Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

Het protocol beschrijft een eenvoudig microfluïdisch chipontwerp en microfabricagemethodologie die wordt gebruikt om C. elegans te laten groeien in aanwezigheid van een continue voedselvoorziening gedurende maximaal 36 uur. Het groei- en beeldvormingsapparaat maakt ook intermitterende langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie van cellulaire en subcellulaire processen mogelijk tijdens de ontwikkeling gedurende meerdere dagen.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) zijn een waardevol modelsysteem gebleken voor het bestuderen van ontwikkelings- en celbiologische processen. Het begrijpen van deze biologische processen vereist vaak langdurige en herhaalde beeldvorming van hetzelfde dier. Lange hersteltijden geassocieerd met conventionele immobilisatiemethoden op agarpads hebben schadelijke effecten op de diergezondheid, waardoor het ongepast is om hetzelfde dier gedurende lange perioden herhaaldelijk in beeld te brengen. Dit artikel beschrijft een microfluïdisch chipontwerp, fabricagemethode, on-chip C. elegans kweekprotocol en drie voorbeelden van langetermijnbeeldvorming om ontwikkelingsprocessen bij individuele dieren te bestuderen. De chip, vervaardigd met polydimethylsiloxaan en gebonden op een dekglas, immobiliseert dieren op een glazen substraat met behulp van een elastomeermembraan dat wordt afgebogen met behulp van stikstofgas. Volledige immobilisatie van C. elegans maakt robuuste time-lapse beeldvorming van cellulaire en subcellulaire gebeurtenissen op een verdovingsvrije manier mogelijk. Een kanaalgeometrie met een grote doorsnede stelt het dier in staat om vrij te bewegen binnen twee gedeeltelijk afgesloten isolatiemembranen, waardoor groei in het kanaal mogelijk is met een continue voedselvoorziening. Met behulp van deze eenvoudige chip kan beeldvorming van ontwikkelingsverschijnselen zoals neuronale procesgroei, vulvalontwikkeling en dendritische arborisatie in de PVD-sensorische neuronen, terwijl het dier in het kanaal groeit, worden uitgevoerd. De langetermijngroei- en beeldvormingschip werkt met een enkele drukleiding, geen externe kleppen, goedkope vloeibare verbruiksartikelen en maakt gebruik van standaard wormbehandelingsprotocollen die gemakkelijk kunnen worden aangepast door andere laboratoria met behulp van C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans heeft bewezen een krachtig modelorganisme te zijn om celbiologie, veroudering, ontwikkelingsbiologie en neurobiologie te bestuderen. Voordelen zoals het transparante lichaam, de korte levenscyclus, eenvoudig onderhoud, een bepaald aantal cellen, homologie met verschillende menselijke genen en goed bestudeerde genetica hebben ertoe geleid dat C. elegans een populair model is geworden voor zowel fundamentele biologische ontdekkingen als toegepast onderzoek 1,2. Het begrijpen van de biologische en ontwikkelingsprocessen van cellen uit herhaalde langetermijnobservatie van individuele dieren kan nuttig blijken te zijn. Conventioneel wordt C. elegans verdoofd op agarpads en afgebeeld onder de microscoop. Schadelijke effecten van anesthetica op de gezondheid van dieren beperken het gebruik van verdoofde dieren voor langdurige en herhaalde intermitterende beeldvorming van hetzelfde dier 3,4. Recente ontwikkelingen in microfluïdische technologieën en hun aanpassing voor anesthetisch-vrije vangst van C. elegans met verwaarloosbare gezondheidsrisico's maken beeldvorming met hoge resolutie van hetzelfde dier gedurende een korte en lange periode mogelijk.

Microfluïdische chips zijn ontworpen voor C. elegans'5 high throughput screening 6,7,8, het vangen en doserenvan 9, drug screening 10,11, neuronstimulatie met hoge resolutie imaging12 en hoge resolutie beeldvorming van het dier 12,13,14. Ultradunne microfluïdische vellen voor immobilisatie op dia's zijn ook ontwikkeld15. Langetermijnstudies van C. elegans zijn uitgevoerd met behulp van afbeeldingen met een lage resolutie van dieren die in vloeibare cultuur groeien om groei, calciumdynamiek, medicijneffecten op hun gedrag 16,17,18,19, hun levensduur en veroudering20 te observeren. Langetermijnstudies met behulp van microscopie met hoge resolutie zijn uitgevoerd om synaptische ontwikkeling21, neuronale regeneratie22 en mitochondriale toevoeging23 te beoordelen. Langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie en tracering van het lot en de differentiatie van cellen zijn gedaan in meerkanaalsapparaten24,25. Verschillende cellulaire en subcellulaire gebeurtenissen vinden plaats over de tijdschalen van enkele uren en vereisen het vangen van hetzelfde individu op verschillende tijdstippen tijdens hun ontwikkeling om alle tussenstappen in het proces te karakteriseren om cellulaire dynamiek in vivo te begrijpen. Om biologische processen zoals organogenese, neuronale ontwikkeling en celmigratie in beeld te brengen, moet het dier op meerdere tijdstippen in dezelfde oriëntatie worden geïmmobiliseerd. We hebben eerder een protocol gepubliceerd voor beeldvorming met hoge resolutie van C. elegans gedurende meer dan 36 uur om te bepalen waar mitochondriën worden toegevoegd langs de aanraakreceptorneuronen (TRN's)23.

Dit artikel biedt een protocol voor het vaststellen van een op microfluïdica gebaseerde methodologie voor herhaalde beeldvorming met hoge resolutie. Dit apparaat, met een enkel stroomkanaal, is het meest geschikt voor herhaalde beeldvorming van een enkel dier per apparaat. Om de doorvoer te verbeteren en veel dieren tegelijk in beeld te brengen, kunnen meerdere apparaten op dezelfde drukleiding worden aangesloten, maar met afzonderlijke driewegconnectoren die een enkel dier in elk apparaat besturen. Het ontwerp is nuttig voor studies die time-lapse-beelden met hoge resolutie vereisen, zoals post-embryonale ontwikkelingsprocessen, celmigratie, organeltransport, genexpressiestudies, enz. De technologie kan beperkend zijn voor sommige toepassingen, zoals levensduur- en verouderingsstudies die parallelle groei en beeldvorming van veel dieren in een laat stadium vereisen. Polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer werd gebruikt voor de fabricage van dit apparaat vanwege de biostabiliteit26, biocompatibiliteit 27,28, gaspermeabliliteit29,30 en instelbare elastische modulus31. Dit tweelaagse apparaat maakt de groei mogelijk van dieren met continue voedseltoevoer in een microfluïdisch kanaal en het vangen van individuele C. elegans via PDMS-membraancompressie met behulp van stikstofgas. Dit apparaat is een uitbreiding van het eerder gepubliceerde apparaat met het voordeel dat hetzelfde dier in het microkanaal wordt gekweekt en in beeld gebracht onder een continue voedselvoorziening3. Het extra isolatiemembraannetwerk en een 2 mm breed vangmembraan maken een efficiënte immobilisatie van ontwikkelende dieren mogelijk. Het apparaat is gebruikt om neuronale ontwikkeling, vulvalontwikkeling en dendritische prieelvorming in sensorische PVD-neuronen te observeren. De dieren groeien zonder nadelige gezondheidseffecten in het apparaat en kunnen herhaaldelijk worden geïmmobiliseerd om het afbeelden van subcellulaire gebeurtenissen bij hetzelfde dier tijdens de ontwikkeling te vergemakkelijken.

