psi azot gazı kullanılarak basınçlandırıldı, ayrıca bir hayvanı 2 mm kalınlığında bir PDMS membranı altında yakalamak için kullanıldı (Şekil 1H, K, L). Bir mikropipet kullanılarak bir NGM plakasından tek bir hayvan toplandı ve akış kanalına yüklendi (Şekil 1F). Büyüme kanalı, S ortamında yeniden askıya alınan bakterilerle doluydu (Şekil 1F, G, I, J). İki izolasyon membranı arasındaki akış kanalında hayvanı izlerken, cihaz giriş ve çıkışına bağlı pipet uçlarındaki ortam yükseklikleri ayarlanarak görüntüleme süresi boyunca sabit bir akış sağlandı. Taze hazırlanmış OP50 çözeltisi, mikrokanal içindeki hayvan için sağlıklı bir besin kaynağı sağlamak için günlük olarak mikropipet uçlarına dolduruldu. Taze gıda kaynağı ve gaz geçirgen PDMS malzemesi,30,29 mikrokanalı içinde yeterli oksijen beslemesi sağlar. Cihazdaki hayvanların büyümesi, hücreye özgü belirteçler veya gelişim sırasında hücre soyunu veya değişken hücresel ekspresyon kalıplarını gösteren belirteçler kullanılarak izlendi. Hayvanlar, 14 psi azot gazı kullanılarak ve solucanları kanal duvarı boyunca düz bir konumda tutarak yakalama zarının altında hareketsiz hale getirildi. Hayvan, mikroakışkan kanalın içinde bir NGM plakası23'e kıyasla daha yavaş büyüdü.

Uzun süreli görüntüleme cihazını kullanarak hücre soyağacı çalışması: C. elegans'ın mikroakışkan cihaz içindeki gelişimini değerlendirmek için, PS3239 (ZMP-1::GFP) suşu32'yi , büyümelerinin farklı zaman noktalarında vulva gelişimini izlemek için sürekli gıda arzı ile büyüttük. ZMP-1 , bir çinko metalloprotease için kodlar ve L3 aşamasındaki ankraj hücresinde, L4 evresindeki vulD ve vulE hücrelerinde ve 1. (1D) yetişkin hayvanlarda vulA'da eksprese edilir (Şekil 2A). İfade modelindeki değişiklikler, aynı genin gelişimin farklı aşamalarında farklı hücrelerde eksprese edildiği zamansal gen düzenlemesinin bir örneğini temsil eder. Vulval gelişimi gözlemlemek için, hayvan önce hareketsiz hale getirildi ve vulval bölge daha sonra L3'ten yetişkin aşamalarına kadar her 8-10 saatte bir çoklu z düzlemlerinde görüntülendi. ZMP-1::GFP, gelişim aşamasına göre farklı vulval hücrelerde eksprese edilir (Şekil 2B). Mikroakışkan cihazın içinde büyüyen hayvanlardan vulval hücrelerin yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleri normal vulval gelişimi göstermektedir ve ZMP-1::GFP ekspresyonu ve lokalizasyonu önceki raporlara benzer32.

