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Immunology and Infection

Modello murino di sindrome da distress respiratorio acuto indotto da acido oleico

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

Il presente protocollo descrive un modello di danno polmonare nei topi che utilizza acido oleico per imitare la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Questo modello aumenta i mediatori dell'infiammazione sull'edema e diminuisce la compliance polmonare. L'acido oleico viene utilizzato sotto forma di sale (oleato) poiché questa forma fisiologica evita il rischio di embolia.

Abstract

La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una minaccia significativa per i pazienti critici con un alto tasso di mortalità. L'esposizione agli inquinanti, il fumo di sigaretta, gli agenti infettivi e gli acidi grassi possono indurre ARDS. I modelli animali possono imitare il complesso meccanismo patotico dell'ARDS. Tuttavia, ognuno di essi ha dei limiti. In particolare, l'acido oleico (OA) è aumentato nei pazienti in condizioni critiche con effetti dannosi sul polmone. L'OA può indurre lesioni polmonari attraverso emboli, interrompendo il tessuto, alterando il pH e compromettendo la clearance dell'edema. Il modello di danno polmonare indotto da OA assomiglia a varie caratteristiche dell'ARDS con danno endoteliale, aumento della permeabilità alveolare, infiammazione, formazione di ialina di membrana e morte cellulare. In questo caso, l'induzione del danno polmonare è descritta iniettando l'OA (in forma di sale) direttamente nel polmone e per via endovenosa in un topo poiché è la forma fisiologica dell'OA a pH 7. Pertanto, l'iniezione di OA sotto forma di sale è un modello animale utile per studiare il danno polmonare/ARDS senza causare emboli o alterare il pH, avvicinandosi così a ciò che sta accadendo nei pazienti critici.

Introduction

Ashbaugh et al.1, nel 1967, descrissero per la prima volta la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e da allora sono stati sottoposti a molteplici revisioni. Secondo la definizione di Berlino, l'ARDS è un'infiammazione polmonare che porta a un'insufficienza respiratoria acuta e all'ipossiemia (PaO 2 / FiO 2 > 300 mm Hg) a causa di uno squilibrio nel rapporto ventilazione/perfusione, danno alveolare bilaterale diffuso (DAD) e infiltrato, aumento del peso polmonare ed edema 2,3. Il parenchima polmonare è un ambiente cellulare complesso composto da cellule epiteliali, endoteliali e di altro tipo. Queste cellule formano barriere e strutture responsabili dello scambio gassoso e dell'omeostasi negli alveoli3. Le cellule più abbondanti all'interno della barriera epiteliale sono le cellule alveolari di tipo I (AT1) con una superficie più ampia per lo scambio gassoso e la gestione dei fluidi attraverso Na/K-ATPasi. Inoltre, le cellule alveolari di tipo II (AT2) producono tensioattivo, riducendo la tensione superficiale negli alveoli4. Al di sotto, le cellule endoteliali formano una barriera semipermeabile che separa la circolazione polmonare dall'interstizio. Le sue funzioni includono il rilevamento degli stimoli, il coordinamento delle risposte infiammatorie e la trasmigrazione cellulare5. Le cellule endoteliali regolano anche lo scambio gassoso, il tono vascolare e la coagulazione5. Pertanto, i disturbi della funzione endoteliale ed epiteliale possono esacerbare un fenotipo proinfiammatorio, causando danni polmonari che portano all'ARDS5.

Lo sviluppo dell'ARDS è associato al rischio di polmonite batterica e virale o a fattori indiretti come sepsi non polmonare, traumi, trasfusioni di sangue e pancreatite6. Queste condizioni causano il rilascio di pattern molecolari associati a patogeni (PAMP) e pattern molecolari associati al danno (DAMPs), inducendo citochine e chemochine proinfiammatorie come TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-85. Il TNF-α è legato alla degradazione della caderina vascolare-endoteliale (VE-caderina) nella rottura della barriera endoteliale e nell'infiltrazione dei leucociti nel parenchima polmonare. I neutrofili sono le prime cellule a migrare, attratte da IL-8 e LTB4 5,7,8. I neutrofili aumentano ulteriormente le citochine proinfiammatorie, le specie reattive dell'ossigeno (ROS)9 e la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET) generando un danno endoteliale ed epiteliale extra10. Il danno epiteliale provoca l'infiammazione e l'attivazione dei recettori Toll-like nelle cellule AT2 e nei macrofagi residenti, inducendo il rilascio di chemochine che attirano le cellule infiammatorie nei polmoni4. Inoltre, la produzione di citochine come l'interferone-β (INFβ) provoca recettori che inducono l'apoptosi correlati al TNF (TRAIL), portando le cellule ATII all'apoptosi, compromettendo la chiarezza del fluido e degli ioni4. La rottura della struttura della barriera endoteliale ed epiteliale consente l'afflusso di liquidi, proteine, globuli rossi e leucociti nello spazio alveolare, causando edema. Con l'edema stabilitosi, lo sforzo polmonare per mantenere la respirazione e lo scambio di gas è alterato11. L'ipercapnia e l'ipossiemia inducono la morte cellulare e disturbi del trasporto del sodio, aggravando l'edema alveolare a causa della scarsa capacità di clearance10. L'ARDS ha anche livelli elevati di IL-17A, associati a disfunzione d'organo, aumento della percentuale di neutrofili alveolari e permeabilità alveolare9.

Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi nella ricerca sulla fisiopatologia, l'epidemiologia e il trattamento dell'ARDS12,13. Tuttavia, l'ARDS è una sindrome eterogenea, nonostante i progressi della ricerca terapeutica che hanno portato alla ventilazione meccanica e all'ottimizzazione della fluidoterapia. Pertanto, è ancora necessario un trattamento farmacologico diretto più efficace10 e gli studi sugli animali possono aiutare a svelare i meccanismi dell'ARDS e gli obiettivi per l'intervento.

Gli attuali modelli di ARDS non sono in grado di replicare completamente la patologia. Pertanto, i ricercatori spesso scelgono il modello che potrebbe adattarsi meglio ai loro interessi. Ad esempio, il modello di induzione dei lipopolisaccaridi (LPS) induce ARDS per shock endotossico innescato principalmente da TLR414. L'induzione dell'HCl imita l'aspirazione acida e il danno è neutrofilo-dipendente14. D'altra parte, l'attuale modello di oleato di sodio induce danni endoteliali che aumentano la permeabilità vascolare e l'edema. Inoltre, l'utilizzo dell'oleato di sodio al posto dell'acido oleico in forma liquida evita i rischi di embolia e l'alterazione del pH15 del sangue.

Modelli di animali per ARDS
Gli studi preclinici in modelli animali aiutano a comprendere la patologia e sono essenziali per la ricerca di nuovi trattamenti per l'ARDS. Il modello animale ideale deve avere caratteristiche simili alla situazione clinica e una buona riproducibilità dei meccanismi della malattia con caratteristiche fisiopatologiche rilevanti di ogni stadio, evoluzione e riparazionedella malattia 14. Diversi modelli animali sono utilizzati per valutare il danno polmonare acuto nell'ARDS in fase preclinica. Tuttavia, poiché tutti i modelli hanno dei limiti, non riproducono completamente la patologia umana 6,14,16. L'ARDS indotta dall'acido oleico è utilizzata in diverse specie animali17. I suini18, gli ovini19 e i cani20 sottoposti a iniezione di OA presentano numerose caratteristiche cliniche della malattia con disfunzione della membrana alveolare-capillare e aumento della permeabilità con l'infiltrazione di proteine e cellule.

Ad esempio, l'OA a 1,25 μM iniettato per via endovenosa ha bloccato il trasporto transepiteliale portando all'edema alveolare15. In alternativa, nel modello in vitro che utilizzava cellule A549, l'OA a una concentrazione di 10 μM non ha modificato il canale epiteliale del sodio (eNAC) o l'espressione di Na/K-ATPasi. Tuttavia, l'OA sembra associarsi a entrambi i canali, inibendo direttamente la loro attività21. L'iniezione endovenosa di OA a 0,1 ml/kg ha causato congestione e gonfiore del tessuto polmonare, riduzione degli spazi alveolari con setti alveolari ispessiti e aumento della conta infiammatoria e dei globuli rossi22. Inoltre, l'OA ha indotto l'apoptosi e la necrosi nelle cellule endoteliali ed epiteliali del polmone15. L'iniezione di una soluzione di tris-oleato, per via intratracheale nei topi, ha migliorato l'infiltrazione dei neutrofili e l'edema già 6 ore dopo la stimolazione23. L'iniezione di OA a 24 ore ha aumentato i livelli di citochine proinfiammatorie (cioè TNF-α, IL-6 e IL-1β)23. Inoltre, l'iniezione endovenosa (plesso orbitale) di 10 μM di un tris-oleato inibisce l'attività polmonare Na/K-ATPasi, simile all'ouabaina a 10-3 μM, un inibitore enzimatico selettivo. Inoltre, l'OA induce infiammazione con infiltrazione cellulare, formazione di corpi lipidici e produzione di leucotriene B4 (LTB4) e prostaglandina E2 (PGE2)22,24. Pertanto, l'ARDS indotta dall'acido oleico genera edema, emorragia, infiltrazione di neutrofili, aumento dell'attività della mieloperossidasi (MPO) e ROS24. Pertanto, la somministrazione di OA è un modello consolidato per il danno polmonare22,25. Tutti i risultati presentati in questo articolo che hanno OA rappresentano la forma del sale, oleato di sodio.

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Protocol

Le procedure utilizzate in questo studio sono state approvate dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali della Fondazione Oswaldo Cruz (licenze CEUA n°002-08, 36/10 e 054/2015). Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi Webster svizzeri maschi di peso compreso tra 20 e 30 g, forniti dall'Istituto di Scienza e Tecnologia in Biomodelli (ICTB) della Fondazione Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Gli animali erano tenuti in isolatori ventilati nel vivaio del Pavilhão Ozório de Almeida, e acqua e cibo erano disponibili ad libitum. Sono stati esposti a un ciclo di luce e buio di 12 ore/12 ore.

1. Preparazione della soluzione di oleato di sodio

  1. Utilizzare l'acido oleico per preparare 100 mmol/L di soluzione madre oleata di sodio in qualsiasi provetta sterile o pallone di vetro.
    NOTA: Per il presente lavoro è stata preparata una soluzione da 50 mL (volume finale), ma il volume deve essere regolato secondo le esigenze sperimentali. La soluzione deve essere sempre preparata in provette sterili o contenitori di vetro.
    1. Innanzitutto, aggiungi compresse o soluzioni di NaOH in acqua ultrapura per aumentare il pH. Si consiglia un valore di pH di 12-13 per un volume di 25 mL.
      NOTA: In alternativa, la base Tris può essere utilizzata per preparare la soluzione Tris-oleato.
    2. Aggiungere l'acido oleico (vedi tabella dei materiali) molto lentamente, goccia a goccia, sotto agitazione costante in un bagno ad ultrasuoni a 37 °C.
      NOTA: Se si verifica una precipitazione dell'acido oleico, ricominciare dall'inizio.
    3. Una volta che l'acido oleico è completamente disciolto, regolare attentamente il pH a 7,4, goccia a goccia sotto agitazione, con HCl diluito ultrapuro e quindi regolare al volume finale di 50 mL.
      NOTA: Preparare di fresco le soluzioni di lavoro dell'oleato. In alternativa, la soluzione può essere aliquotata, immagazzinata e mantenuta a -20 °C in un ambiente arricchito di azoto per evitare l'ossidazione per non più di un mese. Evitare cicli congelati-ricongelati.

2. Induzione del danno polmonare da parte dell'acido oleico

  1. Eseguire la somministrazione intratracheale di acido oleico.
    1. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano al 5% con 2 L/min di O2 utilizzando un vaporizzatore anestetico veterinario (Figura 1A). Rimuovere il pelo nell'area dell'incisione con una crema depilatoria e disinfettare l'area con tre cicli alternati di scrub betadine e alcol utilizzando una garza sterile. Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi.
      NOTA: Utilizzare guanti e strumenti sterili durante la procedura. Usa un telo per coprire l'animale ed esporre solo il sito dell'incisione. Eseguire l'esperimento in una cabina di sicurezza biologica per evitare la fuoriuscita di isofluorano nell'ambiente. Gli analgesici non vengono somministrati in quanto possono inibire la risposta infiammatoria.
    2. Dopo l'anestesia, adagiare l'animale in posizione di decubito dorsale ed eseguire un'incisione (0,5-1 cm) a forma di V a livello della tiroide. Spostare delicatamente la tiroide per esporre la trachea (Figura 1B) e iniettare 50 μL della soluzione oleata preparata (fase 1).
      NOTA: I topi sono stati divisi in due gruppi, con otto animali in ciascun gruppo. Il gruppo con lesione polmonare riceve una soluzione di sodio-oleato a 25 mM (1,25 μmol) e il gruppo di controllo riceve 50 μL di soluzione fisiologica sterile per instillazione nella trachea di ciascun topo con una siringa da insulina (volume 300 μL, 30 G) (Figura 1C).
    3. Suturare il sito di incisione dei topi con una sutura sintetica monofilamento non assorbibile, riportarla nella gabbia e monitorarla fino al completo recupero dall'intervento chirurgico. Durante tutte le procedure, mantenere gli animali su un termoforo a 37 °C.
      NOTA: I topi di solito impiegano fino a 15 minuti per riprendersi dall'intervento chirurgico.
  2. Eseguire la somministrazione endovenosa di acido oleico.
    1. Dopo l'anestesia (passaggio 2.1.1, Figura 2A), iniettare per via endovenosa nel plesso orbitale inserendo l'ago ultrasottile (vedere Tabella dei materiali) nel canto mediale dell'orbita oculare (Figura 2B).
      NOTA: I topi sono stati divisi in due gruppi, con otto animali in ciascun gruppo. Ogni gruppo riceve 100 μL di soluzione di sodio-oleato a 10 μmol di OA per animale, mentre il gruppo di controllo riceve 100 μL di soluzione fisiologica sterile.
  3. Dopo l'intervento chirurgico, monitorare quotidianamente gli animali per verificare la presenza di reazioni avverse. Gli endpoint umani per l'eutanasia includono reazioni avverse, convulsioni e coma.

3. Raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF)

  1. Sopprimere i topi con una dose letale intraperitoneale di ketamina (300 mg/Kg) e xilazina (30 mg/Kg) (vedi Tabella dei materiali).
  2. Adagiare l'animale in posizione di decubito dorsale, praticare un'incisione di circa 1 cm con forbici chirurgiche nella regione anteriore dell'animale, esporre la trachea ed eseguire un piccolo taglio per introdurre un catetere endovenoso (20 G).
  3. Collegare il catetere a una siringa sterile da 1 mL, iniettare lentamente e gradualmente 0,5 mL di soluzione fisiologica sterile nei polmoni, quindi aspirare il liquido dal BALF con la stessa siringa. Ripetilo 3-5 volte e trasferiscilo in una microprovetta sterile, mettendoli nel ghiaccio.
    NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C per un massimo di 6 mesi.

4. Analisi cellulare totale e differenziale in BALF

  1. Per la conta cellulare totale, diluire 20 μL di BALF in 180 μL (diluizione 10x) di soluzione di Turk (vedere Tabella dei materiali). Eseguire il conteggio utilizzando una camera Neubauer al microscopio ottico con un obiettivo 40x.
  2. Per la conta differenziale, mettere 100 μL di BALF nell'imbuto cellulare contenente i vetrini e centrifugarlo a 22,86 x g per 5 minuti a 4 °C in una citocentrifuga, e colorare con May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) (vedi Tabella dei materiali). Procedere con la conta cellulare al microscopio ottico con obiettivo ad immersione.

5. Determinazione delle proteine totali in BALF

  1. Determinare la proteina surnatante totale di BALF con un kit di quantificazione delle proteine commerciale e leggere l'assorbanza a 562 nm utilizzando uno spettrofotometro seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).

6. Saggi di immunoassorbimento enzimatico

  1. Centrifugare BALF a 1.200 x g per 10 minuti a 4 °C. Quindi raccogliere il surnatante con una pipetta e conservarlo a -80 °C per i saggi di TNF-α, IL-1β, IL-6 e PGE215,23,25.
    NOTA: La centrifugazione al punto 6.1 rende il BALF privo di cellule.
    1. Eseguire i saggi delle citochine su BALF cell-free utilizzando un kit ELISA commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire il test PGE2 utilizzando un kit di immunodosaggio enzimatico (EIA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).

7. Colorazione e conteggio del corpo lipidico

  1. Fissare i leucociti sui vetrini di citospin utilizzando il 3,7% di formaldeide in soluzione salina tamponata di Hank libera da Ca 2+, Mg2+ (HBSS, pH 7,4) e colorare con l'1,5% di OsO4 mentre è ancora umido3 (vedi Tabella dei materiali). Quindi, contare i corpi lipidici per cellula in 50 leucociti consecutivi da ciascun vetrino utilizzando la lente dell'obiettivo a immersione in olio del microscopio.

8. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software grafici e statistici (vedi Tabella dei materiali). Esprimere i risultati come media ± SEM e analizzarli con Anova unidirezionale seguito da un Newman-Keuls-Studentpost-test 26. Si considerino le differenze significative quando P < 0,05.

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Representative Results

In un polmone non leso, la clearance del liquido alveolare avviene mediante il trasporto di ioni attraverso lo strato epiteliale alveolare intatto. Il gradiente osmotico trasporta il fluido dagli alveoli all'interstizio polmonare, dove viene drenato dai vasi linfatici o riassorbito. Na/K-ATPasi guida questo trasporto11. L'OA è un inibitore della Na/K-ATPasi27 e del canale del sodio 21, che può contribuire alla formazione dell'edema, come abbiamo già suggerito23. La risposta infiammatoria esacerbata nell'ARDS porta a danno alveolare, aumento della permeabilità endoteliale ed epiteliale e accumulo di liquido alveolare ricco di proteine e cellule infiammatorie, causando edema. L'edema provoca l'aumento della frequenza respiratoria da parte dei polmoni a causa dell'accumulo di liquido interstiziale e compromissione dello scambio gassoso, con conseguente ipossiemia e insufficienza respiratoria28. Le citochine come il TNF-α e il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) destabilizzano i legami VE-caderina, contribuendo ad aumentare la permeabilità endoteliale e l'accumulo di liquido alveolare7.

L'iniezione di OA ha aumentato i leucociti totali nelle vie intratracheali ed endovenose (Figura 3). Era necessario indurre l'OA per il danno polmonare per via endovenosa piuttosto che per via intratracheale. Il presente lavoro ha mostrato un aumento della conta dei neutrofili in BALF a 6 ore, con il picco a 24 ore e la diminuzione a 48 ore e 72 ore. Una maggiore concentrazione di IL-6, IL-1β e TNF-α nel BALF è stata osservata dopo 24 ore di instillazione intratracheale di OA23 (Figura 4). L'OA previene la clearance dell'edema e può innescare la formazione di edema ricco di proteine sia per via endovenosa che intratracheale15,23. L'edema polmonare è stato valutato mediante dosaggio delle proteine totali in BALF, dimostrando che la somministrazione endovenosa e i.t. ha aumentato la concentrazione proteica totale (Figura 5). I corpi lipidici sono organelli intracellulari contenenti substrato ed enzimi per la produzione di eicosanoidi 8,29. La formazione di corpi lipidici aumenta la produzione di mediatori lipidici e può essere utilizzata per accedere all'attivazione cellulare. L'iniezione intratracheale ed endovenosa di OA ha migliorato la formazione di corpi lipidici e la concentrazione di PGE2 23 dopo 24 ore (Figura 6). L'iniezione di OA ha anche indotto la rottura dei tessuti, l'emorragia e l'infiltrazione leucocitaria nelle vie intratracheali ed endovenose, come mostrato nell'istologia di colorazione dell'ematossilina e dell'eosina (H&E) (Figura 7). Inoltre, l'OA provoca un'alterazione della funzione polmonare19. Pertanto, il danno polmonare indotto dall'acido oleico presenta numerose caratteristiche dell'ARDS.

Figure 1
Figura 1: Le singole fasi del protocollo di somministrazione intratracheale . (A) Un topo viene anestetizzato con isofluorano al 5% e 2 L/min di O2 . (B) Un'incisione tracheale con una forbice chirurgica nei topi in posizione di decubito dorsale. (C) Instillazione intratracheale utilizzando una siringa da insulina. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Le singole fasi del protocollo di somministrazione endovenosa. (A) Un topo viene anestetizzato con il 5% di isofluorano e 2 L/min di O2. (B) Iniezione endovenosa utilizzando una siringa da insulina mediante il canto mediale. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La somministrazione di OA induce l'attivazione leucocitaria nel BALF dei topi. I leucociti totali in somministrazione endovenosa (e.v) e intratracheale (i.t) (A) e una fotomicrografia illustrativa (ingrandimento 1000x) in somministrazione intratracheale (i.t.) colorata con May-Grünwald-Giemsa (B) sono stati eseguiti 24 ore dopo il challenge OA. Barra della scala = 10 μm. Lo stesso volume di soluzione fisiologica sterile è stato somministrato al gruppo di controllo. Ogni barra rappresenta la media ± SEM di almeno sette animali. *P < 0,05, rispetto ai controlli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: La somministrazione intratracheale (i.t) di OA induce la produzione di mediatori infiammatori nel polmone dei topi. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) sono stati misurati 24 ore dopo il challenge. Al gruppo di controllo è stata somministrata soluzione fisiologica sterile. Ogni barra rappresenta la media ± SEM per almeno sei animali. *P < 0,05, rispetto ai controlli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Contenuto proteico totale in BALF 24 ore dopo l'iniezione di OA. La somministrazione intratracheale (i.t.) ed endovenosa (i.v.) di OA aumenta la proteina totale nel BALF dei topi. Il gruppo di controllo ha ricevuto lo stesso volume di soluzione fisiologica sterile. I risultati sono mezzi ± SEM di almeno sei animali diversi. *P < 0,0001, rispetto ai controlli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Formazione del corpo lipidico nei leucociti e produzione di PGE2 in BALF di topi trattati con OA. La somministrazione intratracheale (t) ed endovenosa (i.v) di OA induce mediatori infiammatori e l'accumulo di corpi lipidici nel BALF dei topi (A) e (B), rispettivamente. (C) Fotomicrografia illustrativa dei corpi lipidici (ingrandimento 1000x) colorati nei polmoni degli animali con tetrossido di osmio (OsO4) 24 ore dopo la stimolazione OA. Le frecce indicano i corpi lipidici. Barra della scala = 10 μm. I controlli hanno ricevuto lo stesso volume di soluzione fisiologica. I risultati sono mezzi ± SEM di sette animali. *P < 0,05, rispetto ai controlli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Istologia polmonare illustrativa nei topi . (A) Topi di controllo trattati con soluzione fisiologica e nessun segno di emorragia. (B) Somministrazione endovenosa di OA (i.v). (C) Somministrazione intratracheale (i.t) con alterazioni tissutali. È stata eseguita la colorazione H&E. Ingrandimento, 1000x. Barra graduata = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La selezione del modello ARDS corretto è essenziale per condurre gli studi preclinici e il valutatore deve considerare tutte le possibili variabili, come l'età, il sesso, le modalità di somministrazione e altre6. Il modello scelto deve riprodurre la malattia sulla base di fattori di rischio quali sepsi, embolia lipidica, ischemia-riperfusione del sistema vascolare polmonare e altri rischi clinici14. Tuttavia, nessun modello animale utilizzato per l'ARDS può ricreare tutte le caratteristiche della sindrome umana. Diversi modelli di agenti dannosi includono LPS, OA, acido cloridrico, batteri e virus6. Inoltre, vengono utilizzati diversi metodi di somministrazione, più comunemente, intratracheale, intranasale o endovenoso. Il modello di ischemia-riperfusione polmonare provoca la rottura capillare e l'accumulo della proteina6 intraalveolare. Il danno polmonare indotto da LPS è ampiamente utilizzato e porta a lesioni acute delle barriere epiteliali ed endoteliali. LPS si lega al recettore Toll-like 4 (TLR-4) nell'epitelio delle vie aeree innescando l'attivazione di NF-κB migliorando la produzione di citochine e chemochine, attirando le cellule infiammatorie30, che porta a una robusta alveolite neutrofila6. Tuttavia, il modello mostra variazioni tra ceppi e specie di animali, diminuendo la riproducibilità dei risultati negli animali per i pazienti umani con ARDS30.

Il modello di lesione da HCl imita l'ARDS mediante l'aspirazione del contenuto acido. Il basso pH nei polmoni induce una risposta infiammatoria acuta seguita da una lesione fibrotica tardiva. Il danno è neutrofilo-dipendente, causando emorragia alveolare, edema e compromissione della clearance dei liquidi. Tuttavia, gli esseri umani non aspirano solo HCl ma un contenuto gastrico complesso con un pH spesso superiore a 1,531. Questi e altri modelli ARDS sono stati ampiamente recensiti altrove31. Tra tutti i modelli utilizzati, il modello ARDS indotto dall'acido oleico è il più ideale14.

Il modello dell'oleato di sodio causa danni polmonari, induce l'apoptosi e la necrosi delle cellule alveolari e migliora la produzione di citochine come TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β e MIP-1α19. L'OA induce anche l'espressione di proteasi ed elastasi con emorragia che causa gravi lesioni polmonari25. L'OA riproduce la malattia a causa di embolia lipidica, aumento della permeabilità vascolare polmonare e liquido extravascolare con infiltrati radiografici32. Inoltre, i pazienti con ARDS hanno una maggiore concentrazione plasmatica di OA 15,22,24.

La somministrazione intratracheale di OA induce la produzione di mediatori infiammatori simile all'ARDS clinica e diminuisce la compliance polmonare e lo scambio di gas25,32. L'iniezione endovenosa di OA promuove gli aspetti istomorfologici e fisiologici della malattia32. L'albumina sierica è un potente ligando dell'OA, il che può spiegare perché questa via richiede una quantità di OA (10 μmol)15 più elevata rispetto a quella intratracheale (1,25 μmol)23 per indurre danni polmonari. Infatti, il nostro gruppo ha mostrato una correlazione tra lo squilibrio OA/albumina e un rischio di morte più elevato nei pazienti con leptospirosi33.

Come con ogni altro modello, ci sono alcuni svantaggi presentati nel modello. Se non somministrato sotto forma di sale, l'acido oleico può causare effetti tossici e variazioni dovute all'emulsione del sangue. Come dimostrato in questo articolo, l'utilizzo della sua forma salina diminuisce gli effetti tossici ed evita due problemi: la formazione di emboli e la fluttuazione del pH nel sangue e nei polmoni. Inoltre, assicura che la lesione polmonare sia causata dall'oleato e non da un effetto secondario15. Inoltre, la preparazione dell'acido oleico in forma salina in questo modello non richiede la coniugazione con l'albumina. Le ricerche mostrano gli effetti benefici dell'albumina nel ridurre l'infiammazione e la permeabilità vascolare. Inoltre, l'albumina ripristina l'emodinamica e la respirazione nei pazienti con lesioni polmonari. Pertanto, la coniugazione dell'albumina con l'OA potrebbe comprometterne l'impatto sull'animale, riducendo la vitalità dei modelli33,34.

A livello molecolare, l'oleato di sodio inibisce l'ATPasi sodio-potassio (NKA) e il canale del sodio (eNac), che compromettono il trasporto degli ioni, aumentando la permeabilità vascolare e la formazione di edema15. Inoltre, l'OA può legarsi al recettore 1 degli acidi grassi liberi (FFAR1), aumentando la concentrazione intracellulare di Ca 2+ , che innesca le proteine di segnalazione delle chinasi come PI3K e MAPK, portando all'attivazione del fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer delle cellule B attivate (NF-κB) e migliorando la risposta infiammatoria25.

In sintesi, sebbene nessun modello possa riprodurre completamente le caratteristiche dell'ARDS, sono strumenti preziosi per studiare la malattia. La ricerca preclinica è fondamentale per comprendere la fisiopatologia dell'ARDS e lo sviluppo di nuovi trattamenti. La somministrazione intratracheale ed endovenosa di OA, in forma salina, genera modelli di ARDS affidabili e riproducibili, rendendolo un modello d'oro per lo studio dell'ARDS.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata finanziata dall'Instituto Oswaldo Cruz, dalla Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), dalla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, dal Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), dall'Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), dalla Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), e il Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). La Figura 1 e la Figura 2 sono state create con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

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References

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Modello murino indotto da acido oleico sindrome da distress respiratorio acuto ARDS esposizione a sostanze inquinanti fumo di sigaretta agenti infettivi acidi grassi modelli animali meccanismo patologico limitazioni acido oleico (OA) effetti dannosi sul polmone lesioni polmonari emboli tessuto di interruzione alterazione del PH compromissione dell'eliminazione dell'edema danno endoteliale permeabilità alveolare infiammazione formazione ialina della membrana morte cellulare iniezione di OA (in forma salina) forma fisiologica di OA a PH 7
Modello murino di sindrome da distress respiratorio acuto indotto da acido oleico
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de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

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