Het hele protocol is verdeeld in vijf delen. Deel 1 beschrijft de fabricage van apparaten voor de groei- en beeldvormingschip. Deel 2 beschrijft hoe een druksysteem moet worden opgezet voor de PDMS-membraanafbuiging om individuele C. elegans te immobiliseren en te isoleren. Deel 3 beschrijft hoe C. elegans op een nematode groeimedium (NGM) plaat te synchroniseren voor beeldvorming van apparaten. Deel 4 beschrijft hoe je een enkel dier in het apparaat laadt en het dier gedurende meerdere dagen in het microfluïdische apparaat laat groeien. Deel 5 beschrijft hoe een individueel dier op meerdere tijdstippen kan worden geïmmobiliseerd, afbeeldingen met een hoge resolutie kunnen worden vastgelegd met verschillende doelstellingen en de afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met Fiji.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabricage van groei- en beeldvormingsapparatuur

  1. SU8 matrijs fabricage
    1. Ontwerp patronen 1 (flow layer) en 2 (control layer) met behulp van rechthoekige vormen in een tekstverwerkingssoftware (of een computerondersteunde ontwerp CAD-software) en print de fotomaskers met behulp van een laserplotter met een minimale functiegrootte van 8 μm op polyester-gebaseerde film (figuur 1).
    2. Snijd siliconen wafels in stukken van 2,5 cm × 2,5 cm en reinig ze met 20% KOH gedurende 1 min. Spoel de wafels af in gedeïoniseerd (DI) water. Gebruik elk één wafer voor de stroom en de controlelaag.
      LET OP: KOH is corrosief en moet met zorg worden behandeld.
    3. Droog de stukken met 14 psi samengeperst stikstofgas gevolgd door uitdroging op een hete plaat bij 120 °C gedurende 4 uur. Voordat u doorgaat naar de volgende stap, koelt u de twee stukken af tot kamertemperatuur.
    4. Neem een van de siliciumstukken en leg deze op de klauwplaat van een spincoater en zet de stofzuiger aan om de wafer op zijn plaats te houden. Op het siliciumstuk, doe ~ 20 μL hexamethyldisilaan (HMDS) en coat het met behulp van de spin coater met 500 rotatie per minuut (rpm) gedurende 5 s gevolgd door 3.000 rpm gedurende 30 s.
      LET OP: Deze stap moet worden uitgevoerd in geel licht. Gebruik geen wit licht in de kamer.
    5. Om een uniforme fotoresistendikte van ~ 40 μm (specifiek voor de stroomlaag; geschikt voor het in beeld brengen van vroege larvale stadium 1 tot stadium 3 (L1 - L3) dieren), coat de silicium wafer met ~ 1,5 ml negatieve fotoresist-1 met behulp van een spin coater bij 500 rpm gedurende 5 s gevolgd door 2.000 rpm gedurende 30 s.
    6. Herhaal stap 1.1.4 en 1.1.5 met de tweede wafer om een uniforme fotoresistente dikte van ~40 μm te verkrijgen die specifiek is voor de controlelaag.
    7. Als alternatief, om de dikte van de stromingslaag te verhogen tot ~ 80 μm voor oudere dieren, coaten siliconen wafers met ~ 1,5 ml negatieve fotoresist-2 met behulp van de spin coater bij 500 rpm gedurende 5 s gevolgd door 2.000 rpm gedurende 30 s. Deze dikte is geschikt voor L3-stadium voor volwassen dieren.
      LET OP: Houd de siliciumwafers aan de zijkanten om schade aan de met spincoating bedekte lagen te voorkomen. Houd witte lichten uitgeschakeld tijdens deze stap.
    8. Bak de met fotoresistent gecoate siliciumstukken (voor stromings- en regellagen) op een hete plaat bij 65 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 95 °C gedurende 10 minuten. Koel de gebakken stukken af tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: De gebakken siliciumstukjes kunnen een dag worden bewaard voordat ze doorgaan naar de volgende stap. Bewaren in het donker en niet blootstellen aan wit licht.
    9. Plaats zachtgebakken siliciumstukken op de belichtingsfase van de UV-verlichting met het fotoresist-gecoate oppervlak naar de UV-lamp gericht. Stel de twee stukken afzonderlijk bloot aan UV gedurende 15 s, met behulp van een 200 W-lamp, door middel van een fotomasker met patronen 1 en 2 om respectievelijk stromings- en controlelagen te krijgen.
      LET OP: Draag een veiligheidsbril en vermijd directe blootstelling aan UV-licht. Schakel tijdens deze fase geen wit licht in de kamer in.
    10. Bak de twee blootgestelde stukken silicium met een gecoate laag naar boven gericht, bij 65 °C gevolgd door 95 °C gedurende respectievelijk 1 min en 10 min. Koel de stukken af tot kamertemperatuur voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    11. Ontwikkel de patronen door de siliciumstukken gedurende 20 minuten in de fotoresist developer-oplossing (1:3 verdunning van de ontwikkelaar in isopropanol) te weken. Zodra het patroon zichtbaar is, spoelt u de stukken af met pure isopropylalcohol (IPA) en blaast u voorzichtig droog met stikstofgas (14 psi).
      LET OP: Gebruik een goed geventileerde omgeving voor deze chemische behandeling om blootstelling van de mens te voorkomen. Gebruik alleen wit licht nadat functies zijn ontwikkeld en gespoeld met IPA.
    12. Bewaar de stukjes silicium in een exsiccator met het gecoate oppervlak naar boven gericht. Stel de stukken bloot aan silaandampen door 50 μL zuiver trichlooriso (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan op een kleine plastic beker of een glazen dia te gieten. Plaats de beker/schuif in een exsiccator en incubeer gedurende 2 uur.
      LET OP: Vermijd directe blootstelling aan silaandamp. Gebruik altijd een afgesloten kamer voor de behandeling van silaandamp.
      OPMERKING: Indien nodig kunnen de ontwikkelde siliciumstukken 1-2 dagen worden bewaard voordat ze doorgaan naar de volgende stap.
  2. PDMS-chipfabricage
    1. Maak PDMS in een plastic beker door de elastomeerbasis te mengen met het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1. Meng de inhoud goed door gedurende 3 min constant te roeren. Het mengen zal veel luchtbellen creëren in de PDMS-mix.
    2. Ontgas de PDMS-mix gedurende 30 minuten in een exsiccator om alle luchtbellen te verwijderen.
      LET OP: Zorg ervoor dat luchtbellen uit de PDMS-mix worden verwijderd voordat deze op de functies worden gegoten, omdat bellen defecte en niet-functionele apparaten kunnen veroorzaken.
    3. Plaats de siliciumwafers met de controlelaag (patroon 2) in een petrischaaltje. Giet voorzichtig een 5 mm dikke PDMS-menglaag op het siliciumstuk om bellenvorming te voorkomen.
    4. Ontgas de PDMS-mix in een exsiccator om extra bellen te verwijderen die worden gevormd tijdens het PDMS-gietproces.
    5. Plaats de siliciumwafer met stromingslaag (patroon 1) op de spinnerhouder en oefen 200-500 mTorr vacuümdruk uit om de wafer vast te houden. Giet ~ 1 ml PDMS op de siliciumwafer en coat het met een spin coater bij 500 rpm gedurende 5 s gevolgd door 1.000 rpm gedurende 30 s om een dikke laag van ~ 80 μm te krijgen.
    6. Bak de twee siliciumwafers met de met spin gecoate PDMS en giet PDMS-lagen op 50 °C gedurende 6 uur in een heteluchtconvectoren. Wacht na het bakken tot de stukjes bij kamertemperatuur zijn afgekoeld.
    7. Snijd de 5 mm dikke PDMS-laag uit het siliciumstuk rond de controlelaag (patroon 2) met een scherp mes en pel deze af van het siliciumsubstraat.
    8. Pons twee gaten met een diameter van ~ 1 mm met behulp van een Harris-ponser op het reservoir van het PDMS-blok om het immobilisatiekanaal en de isolatiekanaalinlaten aan te sluiten op de gasleidingen voor PDMS-membraanafbuigingen.
    9. Plaats het siliconen stuk met de met spin gecoate PDMS-laag op patroon 1 (flowlaag), met het PDMS-gecoate oppervlak naar boven gericht, op een plastic bakje. Houd het geponste PDMS-blok met patroon 2 (controlelaag) op de lade met de gegoten kant naar boven gericht.
    10. Bewaar de plastic lade in een plasmareiniger en stel de twee PDMS-oppervlakken gedurende 2 minuten onder laag vacuüm (200-600 mTorr) bloot aan 18 W luchtplasma. Breng vacuüm aan totdat de kamer helder violet wordt. Voer deze stap uit bij weinig licht om de plasmakleur te zien veranderen.
    11. Verwijder de twee plasmabehandelde blokken en bind de blokken voorzichtig door de met plasma behandelde oppervlakken van patronen 1 en 2 tegen elkaar te drukken. Bak de gebonden patronen op 50 °C gedurende 2 uur in een heteluchtconvectoren.
    12. Haal het verlijmde apparaat uit de oven. Snijd het verlijmde apparaat uit siliciumwafer met patroon 1 en patroon 2 en pons gaten in de inlaat- en uitlaatreservoirs van de stromingslaag met behulp van de Harris-puncher.
    13. Plaats het verlijmde PDMS-blok met de stroomlaag naar boven gericht op een plastic bakje. Bewaar een schoon afdekglas (#1.5) op dezelfde lade. Stel de blokken en het afdekglas gedurende 2 minuten bloot aan 18 W luchtplasma. Pas de vacuümdruk aan om een violette kamer te zien.
      OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd bij weinig licht om de plasmakleur te zien veranderen. Om het afdekglas schoon te maken, wast u het met IPA en föhnt u het met stikstofgas op 14 psi.
    14. Plaats het plasma blootgestelde PDMS-blok bovenop het afdekglas en bak de gebonden structuur gedurende 2 uur in een oven op 50 °C. Bewaar het apparaat in een schone kamer voor toekomstig experiment.