Uzun vadeli büyüme ve görüntüleme cihazı kullanarak nöron gelişimini izleme: Cihazın bireysel bir hayvandan hücre altı görüntüleme için kullanımını göstermek için, iki mekanosensör nöron PVD ve TRN'nin gelişimi izlendi. İki PVD nöronunda GFP'yi eksprese eden wdIs51'i eksprese eden NC1686 suşu34,36 kullanıldı. Her PVD nöronu, sırasıyla L2 (14-16 saat), geç L2 (20-22 saat), L3 (24-26 saat) ve L4 (36-42 saat) gelişim aşamalarında primer (PP), sekonder (SP), üçüncül (TP) ve kuaterner (QP) süreçlerden oluşan menorah benzeri dallanmış dendritik mimari gösterir (Şekil 3). PVD hücre gövdesi vulvanın arkasında bulunur. SP ve TP'ye yol açan bir akson ve iki birincil dendritik süreç gönderir, bu da vücut duvarı kaslarını innerve eden QP dendritik dallarına yol açar. Geç L3 ve L4 aşamaları yüksek arborizasyon37,34 gösterir. Mikroakışkan cihazın içinde tek bir NC1686 hayvanı yetiştirdik ve onları sürekli olarak bakteriyel gıdalarla besledik. Hayvanlar, L2 sırasında gelişimin 1D aşamasına kadar hareketsiz hale getirildi ve PVD nöronları, SP, TP ve QP dallarının sayısını üç boyutlu olarak saymak için 60x, 1.3 NA yağ hedefi kullanılarak her 8-12 saatte bir tekrar tekrar görüntülendi. Dallanmanın kapsamı, Şekil 3B'de gösterildiği gibi gelişim sırasında artmıştır. Solucan gelişiminin farklı aşamalarındaki SP ve QP sayıları, önceki çalışmalarda görüldüğü gibi yaşla birlikte artmıştır (Şekil 4A)37. L2 hayvanları, cihaz kullanılarak ölçüldüğünde 10 ± 3.8 (n = 9) SPS gösterdi, ancak QP göstermedi (Şekil 4A). C. elegans'ı, vücut duvarı kasının kasılmasına ve felce neden olan bir anestezik olan 3 mM'lik bir levamisol damlasına, hayvan hareketlerini azaltırken ve yeterli felce neden olurken organel taşınması üzerindeki olumsuz etkileri en aza indirmek için yerleştirdik 3,4. SP değerleri (4 ± 1.6, n = 25, p = 0.15), NGM plakalarında yetiştirilen benzer evreli hayvanlardan ölçüldüğü ve bir agar slaytında 3 mM levamisol kullanılarak görüntülendiğinde anlamlı olarak farklı değildi (Şekil 4B). Veriler, cihaz immobilizasyonunun karmaşık nöronal mimarilerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağladığını ve gelişimlerini etkilemediğini göstermektedir. L3 evre hayvanları, gelişimle birlikte sayıları artan az sayıda QP'ye sahiptir. 1D yetişkinler, cihazda yetiştirilen hayvanlarda 67 ± 2.8 QP (n = 5) gösterdi. Önceki çalışmalar, PVD süreçlerinin oluşumunun yanı sıra, kendi kendine kaçınma olarak bilinen gelişim sırasında, şube numaralarını38 azalttıkları bir geri çekilme olduğunu göstermiştir. Kuluçkadan sonra SP'deki 51 saatte (1D) azalma, bu tür geri çekmelerin sonucu olabilir. NGM plakalarında yetişen ve 3 mM levamisol kullanılarak görüntülenen hayvanlar, karşılaştırılabilir gelişim aşamaları için benzer bir dallanma sayısı eğilimi göstermiştir (Şekil 4A, B). Ayrıca, biri kuyrukta, diğeri vulvanın yakınında bulunan iki PVC hücre gövdesi arasındaki mesafe, cihazda yetiştirilen hayvanlarda veya NGM plakalarında yetiştirilenlerde birbirinden uzaklaştıkça artar (Şekil 4C, D). Görüntüleme işlemi boyunca, hayvanlar sağlıklı kaldı ve hayvanlar bu uzun süre boyunca tekrar tekrar zarın altına hareketsiz hale getirildikten sonra bile yumurta bırakabildiler.

Bu cihazı kullanarak, hayvanı aynı yönde hareketsiz hale getirebildik ve aynı nöronu ve mimarisini soluk GFP ifadesiyle bile yüksek çözünürlükle görüntüleyebildik. Büyüme ve immobilizasyon teknolojimizin faydasını göstermek için, TRN'lerin L3'ten yetişkine gelişimi, jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP) hayvanları kullanılarak görüntülendi. Arka TRN'ler vücudun lateral tarafında bulunur ve hayvanın sağ ve sol taraflarına karşılık gelen PLMR ve PLML olarak adlandırılır. Mikroakışkan çipte büyüyen aynı hayvanları görüntüledik ve onları 12-14 saatlik aralıklarla hareketsiz hale getirdik. Montaj, hem mitokondri hem de nöronal süreci vurgulayan ardışık zaman noktalarında tüm PLMR nöronal sürecini temsil eder (Şekil 5A). Toplam nöronal süreç uzunluğu hesaplandı ve saatte 10.4 μm eğimle arttığı bulundu (Şekil 5B). Nöronal süreç uzunluğundaki bu artış oranı, ~ 10 μm / s18,31,39,40,41 önceki bir raporla aynı fikirdedir. Ayrıca, büyüme sürecinde yeni mitokondri ilavesini ve daha önce23'te bildirildiği gibi hücre gövdesine göre sinaptik dal noktası pozisyonundaki değişikliği gözlemledik.

Figure 1
Şekil 1: C. elegans'ın uzun süreli büyümesi ve görüntülenmesi için basit bir mikroakışkan çip. (A) Akış katmanı, ince bir PDMS tabakasında 10 mm uzunluğunda bir mikroakışkan kanaldan (desen 1) oluşur. (B) Yakalama tabakası, 2 mm kalınlığında bir immobilizasyon kanalından ve dökme PDMS tabakasında bir çift ince izolasyon kanalından oluşur. (C) İki PDMS katmanı, cihazı yapmak için ince bir kapak camı ile birlikte birbirine bağlanır. (D, E) Yakalama ve izolasyon kontrol kanalları, sıkıştırılmış azot (N2) gazı altında deiyonize (DI) su ile doldurulur. (F) Yaş senkronize C. eleganlar NGM plakalarından alınır ve cihazın akış katmanına yüklenir. (G) Gıda, giriş ve çıkış rezervuarlarında iki mikropipet ucu kullanılarak sağlanır. (H) Hayvanlar iki izolasyon kanalı içinde hareket etmekte serbesttir ve immobilizasyon zarının altında sıkışıp kalırlar. (I) İki mikropipet ucundan gıda tedariki ile büyüme ve görüntüleme cihazının görüntüsü. (J, K) Mikroakışkan kanalın içinde serbestçe hareket eden ve hareketsiz hale getirilmiş bir C. elegans'ın görüntüleri. Ölçek çubuğu 1 mm (I) ve 200 μm'dir (J, K). (L) Akış kanalı (FC), PDMS membranı (M) ve kontrol kanalının (CC) yüksekliklerini gösteren cihaz kesitinin şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: C. elegans'ta cihazın içinde gelişen bir vulval işaretleyicinin ekspresyonunun izlenmesi. (A) Geliştirme sırasında PS3239 hayvanlarında ZMP-1::GFP'yi eksprese eden vulval hücrelerin şeması. GFP sinyali L3 aşamasındaki ankraj hücresinde, L4 aşamasındaki vulD ve vulE hücrelerinde ve yetişkin 1B aşamasındaki vulA hücrelerinde görünür. (B) Mikroakışkan çipin içinde büyüyen ve L3, L4 ve 1 günlük (1D) yetişkinlerden vulval gelişim sırasında ZMP-1::GFP ekspresyonunun floresan görüntülerini yakalamak için her 8-10 saatte bir hareketsiz hale getirilen PS3239 hayvanının görüntüleri. Kısaltmalar: AC = çapa hücresi, A = vulA, D = vulD, E = vulE. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: PVD nöronal gelişimini izlemek için bireysel wdIs51 C. eleganların görüntülenmesi. (A) L2'den L4'e kadar PVD nöron büyümesi ve dendritik arborizasyonun şeması. Yeşil daire PVD hücre gövdesini gösterir (CB, sarı ok). Dendritler, CB'nin hem ön hem de arka tarafından L2'de birincil süreçlerin (PP), geç L2 sırasında ikincil süreçlerin (SP), L3'te üçüncül süreçlerin (TP) ve L4 aşamalarında kuaterner süreçlerin (QP) ortaya çıktığını göstermektedir. (B) Mikroakışkan bir cihazın içinde büyüyen hayvanlardan PVD nöronlarının görüntüleri. (C) Bir NGM plakasında yetiştirilen ve 3 mM levamisol (Lev) ile hareketsiz hale getirilen hayvanlardan PVD nöronlarının görüntüleri. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Cihazda yetiştirilen hayvanlar ve NGM plakalarında yetiştirilen hayvanlarda PVD gelişiminin karşılaştırılması. (A) Mikroakışkan cihazın içinde büyüyen aynı hayvanlardan elde edilen ortalama ikincil işlem (SP) ve kuaterner işlem (QP) sayısı. Değerler 16 saat (L2), 24 saat (L3), 36 saat (erken L4), 42 saat (geç L4) ve 51 saat (1D yetişkin) olarak hesaplanır. (B) NGM plakalarında yetişen ve 3 mM levamisol ile uyuşturulan farklı bir hayvan grubundan ortalama SP ve QP sayısı. (C) Mikroakışkan cihazda yetişen aynı hayvandan iki PVD nöronal hücre gövdesi arasındaki ortalama ayrım. (D) NGM plakalarında yetişen ve 3 mM levamisol ile uyuşturulan farklı hayvan gruplarından ortalama ayrılma. Ortalama ± SEM olarak gösterilen veriler (3 mM levamisol için n ≥ 10 ve cihaz hareketsiz hayvanlar için n ≥ 6). İstatistiksel anlamlılıklar tek yönlü ANOVA ile hesaplanır ve p-değeri 0.05 (*), p-değeri 0.005 (**) < ve p-değeri 0.05 (ns) < > olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Mikroakışkan cihazın içinde büyüyen hayvanlardan dokunma reseptör nöronlarının (TRN'ler) yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi. (A) Farklı zamanlarda görüntülenen tek bir hayvandan nöronal süreçlerin montajı. Hücre gövdesi (CB, ok), sinaptik dal noktası (BP, ok ucu) ve nöron ucu (Tip, yukarı ok) etiketlenir. Her mitokondrinin nöronal süreci ve pozisyonu Fiji kullanılarak manuel olarak izlenir. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. (B) Farklı görüntüleme zaman noktalarında ortalama nöronal işlem uzunluğu. Ortalama ± SEM olarak gösterilen veriler (n = 8). İstatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanır ve p-değeri 0,005 (**) < ve p-değeri 0,05 (ns) > olarak gösterilir. Bir regresyon denklemi, saatte 10.4 μm nöronal süreç uzaması, R2 = 0.9425 eğimi ile uyumludur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: C. elegans'ın floresan görüntülemesi için mikroskop ayarlarının ekran görüntüleri. (A) Görüntü analiz yazılımının bir paneli, tarama hızını, filtre kümesini ve görüntüleme hedefini ayarlamak için vurgulanan bölümleri gösterir. (B) Yazılım daha sonra tam lazer gücünün% 7'sine sahip 488 nm lazeri seçmek için kullanılır. (C) Görüntü analiz yazılımı, tek bir görüntü karesini veya bir dizi hızlandırılmış görüntüyü alabilir ve bunları gelecekteki analizler için saklayabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: wdIs51 hayvanlarında PVD dallarını saymak için analiz adımlarını gösteren FIJI yazılımının ekran görüntüleri. (A) Fiji ImageJ yazılımında açılan PVD görüntüsünü gösterir ve hücre sayacı eklentisine bağlanır. (B) Bir görüntünün sayacını başlatmak için hücre sayacı penceresi. (C) Dahil edilen dalları işaretlemek ve çoklu sayımı önlemek için sayaçların seçimi. (D) Her kategori altındaki toplam şube sayısını gösteren sonuçlar penceresi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Büyüme ve görüntüleme cihazının şeması. Farklı hacimlerde bakteri gıda çözeltisi (sarı) ile doldurulmuş iki mikropipet ucu, alt katmandaki akış kanalının giriş ve çıkış delicilerine yerleştirilir. Uçlardaki gıda çözeltilerinin yüksekliklerindeki fark, çözeltinin kanalın içinde akmasına neden olur ve bu da büyümesi için hayvana bakteri sağlar. Yakalama ve izolasyon kanalları (mavi) damıtılmış suyla doldurulur ve bir azot gazı (14 psi'ye ayarlanmış) beslemesi kullanılarak sıkıştırılır. İzolasyon kanalı her zaman 14 psi'ye bağlanır. Yakalama membranı üzerindeki basınç, üç yönlü bir konektör kullanılarak 0 (hayvanın hareket etmesi ve beslenmesi serbesttir) ve 14 psi (hayvan yüksek çözünürlüklü görüntüleme için hareketsizleştirilir) arasında değiştirilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, sürekli gıda arzı ve gelişimi sırasında tek bir hayvanın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi ile C. elegans yetiştirmek için basit bir mikroakışkan cihazın üretimi ve kullanımı için bir protokol tanımlanmıştır. Bu üretim süreci basittir ve steril olmayan bir ortamda yapılabilir. Tozsuz bir ortam, üretim aşamalarında kritik öneme sahiptir. Toz parçacıklarının varlığı, iki yapıştırma yüzeyi arasında yanlış temasa yol açacak ve C. elegans hareketsiz hale getirilirken yüksek basınç uygulaması sırasında cihazın zayıf bağlanmasına ve sızmasına neden olacaktır. Üretilen tüm cihazlardan, cihazların %95'i deneyler için uygundur. İmalat veya kullanım sırasında uygunsuz yapıştırma nedeniyle az sayıda cihaz (%5) arızalanır. Yapıştırmadaki başarısızlık, üretim sürecinin dünya çapında çeşitli akademik kurumlarda bulunan tozsuz (> 1.000 dereceli temiz oda) içinde gerçekleştirilmesiyle azaltılabilir. Bakteriyel gıdaları akış kanalından temizlemek ve cihazın yeniden kullanılmasını sağlamak için, her deneyden sonra içinden alkol akarak cihazı yıkayın.

Protokol, C. elegans'ın farklı gelişim aşamaları ve boyutları için kolayca değiştirilebilen basit bir tasarıma sahip bir litografi üretim sürecini göstermektedir. Ayrıca, bu cihaz tasarımı, zebra balığı ve Drosophila gibi diğer model organizmalar için, akışın boyutlarını artırarak ve çeşitli gelişimsel ve hücre altı süreçleri gözlemlemek için katman3'ü yakalayarak uyarlanabilir. Bu protokolde, akış katmanı kanalının iki farklı yüksekliği - 40 μm ve 80 μm - C. elegans'ın farklı gelişim aşamalarında hücresel ve hücre altı özelliklerin vücut boyutlarına uygun olarak tam olarak immobilizasyonu ve izlenmesi için kullanılmıştır. Örneğin, PVD duyusal nöronlarındaki dendritik arborizasyon erken L2 aşamalarında başlar ve L4 aşamasına kadar devam eder. Bu, 40 μm yüksek akış katmanına sahip bir cihazda görüntülendi. PVD nöronları vücut duvarı kaslarını innerve eden dendritler oluşturduğundan, süreçleri 3D'de ölçmek için optik bölümleme gerektirir. Dendritik arborsların kantitatif analizi, vücut çapına uyan cihaz içindeki hayvanların tamamen hareketsiz hale getirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, vulval gelişimi izlemek için, vulval soyları izlemek için 80 μm yükseklikte akış tabakası kullanılmıştır. TRN uzunluğu ve mitokondri görüntüleme için, 40 μm akış katmanı kalınlığına sahip cihazlar kullanarak L2 ila L4 aşamalarını görüntüledik. Yanlış yüksekliğe sahip bir cihaz kullanmak immobilizasyonda zorluğa neden olacaktır. Örneğin, 80 μm akış tabakası yüksekliğindeki bir cihazın içindeki küçük hayvanlar (L2 veya erken L3 aşamaları), hayvanın cihazın içinde dönmesine izin verecek ve yakalama zarı 14 psi basınç altında olsa bile eksik hareketsizlik gösterecektir. Öte yandan, büyük vücut çaplarına sahip hayvanlar (geç L4'ün ötesinde), 40 μm akış tabakası yüksekliğine sahip bir cihazın içine kolayca girmezler. Büyük hayvanları yüksek basınç altında küçük cihazlara hapsetmek vücutlarına zarar verebilir. Mevcut cihazın 40 μm'lik bir akış tabakasına sahip uygulaması sınırlıdır ve membranın altında tamamen hareketsiz olmadıkları için çok genç erken larva evre hayvanlarının (yumurtadan çıktıktan sonra 10 saatten küçük L1 evre hayvanları gibi) yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için uygun değildir. Küçük vücut boyutları nedeniyle, küçük boyutlu larva hayvanları hareket etmeye devam eder ve bazen lazer ışığıyla heyecanlandıklarında tuzaktan kaçarlar. L1 sahne hayvanları için, 4x veya 10x hedefler ve kısa kamera pozlama süreleri kullanarak düşük çözünürlüklü parlak alan veya floresan görüntüleme gerçekleştirilebilir. Alternatif bir yaklaşım olarak, genç larva evresi C. elegans'ı tamamen hareketsiz hale getirmek için 20 μm yüksekliğe sahip yeni < akış katmanı cihazı gerekli olacaktır.

Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme kullanarak aynı hayvandaki gelişimsel fenomenleri uzun bir zaman çizelgesi boyunca izlemek, otofloresanın artmasına neden olabilir. Her hızlandırılmış görüntüleme testi, C. elegans çalışmalarından fizyolojik olarak ilgili gelişimsel bilgiler için uyarma yoğunluğunun, maruz kalma süresinin, görüntüleme zaman aralığının, hayvan iyileşme süresinin ve gıda kalitesinin optimizasyonunu gerektirir. L4 aşamalarından itibaren hayvanları kullanırken gelişimsel çalışmalar için > 3 saatlik zaman aralığı seçtik. Cihaz, C. elegans nöronlarında organel taşınması ve dağılımı gibi diğer dinamik süreçleri incelemek için daha sık görüntüler (birkaç saat boyunca her 5-10 dakikada bir) veya saniyede birden fazla kare (< 1 saat boyunca) elde edebilir. Erken gelişim evrelerinin yakalanması ve görüntülenmesi daha dikkatli gözlem gerektirir, çünkü tam iyileşme olmadan kısa zaman aralıklarıyla tekrarlanan tuzaklama sağlıklarını etkileyebilir. Deneyler sırasında, onları akış katmanına taşımak için yüksek basınca ihtiyaç duyan hayvanların zamanla kötü sağlık ve daha fazla otofloresan gösterdiği bulunmuştur. Yüksek stres seviyesi ile ilişkili olduğu bilinen yüksek vücut floresansına sahip hayvanlardan görüntüleme çalışmaları için kaçınılmıştır. İyi fizyolojiyi korumak için, hayvanlar kanal duvarına bitişik düz bir konumda sıkışıp kaldılar. Hayvanların kanal genişliği boyunca vücutlarıyla hareketsiz hale getirilmesinden kaçınılmıştır, çünkü hayvanlar bu pozisyonda vücutları 14 psi basınç altında sıkıldıktan sonra hastalanırlar. Yağ hedefleriyle tekrarlanan görüntüleme sırasında iyi bir sinyal-gürültü oranını korumak için, kapak kayması her zaman noktasından sonra düzgün bir şekilde temizlenmelidir. Cihazın üretim sürecinde ve uygulamasında özel bir özen gösterildikten sonra, aynı cihazlar birkaç görüntüleme seansında tekrar kullanılabilir.

Bu cihaz, anesteziklere duyarlı olabilecek mutantları kullanan çalışmalar için yararlı olabilir. Sunulan yaklaşım, hayvanlarda morfolojik, fonksiyonel ve davranışsal kusurların uzun süre gözlemlenmesini kolaylaştırmak için büyüme ve fizyoloji üzerindeki olumsuz anestezik etkileri ortadan kaldırabilir. Cihazın üretimi kolaydır ve aralıklı yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektiren C. elegans'ta uzun vadeli gelişimsel/hücre biyolojik sorularını ele almak için herhangi bir laboratuvarda kurulabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. ve S.P.K., mikroakışkan büyüme ve görüntüleme cihazı hakkında bekleyen bir patentin yazarlarıdır (Patent başvuru numarası 640/CHE/2011).

Acknowledgments

CIFF görüntüleme tesisi NCBS'ye, DST - Nanoteknoloji Merkezi tarafından desteklenen konfokal mikroskopların kullanımı için teşekkür ederiz (Hayır. SR/55/NM-36-2005). DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK ve Gautam Menon) tarafından desteklenen eğirme diski ve HHMI-IECS hibe numarası 55007425 (SPK) tarafından sağlanan araştırma fonlarına teşekkür ederiz. HB101, PS3239 ve wdIs51 suşları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlanmıştır. S.P.K., Mike Nonet'in laboratuvarında jsIs609'u yaptı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Biyomühendislik Sayı 182 C. elegans mikroakışkan çip çip üstü büyüme uzun süreli görüntüleme nöronal görüntüleme vulva hücre soyu
<em>Caenorhabditis elegans'ın</em> Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter