Summary
이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) 는 발달 및 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델 시스템임이 입증되었습니다. 이러한 생물학적 과정을 이해하려면 종종 동일한 동물의 장기적이고 반복적 인 이미징이 필요합니다. 한천 패드에서 수행되는 기존의 고정 방법과 관련된 긴 회복 시간은 동물 건강에 해로운 영향을 미치므로 장기간에 걸쳐 동일한 동물을 반복적으로 이미지화하는 것은 부적절합니다. 이 논문은 미세 유체 칩 설계, 제조 방법, 온칩 C. elegans 배양 프로토콜 및 개별 동물의 발달 과정을 연구하기위한 장기 이미징의 세 가지 예를 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산으로 제작되고 커버 유리에 접착 된이 칩은 질소 가스를 사용하여 편향되는 엘라스토머 멤브레인을 사용하여 유리 기판에 동물을 고정시킵니다. C. elegans 의 완전한 고정화는 마취 없는 방식으로 세포 및 하위 세포 이벤트의 강력한 타임 랩스 이미징을 가능하게 합니다. 단면이 큰 채널 형상을 통해 동물은 부분적으로 밀봉 된 두 개의 격리 막 내에서 자유롭게 움직일 수있어 지속적인 먹이 공급으로 채널에서 성장할 수 있습니다. 이 간단한 칩을 사용하여 동물이 채널 내부에서 성장함에 따라 PVD 감각 뉴런의 신경 과정 성장, 외음부 발달 및 수지상 수목 화와 같은 발달 현상의 이미징을 수행 할 수 있습니다. 장기 성장 및 이미징 칩은 단일 압력 라인, 외부 밸브 없음, 저렴한 유체 소모품으로 작동하며 C. elegans를 사용하는 다른 실험실에서 쉽게 적용할 수 있는 표준 웜 처리 프로토콜을 활용합니다.
Introduction
Caenorhabditis elegans는 세포 생물학, 노화, 발달 생물학 및 신경 생물학을 연구하는 강력한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 투명한 몸체, 짧은 수명주기, 쉬운 유지 관리, 정의 된 수의 세포, 여러 인간 유전자와의 상 동성 및 잘 연구 된 유전학과 같은 장점으로 인해 C. elegans는 기초 생물학 발견과 응용 연구 1,2 모두에서 인기있는 모델이되었습니다. 개별 동물에 대한 반복적 인 장기 관찰을 통해 세포의 생물학적 및 발달 과정을 이해하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 통상적으로, C. elegans는 한천 패드에 마취되고 현미경으로 이미지화된다. 동물의 건강에 대한 마취제의 부작용은 동일한 동물의 장기간 및 반복 간헐적 인 영상에 마취 된 동물의 사용을 제한합니다 3,4. 최근 미세 유체 기술의 발전과 건강 위험이 무시할 수있는 C. elegans의 마취없는 포획에 대한 적응은 단기간에 걸쳐 동일한 동물의 고해상도 이미징을 가능하게합니다.
미세 유체 칩은 C. elegans'5 고 처리량 스크리닝 6,7,8, 트래핑 및 분배9, 약물 스크리닝 10,11, 고해상도 이미징 12 및 동물의 고해상도 이미징12,13,14을 위해 설계되었습니다. 슬라이드 상의 고정화를 위한 초박형 마이크로유체 시트가 또한 개발되었다(15). C. elegans에 대한 장기 연구는 성장, 칼슘 역학, 행동에 대한 약물 효과16,17,18,19, 수명및 노화 20를 관찰하기 위해 액체 배양에서 자라는 동물의 저해상도 이미지를 사용하여 수행되었습니다. 고분해능 현미경을 사용한 장기 연구는 시냅스 발달21, 뉴런 재생22 및 미토콘드리아 추가23을 평가하기 위해 수행되었습니다. 세포 운명 및 분화의 장기 고해상도 이미징 및 추적은 다중 채널 장치24,25에서 수행되었습니다. 여러 세포 및 하위 세포 사건은 몇 시간의 시간 규모에 걸쳐 발생하며 생체 내 세포 역학을 이해하기 위해 프로세스의 모든 중간 단계를 특성화하기 위해 발달 중 다른 시점에서 동일한 개체를 포획해야 합니다. 기관 형성, 신경 발달 및 세포 이동과 같은 생물학적 과정을 이미지화하려면 동물이 여러 시점에서 동일한 방향으로 고정되어야 합니다. 우리는 이전에 터치 수용체 뉴런(TRN)23을 따라 미토콘드리아가 추가되는 위치를 결정하기 위해 36시간 이상 동안 C. elegans의 고해상도 이미징을 위한 프로토콜을 발표했습니다.
이 논문은 반복적인 고해상도 이미징을 위한 미세유체공학 기반 방법론을 확립하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 단일 흐름 채널이 있는 이 장치는 장치당 단일 동물의 반복 이미징에 가장 적합합니다. 처리량을 개선하고 한 번에 많은 동물을 이미지화하기 위해 여러 장치를 동일한 압력 라인에 연결할 수 있지만 각 장치에서 단일 동물을 제어하는 별도의 3방향 커넥터를 사용할 수 있습니다. 이 디자인은 배아 후 발달 과정, 세포 이동, 세포 소기관 수송, 유전자 발현 연구 등과 같은 고해상도 타임랩스 이미지를 요구하는 연구에 유용합니다. 이 기술은 많은 후기 단계의 동물의 병렬 성장 및 이미징이 필요한 수명 및 노화 연구와 같은 일부 응용 분야에서 제한 될 수 있습니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 엘라스토머는 생체 안정성26, 생체 적합성 27,28, 가스 투과성 29,30 및 조정 가능한 탄성 계수 31로 인해이 장치를 제조하는 데 사용되었습니다. 이 2 층 장치는 미세 유체 채널에서 지속적인 먹이 공급으로 동물의 성장과 질소 가스를 사용한 PDMS 막 압축을 통해 개별 C. elegans의 포획을 허용합니다. 이 장치는 연속적인 식품 공급 하에서 마이크로 채널에서 동일한 동물을 성장시키고 이미징하는 이점을 가진 이전에 공개 된 장치의 확장입니다3. 추가 격리막 네트워크와 2mm 너비의 포획 멤브레인은 발달 중인 동물을 효율적으로 고정할 수 있습니다. 이 장치는 감각 PVD 뉴런에서 신경 발달, 외음부 발달 및 수지상 수목 수목을 관찰하는 데 사용되었습니다. 동물은 장치에서 건강에 악영향을 미치지 않고 성장하며 발달 중에 동일한 동물에서 이미징 하위 세포 이벤트를 용이하게하기 위해 반복적으로 고정 될 수 있습니다.
전체 프로토콜은 다섯 부분으로 나뉩니다. 파트 1에서는 성장 및 이미징 칩의 장치 제작에 대해 설명합니다. 파트 2에서는 개별 C. elegans를 고정하고 분리하기 위해 PDMS 멤브레인 편향에 대한 압력 시스템을 설정하는 방법을 설명합니다. 3부에서는 장치 이미징을 위해 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 C. elegans를 동기화하는 방법을 설명합니다. 파트 4는 장치에 단일 동물을 로딩하고 며칠 동안 미세 유체 장치 내부에서 동물을 성장시키는 방법을 설명합니다. 5부에서는 여러 시점에서 개별 동물을 고정하고, 다양한 대물렌즈를 사용하여 고해상도 이미지를 캡처하고, 피지를 사용하여 이미지를 분석하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
1. 성장 및 이미징 장치의 제작
- SU8 금형 제작
- 워드 프로세싱 소프트웨어 (또는 컴퓨터 지원 설계 CAD 소프트웨어)에서 직사각형 모양을 사용하여 패턴 1 (플로우 레이어) 및 2 (제어 레이어)를 설계하고 폴리 에스테르 기반 필름에 최소 피처 크기가 8μm 인 레이저 플로터를 사용하여 포토 마스크를 인쇄합니다 (그림 1).
- 실리콘 웨이퍼를 2.5cm× 2.5cm 조각으로 자르고 20% KOH로 1분 동안 청소합니다. 웨이퍼를 탈이온수(DI)로 헹굽니다. 흐름과 제어 레이어에 각각 하나의 웨이퍼를 사용하십시오.
주의 : KOH는 부식성이있어주의해서 취급해야합니다. - 조각을 14psi 압축 질소 가스로 건조시킨 다음 120°C의 핫 플레이트에서 4시간 동안 탈수합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 두 조각을 실온으로 식히십시오.
- 실리콘 조각 중 하나를 스핀 코터의 척에 놓고 진공을 켜서 웨이퍼를 제자리에 고정합니다. 실리콘 조각에 ~20μL의 헥사메틸디실란(HMDS)을 넣고 스핀 코터를 사용하여 분당 500회전(rpm)으로 5초 동안 코팅한 다음 3,000rpm으로 30초 동안 코팅합니다.
주의: 이 단계는 노란색 표시등에서 수행해야 합니다. 실내에서 백색광을 사용하지 마십시오. - ~40μm의 균일한 포토레지스트 두께(유동층에 따라 다름, 초기 유충 단계 1에서 단계 3(L1 - L3) 동물 이미징에 적합)를 얻으려면 스핀 코터를 사용하여 ~1.5mL의 네거티브 포토레지스트-1로 실리콘 웨이퍼를 500rpm에서 5초 동안 코팅한 다음 2,000rpm에서 30초 동안 코팅합니다.
- 두 번째 웨이퍼로 1.1.4 및 1.1.5 단계를 반복하여 제어층에 특정한 ~40μm의 균일한 포토레지스트 두께를 얻습니다.
- 또는 나이가 많은 동물의 경우 유동층의 두께를 ~ 80μm로 늘리려면 스핀 코터를 사용하여 ~ 1.5mL의 네거티브 포토 레지스트 -2로 실리콘 웨이퍼를 500 초 동안 코팅 한 다음 2,000 rpm에서 30 초 동안 코팅합니다. 이 두께는 성인 동물에 L3 단계에 적합합니다.
주의: 스핀 코팅된 층의 손상을 방지하기 위해 실리콘 웨이퍼를 옆으로 잡습니다. 이 단계에서 흰색 조명을 끈 상태로 유지하십시오. - 포토레지스트로 코팅된 실리콘 조각(유동 및 제어층용)을 핫 플레이트에서 65°C에서 1분 동안 베이킹한 다음 95°C에서 10분 동안 굽습니다. 구운 조각을 실온으로 식히십시오.
알림: 구운 실리콘 조각은 다음 단계로 진행하기 전에 하루 동안 보관할 수 있습니다. 어두운 곳에 보관하고 백색광에 노출시키지 마십시오. - 포토레지스트 코팅 표면이 UV 램프를 향하도록 UV 조명기의 노출 단계에 소프트 베이킹된 실리콘 조각을 놓습니다. 패턴 1과 2가 있는 포토마스크를 통해 200W 램프를 사용하여 두 조각을 15초 동안 UV에 개별적으로 노출시켜 각각 흐름 및 제어 레이어를 얻습니다.
주의 : 보안경을 착용하고 자외선에 직접 노출되지 않도록하십시오. 이 단계에서는 실내의 백색광을 켜지 마십시오. - 코팅층이 위를 향하도록 노출된 두 개의 실리콘 조각을 65°C에서 굽고, 이어서 95°C에서 각각 1분 및 10분 동안 굽습니다. 다음 단계로 진행하기 전에 조각을 실온으로 식히십시오.
- 실리콘 조각을 포토레지스트 현상액(이소프로판올에 현상액의 1:3 희석)에 20분 동안 담가 패턴을 현상합니다. 패턴이 보이면 순수한 이소프로필 알코올(IPA)로 조각을 헹구고 질소 가스(14psi)를 사용하여 부드럽게 불어냅니다.
주의 : 인체 노출을 피하기 위해이 화학 처리에는 통풍이 잘되는 환경을 사용하십시오. 피처를 개발하고 IPA로 헹군 후에만 백색광을 사용하십시오. - 실리콘 조각을 코팅된 표면이 위를 향하도록 데시케이터에 보관하십시오. 작은 플라스틱 컵이나 유리 슬라이드에 50μL의 순수한 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸) 실란을 부어 조각을 실란 증기에 노출시킵니다. 컵/슬라이드를 데시케이터 안에 넣고 2시간 동안 배양합니다.
주의 : 실란 증기에 직접 노출되지 않도록하십시오. 실란 증기 처리를 위해 항상 밀봉 된 챔버를 사용하십시오.
참고 : 필요한 경우 개발 된 실리콘 조각을 다음 단계로 진행하기 전에 1-2 일 동안 보관할 수 있습니다.
- PDMS 칩 제조
- 엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 플라스틱 컵에 PDMS를 만듭니다. 3 분 동안 계속 저어 내용물을 잘 섞는다. 혼합은 PDMS 혼합물에서 많은 기포를 생성합니다.
- PDMS 혼합물을 데시케이터에서 30분 동안 탈기시켜 모든 기포를 제거하였다.
주의: 기포는 결함이 있거나 작동하지 않는 장치를 유발할 수 있으므로 PDMS 혼합물이 피처에 부어지기 전에 기포에서 기포를 제거했는지 확인하십시오. - 제어층(패턴 2)이 있는 실리콘 웨이퍼를 페트리 접시에 놓습니다. 기포 형성을 피하면서 실리콘 조각에 5mm 두께의 PDMS 믹스층을 부드럽게 붓습니다.
- PDMS 혼합물을 데시케이터에서 탈기하여 PDMS 주입 공정 동안 형성되는 추가적인 기포를 제거한다.
- 플로우 층(패턴 1)이 있는 실리콘 웨이퍼를 스피너 척에 놓고 웨이퍼를 고정하기 위해 200-500mTorr 진공 압력을 가합니다. 실리콘 웨이퍼에 ~1mL의 PDMS를 붓고 스핀 코터를 사용하여 500rpm에서 5초 동안 코팅한 다음 1,000rpm에서 30초 동안 코팅하여 ~80μm 두께의 층을 얻습니다.
- 스핀 코팅된 PDMS로 2개의 실리콘 웨이퍼를 베이크하고, PDMS 층을 50°C에서 열풍 대류 오븐에서 6시간 동안 부었다. 베이킹 후 조각이 실온에서 식을 때까지 기다리십시오.
- 날카로운 칼날을 사용하여 제어층(패턴 2) 주위의 실리콘 조각에서 5mm 두께의 PDMS 층을 절단하고 실리콘 기판에서 떼어냅니다.
- PDMS 블록의 저장소에 있는 Harris 펀처를 사용하여 ~1mm 직경의 구멍 2개를 펀칭하여 고정 채널과 격리 채널 입구를 PDMS 멤브레인 편향을 위한 가스 라인에 연결합니다.
- 스핀 코팅된 PDMS 층이 있는 실리콘 조각을 패턴 1(플로우 레이어)에 놓고 PDMS 코팅 표면이 위를 향하도록 플라스틱 트레이에 놓습니다. 패턴 2(제어 레이어)가 있는 펀칭된 PDMS 블록을 몰딩된 면이 위를 향하도록 트레이에 놓습니다.
- 플라스틱 트레이를 플라즈마 클리너 안에 보관하고 두 개의 PDMS 표면을 저진공(200-600mTorr)에서 2분 동안 18W 공기 플라즈마에 노출시킵니다. 챔버가 밝은 보라색이 될 때까지 진공을 적용하십시오. 저조도에서 이 단계를 수행하여 플라즈마 색상 변화를 확인합니다.
- 두 개의 플라즈마 처리된 블록을 꺼내고 패턴 1과 2의 플라즈마 처리된 표면을 함께 눌러 블록을 부드럽게 결합합니다. 접합된 패턴을 50°C에서 2시간 동안 뜨거운 공기 대류 오븐에서 굽습니다.
- 오븐에서 접합된 장치를 꺼냅니다. 패턴 1 및 패턴 2로 실리콘 웨이퍼에서 접합 장치를 절단하고 Harris 펀처를 사용하여 유동층의 입구 및 출구 저장소에 구멍을 펀칭합니다.
- 플로우 레이어가 위를 향하도록 접합된 PDMS 블록을 플라스틱 트레이에 놓습니다. 동일한 트레이에 깨끗한 커버 유리(#1.5)를 보관하십시오. 블록과 커버 유리를 18W 공기 플라즈마에 2분 동안 노출시킵니다. 보라색 챔버를 보기 위해 진공 압력을 조정합니다.
알림: 이 단계는 플라즈마 색상 변화를 확인하기 위해 저조도에서 수행해야 합니다. 커버 유리를 청소하려면 IPA로 세척하고 14psi에서 질소 가스를 사용하여 건조시킵니다. - 플라즈마 노출 PDMS 블록을 커버 글라스 위에 놓고 접합 구조를 50°C의 오븐에서 2시간 동안 베이킹합니다. 향후 실험을 위해 장치를 깨끗한 챔버에 보관하십시오.
2. PDMS 멤브레인 프라이밍
- 장치를 실체 현미경에 놓고 튜브를 부착하십시오. 마이크로 플렉스 튜브 (내경 ~ 5mm, 외경 ~ 8mm)를 한쪽 끝의 압축 질소 가스 라인에 연결합니다. 다른 쪽 끝에 3방향 커넥터를 연결합니다. 3 방향 커넥터의 튜브 1과 2는 각각 트랩과 절연 멤브레인에 연결됩니다.
- 두 개의 마이크로 플렉스 튜브 (내경 ~ 1.6 mm, 외경 ~ 5 mm)를 3 방향 스톱 콕의 두 출구 포트에 연결합니다. 두 튜브의 다른 쪽 끝을 8mm 길이의 18G 바늘에 연결합니다.
- 입구 포트를 통해 마이크로 피펫을 사용하여 M9 버퍼로 유동층을 채 웁니다. 바늘에 연결된 끝을 통해 두 튜브를 DI 물로 채 웁니다. 두 개의 바늘을 펀칭 된 구멍에 삽입하여 각각 분리 막과 트래핑 멤브레인을 연결합니다.
- 질소 가스 조절기를 14psi에서 열고 튜브 1에서 3 방향 밸브를 돌려 제어 층, 즉 트랩 및 격리 멤브레인의 미세 유체 채널을 통해 물을 장치로 밀어 넣습니다.
- 두 채널에 공기 방울이 없는 상태에서 물이 채널을 채울 때까지 기다리십시오. 채널이 물로 완전히 채워지면 채널은 프라이밍된 것으로 간주됩니다.
- 채널이 물로 채워지고 프라이밍되면 3방향 스톱콕을 사용하여 압력을 해제합니다. 프라이밍은 유동층에 기포를 유도할 수 있고, 유동 채널을 통해 추가적인 매체를 유동시킴으로써 기포를 제거한다.
3. C. 엘레 간스 유지 보수 및 동기화
참고: C. 엘레간스 균주: 이 연구는 외음부 발달 32에 대한 전이유전자 PS3239(dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)])를 사용하고, 터치 수용체 뉴런(TRN) 발달 및 미토콘드리아 수송 이미징을 위한 jsIs609(mec7p::MLS(미토콘드리아 기질 국소화 신호)::GFP)33, PVD 발달을 추적하기 위해 wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+))을 사용했습니다34. 표준 C. 엘레간스 배양 및 유지 프로토콜을 따랐습니다35.
- 22 ° C에서 식품 공급원으로 대장균 OP50을 사용하여 선충 성장 배지 (NGM) 페트리 플레이트에서 C. elegans를 성장시킵니다. 몇 마리의 자웅동체를 반복적으로 옮기거나 몇 마리의 동물과 함께 소량의 한천을 OP50 잔디가 있는 새로운 NGM 플레이트로 청킹하여 C. elegans 균주를 유지합니다.
- 3-5 일 후 NGM 플레이트에서 동물 성장과 C. elegans 알을 확인하십시오. 접시에서 약 30 개의 계란을 모아 OP50 잔디가있는 신선한 NGM 접시로 옮깁니다.
- 이미징을 위해 동물을 동기화하려면 2시간마다 접시에서 부화되지 않은 모든 알을 새 접시로 옮기고 22°C에서 유지합니다. 약 15-20 개의 알이 각 접시에 부화합니다.
- 유충 2 (L2) 및 유충 3 (L3) 단계를 위해 부화 한 후 14-16 시간에서 28-30 시간 사이에 동물을 선택하십시오. 동물을 영상화를 위해 미세유체 장치로 옮긴다. 장기 성장 및 이미징 실험을 위해 장치 내부에 동물을 유지하기 위해 다음 섹션에 설명된 대로 음식 공급을 추가합니다.
4. C. 엘레간스 생장 내부 성장 및 이미징 미세유체 장치
- 성장 및 이미징 미세유체 장치를 도립 현미경에 장착하고 격리막과 고정화 막을 연결한 후 저배율(4x 또는 10x)에서 패턴 2를 봅니다. 채널이 깨끗한 증류수로 채워져 있는지 확인하십시오.
- 1 M 구연산칼륨 pH 6.0 10 mL, 미량 금속 용액 10 mL, 1 MCaCl2 3 mL, 1 M MgSO4 3 mL를 사용하여 S 배지의 신선한 1 L 용액을 준비한다. 멸균 상태에서 용액을 준비하십시오. S 매체를 오토클레이브하지 마십시오.
- 실험 10분 전에 유동 채널을 성장 배지(S 배지)로 채웁니다. 흐름 채널의 기포를 피하십시오. 기포를 제거하기 위해 필요한 경우 추가 매체를 흐릅니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 10μL의 S 배지에 있는 NGM 플레이트에서 필요한 발달 단계에서 한 마리의 동물을 선택하고 동물을 입구 구멍을 통해 유동 채널로 밀어 넣습니다.
- 저배율 대물렌즈를 사용하여 유동 채널에서 동물 위치를 모니터링합니다. 입구 또는 출구를 통해 추가 매체를 유동시켜 동물을 밀고 두 격리막 사이에 제한된 유동 채널 내에 위치시킵니다.
- 3방향 스톱콕을 열어 격리 채널에 14psi 압력을 가하고 멤브레인을 흐름 채널로 밀어 넣습니다.
알림: 멤브레인은 유로를 부분적으로 밀봉하고 두 격리 멤브레인 사이의 영역으로 동물의 움직임을 제한합니다. - 줄무늬 플레이트에서 대장균 OP50의 단일 콜로니를 사용하여 L 브로스 250mL(박토 트립톤 2.5g, 박토 효모 1.25g,H2O중 NaCl 1.25g)를 접종합니다. 접종된 배양물을 37°C에서 밤새 성장시킨다.
- 500 μL의 OP50 배양액을 1.5 mL 멸균 원심분리 튜브에 분취하고, 분취량을 4°C에서 2주 동안 저장하였다.
- OP50 배양물을 1.3 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿 다운합니다. 펠릿을 1mL의 새로운 S 배지(0.5배 희석)에 녹이고 실온에서 3-4일 동안 보관합니다. 이 희석된 OP50을 사용하여 미세유체 장치 내부의 C. elegans를 공급하십시오.
- 유동 채널에서 S 매체의 증발을 줄이기 위해 입구 및 출구 저장소 위에 S 매체를 한 방울 떨어 뜨립니다.
- 희석된 OP50 용액을 10μL 마이크로피펫에 담습니다. 피펫에서 OP50 용액으로 채워진 마이크로 팁을 제거하고 팁을 입구 저장소에 압입합니다. 그런 다음 10μL의 식품 용액이 담긴 다른 마이크로피펫 팁을 놓고 배출구 저장소에 삽입합니다.
- 에어 갭 없이 식품 용액의 연속성을 보장하기 위해 손가락을 사용하여 압력을 가하는 팁 헤드를 밀봉합니다. 3-4 일이 지나지 않은 OP50 용액으로 마이크로 피펫 팁을 매일 교체하십시오.
- 양쪽 팁에 20-30μL의 식품 용액을 추가로 채웁니다. 마이크로피펫 팁에서 식품 용액을 추가하거나 제거하여 기울기를 조정하여 동물을 유동 채널로 밀어내고 이미징을 위해 트래핑 멤브레인 아래에서 동물의 위치를 조정합니다.
- 박테리아의 흐름을 모니터링하여 명시야 이미지를 사용하여 흐름 채널의 부분적으로 닫힌 격리 멤브레인을 통해 연속적인지 확인합니다.
알림: 박테리아 흐름이 없으면 동물은 두 격리막 사이의 흐름 채널에서 사용 가능한 박테리아를 먹을 수 있습니다. 채널에 박테리아가 없거나 흐름이 없는 경우 입구와 출구에 있는 두 개의 마이크로피펫 팁을 새로 준비된 식품으로 채워진 새 피펫 팁으로 교체하십시오.
5. C. 엘레 간스 고정 및 이미징
- C. 포획 막 아래의 엘레 간스 고정
- 낮은 배율의 성장 채널에서 단일 동물을 찾습니다. 입구 및 출구 저장소에 연결된 두 개의 마이크로피펫 팁에서 식품 용액 높이를 조정합니다. 유동 채널의 정수압 차이를 사용하여 동물을 필요한 방향으로 밉니다.
- 동물을 트래핑 멤브레인의 중앙에 배치하고 저배율 대물렌즈(4x)를 사용하여 수영 행동을 모니터링합니다.
- 3방향 스톱콕을 돌려 트랩 채널의 압력을 천천히 높입니다. 트랩 멤브레인 아래에 동물을 성장 채널 경계 벽을 따라 직선 자세로 고정시킵니다.
주의 : Z 또는 U 굽힘 위치에서 흐름 채널을 가로 질러 동물을 가두지 마십시오. 이로 인해 동물의 몸이 더 큰 압력으로 압착되어 건강에 영구적 인 손상을줍니다.
- C. 엘레 간스 이미징 및 멤브레인에서의 방출
- 현미경 스테이지에서 장치를 운반하고 로드합니다. 고해상도 명시야, 시차 이미징 대비(DIC) 또는 형광 이미징(보충 그림 1)에 필요한 모든 광학 구성 요소(대물렌즈, 광원, 형광 필터 및 검출기)를 사용하여 원하는 이미징 설정에서 도립 현미경을 설정합니다.
- 단일 또는 여러 개의 타임랩스 형광 이미지를 획득하여 세포 및 하위 세포 이벤트를 캡처합니다.
- 회전 디스크 현미경에서 60x, 1.4 개구(NA) 대물렌즈, 7%-10% 레이저 출력의 488nm 파장 레이저, CCD 카메라를 사용하여 발달 함수로 C. elegans 뉴런의 형광 이미지를 획득합니다. 현미경과 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 이미징을 수행하고 초당 4프레임의 속도로 이미지를 획득합니다(보충 그림 1).
- 이미지를 획득 한 후 트래핑 압력을 해제하고 4x 및 10x의 저배율로 동물의 움직임을 모니터링하십시오. 동물을 분리막에 의해 정의된 영역 내에서 제한되게 유지한다(실험 내내 14psi 미만으로 유지).
- 성장 채널에서 느린 중력 구동 식품 흐름을 계속하기 위해 두 개의 마이크로피펫 팁에서 식품 용액의 부피를 조정합니다. 이 식품 흐름은 입구와 출구의 마이크로 피펫에서 식품 용액의 수준을 조정하여 얻습니다 (일반적으로 1-5mm 높이 차이).
- 성장 채널에서 박테리아의 흐름 패턴에서 명시야 아래의 흐름을 시각화합니다.
알림: 흐름이 없으면 동물은 사용 가능한 OP50 박테리아를 먹고 채널이 깨끗해 보이며 동물은 몇 시간 동안 굶어 죽습니다. 굶주린 동물은 일반적으로 높은 자가형광을 발생시키며, 타임랩스 형광 이미지를 획득할 때 쉽게 관찰할 수 있습니다. 이러한 사건은 동물 생리학에 해로운 영향을 미치며 실험에서 피했습니다. - 미리 결정된 시간 간격 후에 5.2.1-5.2.3단계를 반복하여 여러 시점에서 동일한 개인의 형광/DIC/명시야 이미지를 획득합니다.
- 동일한 개별 동물로부터 원하는 여러 시점에서 이미지를 획득한 후 격리 및 포획 압력을 해제합니다. M9 버퍼로 채널을 플러시하고 입구 저장소를 통해 동물을 밀어냅니다. 저수지에서 동물을 회수하고 추가 건강 모니터링을 위해 동물을 신선한 NGM 플레이트에 놓습니다.
- M9 버퍼로 채널을 몇 번 플러시하여 박테리아를 제거합니다. 흐름 채널을 70 % 에틸 알코올 (증류수에 희석)로 헹굽니다. 주사기를 사용하여 공기를 밀어 채널을 건조시킵니다. 나중에 반복적으로 사용할 수 있도록 먼지가없는 건조한 장소에 장치를 보관하십시오.
- 이미지 분석 및 통계
- tiff 이미지 분석을 위해 FIJI ImageJ 소프트웨어를 사용하십시오. 피지 ImageJ에서 wdIs51 동물의 PVD 타임랩스 이미지의 tiff 이미지를 엽니다. Z 프로젝트 스택에서 이미지 탭을 선택하여 기본 프로세스를 보여주는 Z 평면 스택에서 최상의 평면> 추출> 있습니다.
- 전체 일련의 이미지를 스크리닝하고 동물 이미지 프레임의 겹치는 부분을 사용하여 전체 신경 과정을 성공적으로 덮는 특정 이미지 프레임을 찾습니다. FIJI 도구 모음에서 플러그인 > > 셀 카운터 분석을 선택합니다. 그러면 다른 분기에 번호를 매기고 선택한 각 뉴런의 수를 유지하는 창이 열립니다.
- > 카운터 초기화 > Type1을 선택한 다음 보조 분기를 표시합니다. 그런 다음 유형 2를 선택하고 Quaternary를 표시하고 모든 분기의 수를 보여주는 결과 창을 클릭합니다(보충 그림 2). 이 메서드는 이미 계산 된 분기를 표시합니다.
- 겹치는 다음 이미지를 열고 나머지 분기를 계산합니다. 이 프로세스는 이중 계산을 방지하고 모든 프로세스가 계산되도록 합니다. C. elegans의 초기 애벌레 단계에 존재하는 주요 가지의 총 수를 식별하고 계산합니다. 나이가 많은 동물의 2 차 및 4 차 과정에 대한 이미지에 대해 유사한 분석을 수행하십시오.
알림: 성인은 체벽 근육에 신경을 공급하는 많은 과정을 보여 주며 계산하기 어려울 수 있습니다. 모든 프로세스가 한 번만 계산되는지 확인합니다. - PVD 세포체(CB)에서 PVC CB까지 분할된 선을 그려 wdIs51 동물에서 PVD 세포체 사이의 거리를 계산한다. 애벌레 4(L4) 단계 동물의 경우 세포체가 멀리 떨어져 있고 60x 대물렌즈로 이미징할 때 동일한 프레임에 있지 않습니다.
- ImageJ의 Stacks > Z 프로젝트를 > 이미지 탭을 사용하여 머리에서 꼬리까지 전체 동물 길이를 포함하도록 스택에서 겹치는 이미지를 선택합니다. PVD와 PVC CB 사이의 신경 과정을 따라 분할 된 선을 그립니다.
- ImageJ > 분석 > 측정을 사용하여 분할된 모든 선의 길이를 측정합니다. 모든 세그먼트의 길이를 추가하여 각 시점에 대한 PVD와 PVC CB 사이의 총 거리를 계산합니다.
- jsIs609 동물에서 TRN의 뉴런 길이는 피지로 이미지를 불러옵니다. 세포체에서 첫 번째 미토콘드리아의 중심까지 후방 측면 미세 소관 (PLM, 가용성 GFP로 볼 수 있음)을 따라 분할 된 선을 그립니다. 첫 번째 거리 값에 대한 선의 길이를 계산합니다.
- 첫 번째 미토콘드리아의 중심에서 두 번째 미토콘드리아까지 분할 된 선을 그립니다. 뉴런 과정 길이가 끝날 때까지 각 미토콘드리아 쌍에 대해이 과정을 반복하십시오. 모든 길이를 더하여 총 뉴런 프로세스 길이를 계산합니다.
- 세포 계통 분석을 위해 피지의 모든 외음부 이미지를 로드하고 여러 z 평면의 타임랩스 이미지에서 세포의 최상의 초점 이미지를 추출합니다.
- 데이터를 평균± 평균(SEM)의 표준 오차로 나타냅니다. 두 개 이상의 표본에 대한 일원 분산 분석 또는 한 쌍의 표본에 대한 2표본 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 계산합니다. 유의성을 p-값 < 0.05(*), p-값 < 0.005(**), p-값 > 0.05(ns, 유의하지 않음)로 나타냅니다.
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Representative Results
장치 특성화: 성장 및 이미징 장치는 비가역적 플라즈마 결합을 사용하여 함께 결합된 두 개의 PDMS 층(그림 1)으로 구성됩니다. 길이가 10mm이고 높이가 40μm 또는 80μm 인 유동층 (패턴 1)을 통해 액체 배양에서 동물을 키울 수 있습니다 (그림 1A). 트래핑 층(패턴 2)은 고해상도 이미징을 위해 동물을 고정화하기 위한 2mm 너비의 멤브레인(그림 1B)을 갖는다. 트래핑 층을 위한 마스크는 또한 연속적인 이미징 시점들 사이의 유동 채널의 섹션 내에서 동물의 움직임을 제한하기 위한 한 쌍의 격리 멤브레인을 생성한다. 장치의 트래핑 멤브레인은 이전 이미징 장치3에서 채택되었습니다. 현재 장치(그림 1C, L)에는 격리 멤브레인을 추가하고 여러 시점에 걸쳐 동일한 동물을 효율적으로 고정하기 위해 트랩핑 멤브레인의 너비를 2mm로 늘리는 것이 포함됩니다.
장치를 테스트하기 위해 깨끗한 증류수를 트래핑 멤브레인(그림 1D, E 및 보충 그림 3)을 연결하는 미세 유체 채널에 채우고 2mm 두께의 PDMS 멤브레인(그림 1H, K, L) 아래에 동물을 포획하는 데에도 사용되는 14psi 질소 가스를 사용하여 가압했습니다. 마이크로피펫을 사용하여 NGM 플레이트에서 단일 동물을 선택하고 유동 채널에 로딩했습니다(그림 1F). 성장 채널은 S 배지에 재현탁된 박테리아로 채워졌다(도 1F,G,I,J). 두 격리막 사이의 유동 채널에서 동물을 모니터링하면서 장치 입구 및 출구에 연결된 피펫 팁의 배지 높이를 조정하여 이미징 기간 동안 일정한 흐름을 유지했습니다. 신선하게 제조된 OP50 용액을 마이크로채널 내부의 동물에 대한 건강한 식품 공급원을 보장하기 위해 매일 마이크로피펫 팁에 채웠다. 신선 식품 공급원 및 가스 투과성 PDMS 물질은 마이크로채널(30,29) 내부에 충분한 산소 공급을 보장한다. 장치에서 동물의 성장은 발달 중에 세포 계통 또는 다양한 세포 발현 패턴을 보여주는 세포 특이적 마커 또는 마커를 사용하여 추적되었습니다. 동물을 14 psi 질소 가스를 사용하여 포획 막 아래에 고정화하고 채널 벽을 따라 직선 위치에 웜을 유지하였다. 동물은 NGM 플레이트23에 비해 미세유체 채널 내부에서 느리게 성장했습니다.
장기 이미징 장치를 사용한 세포 계통 연구: 미세 유체 장치 내부의 C. elegans 발달을 평가하기 위해 PS3239 (ZMP-1 :: GFP) 균주32 를 지속적인 식량 공급으로 성장시켜 성장의 다른 시점에서 외음부 발달을 추적했습니다. ZMP-1 은 아연 메탈로프로테아제를 암호화하고 L3 단계의 앵커 세포, L4 단계의 vulD 및 vulE 세포, 1일째(1D) 성체 동물의 vulA에서 발현합니다(그림 2A). 발현 패턴의 변화는 동일한 유전자가 상이한 발달 단계에서 상이한 세포에서 발현되는 시간적 유전자 조절의 예를 나타낸다. 외음부 발달을 관찰하기 위해 동물을 먼저 고정시킨 다음 L3부터 성체 단계까지 8-10시간마다 여러 z 평면에 걸쳐 외음부 영역을 이미지화했습니다. ZMP-1::GFP는 발달 단계에 따라 다른 외음부 세포에서 발현됩니다(그림 2B). 미세유체 장치 내부에서 자라는 동물로부터의 외음부 세포의 고해상도 형광 이미지는 정상적인 외음부 발달을 입증하고 ZMP-1::GFP 발현 및 국소화는 이전 보고와 유사하다(32).
장기 성장 및 이미징 장치를 사용한 뉴런 발달 추적: 개별 동물로부터의 하위 세포 이미징을위한 장치의 사용을 입증하기 위해, 2 개의 기계 감각 뉴런 PVD 및 TRN의 발달을 모니터링했다. 두 개의 PVD 뉴런에서 GFP를 발현하는 wdIs51을 발현하는 NC1686 균주는34,36을 사용하였다. 각 PVD 뉴런은 L2(14-16시간), 후기 L2(20-22시간), L3(24-26시간) 및 L4(36-42시간) 발달 단계에서 각각 1차(PP), 2차(SP), 3차(TP) 및 4차(QP) 과정으로 구성된 메노라와 같은 분지 수지상 구조를 보여줍니다(그림 3). PVD 세포체는 외음부 뒤쪽에 존재합니다. 그것은 SP와 TP를 생성하는 하나의 축삭과 두 개의 주요 수지상 과정을 보내고, 차례로 체벽 근육을 자극하는 QP 수지상 가지를 생성합니다. 후기 L3 및 L4 단계는 높은 수목37,34를 보여줍니다. 우리는 미세 유체 장치 내에서 단일 NC1686 동물을 키우고 박테리아 음식을 지속적으로 먹였습니다. 동물은 발달의 1D 단계까지 L2 동안 고정화되었으며 PVD 뉴런은 60x, 1.3 NA 오일 대물렌즈를 사용하여 8-12시간마다 반복적으로 이미징되어 SP, TP 및 QP 가지의 수를 3차원으로 세었습니다. 분기의 범위는 그림 3B에 도시된 바와 같이 개발 중에 증가했습니다. 웜 발달의 상이한 단계에서의 SP 및 QP의 수는 이전 연구37에서 볼 수 있듯이 연령에 따라 증가하였다 (도 4A). L2 동물은 장치를 사용하여 측정했을 때 10 ± 3.8 (n = 9) SP를 나타내었지만 QP는 없었습니다 (그림 4A). 우리는 고해상도 이미징3,4에 필요한 동물의 움직임을 줄이고 충분한 마비를 유발하면서 세포 기관 수송에 대한 부작용을 최소화하기 위해 체벽 근육의 수축과 마비를 유발하는 마취제인 3mM levamisole을 한 방울에 C. elegans를 넣었습니다. SP 값 (4 ± 1.6, n = 25, p = 0.15)은 NGM 플레이트에서 성장한 유사한 병기 동물로부터 측정하고 한천 슬라이드에서 3mM levamisole을 사용하여 이미징했을 때 크게 다르지 않았습니다 (그림 4B). 데이터는 장치 고정화가 복잡한 신경 구조의 고해상도 이미징을 가능하게 하고 개발에 영향을 미치지 않음을 시사합니다. L3 단계 동물은 발달에 따라 숫자가 증가하는 적은 수의 QP를 가지고 있습니다. 1D 성인은 장치에서 성장한 동물에서 67 ± 2.8 QP (n = 5)를 보였다. 이전 연구에 따르면 자기 회피로 알려진 개발 중 PVD 프로세스의 형성과 철회가 나타나 분기 번호38을 줄입니다. 부화 후 51 시간 (1D)에서 SP의 감소는 그러한 철회의 결과 일 수 있습니다. NGM 플레이트에서 성장하고 3mM levamisole을 사용하여 이미징 된 동물은 유사한 발달 단계에서 유사한 분기 수 경향을 보였다 (그림 4A, B). 또한, 꼬리에 존재하는 하나와 외음부 근처에 존재하는 두 번째 PVC 세포체 사이의 거리는 장치에서 자란 동물 또는 NGM 플레이트에서 자란 동물에서 멀어짐에 따라 증가합니다(그림 4C, D). 이미징 과정에서 동물들은 건강을 유지했으며 이 오랜 기간 동안 동물이 반복적으로 막 아래에 고정된 후에도 알을 낳을 수 있었습니다.
이 장치를 사용하여 동물을 동일한 방향으로 고정시키고 희미한 GFP 발현에도 불구하고 동일한 뉴런과 그 구조를 고해상도로 이미지화할 수 있었습니다. 우리의 성장 및 고정화 기술의 유용성을 입증하기 위해, L3에서 성체까지의 TRN의 발달은 jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP) 동물을 사용하여 이미지화되었다. 후방 TRN은 신체의 측면에 존재하며 동물의 오른쪽과 왼쪽에 해당하는 PLMR 및 PLML로 명명됩니다. 우리는 미세 유체 칩에서 자라는 동일한 동물을 이미지화하고 12-14 시간 간격으로 고정화했습니다. 몽타주는 미토콘드리아와 뉴런 과정을 모두 강조하는 연속적인 시점에서 전체 PLMR 뉴런 프로세스를 나타냅니다(그림 5A). 총 뉴런 프로세스 길이를 계산한 결과 h당 10.4μm의 기울기로 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 5B). 신경 세포 과정 길이의 이러한 증가 속도는 ~10μm/h 18,31,39,40,41의 이전 보고서와 일치합니다. 우리는 또한 성장 과정에서 새로운 미토콘드리아의 추가와 앞서 보고된 바와 같이 세포체에 대한 시냅스 분기점 위치의 변화를 관찰했습니다23.
그림 1: C. elegans의 장기 성장 및 이미징을 위한 간단한 미세유체 칩. (A) 유동층은 얇은 PDMS 층에 10mm 길이의 미세유체 채널(패턴 1)로 구성된다. (B) 트래핑 층은 벌크 PDMS 층에서 2mm 두께의 고정 채널과 한 쌍의 얇은 격리 채널로 구성됩니다. (C) 두 개의 PDMS 층은 얇은 커버 유리와 함께 함께 접착되어 장치를 만듭니다. (D, E) 트래핑 및 격리 제어 채널은 압축 질소(N2) 가스 하에서 탈이온수(DI)로 채워집니다. (F) 연령 동기화 C. 엘레 간은 NGM 플레이트에서 픽업되어 장치의 유동층 내부에로드됩니다. (G) 음식은 입구 및 출구 저장소에서 두 개의 마이크로 피펫 팁을 사용하여 제공됩니다. (H) 동물은 2개의 격리 채널 내에서 자유롭게 이동하고 고정화 막 아래에 갇혀 있습니다. (i) 두 개의 마이크로피펫 팁을 통한 식품 공급을 통한 성장 및 이미징 장치의 이미지. (J, K) 미세유체 채널 내부에서 자유롭게 움직이고 고정화된 C. elegans의 이미지. 스케일 바는 1 mm (I) 및 200 μm (J, K)입니다. (L) 유동 채널(FC), PDMS 멤브레인(M) 및 제어 채널(CC)의 높이를 보여주는 장치 단면의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장치 내부에서 발생하는 C. elegans 에서 외음부 마커의 발현 추적. (A) 발달 중 PS3239 동물에서 ZMP-1::GFP를 발현하는 외음부 세포의 개략도. GFP 신호는 L3 단계의 앵커 셀, L4 단계의 vulD 및 vulE 셀, 성인 1D 단계의 vulA 셀에 나타납니다. (b) 미세유체 칩 내부에서 성장하는 PS3239 동물의 이미지를 8-10시간마다 고정화하여 L3, L4 및 1일(1D) 성체로부터 외음부 발달 동안 ZMP-1::GFP 발현의 형광 이미지를 캡처하였다. 약어 : AC = 앵커 셀, A = vulA, D = vulD, E = vulE. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : PVD 신경 발달을 추적하기위한 개별 wdIs51 C. elegans의 이미징. (A) L2 단계에서 L4 단계까지의 PVD 뉴런 성장 및 수지상 수목 화의 개략도. 녹색 원은 PVD 세포체 (CB, 노란색 화살표)를 나타냅니다. 수상 돌기는 CB의 전방 및 후방 모두에서 L2의 1 차 프로세스 (PP), 후기 L2 동안 2 차 프로세스 (SP), L3의 3 차 프로세스 (TP) 및 L4 단계 동안 4 차 프로세스 (QP)의 출현을 보여줍니다. (B) 미세유체 장치 내부에서 자라는 동물의 PVD 뉴런 이미지. (C) NGM 플레이트 상에서 성장하고, 3 mM 레바미솔(Lev)로 고정화된 동물로부터의 PVD 뉴런의 이미지. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 장치 재배 동물과 NGM 플레이트에서 자란 동물의 PVD 발달 비교. (A) 미세유체 장치 내부에서 성장하는 동일한 동물로부터의 평균 2차 공정(SP) 및 4차 공정(QP) 수. 값은 16시간(L2), 24시간(L3), 36시간(초기 L4), 42시간(L4 후반) 및 51시간(성인 1일)에 계산됩니다. (b) NGM 플레이트 상에서 성장하고, 3 mM 레바미솔로 마취시킨 동물의 상이한 배치로부터의 SP 및 QP의 평균 수. (c) 마이크로유체 장치에서 성장하는 동일한 동물로부터 2개의 PVD 뉴런 세포체 사이의 평균 분리. (D) NGM 플레이트 상에서 성장하는 상이한 동물 세트로부터의 평균 분리를 3 mM 레바미솔로 마취시켰다. 데이터는 평균 ± SEM (3 mM 레바미솔에 대해 n ≥10 및 장치 고정화 동물에 대해 n ≥ 6)으로 표시되었다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석으로 계산되며 p-값 < 0.05(*), p-값 < 0.005(**) 및 p-값 > 0.05(ns)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 미세유체 장치 내부에서 자라는 동물의 접촉 수용체 뉴런(TRN)의 고해상도 이미징. (A) 서로 다른 시간에 이미징 된 단일 동물의 신경 과정 몽타주. 세포체(CB, 화살표), 시냅스 분기점(BP, 화살촉) 및 뉴런 팁(팁, 위쪽 화살표)에 레이블이 지정됩니다. 각 미토콘드리아의 신경 과정과 위치는 피지를 사용하여 수동으로 추적됩니다. 스케일 바는 10 μm입니다. (B) 다른 이미징 시점에서의 평균 신경 과정 길이. 데이터는 평균± SEM으로 표시된다(n=8). 통계적 유의성은 일원 분산 분석을 사용하여 계산되며 p-값 < 0.005(**) 및 p-값 > 0.05(ns)로 표시됩니다. 회귀 방정식은 시간당 10.4μm의 뉴런 프로세스 연신율, R2=0.9425의 기울기에 적합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: C. elegans의 형광 이미징을 위한 현미경 설정의 스크린샷. (A) 이미지 분석 소프트웨어의 패널에는 스캔 속도, 필터 세트 및 이미징 대물렌즈를 설정하기 위한 강조 표시된 섹션이 표시됩니다. (B) 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 전체 레이저 출력의 7 %를 가진 488nm 레이저를 선택합니다. (C) 이미지 분석 소프트웨어는 단일 이미지 프레임 또는 일련의 타임 랩스 이미지를 가져 와서 향후 분석을 위해 저장할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: wdIs51 동물에서 PVD 가지를 계수하기 위한 분석 단계를 보여주는 FIJI 소프트웨어의 스크린샷. (A) 피지 ImageJ 소프트웨어에서 열린 PVD 이미지를 보여주고 셀 카운터 플러그인에 연결합니다. (비) 이미지에 대한 카운터를 초기화하는 셀 카운터 창. (C) 포함 된 분기를 표시하고 다중 계산을 피하기 위해 카운터 선택. (D) 각 범주의 총 분기 수를 보여주는 결과 창입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 성장 및 이미징 장치의 개략도. 서로 다른 부피의 박테리아 식품 용액 (노란색)으로 채워진 두 개의 마이크로 피펫 팁이 하단 층에있는 유동 채널의 입구 및 출구 펀치에 삽입됩니다. 팁에 있는 음식 용액의 높이 차이로 인해 용액이 채널 내부로 흐르게 되어 성장을 위해 동물에게 박테리아를 공급합니다. 트래핑 및 격리 채널(파란색)은 증류수로 채워지고 질소 가스(14psi로 설정) 공급을 사용하여 압축됩니다. 분리 채널은 항상 14psi로 연결됩니다. 트래핑 멤브레인의 압력은 3방향 커넥터를 사용하여 0(동물이 자유롭게 이동하고 먹이를 줄 수 있음)과 14psi(고해상도 이미징을 위해 동물이 고정됨) 사이에서 전환됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에서는 개발 과정에서 단일 동물의 지속적인 식량 공급과 고해상도 이미징으로 C. elegans 를 성장시키기위한 간단한 미세 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되었습니다. 이 제조 공정은 간단하며 비멸균 환경에서 수행할 수 있습니다. 먼지가 없는 환경은 제조 단계에서 매우 중요합니다. 먼지 입자가 있으면 두 접합 표면 사이에 부적절한 접촉이 발생하여 C. elegans 가 고정되어있는 동안 고압 적용 중에 장치의 접착 불량 및 누출이 발생합니다. 제작 된 모든 장치 중에서 장치의 95 %가 실험에 적합합니다. 제조 또는 사용 중 부적절한 접착으로 인해 소수의 장치가 고장납니다(5%). 접착 실패는 전 세계 여러 학술 기관에서 사용할 수 있는 먼지가 없는(> 1,000등급 클린룸) 내부에서 제조 공정을 수행함으로써 줄일 수 있습니다. 흐름 채널에서 박테리아 음식을 청소하고 장치를 재사용하려면 모든 실험 후에 알코올을 흘려 장치를 세척하십시오.
이 프로토콜은 C. elegans의 다양한 발달 단계와 크기에 맞게 쉽게 수정할 수 있는 단순한 디자인의 리소그래피 제조 공정을 보여줍니다. 또한, 이 장치 설계는 다양한 발달 및 하위 세포 과정을 관찰하기 위해 흐름의 크기를 증가시키고 층3을 포획함으로써 제브라피쉬 및 초파리와 같은 다른 모델 유기체에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 40μm 및 80μm의 두 가지 다른 높이의 유동층 채널이 신체 크기에 적합한 C. elegans의 다양한 발달 단계에서 세포 및 하위 세포 기능의 완전한 고정 및 추적에 사용되었습니다. 예를 들어, PVD 감각 뉴런의 수지상 수목 재배는 초기 L2 단계에서 시작하여 L4 단계까지 계속됩니다. 이것은 40 μm 높은 흐름 층이있는 장치에서 이미징되었습니다. PVD 뉴런이 체벽 근육을 자극하는 수상 돌기를 형성함에 따라 3D로 프로세스를 정량화하기 위해 광학 절단이 필요합니다. 수지상 아버의 정량 분석은 신체 직경과 일치하는 장치 내에서 동물을 완전히 고정시켜야합니다. 그러나 외음부 발달을 모니터링하기 위해 80μm 높이의 유동층을 사용하여 외음부 계통을 추적했습니다. TRN 길이 및 미토콘드리아 이미징의 경우 유동층 두께가 2μm인 장치를 사용하여 L40에서 L4 단계를 이미지화했습니다. 높이가 잘못된 장치를 사용하면 고정이 어려워집니다. 예를 들어, 80μm 유동층 높이 장치 내부의 작은 동물(L2 또는 초기 L3 단계)은 장치 내부에서 동물 뒤집기를 허용하고 트래핑 멤브레인이 14psi 압력 미만인 후에도 불완전한 고정화를 나타냅니다. 반면에 몸 직경이 큰 동물 (후기 L4 이상)은 유동층 높이가 40μm 인 장치 내부로 쉽게 들어 가지 않습니다. 고압으로 작은 장치에 큰 동물을 가두면 신체가 손상 될 수 있습니다. 40μm 유동층이 있는 현재 장치의 적용은 제한적이며 멤브레인 아래에 완전히 고정되지 않기 때문에 매우 어린 초기 애벌레 단계 동물(예: 부화 후 10시간 미만의 L1 단계 동물)의 고해상도 이미징에는 적합하지 않습니다. 몸집이 작기 때문에 작은 유충 동물은 계속 움직이고 때때로 레이저 광선에 흥분하면 함정을 탈출합니다. L1 스테이지 동물의 경우 4x 또는 10x 대물렌즈와 짧은 카메라 노출 시간을 사용하여 저해상도 명시야 또는 형광 이미징을 수행할 수 있습니다. 대안적인 접근법으로, 어린 애벌레 단계 C. elegans를 완전히 고정시키기 위해 20 μm 높이< 새로운 유동층 장치가 필요할 것이다.
고해상도 형광 이미징을 사용하여 장기간에 걸쳐 동일한 동물의 발달 현상을 추적하면 자가형광이 증가할 수 있습니다. 모든 타임랩스 이미징 분석에는 C. elegans 연구의 생리학적으로 관련된 발달 정보를 위해 여기 강도, 노출 시간, 이미징 시간 간격, 동물 회복 시간 및 식품 품질의 최적화가 필요합니다. L4 단계 이후의 동물을 사용할 때 발달 연구를 위해 > 3 시간 간격을 선택했습니다. 이 장치는 C. elegans 뉴런 3,23에서 세포 기관 수송 및 분포와 같은 다른 동적 과정을 연구하기 위해 더 빈번한 이미지 (몇 시간 동안 5-10 분마다) 또는 초당 여러 프레임 (< 1 시간 동안)을 획득 할 수 있습니다. 초기 발달 단계의 트래핑 및 이미징은 완전한 회복 없이 짧은 시간 간격으로 반복되는 트래핑이 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 보다 주의 깊은 관찰이 필요합니다. 실험 중에 유동층으로 이동하기 위해 고압이 필요한 동물은 시간이 지남에 따라 건강이 좋지 않고 자가 형광이 더 많은 것으로 나타났습니다. 높은 스트레스 수준과 관련된 것으로 알려진 높은 신체 형광을 가진 동물은 영상 연구를 위해 피했습니다. 양호한 생리학을 유지하기 위해, 동물들은 채널 벽에 인접한 직선 위치에 포획되었다. 채널 폭을 가로질러 동물을 몸으로 고정시키는 것은 동물이 이 위치에서 14psi 압력 하에서 압착된 후 아프기 때문에 피했습니다. 오일 대물렌즈를 사용하여 반복적으로 이미징하는 동안 우수한 신호 대 잡음비를 유지하려면 모든 시점 후에 커버슬립을 적절하게 청소해야 합니다. 장치의 제조 과정과 적용 과정에서 특별한주의를 기울이면 동일한 장치를 여러 이미징 세션에서 재사용 할 수 있습니다.
이 장치는 마취제에 민감 할 수있는 돌연변이를 사용하는 연구에 유용 할 수 있습니다. 제시된 접근법은 성장 및 생리학에 대한 부작용을 제거하여 장기간에 걸쳐 동물의 형태 학적, 기능적 및 행동 적 결함을 쉽게 관찰 할 수 있습니다. 이 장치는 제작이 쉽고 간헐적 고해상도 이미징이 필요한 C. elegans 의 장기적인 발달/세포 생물학적 문제를 해결하기 위해 모든 실험실에 설치할 수 있습니다.
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Disclosures
S.M. 및 SPK는 미세유체 성장 및 이미징 장치에 대한 출원 중인 특허(특허 출원 번호 640/CHE/2011)의 저자입니다.
Acknowledgments
우리는 CIFF 이미징 시설, NCBS가 DST - 나노 기술 센터에서 지원하는 컨포칼 현미경을 사용해 주셔서 감사합니다. SR/55/NM-36-2005). DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK 및 Gautam Menon)가 지원하는 스피닝 디스크, HHMI-IECS 보조금 번호 55007425 (SPK)의 연구 자금에 감사드립니다. HB101, PS3239 및 wdIs51 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)에서 제공했습니다. SPK는 Mike Nonet의 실험실에서 jsIs609 를 만들었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
References
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