2. PDMS membraanaanzuigen

  1. Neem het apparaat en zet het op een stereomicroscoop en bevestig de slangen. Sluit de micro flexbuis (binnendiameter ~ 5 mm, buitendiameter ~ 8 mm) aan op een gecomprimeerde stikstofgasleiding aan het ene uiteinde. Sluit een driewegconnector aan het andere uiteinde aan. Buizen 1 en 2 van de driewegconnectoren worden respectievelijk op de val- en isolatiemembranen aangesloten.
  2. Sluit twee micro flexbuizen (binnendiameter ~1,6 mm, buitendiameter ~5 mm) aan op de twee uitlaatpoorten van de driewegstopkraan. Verbind het andere uiteinde van de twee buizen met een 8 mm lange naald van 18 G.
  3. Vul de stroomlaag met M9-buffer met behulp van een micropipette door de inlaatpoort. Vul beide buisjes met DI-water door het uiteinde dat op de naald is aangesloten. Steek de twee naalden in de geponste gaten en verbind respectievelijk het isolerende en vangmembraan.
  4. Open de stikstofgasregelaar op 14 psi en draai de driewegklep van buis 1 om het water in het apparaat te duwen via de microfluïdische kanalen in de controlelagen, namelijk de val- en isolatiemembranen.
  5. Wacht tot water het kanaal vult zonder de aanwezigheid van een luchtdruppel in beide kanalen. Zodra de kanalen volledig gevuld zijn met water, worden de kanalen beschouwd als geprimed.
  6. Laat de druk los met behulp van de driewegstopkraan zodra de kanalen met water zijn gevuld en geprimed. Priming kan leiden tot bubbels in de stroomlaag, verwijder de bellen door extra media door het stroomkanaal te laten stromen.

3. C. elegans onderhoud en synchronisatie

OPMERKING: C. elegans-stammen : De studie gebruikte de volgende transgenen PS3239 (dpy-20 (e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) voor vulva-ontwikkeling32, jsIs609 (mec7p::MLS(mitochondriaal matrixlokalisatiesignaal)::GFP)33 voor de ontwikkeling van aanraakreceptorneuronen (TRN) en mitochondriale transportbeeldvorming, en wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) om de ontwikkeling van PVD te volgen34. Standaard C. elegans cultuur- en onderhoudsprotocol werd gevolgd35.

  1. Kweek C. elegans op het aaltjesgroeimedium (NGM) Petriplaten met E. coli OP50 als voedselbron bij 22 °C. Onderhoud de C. elegans-stammen door herhaaldelijk een paar hermafrodieten over te brengen of een kleine hoeveelheid agar met een paar dieren in stukken te hakken naar een nieuwe NGM-plaat met een OP50-gazon.
  2. Controleer na 3-5 dagen de NGM-plaat op diergroei en C. elegans-eieren . Verzamel en breng ongeveer 30 eieren over van een bord naar een verse NGM-plaat met OP50-gazon.
  3. Om dieren te synchroniseren voor beeldvorming, breng alle niet-gehate eieren elke 2 uur van de plaat naar een vers bord en houd ze op 22 °C. Ongeveer 15-20 eieren komen op elk bord uit.
  4. Pluk de dieren tussen 14-16 uur en 28-30 uur na het uitkomen voor respectievelijk larvale 2 (L2) en larvale 3 (L3) stadia. Breng de dieren over naar het microfluïdische apparaat voor beeldvorming. Voeg voedselvoorziening toe zoals beschreven in de volgende sectie om het dier in het apparaat te houden voor langdurige groei- en beeldvormingsexperimenten.

4. C. elegans groei in de groei en beeldvorming microfluïdische apparaat

  1. Monteer een groei- en beeldvormingsmicrofluïdisch apparaat op een omgekeerde microscoop en bekijk patroon 2, na het aansluiten van de isolatiemembranen en het immobilisatiemembraan, bij lage vergrotingen (4x of 10x). Zorg ervoor dat de kanalen gevuld zijn met schoon gedestilleerd water.
  2. Bereid een verse 1 L oplossing van S medium met 10 ml 1 M kaliumcitraat pH 6,0, 10 ml spoormetaaloplossing, 3 ml 1 M CaCl2, 3 ml 1 M MgSO4. Bereid de oplossing onder steriele omstandigheden. Autoclaaf het S-medium niet.
  3. Vul het stroomkanaal 10 minuten voor het experiment met groeimedia (S-medium). Vermijd luchtbellen in het stroomkanaal. Laat indien nodig extra medium stromen om luchtbellen te verwijderen.
  4. Kies een enkel dier uit de vereiste ontwikkelingsfase van een NGM-plaat in 10 μL S-medium met behulp van een micropipette en duw het dier in het stroomkanaal door het inlaatgat.
  5. Controleer de positie van het dier in het stroomkanaal met behulp van een laag vergrotingsobjectief. Laat extra medium door de inlaat of uitlaat stromen om het dier te duwen en plaats het binnen het stroomkanaal dat beperkt is tussen de twee isolatiemembranen.
  6. Open de driewegstopkraan om 14 psi druk uit te oefenen in de isolatiekanalen en duw de membranen naar beneden in het stroomkanaal.
    OPMERKING: Het membraan sluit het stromingskanaal gedeeltelijk af en beperkt de beweging van dieren naar het gebied tussen de twee isolatiemembranen.
  7. Gebruik een enkele kolonie E. coli OP50 uit een gestreepte plaat om 250 ml L-bouillon (2,5 g bacto-trypton, 1,25 g bacto-gist, 1,25 g NaCl in H2O) te enten. Kweek de geënte cultuur 's nachts bij 37 °C.
  8. Aliquot 500 μL OP50-cultuur in steriele centrifugebuizen van 1,5 ml en bewaar de voorraad en de aliquot gedurende 2 weken bij 4 °C.
  9. Pellet down OP50-cultuur door centrifugatie bij 1,3 x g gedurende 5 min. Los de pellet op met 1 ml vers S-medium (0,5x verdunning) en bewaar het bij kamertemperatuur gedurende 3-4 dagen. Gebruik deze verdunde OP50 om C. elegans in microfluïdische apparaten te voeden.
  10. Laat een druppel S-medium bovenop de inlaat- en uitlaatreservoirs liggen om de verdamping van het S-medium in het stroomkanaal te verminderen.
  11. Neem verdunde OP50-oplossing in een micropipette van 10 μL. Verwijder de micropunt gevuld met de OP50-oplossing uit de pipet en druk de punt in het inlaatreservoir. Plaats vervolgens nog een micropipettetip met 10 μL voedseloplossing en plaats deze in het uitlaatreservoir.
  12. Sluit de puntkop af die druk uitoefent met een vinger om de continuïteit van voedseloplossingen te garanderen zonder luchtspleet. Vervang de micropipettetip elke dag met OP50-oplossing die niet ouder is dan 3-4 dagen.
  13. Vul een extra 20-30 μL voedseloplossing in beide tips. Voeg voedseloplossing toe of verwijder deze van en naar de micropipettepunt om de gradiënt aan te passen om het dier in het stroomkanaal te duwen en om de positie van het dier onder het vangmembraan aan te passen voor beeldvorming.
  14. Controleer de stroom van bacteriën om ervoor te zorgen dat deze continu is door de gedeeltelijk gesloten isolatiemembranen in het stroomkanaal met behulp van bright-field beelden.
    OPMERKING: Bij afwezigheid van bacteriestroom kunnen dieren de beschikbare bacteriën in het stroomkanaal tussen de twee isolatiemembranen eten. In het geval van geen bacteriën of geen stroming aanwezig in het kanaal, vervang de twee micropipette tips bij de in- en uitlaat door nieuwe pipet tips gevuld met vers bereide voedselvoorraden.

5. C. elegans immobilisatie en beeldvorming

  1. C. immobilisatie van elegans onder het vangmembraan
    1. Lokaliseer een enkel dier in het groeikanaal bij lage vergrotingen. Pas de hoogten van de voedseloplossing aan in de twee micropipettepunten die zijn aangesloten op de inlaat- en uitlaatreservoirs. Duw het dier in de gewenste richting met behulp van de hydrostatische drukverschillen in het stroomkanaal.
    2. Plaats het dier in het midden van het vangmembraan en controleer het zwemgedrag met behulp van een lage vergrotingsdoelstelling (4x).
    3. Draai de driewegstopkraan om de druk in het valkanaal langzaam te verhogen. Immobiliseer het dier onder het valmembraan in een rechte houding langs de grenswand van het groeikanaal.
      LET OP: Vermijd het vangen van het dier over het stroomkanaal in een Z- of U-bochtpositie. Dit zorgt ervoor dat het dierlijke lichaam met grotere druk wordt geperst en veroorzaakt permanente schade aan de gezondheid.
  2. C. elegans beeldvorming en afgifte uit het membraan
    1. Draag en laad het apparaat op een microscooptrap. Stel een omgekeerde microscoop in op de gewenste beeldinstellingen met alle benodigde optische componenten (objectief, lichtbron, fluorescentiefilters en een detector) voor helder veld met hoge resolutie, differentieel beeldcontrast (DIC) of fluorescentiebeeldvorming (aanvullende figuur 1).
    2. Verkrijg een enkele of meerdere time-lapse fluorescentiebeelden om cellulaire en subcellulaire gebeurtenissen vast te leggen.
    3. Verkrijg fluorescentiebeelden van C. elegans-neuronen als een functie van hun ontwikkeling met behulp van een 60x, 1,4 numeriek diafragma (NA) objectief, een 488 nm golflengtelaser met 7% -10% laservermogen, een CCD-camera, op een draaiende schijfmicroscoop. Voer time-lapse-beeldvorming uit met behulp van de software die bij de microscoop wordt geleverd en verkrijg beelden met een snelheid van 4 frames per seconde (aanvullende figuur 1).
    4. Laat na het verkrijgen van beelden de vangdruk los en controleer de voortbeweging van het dier bij lage vergrotingen - 4x en 10x. Houd het dier beperkt binnen het gebied dat wordt gedefinieerd door het isoleren van membranen (gedurende het hele experiment onder 14 psi gehouden).
    5. Pas het volume van de voedseloplossing in de twee micropipettetips aan om een langzame door de zwaartekracht aangedreven voedselstroom in het groeikanaal voort te zetten. Deze voedselstroom wordt verkregen door de niveaus van de voedseloplossingen in micropipettes aan de inlaat en de uitlaat aan te passen (meestal 1-5 mm hoogteverschil).
    6. Visualiseer de stroom onder een helder veld van het stromingspatroon van de bacteriën in het groeikanaal.
      OPMERKING: Bij afwezigheid van stroming eet het dier de beschikbare OP50-bacteriën, lijkt het kanaal helder en verhongert het dier gedurende een paar uur. Een uitgehongerd dier ontwikkelt meestal een hoge autofluorescentie, gemakkelijk waarneembaar bij het verkrijgen van time-lapse fluorescentiebeelden. Dergelijke gebeurtenissen hebben schadelijke effecten op de dierfysiologie en werden in de experimenten vermeden.
    7. Herhaal stap 5.2.1-5.2.3 na een vooraf bepaald tijdsinterval om fluorescentie-/DIC/bright-field-beelden van hetzelfde individu op meerdere tijdstippen te verkrijgen.
    8. Nadat de beelden op meerdere gewenste tijdstippen van hetzelfde individuele dier zijn verkregen, laat u de isolatie- en vangdruk los. Spoel het kanaal met M9-buffer en duw het dier door het inlaatreservoir. Haal het dier uit het reservoir en plaats het dier op een verse NGM-plaat voor verdere gezondheidsmonitoring.
    9. Spoel het kanaal een paar keer met M9-buffer om bacteriën te verwijderen. Spoel het stroomkanaal af met 70% ethylalcohol (verdund in gedestilleerd water). Droog de kanalen door lucht te duwen met een spuit. Bewaar het apparaat op een droge stofvrije plaats voor herhaald gebruik in de toekomst.
  3. Beeldanalyse en statistieken
    1. Gebruik FIJI ImageJ software voor tiff beeldanalyse. Open tiff beelden van de PVD time-lapse beelden van de wdIs51 dieren in Fiji ImageJ. Extraheer de beste vlakken uit de stapel z-vlakken met de primaire processen door het tabblad Afbeelding > project Stapels > Z te selecteren.
    2. Scherm de hele reeks afbeeldingen en vind specifieke beeldframes die met succes de volledige neuronale processen bestrijken met behulp van overlappende secties van de dierlijke beeldframes. Selecteer Plugin > Analyseren > Cell Counter op de FIJI werkbalk. Dit opent een venster voor het nummeren van verschillende takken en het bijhouden van een telling van elk geselecteerd neuron.
    3. Selecteer Initialiseer > items > Type1 en markeer vervolgens de secundaire vertakkingen. Selecteer vervolgens Type 2 en markeer Quaternair, klik op het venster Resultaten met tellingen van alle takken (aanvullende figuur 2). Met deze methode worden de vertakkingen weergegeven die al zijn geteld.
    4. Open de volgende overlappende afbeelding en tel de resterende vertakkingen. Dit proces voorkomt dubbeltelling en zorgt ervoor dat elk proces wordt geteld. Identificeer en tel het totale aantal primaire takken dat aanwezig is in de vroege larvale stadia van C. elegans. Voer een vergelijkbare analyse uit voor de beelden voor secundaire en quaternaire processen bij oudere dieren.
      OPMERKING: Volwassenen vertonen veel processen die innerveren in lichaamswandspieren en kunnen moeilijk te tellen zijn. Zorg ervoor dat elk proces slechts één keer wordt geteld.
    5. Bereken de afstand tussen de PVD-cellichamen bij de wdIs51-dieren door een gesegmenteerde lijn te tekenen van het PVD-cellichaam (CB) naar PVC CB. Bij larvale 4 (L4) stadiumdieren liggen de cellichamen ver uit elkaar en bevinden ze zich niet in hetzelfde frame wanneer ze worden afgebeeld met een 60x-objectief.
    6. Selecteer overlappende afbeeldingen uit stapel om de volledige dierlengte van kop tot staart te bedekken met behulp van het tabblad Afbeelding > Stacks > Z-project van ImageJ. Teken gesegmenteerde lijnen langs het neuronale proces tussen de PVD- en PVC-CI's.
    7. Meet de lengtes voor alle gesegmenteerde lijnen met behulp van ImageJ > Analyseren > Meten. Tel de lengtes voor alle segmenten op om de totale afstand tussen PVD en PVC CI's voor elk tijdstip te berekenen.
    8. Voor neuronlengte van TRN's bij jsIs609-dieren , laadt u de afbeeldingen in Fiji. Teken een gesegmenteerde lijn langs de achterste laterale microtubuli (PLMs; zichtbaar met oplosbare GFP) van het cellichaam naar het centroïde van het eerste mitochondrion. Bereken de lengte van de lijn voor de eerste afstandswaarde.
    9. Teken een gesegmenteerde lijn van het midden van het eerste naar het tweede mitochondrion. Herhaal dit proces voor elk paar mitochondriën tot het einde van de neuronale proceslengte. Tel alle lengtes op om de totale neuronale proceslengte te berekenen.
    10. Voor de cellijnanalyse laadt u alle vulvabeelden in Fiji en haalt u de beste focusafbeelding van de cellen uit de time-lapse-afbeeldingen van meerdere z-vlakken.
    11. Geef de gegevens weer als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Bereken statistische significantie met behulp van eenrichtings-ANOVA voor meer dan twee monsters of een t-test met twee monsters voor een paar monsters. Geef significantie aan met p-waarde < 0,05 (*), p-waarde < 0,005 (**), en p-waarde > 0,05 (ns, niet significant).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Apparaatkarakterisering: Het groei- en beeldvormingsapparaat bestaat uit twee PDMS-lagen die aan elkaar zijn gebonden (figuur 1) met behulp van onomkeerbare plasmabinding. De stromingslaag (patroon 1) die 10 mm lang en 40 μm of 80 μm hoog is, stelt ons in staat om het dier in vloeibare cultuur te laten groeien (figuur 1A). De vanglaag (patroon 2) heeft een membraan van 2 mm breed (figuur 1B) voor het immobiliseren van het dier voor beeldvorming met hoge resolutie. Het masker voor de vanglaag creëert ook een paar isolatiemembranen voor het beperken van dierlijke bewegingen binnen een deel van het stroomkanaal tussen opeenvolgende beeldtijdpunten. Het vangmembraan van het apparaat is aangepast van ons vorige beeldvormingsapparaat3. Het huidige apparaat (figuur 1C, L) omvat de toevoeging van een isolatiemembraan en een toename van de breedte van het vangmembraan tot 2 mm voor de efficiënte immobilisatie van hetzelfde dier over meerdere tijdstippen.

Om het apparaat te testen, werd schoon gedestilleerd water gevuld in de microfluïdische kanalen die de vangmembranen verbinden (figuur 1D, E en aanvullende figuur 3) en onder druk gezet met behulp van 14 psi stikstofgas, ook gebruikt voor het vangen van een dier onder een 2 mm dik PDMS-membraan (figuur 1H, K, L). Een enkel dier werd met behulp van een micropipette uit een NGM-plaat geplukt en in het stroomkanaal geladen (figuur 1F). Het groeikanaal was gevuld met bacteriën die in S-media waren geresuspendeerd (figuur 1F, G, I, J). Gedurende de hele duur van de beeldvorming werd een constante stroom gehandhaafd door de mediahoogten in de pipetpunten die op de in- en uitlaat van het apparaat waren aangesloten, aan te passen terwijl het dier in het stroomkanaal tussen de twee isolatiemembranen werd bewaakt. Vers bereide OP50-oplossing werd dagelijks in de micropipettetips ingevuld om een gezonde voedselbron voor het dier in het microkanaal te garanderen. Verse voedselbron en gasdoorlatend PDMS-materiaal zorgen voor voldoende zuurstoftoevoer in het microkanaal30,29. De groei van dieren in het apparaat werd gevolgd met behulp van celspecifieke markers of markers die cellijn of variabele cellulaire expressiepatronen tijdens de ontwikkeling laten zien. De dieren werden geïmmobiliseerd onder het vangmembraan met behulp van 14 psi stikstofgas en hielden wormen in een rechte positie langs de kanaalwand. Het dier groeide langzamer in het microfluïdische kanaal in vergelijking met op een NGM-plaat23.

Cellijnstudie met behulp van het langetermijnbeeldvormingsapparaat: Om de ontwikkeling van C. elegans in het microfluïdische apparaat te beoordelen, hebben we de PS3239 (ZMP-1: : GFP) stam32 gekweekt met constante voedseltoevoer om de ontwikkeling van vulva op verschillende tijdstippen van hun groei te volgen. ZMP-1 codeert voor een zinkmetalloprotease en drukt zich uit in de ankercel in het L3-stadium, in vulD- en vulE-cellen in het L4-stadium en in vulA in dag 1 (1D) volwassen dieren (figuur 2A). De veranderingen in het expressiepatroon zijn een voorbeeld van temporele genregulatie waarbij hetzelfde gen tot expressie komt in verschillende cellen in verschillende stadia van ontwikkeling. Om de ontwikkeling van vulva te observeren, werd het dier eerst geïmmobiliseerd en het vulvagebied werd vervolgens elke 8-10 uur in beeld gebracht over meerdere z-vlakken vanaf L3 tot volwassen stadia. ZMP-1::GFP wordt uitgedrukt in verschillende vulvacellen volgens het ontwikkelingsstadium (figuur 2B). De fluorescentiebeelden met hoge resolutie van de vulvacellen van de dieren die in het microfluïdische apparaat groeien, tonen een normale vulvaontwikkeling en ZMP-1: : GFP-expressie en -lokalisatie zijn vergelijkbaar met eerdere rapporten32.

Het volgen van de ontwikkeling van neuronen met behulp van groei- en beeldvormingsapparatuur op lange termijn: Om het gebruik van het apparaat voor subcellulaire beeldvorming van een individueel dier aan te tonen, werd de ontwikkeling van twee mechanosensorische neuronen PVD en TRN's gevolgd. De NC1686-stam die wdIs51 tot expressie brengt en die GFP tot expressie brengt in de twee PVD-neuronen werd gebruikt34,36. Elk PVD-neuron toont menora-achtige vertakte dendritische architectuur bestaande uit primaire (PP), secundaire (SP), tertiaire (TP) en quaternaire (QP) processen in respectievelijk L2 (14-16 h), late L2 (20-22 h), L3 (24-26 h) en L4 (36-42 h) ontwikkelingsstadia (figuur 3). Het PVD-cellichaam is posterieur aanwezig ten opzichte van de vulva. Het zendt één axon en twee primaire dendritische processen uit die aanleiding geven tot SP en TP, die op hun beurt aanleiding geven tot QP-dendritische takken die de lichaamswandspieren innerveren. Late L3- en L4-stadia tonen een hoge prieelvorming37,34. We kweekten enkele NC1686-dieren in het microfluïdische apparaat en voedden ze continu met bacterieel voedsel. De dieren werden geïmmobiliseerd tijdens L2 tot 1D-stadium van ontwikkeling en de PVD-neuronen werden herhaaldelijk elke 8-12 uur in beeld gebracht met behulp van 60x, 1,3 NA-oliedoelstelling om het aantal SP-, TP- en QP-takken in drie dimensies te tellen. De mate van vertakking nam toe tijdens de ontwikkeling zoals weergegeven in figuur 3B. Het aantal SP en QP in verschillende stadia van de wormontwikkeling nam toe met de leeftijd (figuur 4A), zoals is gezien in eerdere studies37. L2-dieren vertoonden 10 ± 3,8 (n = 9) SP's, maar geen QP, gemeten met behulp van het apparaat (figuur 4A). We plaatsten C. elegans in een druppel van 3 mM levamisol, een verdovingsmiddel dat samentrekking van lichaamswandspier en verlamming veroorzaakt, om nadelige effecten op organeltransport te minimaliseren, terwijl dierlijke bewegingen worden verminderd en voldoende verlamming wordt veroorzaakt, vereist voor beeldvorming met hoge resolutie 3,4. De SP-waarden (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) verschilden niet significant wanneer ze werden gemeten van vergelijkbare geënsceneerde dieren gekweekt op NGM-platen en afgebeeld met 3 mM levamisol op een agarplaat (figuur 4B). De gegevens suggereren dat de immobilisatie van het apparaat beeldvorming met hoge resolutie van complexe neuronale architecturen mogelijk maakt en hun ontwikkeling niet beïnvloedt. L3-stadiumdieren hebben een klein aantal QP dat in aantal toeneemt met de ontwikkeling. 1D-volwassenen vertoonden 67 ± 2,8 QP's (n = 5) bij dieren die in het apparaat werden gekweekt. Eerdere studies hebben de vorming en een terugtrekking van PVD-processen tijdens de ontwikkeling aangetoond, bekend als zelfvermijding, waarbij ze hun taknummers verminderen38. De vermindering van SP bij 51 h (1D) na het uitkomen kan het gevolg zijn van dergelijke terugtrekkingen. Dieren die op NGM-platen groeiden en in beeld werden gebracht met 3 mM levamisol vertoonden een vergelijkbare vertakkingscijfertrend voor vergelijkbare ontwikkelingsstadia (figuur 4A, B). Verder neemt de afstand tussen de twee PVC-cellichamen, één aanwezig in de staart en de tweede aanwezig in de buurt van de vulva, toe naarmate ze uit elkaar bewegen bij dieren die in het apparaat worden gekweekt of die op NGM-platen worden gekweekt (figuur 4C, D). Gedurende het hele beeldvormingsproces bleven de dieren gezond en konden ze eieren leggen, zelfs nadat de dieren gedurende deze lange periode herhaaldelijk onder het membraan waren geïmmobiliseerd.

Met behulp van dit apparaat konden we het dier in dezelfde oriëntatie immobiliseren en het identieke neuron en zijn architectuur met hoge resolutie in beeld brengen, zelfs met zwakke GFP-expressie. Om het nut van onze groei- en immobilisatietechnologie aan te tonen, werd de ontwikkeling van de TRN's van L3 tot volwassene in beeld gebracht met behulp van jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP) dieren. De achterste TRN's zijn aanwezig aan de zijkant van het lichaam en worden PLMR en PLML genoemd, wat overeenkomt met de rechter- en linkerkant van het dier. We hebben dezelfde dieren in beeld gebracht die in de microfluïdische chip groeien en ze geïmmobiliseerd met intervallen van 12-14 uur. De montage vertegenwoordigt het hele PLMR neuronale proces op opeenvolgende tijdstippen die zowel mitochondriën als het neuronale proces benadrukken (figuur 5A). De totale neuronale proceslengte werd berekend en bleek toe te nemen met een helling van 10,4 μm per h (figuur 5B). Deze toename van de neuronale proceslengte komt overeen met een eerder rapport van ~ 10 μm / h 18,31,39,40,41. We observeerden ook de toevoeging van nieuwe mitochondriën in het groeiproces en de verandering in de synaptische vertakkingspuntpositie ten opzichte van het cellichaam zoals eerder gemeld23.

Figure 1
Figuur 1: Een eenvoudige microfluïdische chip voor langdurige groei en beeldvorming van C. elegans. (A) De stromingslaag bestaat uit een 10 mm lang microfluïdisch kanaal (patroon 1) in een dunne PDMS-laag. (B) De vanglaag bestaat uit een 2 mm dik immobilisatiekanaal en een paar dunne isolatiekanalen in de bulk PDMS-laag. (C) De twee PDMS-lagen zijn samen met een dun afdekglas aan elkaar gelijmd om het apparaat te maken. (D, E) De vang- en isolatiecontrolekanalen zijn gevuld met gedeïoniseerd (DI) water, onder gecomprimeerd stikstof (N2) gas. (F) Leeftijd gesynchroniseerde C. elegans worden geplukt van NGM-platen en geladen in de stroomlaag van het apparaat. (G) Voedsel wordt verstrekt met behulp van twee micropipettepunten bij de inlaat- en uitlaatreservoirs. (H) De dieren kunnen zich vrij bewegen binnen de twee isolatiekanalen en zitten gevangen onder het immobilisatiemembraan. (I) Afbeelding van het groei- en beeldvormingsapparaat met voedselvoorziening via twee micropipettetips. (J, K) Beelden van een vrij bewegende en geïmmobiliseerde C. elegans in het microfluïdische kanaal. De schaalbalk is 1 mm (I) en 200 μm (J, K). (L) Schema van de doorsnede van het apparaat met de hoogten van het stroomkanaal (FC), het PDMS-membraan (M) en het besturingskanaal (CC). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Het volgen van de expressie van een vulva marker in C. elegans die zich in het apparaat ontwikkelen. (A) Schematische weergave van vulvacellen die ZMP-1::GFP tot expressie brengen bij PS3239-dieren tijdens de ontwikkeling. Het GFP-signaal verschijnt in de ankercel in het L3-stadium, in de vulD- en vulE-cellen in het L4-stadium en in vulA-cellen in het volwassen 1D-stadium. (B) Afbeeldingen van PS3239-dieren die in de microfluïdische chip groeien en elke 8-10 uur worden geïmmobiliseerd om fluorescentiebeelden van ZMP-1:: GFP-expressie vast te leggen tijdens vulva-ontwikkeling van L3, L4 en 1 dag (1D) volwassene. Afkortingen: AC = ankercel, A = vulA, D = vulD, E = vulE. Schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Beeldvorming van individuele wdIs51 C. elegans om de neuronale ontwikkeling van PVD te volgen. (A) Schematische van PVD-neurongroei en dendritische arborisatie van L2 tot L4-stadium. Groene cirkel toont PVD-cellichaam (CB, gele pijl). De dendrieten tonen de opkomst van primaire processen (PP) bij L2 van zowel de voorste als de achterste kant van de CB, secundaire processen (SP) tijdens late L2, tertiaire processen (TP) in L3 en quaternaire processen (QP) tijdens L4-stadia. (B) Beelden van PVD-neuronen van dieren die in een microfluïdisch apparaat groeien. (C) Beelden van PVD-neuronen van dieren gekweekt op een NGM-plaat en geïmmobiliseerd met 3 mM levamisol (Lev). Schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Vergelijking van pvd-ontwikkeling bij in hulpmiddelen gekweekte dieren en dieren gekweekt op NGM-platen. (A) Het gemiddelde aantal secundaire processen (SP) en quaternaire processen (QP) van dezelfde dieren die in het microfluïdische apparaat groeien. De waarden worden berekend op 16 h (L2), 24 h (L3), 36 h (vroege L4), 42 h (late L4) en 51 h (1D volwassene). (B) Het gemiddelde aantal SP en QP van een verschillende partij dieren die op NGM-platen groeien en verdoofd zijn met 3 mM levamisol. (C) Gemiddelde scheiding tussen de twee PVD neuronale cellichamen van hetzelfde dier dat in het microfluïdische apparaat groeit. (D) Gemiddelde scheiding van verschillende groepen dieren die op NGM-platen groeien en verdoofd zijn met 3 mM levamisol. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM (n ≥ 10 voor 3 mM levamisol en n ≥ 6 voor geïmmobiliseerde dieren). De statistische significanties worden berekend door eenrichtings-ANOVA en aangeduid als p-waarde < 0,05 (*), p-waarde < 0,005 (**) en p-waarde > 0,05 (ns). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Hoge resolutie beeldvorming van aanraakreceptorneuronen (TRN's) van dieren die in het microfluïdische apparaat groeien. (A) Montage van neuronale processen van een enkel dier die op verschillende tijdstippen in beeld zijn gebracht. Het cellichaam (CB, pijl), het synaptische vertakkingspunt (BP, pijlpunt) en de neuronpunt (Tip, pijl-omhoog) zijn gelabeld. Het neuronale proces en de positie van elk mitochondrion worden handmatig getraceerd met behulp van Fiji. De schaalbalk is 10 μm. (B) Gemiddelde neuronale proceslengte op verschillende beeldvormingstijdpunten. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 8). De statistische significantie wordt berekend met behulp van eenrichtings-ANOVA en aangeduid als p-waarde < 0,005 (**) en p-waarde > 0,05 (ns). Een regressievergelijking is geschikt met een helling van 10,4 μm neuronale procesverlenging per uur, R2=0,9425. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Screenshots van microscoopinstellingen voor fluorescentiebeeldvorming van C. elegans. (A) Een paneel van de beeldanalysesoftware toont de gemarkeerde secties voor het instellen van de scansnelheid, filterset en doelstelling voor beeldvorming. (B) De software wordt vervolgens gebruikt om de 488 nm laser te kiezen met 7% van het volledige laservermogen. (C) De beeldanalysesoftware kan een enkel beeldframe of een reeks time-lapse-afbeeldingen nemen en opslaan voor toekomstige analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Screenshots van FIJI-software met de analysestappen voor het tellen van PVD-takken in wdIs51-dieren . (A) Toont PVD-afbeelding geopend in Fiji ImageJ-software en link naar de celtellerplug-in. (B) Celtellervenster om de teller voor een afbeelding te initialiseren. (C) Selectie van tellers om takken te markeren die zijn opgenomen en om meervoudig tellen te voorkomen. (D) Resultatenvenster met het totale aantal vestigingen onder elke categorie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Schema van het groei- en beeldvormingsapparaat. Twee micropipette tips, gevuld met verschillende volumes van bacteriën voedseloplossing (geel), worden ingebracht in de inlaat en uitlaat punches van het stroomkanaal op de onderste laag. Het verschil in de hoogte van voedseloplossingen in de uiteinden zorgt ervoor dat de oplossing in het kanaal stroomt, wat op zijn beurt bacteriën aan het dier levert voor zijn groei. De vang- en isolatiekanalen (blauw) worden gevuld met gedestilleerd water en gecomprimeerd met behulp van een stikstofgastoevoer (ingesteld op 14 psi). Het isolatiekanaal is altijd verbonden met 14 psi. De druk op het vangmembraan wordt geschakeld tussen 0 (dier is vrij om te bewegen en te voeden) en 14 psi (dier wordt geïmmobiliseerd voor beeldvorming met hoge resolutie) met behulp van een driewegconnector. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel is een protocol beschreven voor de fabricage en het gebruik van een eenvoudig microfluïdisch apparaat voor het kweken van C. elegans met constante voedselvoorziening en beeldvorming met hoge resolutie van een enkel dier tijdens de ontwikkeling ervan. Dit fabricageproces is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in een niet-steriele omgeving. Een stofvrije omgeving is van cruciaal belang tijdens fabricagestappen. De aanwezigheid van stofdeeltjes zou leiden tot onjuist contact tussen de twee verlijmingsoppervlakken, wat resulteert in een slechte hechting en lekkage van het apparaat tijdens hogedruktoepassing terwijl C. elegans worden geïmmobiliseerd. Van alle gefabriceerde apparaten is 95% van de apparaten geschikt voor experimenten. Een klein aantal apparaten faalt (5%) als gevolg van onjuiste hechting tijdens fabricage of gebruik. Falen in de verlijming kan worden verminderd door het fabricageproces uit te voeren in een stofvrije (> cleanroom van 1.000 graden) die beschikbaar is bij verschillende academische instellingen over de hele wereld. Om bacterieel voedsel uit het stroomkanaal te reinigen en hergebruik van het apparaat mogelijk te maken, spoelt u het apparaat door er na elk experiment alcohol doorheen te laten stromen.

Het protocol demonstreert een lithografie fabricageproces met een eenvoudig ontwerp dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende ontwikkelingsstadia en maten van C. elegans. Verder kan dit apparaatontwerp worden aangepast voor andere modelorganismen zoals zebravissen en Drosophila, door de afmetingen van de stroom te vergroten en lagen3 te vangen om een verscheidenheid aan ontwikkelings- en subcellulaire processen te observeren. In dit protocol zijn twee verschillende hoogten van het stroomlaagkanaal - 40 μm en 80 μm - gebruikt voor volledige immobilisatie en het volgen van cellulaire en subcellulaire kenmerken in verschillende ontwikkelingsstadia van C. elegans , afhankelijk van hun lichaamsgrootte. De dendritische arborisatie in de PVD-sensorische neuronen begint bijvoorbeeld in de vroege L2-stadia en gaat door tot het L4-stadium. Dit werd in beeld gebracht in een apparaat met een 40 μm hoge stroomlaag. Omdat de PVD-neuronen dendrieten vormen die lichaamswandspieren innerveren, vereist het optische secties om de processen in 3D te kwantificeren. De kwantitatieve analyse van dendritische prieeltjes vereist volledige immobilisatie van de dieren in het apparaat dat overeenkomt met de lichaamsdiameter. Voor het monitoren van vulvalontwikkeling werd echter 80 μm hoogte van de stromingslaag gebruikt om de vulvalijnen te volgen. Voor TRN-lengte en mitochondriale beeldvorming hebben we L2- tot L4-stadia in beeld gebracht met behulp van apparaten met een stroomlaagdikte van 40 μm. Het gebruik van een apparaat met de verkeerde hoogte zal problemen veroorzaken bij immobilisatie. Kleine dieren (L2- of vroege L3-stadia) in een stromingslaaghoogteapparaat van 80 μm maken het bijvoorbeeld mogelijk om dieren in het apparaat om te draaien en vertonen onvolledige immobilisatie, zelfs nadat het vangmembraan onder de druk van 14 psi is. Aan de andere kant komen dieren met grote lichaamsdiameters (voorbij laat L4) niet gemakkelijk binnen in een apparaat met een stroomlaaghoogte van 40 μm. Het vangen van grote dieren in kleine apparaten onder hoge druk kan hun lichaam beschadigen. De toepassing van het huidige apparaat met een stromingslaag van 40 μm is beperkt en niet geschikt voor beeldvorming met hoge resolutie van zeer jonge dieren in het vroege larvale stadium (zoals L1-stadiumdieren jonger dan 10 uur na het uitkomen) omdat ze niet volledig geïmmobiliseerd zijn onder het membraan. Vanwege kleine lichaamsmaten blijven de kleine larvale dieren in beweging en ontsnappen ze af en toe aan de val wanneer ze opgewonden zijn met laserlicht. Voor L1-stadiumdieren kan men heldere veld- of fluorescentiebeelden met een lage resolutie uitvoeren met behulp van 4x of 10x objectieven en korte belichtingstijden van de camera. Als alternatieve benadering zal een nieuw stromingslaagapparaat met < hoogte van 20 μm nodig zijn om jonge larvale stadium C. elegans volledig te immobiliseren.

Het volgen van ontwikkelingsverschijnselen bij hetzelfde dier over een lange tijdschaal met behulp van fluorescentiebeelden met hoge resolutie kan leiden tot verhoogde autofluorescentie. Elke time-lapse beeldvormingstest vereist optimalisatie van excitatie-intensiteit, blootstellingstijd, beeldtijdinterval, hersteltijd van dieren en voedselkwaliteit voor fysiologisch relevante ontwikkelingsinformatie uit C. elegans-studies. We hebben > tijdsinterval van 3 uur geselecteerd voor ontwikkelingsstudies bij het gebruik van dieren vanaf L4-stadia. Het apparaat is in staat om frequentere beelden te verkrijgen (elke 5-10 minuten gedurende een paar uur) of meerdere frames per seconde (gedurende < 1 uur) om andere dynamische processen zoals organeltransport en distributie in C. elegans neuronen 3,23 te bestuderen. Het vangen en afbeelden van vroege ontwikkelingsstadia vereist een zorgvuldigere observatie, omdat herhaald vangen met korte tijdsintervallen zonder volledig herstel hun gezondheid kan beïnvloeden. Tijdens experimenten bleek dat dieren die hoge druk nodig hadden om ze in de stroomlaag te verplaatsen, een slechte gezondheid en meer autofluorescentie in de loop van de tijd vertonen. Dieren met een hoge lichaamsfluorescentie, waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met een hoog stressniveau, werden vermeden voor beeldvormingsstudies. Om een goede fysiologie te behouden, werden dieren gevangen in een rechte positie naast de kanaalwand. Het immobiliseren van de dieren met hun lichaam over de kanaalbreedte werd vermeden omdat dieren ziek worden nadat hun lichaam in deze positie onder 14 psi druk is geperst. Om een goede signaal-ruisverhouding te behouden tijdens herhaalde beeldvorming met oliedoelstellingen, moet de coverslip na elk tijdstip goed worden gereinigd. Na speciale zorg tijdens het fabricageproces van het apparaat en de toepassing ervan, kunnen dezelfde apparaten opnieuw worden gebruikt tijdens verschillende beeldvormingssessies.

Dit apparaat kan nuttig zijn voor studies met mutanten die gevoelig kunnen zijn voor anesthetica. De gepresenteerde aanpak kan nadelige anesthetische effecten op groei en fysiologie elimineren om observatie van morfologische, functionele en gedragsdefecten bij dieren gedurende een lange periode te vergemakkelijken. Het apparaat is eenvoudig te fabriceren en kan in elk laboratorium worden opgezet om langdurige ontwikkelings- / celbiologische vragen in C. elegans aan te pakken die intermitterende beeldvorming met hoge resolutie vereisen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. en S.P.K. zijn auteurs van een aangevraagd patent op het microfluïdische groei- en beeldvormingsapparaat (patentaanvraagnummer 640/CHE/2011).

Acknowledgments

We bedanken CIFF imaging facility, NCBS voor het gebruik van de confocale microscopen ondersteund door het DST - Centre for Nanotechnology (Nr. SR/55/NM-36-2005). We bedanken onderzoeksfinanciering van DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), draaiende schijf ondersteund door DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK en Gautam Menon) en HHMI-IECS-subsidienummer 55007425 (SPK). HB101-, PS3239- en wdIs51-stammen werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. maakte jsIs609 in het laboratorium van Mike Nonet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Bio-engineering C. elegans microfluïdische chip on-chip groei langetermijn beeldvorming neuronale beeldvorming vulva cell lineage
Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter