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Biochemistry

कोशिकाओं और ऊतकों में ग्लूकोज अपटेक के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में बाह्य ग्लूकोज की कमी पूर्व विवो

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Human Sciences, The Ohio State University

Summary

फ्लोरोसेंटली लेबल ग्लूकोज की बाह्य कमी ग्लूकोज अपटेक के साथ सहसंबंधित होती है और इसका उपयोग एक्साइज्ड अंगों और सेल संस्कृतियों में ग्लूकोज अपटेक की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है।

Abstract

मधुमेह की चल रही विश्वव्यापी महामारी ग्लूकोज अपटेक को प्रभावित करने वाले पर्यावरणीय, पोषण, अंतःस्रावी, आनुवंशिक और एपिजेनेटिक कारकों की पहचान की मांग को बढ़ाती है। इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति का माप इन विट्रो में कोशिकाओं में फ्लोरोसेंटली-लेबल ग्लूकोज (एफडी-ग्लूकोज) के उत्थान का परीक्षण करने के लिए या विवो में ग्लूकोज-खपत ऊतकों की इमेजिंग के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। यह परख एक चुने हुए समय बिंदु पर ग्लूकोज तेज का आकलन करता है। इंट्रासेल्युलर विश्लेषण मानता है कि एफडी-ग्लूकोज का चयापचय अंतर्जात ग्लूकोज की तुलना में धीमा है, जो कैटाबोलिक और एनाबॉलिक प्रतिक्रियाओं और सिग्नलिंग में भाग लेता है। हालांकि, गतिशील ग्लूकोज चयापचय भी तेज तंत्र को बदल देता है, जिसके लिए विभिन्न कारकों के जवाब में ग्लूकोज अपटेक के गतिज माप की आवश्यकता होगी। यह लेख बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है और कोशिकाओं और ऊतकों में इंट्रासेल्युलर एफडी-ग्लूकोज तेज के साथ इसके सहसंबंध को मान्य करता है। बाह्य ग्लूकोज की कमी उच्च-थ्रूपुट गतिज और खुराक-निर्भर अध्ययनों के साथ-साथ ग्लाइसेमिक गतिविधि और उनके ऊतक-विशिष्ट प्रभावों के साथ यौगिकों की पहचान करने के लिए संभावित रूप से लागू हो सकती है।

Introduction

ग्लूकोज चयापचय पर निर्भर बीमारियों की एक भीड़ में महामारी वृद्धि को संबोधित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता के साथ ग्लूकोज अपटेक को मापने की मांग बढ़ जाती है। अपक्षयी चयापचय रोगों, न्यूरोलॉजिकल और संज्ञानात्मक विकारोंके अंतर्निहित तंत्र 1, भड़काऊ2 और संक्रामक रोग3, कैंसर 4,5, साथ ही उम्र बढ़ने6, ऊर्जा और इसके भंडारण, उपचय प्रक्रियाओं, प्रोटीन और जीन संशोधन, सिग्नलिंग, जीन के विनियमन, और न्यूक्लिक एसिड संश्लेषण और प्रतिकृति 7,8,9 के लिए ग्लूकोज चयापचय पर निर्भर करते हैं . मधुमेह मेलेटस (डीएम) सीधे ग्लूकोज अपटेक विनियमन की खराबी से संबंधित है। डीएम पुरानी बीमारियों का एक स्पेक्ट्रम है जैसे टाइप -1, -2, और -3 मधुमेह मेलेटस, गर्भकालीन मधुमेह, युवाओं की परिपक्वता-शुरुआत मधुमेह, और पर्यावरणीय और / या आनुवंशिक कारकों से प्रेरित इस बीमारी के अन्य प्रकार। 2016 में, मधुमेह पर पहली डब्ल्यूएचओ ग्लोबल रिपोर्ट से पता चला कि सबसे व्यापक डीएम के साथ रहने वाले वयस्कों की संख्या 1980 से लगभग चौगुनी होकर 422 मिलियनवयस्क10 हो गई है, और डीएम रोगियों की यह संख्या पिछले कुछ दशकों से तेजी से बढ़ रही है। अकेले 2019 में, 1.5 मिलियन मौतों का अनुमान सीधे डीएम10 के कारण हुआ था। यह नाटकीय उछाल टाइप -2 डीएम में वृद्धि और इसे चलाने वाली स्थितियों के कारण है, जिसमें अधिक वजन और मोटापा10 शामिल है। कोविड-19 महामारी ने सामान्य आबादी की तुलना में डीएम के रोगियों में मृत्यु दर में दो गुना वृद्धि का खुलासा किया, जो प्रतिरक्षा रक्षा में ग्लूकोज चयापचय की गहरी लेकिन खराब समझ वाली भूमिका का सुझावदेता है। डीएम, मोटापा और अन्य बीमारियों की रोकथाम, प्रारंभिक निदान और उपचार के लिए विभिन्न ऊतकों द्वारा ग्लूकोज अपटेक के माप के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और ग्लूकोज अपटेक को प्रभावित करने वाले पर्यावरण11, पोषण12, अंतःस्रावी13, आनुवंशिक14 और एपिजेनेटिक15 कारकों की पहचान की आवश्यकता होती है।

अनुसंधान में, ग्लूकोज के इंट्रासेल्युलर और / या ऊतक उत्थान को आमतौर पर फ्लोरोसेंटली-लेबल ग्लूकोज (एफडी-ग्लूकोज) द्वारा इन विट्रो 16,17,18 और विवो19 में मापा जाता है। एफडी-ग्लूकोज रेडियोधर्मी लेबल ग्लूकोज 20, विश्लेषणात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण21, चयापचय22, परमाणु चुंबकीय अनुनाद विधियों 23, और पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी / एफडी-ग्लूकोज अपटेक के विपरीत, अधिक जैविक सामग्री की आवश्यकता वाले विश्लेषणात्मक तरीकों में बहु-चरण नमूना तैयारी, महंगे उपकरण और जटिल डेटा विश्लेषण शामिल हो सकते हैं। सेल संस्कृतियों में एफडी-ग्लूकोज अपटेक के प्रभावी और सस्ती माप का उपयोग प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रयोगों में किया गया है और अन्य तरीकों से सत्यापन की आवश्यकता हो सकती है।

ग्लूकोज अपटेक अध्ययन के लिए एफडी-ग्लूकोज आवेदन का आधार अंतर्जात ग्लूकोज25 की तुलना में एफडी-ग्लूकोज का कम चयापचय है। बहरहाल, अंतर्जात ग्लूकोज और एफडी-ग्लूकोज दोनों को एनाबॉलिक, कैटाबोलिक और सिग्नलिंग प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए सभी सेलुलर डिब्बों के बीच गतिशील रूप से वितरित किया जाता है। एफडी-ग्लूकोज के कंपार्टमेंटलाइजेशन और समय-निर्भर प्रसंस्करण25 प्रतिदीप्ति माप में हस्तक्षेप करते हैं, और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रयोगों, गतिज विश्लेषण, 3 डी सेल संस्कृति, सह-संस्कृतियों और ऊतक एक्सप्लांट प्रयोगों में इस परख के उपयोग के लिए प्रमुख सीमित कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां, हम एफडी-ग्लूकोज की बाह्य कमी और इसके इंट्रासेल्युलर अपटेक के बीच एक उच्च सहसंबंध का प्रदर्शन करने वाले डेटा प्रदान करते हैं, जो इंट्रासेल्युलर ग्लूकोज अपटेक के लिए सरोगेट माप के रूप में एफडी-ग्लूकोज की बाह्य कमी का सुझाव देते हैं। ग्लूकोज की बाह्य कमी का माप इंसुलिन के साथ इलाज किए गए चूहों में ग्लूकोज अपटेक में ऊतक-विशिष्ट मतभेदों को मान्य करने के लिए लागू किया गया था और इस पद्धति का प्रमाण-सिद्धांत प्रदान करने के लिए एक प्रयोगात्मक दवा18 ।

वर्तमान प्रोटोकॉल 3 टी 3-एल 1 कोशिकाओं में एफडी-ग्लूकोज तेज के इंट्रासेल्युलर और बाह्य (चित्रा 1) माप का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल अनुभाग 1-7 48 घंटे के लिए कोशिकाओं की संस्कृति और विकास की व्याख्या करते हैं; सेल भुखमरी, उत्तेजना, और आधारभूत बाह्य माप; और बाह्य एफडी-ग्लूकोज और एफडी-ग्लूकोज और प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर माप के पोस्ट-उत्तेजना माप। प्रोटोकॉल अनुभाग 8 इंसुलिन और एमिनो एसिड यौगिक 2 (एएसी 2) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में ओबी / ओब चूहों से विच्छेदित ऊतकों में एफडी-ग्लूकोज के बाह्य कोशिकीय तेज के पूर्व विवो माप का वर्णनकरता है।

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Protocol

पशु अध्ययन ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी (ओएसयू, प्रोटोकॉल 2007 ए 0262-आर 4) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

नोट: सभी प्रक्रियाओं को ब्लोअर के साथ कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए और रोशनी बंद हो जाती है।

1. सामग्री की तैयारी

नोट: सभी सामग्रियों को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।

  1. कक्षा 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट में तालिका 1 के अनुसार मध्यम 1, सेंट्रीफ्यूजेशन मीडियम 2, और फ्लोरोसेंट 2-डीऑक्सी -2-[(7-नाइट्रो-2,1,3-बेंजोक्साडियाज़ोल-4-वाईएल) अमीनो]-डी-ग्लूकोज (2-एनबीडीजी या एफडी-ग्लूकोज) के भंडारण और कामकाजी समाधान तैयार करें। हुड के नीचे सभी रोशनी बंद करके पूरे प्रयोग में प्रकाश से एफडी-ग्लूकोज की रक्षा करें।
  2. उपयोग के लिए तैयार सेल संस्कृति अभिकर्मकों का उपयोग करें: ट्रिप्सिन-ईडीटीए, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), और ग्लूकोज मुक्त और फिनोल लाल मुक्त डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (इसके बाद, ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम)।
  3. रेडियोइम्यूनोप्रेसिपिटेशन परख (आरआईपीए) लाइसिस बफर के 20 मिलीलीटर का उपयोग करें।
    नोट: निम्नलिखित वर्गों में, विभिन्न एफडी-ग्लूकोज खुराक के बाह्य कोशिकीय कमी और इंट्रासेल्युलर तेज इंसुलिन उत्तेजना (चित्रा 2) के साथ और बिना 3 टी 3-एल 1 फाइब्रोब्लास्ट में तुलना की जाती है।

2. 3 टी 3-एल 1 सेल संस्कृति और रखरखाव

  1. संस्कृति 3 टी 3-एल 1 माउस फाइब्रोब्लास्ट चढ़ाना द्वारा 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं को दो96-अच्छी तरह से प्लेटों में मध्यम 1 के 20 मिलीलीटर में पतला किया जाता है। अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन की प्लेट 100 μL, मिश्रण द्वारा इस निलंबन की एकरूपता बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करता है। लगभग 70% -80% संगम तक मीडिया को बदलने के बिना 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (5% सीओ2 और 95% आर्द्रता) में 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  2. कोशिकाओं को संगम बनाए रखें और उन्हें 48 घंटे के लिए एक ही माध्यम में संवर्धन करके उपवास करें। वांछित उपवास अपचय अवस्था के आधार पर 24-72 घंटे से इनक्यूबेशन समय को अलग-अलग करें।

3. 3 टी 3-एल 1 कोशिकाओं की भुखमरी

  1. 96-अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं से डिकेंट मीडिया। बाँझ कागज तौलिए का उपयोग कर शेष तरल पदार्थ को अवशोषित करें।
  2. अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 100 μL के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेट कुल्ला और बाँझ कागज तौलिए के साथ शेष तरल पदार्थ को अवशोषित।
  3. अच्छी तरह से प्रति ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम के 100 μL जोड़ें और 40 मिनट के लिए सेते हैं। सेल प्रकार, उत्तेजनाओं और उपवास के वांछित स्तर के आधार पर इनक्यूबेशन के समय को समायोजित करें।
    नोट: इनक्यूबेशन के समय मौसम के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

4. विभिन्न सांद्रता के साथ एफडी-ग्लूकोज समाधान की तैयारी

नोट: चित्रा 2 में प्रयोग इंसुलिन के साथ उत्तेजना के साथ और बिना बाह्य और अंतरकोशिकीय मीडिया की जांच करता है।

  1. प्रत्येक उत्तेजना की स्थिति के लिए आठ प्रतिकृति (96-अच्छी तरह से प्लेट में एक पंक्ति) का उपयोग करें। इसलिए, प्रत्येक उत्तेजना की स्थिति के लिए 1 एमएल तैयार करें ( तालिका 2 और नीचे निर्दिष्ट)।
  2. इंसुलिन के बिना आठ उत्तेजना स्थितियों का उपयोग करें: एफडी-ग्लूकोज 2.5 μg / एमएल, 1 μg / एमएल, 0.5 μg / एमएल, 0.2 μg / एमएल, 0.1 μg / एमएल, 0.05 μg / एमएल, और 0 μg / एमएल (एफडी-ग्लूकोज के बिना नियंत्रण) एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में।
  3. इंसुलिन (10 μg / एमएल, अंतिम एकाग्रता) के साथ आठ उत्तेजना स्थितियों का उपयोग करें: 2.5 μg / एमएल, 1 μg / एमएल, 0.5 μg / एमएल, 0.2 μg / एमएल, 0.1 μg / एमएल, 0.05 μg / एमएल, और 0 μg / एमएल (एफडी-ग्लूकोज के बिना नियंत्रण) के एफडी-ग्लूकोज एक और 96-अच्छी प्लेट में।
  4. उत्तेजना की स्थिति तैयार करने के लिए, 1 एमएल काम करने वाले स्टॉक समाधान (1: 1000 कमजोर पड़ने या 5 μg / एमएल) प्राप्त करने के लिए ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम के 999 μL में 5 मिलीग्राम /
    1. इस वर्किंग स्टॉक समाधान का उपयोग करके, 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000, और 1:100,000 कमजोर पड़ने एफडी-ग्लूकोज के 2.5 μg / mL, 1 μg / एमएल, 0.5 μg / एमएल, 0.2 μg / एमएल, 0.2 μg / एमएल, 0.2 μg / एमएल, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.2 μg /
  5. चरण 4.4 दोहराएं और ऊपर निर्दिष्ट प्रत्येक स्थिति में इंसुलिन के 1 μL (10 मिलीग्राम / एमएल, अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    नोट: इन नमूनों में इंसुलिन की अंतिम एकाग्रता 10 μg/mL = 1.7 एनएमओएल/एमएल है। होमोजेनाइजेशन प्राप्त करने के लिए, अन्य समाधानों को जोड़ने से पहले ट्यूबों में इंसुलिन जोड़ें।

5. भूखे 3 टी 3-एल 1 कोशिकाओं का इलाज करना

  1. इनक्यूबेशन के 40 मिनट के बाद, 96-अच्छी तरह से प्लेटों में प्रत्येक कुएं से ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम को हटा दें और बाँझ पेपर तौलिए के साथ शेष तरल पदार्थ को अवशोषित करें।
  2. ऊपर वर्णित विभिन्न उपचार स्थितियों से प्रत्येक को एक स्तंभ के साथ कुओं में 100 μL (प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें, और 100 μL (प्रति अच्छी तरह से) एक ही उपचार की स्थिति से दोनों 96-अच्छी तरह से प्लेटों में पंक्ति (आठ प्रतिकृति) के साथ कुओं के लिए। उन प्लेटों को लेबल करें जो इंसुलिन के साथ और बिना स्थितियों का उपयोग करते हैं। नियंत्रण कुओं (एन = 8) में अकेले ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम जोड़ें।
  3. अंधेरे में एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता) में 40 मिनट के लिए प्लेट सेते हैं।

6. उत्तेजित 3 टी 3-एल 1 कोशिकाओं के लिए बाह्य और अंतरकोशिकीय माप

  1. कोशिकाओं को 40 मिनट के लिए उत्तेजित करने के बाद, दोनों प्लेटों से उत्तेजना मीडिया को एक ही प्रयोगात्मक लेआउट को बनाए रखने वाले नए 96-अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करें।
  2. बाँझ कागज तौलिए पर कोशिकाओं के साथ मूल उत्तेजित 96-अच्छी तरह से प्लेटों से किसी भी शेष समाधान को कम करें।
  3. वैकल्पिक रूप से, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस निकालें और बाँझ कागज तौलिए पर किसी भी शेष समाधान को हटा दें।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए आरआईपीए लाइसिस बफर के 100 μL जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन की रक्षा के लिए आरआईपीए बफर में प्रोटीज अवरोधक जोड़ें। आरआईपीए युक्त प्लेटों को 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन में रखें।
  5. एक माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके, क्रमशः 485 और 535 एनएम के उत्तेजना (पूर्व) और उत्सर्जन (ईएम) तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति को मापें, पहले बाह्य एफडी-ग्लूकोज युक्त माध्यम में, और फिर, 30 मिनट इनक्यूबेशन के अंत में आरआईपीए-लाइसेड कोशिकाओं के साथ प्लेट (चरण 6.4 देखें)।

7. इंट्रासेल्युलर ग्लूकोज अपटेक का प्रोटीन-आधारित सामान्यीकरण

नोट: इंट्रासेल्युलर एफडी-ग्लूकोज अपटेक सेल नंबर पर निर्भर करता है। सेलुलर लाइसेट्स में प्रोटीन का स्तर सेल नंबरों के आनुपातिक होते हैं जो प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं की संख्या के लिए इंट्रासेल्युलर एफडी-ग्लूकोज के स्तर को सामान्य करने की अनुमति देते हैं।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए प्रोटीन परख करें ( सामग्री की तालिका देखें)। आरआईपीए-लाइज्ड कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं में प्रोटीन सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  2. आरआईपीए होमोजेनेट के 10 μL का उपयोग करें और 96-अच्छी तरह से प्लेटों में माप की सटीकता बढ़ाने के लिए ट्रिप्लिकेट में प्रोटीन सांद्रता को मापें।
  3. प्रोटीन मानकों (0, 10, 20, 30, 40, 50, और 60 μg / एमएल प्रोटीन) के आधार पर प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें प्रत्येक 96-अच्छी तरह से प्लेट पर नमूनों के साथ विश्लेषण किया।
  4. 562 एनएम पर अवशोषण को मापें और प्रोटीन मानक के लिए प्राप्त रैखिक प्रतिगमन सूत्र के आधार पर प्रत्येक नमूने में प्रोटीन सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  5. प्रत्येक कुएं में फ्लोरोसेंट मूल्य / प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर एफडी-ग्लूकोज के स्तर को सामान्य करें। बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी को सामान्यीकरण की आवश्यकता नहीं होती है।
  6. वैकल्पिक रूप से, अतिरिक्त सामान्यीकरण (100%) के लिए नियंत्रण नमूनों में औसत आधारभूत मानों का उपयोग करें।

8. अंगों में बाह्य एफडी ग्लूकोज की कमी का पूर्व विवो माप

  1. अंग विच्छेदन से पहले ग्लूकोज चयापचय को उत्तेजित करने वाले यौगिकों के साथ प्रीट्रीट चूहों, निम्नानुसार।
  2. नौ सप्ताह के लेपओब नर चूहों का उपयोग करें (एन = 11)। प्रयोग से पहले एक नियमित चाउ आहार के साथ सभी चूहों फ़ीड।
  3. इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के लिए चूहों को बेतरतीब ढंग से तीन समूहों में असाइन करें।
    1. बाँझ पीबीएस (एन = 4) के 0.1 एमएल के साथ नियंत्रण लेपओबी समूह से चूहों को इंजेक्ट करें।
    2. बाँझ पीबीएस के 0.1 एमएल के साथ इंसुलिन लेपओबी समूह से चूहों को इंजेक्ट करें, जिसमें शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) (एन = 3) के प्रति ग्राम 12 आईयू मानव इंसुलिन होता है।
    3. बाँझ पीबीएस के 0.1 एमएल के साथ एएसी 2 लेपओब समूह से चूहों को इंजेक्ट करें, जिसमें शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) (एन = 4) के प्रति ग्राम 0.1 एनएमओएल एएसी 2 होता है।
  4. 15 मिनट के बाद, 5% आइसोफ्लूरेन के साँस लेना और संवेदनाहारी जानवरों से कार्डियक पंचर द्वारा रक्त को बाहर निकालना26.
  5. प्रत्येक जानवर से आंत के एपिडिडिमल सफेद वसा ऊतक (200 मिलीग्राम), यकृत (200 मिलीग्राम), और पूरे मस्तिष्क को विच्छेदित करें। ऊतक हैंडलिंग के लिए कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा हुड का उपयोग करें।
  6. प्रकाश के बिना कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम में एफडी-ग्लूकोज (0.29 एमएम) कामकाजी समाधान तैयार करें।
  7. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके क्रमशः 485 और 535 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एफडी-ग्लूकोज वर्किंग सॉल्यूशन (0.29 एमएम) के प्रतिदीप्ति को मापें।
  8. 1 मिनट के लिए पीबीएस युक्त एक 6 अच्छी तरह से प्लेट में कटा हुआ ऊतकों / प्रत्येक ऊतक या अंग को एक अलग कुएं में संभालें।
  9. 1 मिनट के बाद, पीबीएस को अवशोषित करने के लिए एक बाँझ कागज तौलिया पर प्रत्येक ऊतक रखें। अंगों को ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम के 4,000 μL युक्त एक अलग 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. 2 मिनट के बाद, 0.29 एमएम एफडी-ग्लूकोज कामकाजी समाधान (1 एमएल / अच्छी तरह से) युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में ऊतकों को हटा दें और स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ2 और 95% आर्द्रता) पर एफडी-ग्लूकोज कामकाजी समाधान में ऊतकों युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेटों सेते हैं।
  11. बाह्य एफडी ग्लूकोज की कमी के कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए, 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, और 120 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद प्रत्येक कुएं से एफडी-ग्लूकोज कामकाजी समाधान के 100 μL ले लीजिए। संग्रह से पहले और बाद में हिलाएं।
  12. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके क्रमशः 485 और 535 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति को मापने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेटों में एफडी-ग्लूकोज वर्किंग सॉल्यूशन के 100 μL को स्थानांतरित करें।
  13. प्रत्येक जानवर (चित्रा 3) में प्रत्येक अंग के लिए 0 मिनट मूल्य (100%) के लिए प्रतिदीप्ति को सामान्य करें।

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Representative Results

इंसुलिन उत्तेजना के साथ और बिना एफडी-ग्लूकोज (चित्रा 2) की विभिन्न सांद्रता के जवाब में इंट्रासेल्युलर सेवन और बाह्य ग्लूकोज की कमी को 3 टी 3-एल 1 प्रीडिपोसाइट्स में मापा गया था। चित्रा 2 ए एफडी-ग्लूकोज के इंट्रासेल्युलर अपटेक में खुराक-निर्भर वृद्धि को दर्शाता है, जो इंसुलिन की उपस्थिति में काफी बढ़ गया था। एक ही कोशिकाओं में बाह्य एफडी-ग्लूकोज में सहवर्ती कमी चित्रा 2 बी में दिखाई गई है, जहां इंसुलिन उत्तेजना ने इंसुलिन उत्तेजना के बिना नमूनों की तुलना में बाह्य एफडी-ग्लूकोज के स्तर में काफी कमी की है। एफडी-ग्लूकोज का इंट्रासेल्युलर सेवन इंसुलिन (चित्रा 2 सी) के साथ और बिना नमूनों में खुराक-निर्भर तरीके से एफडी-ग्लूकोज की बाह्य कमी के साथ सहसंबद्ध है। इस प्रकार, एफडी-ग्लूकोज की बाह्य कमी इंट्रासेल्युलर एफडी-ग्लूकोज अपटेक के रूप में तुलनीय सटीकता (आर2 = 0.99, पी < 0.001) के साथ ग्लूकोज अपटेक में परिवर्तन को माप सकती है।

अगला, ग्लूकोज अपटेक (चित्रा 3) के कैनोनिक और प्रयोगात्मक प्रेरक के साथ उत्तेजना पर विभिन्न ऊतकों की जांच करने वाले गतिज अध्ययनों में बाह्य एफडी-ग्लूकोज अपटेक एप्लिकेशन को मान्य करने के लिए एक प्रयोगात्मक सेटिंग विकसित की गई थी। हमने परिधीय ऊतकों में इंसुलिन प्रतिरोध के लेपओब माउस मॉडल का चयन किया, जिसमें आंत का सफेद वसा ऊतक27,28 शामिल है। इन चूहों में इंसुलिन के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्रतिक्रियाओं की तुलना उपन्यास यौगिक एएसी 2 के प्रभावों से की गई थी, जो लेप्टिन रिसेप्टर और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर जीएलयूटी 1 निर्भर तंत्र18 के माध्यम से परिधीय और तंत्रिका ऊतकों दोनों पर अभिनय करते हैं। लेपओब चूहों को इंसुलिन या एएसी 2 के साथ इंजेक्शन दिया गया था। इंजेक्शन के 15 मिनट बाद अंगों को विच्छेदित किया गया था। फिर, बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी के कैनेटीक्स का अध्ययन आंत की वसा, यकृत और मस्तिष्क पूर्व विवो (चित्रा 3) में किया गया था। परिधीय ऊतकों में रिपोर्ट इंसुलिन प्रतिरोध के साथ समझौते में, बाह्य एफडी ग्लूकोज इनक्यूबेशन (चित्रा 3 ए) के 120 मिनट के दौरान गैर-उत्तेजित नियंत्रण आंत वसा में समाप्त नहीं हुआ था। इसके विपरीत, विच्छेदन से पहले इंसुलिन या एएसी 2 के साथ चूहों के प्रीट्रीटमेंट ने क्रमशः 30 मिनट और 60 मिनट के समय अंतराल के भीतर बाह्य एफडी-ग्लूकोज की महत्वपूर्ण कमी का नेतृत्व किया।

ग्लूकोज का यकृत तेज ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों का उपयोग करता है, जिसमें जीएलयूटी 2 भी शामिल है, जो इंसुलिन उत्तेजना29,30 से स्वतंत्र है। तदनुसार, बाह्य एफडी-ग्लूकोज शुरू में गैर-उत्तेजित यकृत एक्सप्लांट्स (चित्रा 3 बी) की तुलना में इंसुलिन-उत्तेजित यकृत एक्सप्लांट्स में समाप्त नहीं हुआ था, हालांकि प्रारंभिक स्तर (0 मिनट) की तुलना में इंसुलिन के साथ उत्तेजित यकृत एक्सप्लांट में इनक्यूबेशन के 120 मिनट के बाद एफडी-ग्लूकोज की महत्वपूर्ण कमी देखी गई थी। दूसरी ओर, एएसी 2 के साथ प्रीट्रीटेड यकृत एक्सप्लांट्स में समय-निर्भर तरीके से बाह्य एफडी ग्लूकोज काफी कम हो गया था।

मस्तिष्क में, मुख्य ट्रांसपोर्टर अन्य ट्रांसपोर्टरों के बीच जीएलयूटी 1 है31. एफडी-ग्लूकोज की कमी कैनेटीक्स अन्य ऊतक (चित्रा 3 सी) की तुलना में मस्तिष्क में हड़ताली रूप से अलग था। ग्लूकोज की महत्वपूर्ण कमी इनक्यूबेशन के 60 मिनट (0 मिनट से 78% पर 100% से) के बाद गैर-इलाज मस्तिष्क युक्त बाह्य माध्यम में देखी गई थी। इंसुलिन-उपचारित लेपओब चूहों से दिमाग के साथ ऊष्मायन किए गए माध्यम ने एफडी-ग्लूकोज में मध्यम लेकिन महत्वपूर्ण रैखिक कमी (0 मिनट से 95% तक 100% से) दिखाई है। एएसी 2-उत्तेजित दिमाग पहले 20 मिनट के दौरान बाह्य एफडी-ग्लूकोज की गहरी तेजी से कमी का कारण बनता है (0 मिनट में 100% से 67.4%)। साथ में, बाह्य ग्लूकोज की कमी के माप विवो32 में इन ऊतकों में ग्लूकोज तेज में पहले से रिपोर्ट किए गए मतभेदों का समर्थन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी विधि का सिद्धांत। 96 अच्छी तरह से प्रारूप में सुसंस्कृत कोशिकाओं इस परख के लिए उपयुक्त हैं. जीवित रहने के लिए, कोशिकाएं ग्लूकोज लेती हैं और यह प्रवाह बाह्य ग्लूकोज के स्तर को कम करता है। एफडी-ग्लूकोज के साथ ग्लूकोज का प्रतिस्थापन इन परिवर्तनों की निगरानी की अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो में इंट्रासेल्युलर अपटेक के साथ सहसंबद्ध बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी 3 टी 3-एल 1 प्रीडिपोसाइट्स को इंसुलिन (1.7 एमएम; 40 मिनट इनक्यूबेशन) के साथ और बिना एफडी-ग्लूकोज की विभिन्न सांद्रता के साथ इनक्यूबेशन से पहले 40 मिनट के लिए ग्लूकोज मुक्त माध्यम में ऊष्मायन किया गया था। (ए, बी) नियंत्रण में एफडी-ग्लूकोज (ए) और बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी (बी) की खुराक-निर्भर तेज (यानी, इंसुलिन के बिना) (हैचेड बार) और इंसुलिन-उत्तेजित कोशिकाएं (काली सलाखें)। एफडी-ग्लूकोज अपटेक प्रोटीन सांद्रता द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। डेटा को एफडी-ग्लूकोज (मतलब एसडी, एन = 8 प्रति स्थिति) के बिना नियंत्रण में मापा गया मूल्य के% के रूप में दिखाया गया है। अप्रकाशित टी-टेस्ट द्वारा महत्व की जांच की गई थी। (सी) इंट्रासेल्युलर और बाह्य एफडी-ग्लूकोज (%) के बीच सहसंबंध (वर्ग) या (सर्कल) इंसुलिन के बिना (ए) और (बी) में वर्णित प्रयोगों में। पियर्सन सहसंबंध, पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न अंगों पूर्व विवो में बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी के कैनेटीक्स। (ए-सी) लेपओब चूहों को वाहन (पीबीएस, एन = 4), इंसुलिन (12 आईयू / किग्रा बीडब्ल्यू, एन = 3), और एएसी 2 (1 एनएमओएल / जी बीडब्ल्यू, एन = 3) के साथ इंजेक्ट किया गया था। 15 मिनट के बाद, ऊतकों विच्छेदित और पृथक थे। (ए) आंत की वसा, (बी) यकृत, और (सी) मस्तिष्क के एक्सप्लांट्स को एफडी-ग्लूकोज (0.29 एमएम) में ऊष्मायन किया गया था। बाह्य ग्लूकोज की कमी के कैनेटीक्स को अलग-अलग समय बिंदुओं पर माध्यम के विभाज्य में मापा गया था। डेटा (मतलब एसडी) इनक्यूबेशन के 0 मिनट में प्रत्येक अंग में प्रतिदीप्ति के% के रूप में दिखाया गया है। महत्व पी < 0.05, अप्रकाशित टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समाधान/मध्यम घटक
इथेनॉल: डीएमएसओ (1: 1 / इथेनॉल (200 μL) और डीएमएसओ (200 μL) 1-1.5 एमएल ट्यूब में; सेल संस्कृति ग्रेड इथेनॉल और डीएमएसओ का उपयोग करें
मध्यम 1 स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) (1 एमएल) और बछड़ा सीरम (10%) (10 एमएल) बाँझ 50 एमएल ट्यूब में
सेंट्रीफ्यूजेशन मीडियम 2 स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) (1%) और बोवाइन सीरम (10%) (10 एमएल) बाँझ 50 एमएल ट्यूब में
भंडारण एफडी-ग्लूकोज समाधान 5 मिलीग्राम / एमएल (14.5 एमएम) एफडी ग्लूकोज (1 मिलीग्राम) और इथेनॉल: डीएमएसओ (1: 1 / वी / वी) (200 μL) 0.5 एमएल ट्यूब में; -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, अधिमानतः आर्गन या नाइट्रोजन वायुमंडल के तहत
काम कर रहे एफडी ग्लूकोज समाधान 5 μg / एमएल (14.5 एमएम) भंडारण एफडी ग्लूकोज समाधान 5 मिलीग्राम / एमएल (1 μL), ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम (999 μL); प्रयोग से तुरंत पहले तैयारी करें।

तालिका 1: संस्कृति मीडिया और एफडी-ग्लूकोज समाधान की तैयारी।

तनूकरण नियंत्रण 1:2x103 1:5x103 1:1x104 1:2.5x104 1:5x104 1:1x105
एकाग्रता (μg/ 0 2.5 1 0.5 0.2 0.1 0.05
ग्लूकोज मुक्त डीएमईएम (μL) 1000 500 800 900 960 980 990
एफडी ग्लूकोज 5 μg/mL (μL) 0 500 200 100 40 20 10

तालिका 2: चित्रा 2 में दिखाए गए प्रयोगों के लिए विभिन्न सांद्रता के साथ एफडी-ग्लूकोज समाधान की तैयारी।

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Discussion

कोशिकाओं की संस्कृति में सामान्यीकृत इंट्रासेल्युलर ग्लूकोज अपटेक के साथ बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी की सीधी तुलना ने एक उच्च सहसंबंध दिखाया, यह सुझाव देते हुए कि बाह्य ग्लूकोज की कमी ग्लूकोज अपटेक मूल्यांकन के लिए एक सरोगेट माप हो सकती है। बाह्य एफडी-ग्लूकोज का माप एफडी ग्लूकोज सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कर सकता है, 0.5-2.5 μg एफडी-ग्लूकोज / बाह्य एफडी-ग्लूकोज को इंट्रासेल्युलर एफडी-ग्लूकोज अपटेक के लिए आवश्यक सेल नंबर या प्रोटीन सांद्रता के सामान्यीकरण की आवश्यकता नहीं होती है। बाह्य एफडी-ग्लूकोज माप की प्रत्याशित सीमा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों-उत्प्रेरण एजेंटों की जांच और एक्सप्लांट्स के भीतर रक्त के निशान हैं जो प्रतिदीप्ति को बुझा सकते हैं। प्रतिदीप्ति को प्रभावित करने वाले अन्य पर्यावरणीय कारकों, जैसे प्रकाश, पर भी विचार किया जाना चाहिए। कई ऊतक एक्सप्लांट्स का उपयोग करते समय आवश्यक लंबे समय तक हैंडलिंग समय ऊतक व्यवहार्यता और ग्लूकोज चयापचय से समझौता कर सकता है। यह एक अतिरिक्त सीमा हो सकती है। ऊतक के अंदर ग्लूकोज की पारगम्यता की अनुमति देने के लिए उत्सर्जित ऊतकों को एक छोटे आकार की सीमा (50-300 मिलीग्राम) में होना चाहिए। कई ऑपरेटरों द्वारा ऊतकों की एक साथ हैंडलिंग हैंडलिंग समय को कम कर सकती है। यद्यपि हमने ऊतक एक्सप्लांट्स के भीतर ग्लूकोज अपटेक को नहीं मापा, सुसंस्कृत ऊतक एक्सप्लांट्स में संचित टिप्पणियों से पता चलता है कि वे कार्यक्षमता33 के प्रगतिशील नुकसान के साथ ग्लूकोज युक्त माध्यम में 17 दिनों तक जीवित रहते हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक्सप्लांट्स के लिए कम इनक्यूबेशन समय अपेक्षाकृत कार्यात्मक ऊतकों में ग्लूकोज चयापचय की निगरानी की अनुमति देता है। जटिल सेलुलर संगठन वाले ऊतकों में, जैसे कि मस्तिष्क, आकार एक अनसुलझी सीमा प्रस्तुत करता है, क्योंकि जटिल ऊतक का विघटन और परिणामस्वरूप कोशिका मृत्यु ग्लूकोज तेज को प्रभावित करती है। हालांकि, 24 घंटे के लिए मस्तिष्क के इनक्यूबेशन का उपयोग पहले अंतर्जात नियामक तंत्र की पहचान के लिए किया गया है, जो ग्लूकोज युक्त माध्यम34 में एक्साइज्ड माउस मस्तिष्क की सापेक्ष शारीरिक कार्यक्षमता का समर्थन करता है। भले ही, सरलीकृत प्रक्रिया और बाह्य एफडी-ग्लूकोज की आसान पहुंच एक उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में इस परख का उपयोग करने की अनुमति दे सकती है। बुनियादी और इंसुलिन-उत्तेजित बाह्य एफडी-ग्लूकोज की कमी की तुलना से पता चलता है कि इस परख को ग्लूकोज अपटेक को विनियमित करने वाले हास्य, पोषण, रोगजनक, पर्यावरणीय कारकों या फार्मास्यूटिकल दवाओं की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है। यद्यपि यह परख खोज को सरल बनाती है, निष्कर्षों को मात्रात्मक रेडियोलेबलिंग के साथ सत्यापन की आवश्यकता होती है20 विश्लेषणात्मक विधियां 21,22,23 और / या इमेजिंग विधियां 5,24 मार्गों के कठोर यांत्रिक स्पष्टीकरण के लिए।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम ों में संगम और उपवास समय का अनुकूलन शामिल है जो बेसल और उत्तेजित एफडी-ग्लूकोज अपटेक दोनों को प्रभावित करता है। ये पैरामीटर लेखकों की टिप्पणियों के आधार पर मौसम से भी प्रभावित हो सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न सेल प्रकार ग्लूकोज अपटेक के लिए विशिष्ट तंत्र का उपयोग करते हैं जिसमें विभिन्न ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर और नियामक हार्मोन / रिसेप्टर इंटरैक्शन 32,35,36 शामिल हैं। इसलिए, इंसुलिन के अलावा अन्य सकारात्मक नियंत्रणों को इंसुलिन / जीएलयूटी 4 कुल्हाड़ियों द्वारा विनियमित मांसपेशियों या वसा ऊतक के अलावा अन्य ऊतकों का प्रतिनिधित्व करने वाले सेल संस्कृतियों के लिए विचार करने की आवश्यकता है। समस्या निवारण में सेल संगम को समायोजित करना और एफडी-ग्लूकोज के साथ उपवास / इसके अलावा, बाह्य कोशिकीय ग्लूकोज माप की संवेदनशीलता को बाह्य एफडी-ग्लूकोज के स्तर को कम करके सुधार किया जा सकता है, ग्लूकोज अपटेक के लिए आवश्यक थ्रेसहोल्ड स्तर को ध्यान में रखते हुए। चित्रा 2 में वर्णित प्रयोग शोधकर्ताओं को अन्य सेल संस्कृतियों या समस्या निवारण के साथ उपयोग के लिए इस परख को अनुकूलित करने में मदद कर सकता है।

ग्लूकोज चयापचय की आंतरिक परिवर्तनशीलता को भी उच्च नमूना आकार (एन = 5-8) की आवश्यकता होती है। यद्यपि एफडी-ग्लूकोज हानि के बाह्य माप ने प्रोटीन द्वारा सामान्यीकृत एफडी-ग्लूकोज के इंट्रासेल्युलर अपटेक के समान सटीकता का प्रदर्शन किया, सामान्यीकरण परख परिवर्तनशीलता को कम कर सकता है। प्रोटीन सांद्रता के माप के अलावा, सेल में डीएनए सामग्री का माप सेल नंबर37 का एक और विश्वसनीय सरोगेट मूल्यांकन हो सकता है।

बाह्य एफडी-ग्लूकोज गतिज माप के लिए सुलभ है। यहां, ग्लूकोज अपटेक के मध्यस्थों के लिए अंग-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के लिए बाह्य एफडी-ग्लूकोज के गतिज माप की एक सरल प्रक्रिया विकसित की गई है। ये पूर्व कृत्रिम परिवेशीय अध्ययन सीधे विवो में विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए अंग प्रतिक्रिया का परीक्षण कर सकते हैं जो एफडी-ग्लूकोज और पूर्व विवो गतिज माप के अंगों के संपर्क के साथ संयुक्त है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। यद्यपि पूर्व विवो अध्ययन विवो स्थितियों में पूरी तरह से समान नहीं हैं, लेकिन उनके कई फायदे हैं। अंग एक्सप्लांट जटिल बहुकोशिकीय प्राथमिक कोशिका संरचना को बनाए रखते हैं, अमर सेल संस्कृतियों के विपरीत परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हैं। आधुनिक दवा विकास मॉडल जीवों का उपयोग करता है, ट्रांसक्रिप्टोम या मेटाबोलोम22 के आधार पर ग्लूकोज अपटेक का अप्रत्यक्ष मूल्यांकन, व्यापक इंसुलिन क्लैंप तकनीक38, या महंगी इमेजिंग32। यद्यपि प्रत्यारोपित अंगों में बाह्य एफडी-ग्लूकोज का माप इन प्रौद्योगिकियों को प्रतिस्थापित नहीं करेगा, यह ऊतक-विशिष्ट तरीके से ग्लूकोज अपटेक को विनियमित करने वाले उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज की सुविधा के लिए यौगिक, मेटाबोलाइट और जीन का तेजी से मूल्यांकन प्रदान करेगा। विशिष्ट ऊतकों में ग्लूकोज चयापचय को संबोधित करने वाले सुरक्षित उपचारों का विकास कैंसर, मनोभ्रंश, उम्र बढ़ने, मधुमेह, ऑटोइम्यून बीमारियों, मोटापे और अन्य संबंधित अनुप्रयोगों के लिए एक समाधान प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई मुद्दा नहीं है और हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था राल्फ और मैरियन फॉक मेडिकल रिसर्च कैटेलिस्ट अवार्ड तथा कैथलीन केली अवार्ड। अन्य समर्थनों में नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्सेज यूएल 1 आरआर 025755 और एनसीआई पी 30 सीए 16058 (ओएसयूसीसीसी), चिकित्सा अनुसंधान के लिए एनआईएच रोडमैप शामिल थे। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्सेज या एनआईएच के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts ATCC CL-173 Cell line
96-well plates Falcon 353227 Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice Jackson Laboratory stock number 000632 Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) Fisher Scientific, US  B-SHT Device
Bovine serum Gibco/ThermoFisher 161790-060 Cell culture
Calf serum Gibco/ThermoFisher 26010-066 Cell culture
Cell incubator Forma Series II Water Jacket Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated) Envigo Teklad LM-485 Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma LifeScience D2650-100mL Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco/ThermoFisher  11965-092 Cell culture
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500mL Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) Sigma 72987-1MG Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM Gibco/ThermoFisher A14430-01 Cell culture
Human insulin 10 mg/mL MilliporeSigma, Cat N 91077C Cat N 91077C Reagent
Isoflurane, 5% Henry Schein NDC 11695-6776-2 Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco/ThermoFisher 15140-122 Cell culture
Phosphate buffered solution Sigma-Aldrich DA537-500 mL Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay ThermoFisher Cat N23225 Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer Santa Cruz Biotechnology sc-24948 Assay
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco/ThermoFisher  25300-054 Cell culture

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References

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जैव रसायन अंक 182
कोशिकाओं और ऊतकों में ग्लूकोज अपटेक के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में बाह्य ग्लूकोज की कमी <em>पूर्व विवो</em>
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Kumar, S. B., Arnipalli, S.,… More

Kumar, S. B., Arnipalli, S., Abushukur, A., Carrau, S., Mehta, P., Ziouzenkova, O. Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo. J. Vis. Exp. (182), e63681, doi:10.3791/63681 (2022).

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