Summary
El agotamiento extracelular de la glucosa marcada fluorescentemente se correlaciona con la absorción de glucosa y podría usarse para la detección de alto rendimiento de la absorción de glucosa en órganos extirpados y cultivos celulares.
Abstract
La epidemia mundial de diabetes en curso aumenta la demanda de identificación de factores ambientales, nutricionales, endocrinos, genéticos y epigenéticos que afectan la absorción de glucosa. La medición de la fluorescencia intracelular es un método ampliamente utilizado para probar la absorción de glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) en células in vitro, o para obtener imágenes de tejidos que consumen glucosa in vivo. Este ensayo evalúa la absorción de glucosa en un punto de tiempo elegido. El análisis intracelular asume que el metabolismo de la glucosa DF es más lento que el de la glucosa endógena, que participa en las reacciones catabólicas y anabólicas y en la señalización. Sin embargo, el metabolismo dinámico de la glucosa también altera los mecanismos de absorción, lo que requeriría mediciones cinéticas de la absorción de glucosa en respuesta a diferentes factores. Este artículo describe un método para medir el agotamiento extracelular de la DF-glucosa y valida su correlación con la absorción intracelular de FD-glucosa en células y tejidos ex vivo. El agotamiento extracelular de la glucosa puede ser potencialmente aplicable para estudios cinéticos y dependientes de la dosis de alto rendimiento, así como para identificar compuestos con actividad glucémica y sus efectos específicos del tejido.
Introduction
La demanda para medir la absorción de glucosa aumenta junto con la necesidad crítica de abordar un aumento epidémico en una multitud de enfermedades dependientes del metabolismo de la glucosa. Los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas degenerativas, los trastornos neurológicos y cognitivos1, las enfermedades inflamatorias2 e infecciosas3, el cáncer 4,5, así como el envejecimiento6, dependen del metabolismo de la glucosa para obtener energía y su almacenamiento, los procesos anabólicos, la modificación de proteínas y genes, la señalización, la regulación de genes y la síntesis y replicación de ácidos nucleicos 7,8,9 . La diabetes mellitus (DM) está directamente relacionada con el mal funcionamiento de la regulación de la absorción de glucosa. La DM es un espectro de enfermedades crónicas como la diabetes mellitus tipo 1, -2 y -3, la diabetes gestacional, la diabetes de inicio en la madurez de los jóvenes y otros tipos de esta enfermedad inducida por factores ambientales y / o genéticos. En 2016, el primer informe mundial de la OMS sobre la diabetes demostró que el número de adultos que viven con la DM más extendida casi se ha cuadruplicado desde 1980 a 422 millones de adultos10, y este número de pacientes con DM ha aumentado exponencialmente durante las últimas décadas. Solo en 2019, una estimación de 1,5 millones de muertes fue causada directamente por DM10. Este aumento dramático se debe al aumento de la DM tipo 2 y las condiciones que la impulsan, incluido el sobrepeso y la obesidad10. La pandemia de COVID-19 reveló un aumento de dos veces en la mortalidad en pacientes con DM en comparación con la población general, lo que sugiere el papel profundo pero poco conocido del metabolismo de la glucosa en la defensa inmune3. La prevención, el diagnóstico temprano y el tratamiento de la DM, la obesidad y otras enfermedades requieren la optimización de las mediciones de la absorción de glucosa por diferentes tejidos y la identificación de los factores ambientales11,nutricionales 12, endocrinos 13,genéticos 14 y epigenéticos15 que afectan la absorción de glucosa.
En la investigación, la absorción intracelular y/o tisular de glucosa se mide comúnmente mediante glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) in vitro 16,17,18 e in vivo19. La glucosa FD se convirtió en un método preferido en comparación con los métodos más precisos que utilizan glucosa20 marcada radiactivamente, análisis analítico de espectroscopiade masas 21, metabolómica22, métodos de resonancia magnética nuclear23 y tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT)5,24. A diferencia de la absorción de glucosa FD, los métodos analíticos que requieren más material biológico pueden implicar una preparación de muestras de varios pasos, instrumentos costosos y análisis de datos complejos. Las mediciones efectivas y económicas de la absorción de glucosa FD en cultivos celulares se han utilizado en experimentos de prueba de concepto y pueden requerir la validación por otros métodos.
La base de la aplicación de DF-glucosa para los estudios de captación de glucosa es la reducción del metabolismo de la glucosa-DF en comparación con la glucosa endógena25. Sin embargo, tanto la glucosa endógena como la glucosa FD se distribuyen dinámicamente entre todos los compartimentos celulares para su uso en procesos anabólicos, catabólicos y de señalización. La compartimentación y el procesamiento dependiente del tiempo25 de la glucosa FD interfieren con las mediciones de fluorescencia y representan los principales factores limitantes para el uso de este ensayo en experimentos de detección de alto rendimiento, análisis cinético, cultivo celular 3D, cocultivos y experimentos de explante de tejidos. Aquí, proporcionamos datos que demuestran una alta correlación entre el agotamiento extracelular de la glucosa FD y su absorción intracelular, lo que sugiere el agotamiento extracelular de la glucosa FD como una medida sustituta para la absorción de glucosa intracelular. La medición del agotamiento extracelular de la glucosa se aplicó para validar las diferencias específicas del tejido en la absorción de glucosa en ratones tratados con insulina y un fármaco experimental18 para proporcionar una prueba de principio de este método.
El protocolo actual describe mediciones intracelulares y extracelulares (Figura 1) de la absorción de glucosa FD en células 3T3-L1. Las secciones 1-7 del protocolo explican el cultivo y el crecimiento de las células durante 48 h; inanición celular, estimulación y mediciones extracelulares basales; y mediciones posteriores a la estimulación de la FD-glucosa extracelular y mediciones intracelulares de la FD-glucosa y la proteína. La sección 8 del protocolo describe la medición ex vivo de la captación extracelular de FD-glucosa en tejidos diseccionados de ratones ob/ob en presencia y ausencia de insulina y compuesto de aminoácidos 2 (AAC2) descrita en otra parte18.
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Protocol
Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II con el soplador encendido y las luces apagadas.
1. Preparación de materiales
NOTA: Todos los materiales se enumeran en la Tabla de materiales.
- Preparar el Medio 1, el Medio de centrifugación 2 y las soluciones de almacenamiento y trabajo de 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) amino]-D-glucosa (2-NBDG o FD-glucosa) según la Tabla 1 en un gabinete de bioseguridad de Clase II. Proteja la FD-glucosa de la luz durante todo el experimento apagando todas las luces debajo del capó.
- Use reactivos de cultivo celular listos para usar: Tripsina-EDTA, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Medio Águila Modificada de Dulbecco libre de glucosa y fenol sin rojo (en adelante, DMEM sin glucosa).
- Utilice 20 ml de tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA).
NOTA: En las siguientes secciones, se compara el agotamiento extracelular y la absorción intracelular de diferentes dosis de FD-glucosa en fibroblastos 3T3-L1 con y sin estimulación con insulina (Figura 2).
2. Cultivo y mantenimiento celular 3T3-L1
- Cultivo de fibroblastos de ratón 3T3-L1 mediante el recubrimiento de 1 x 106 células diluidas en 20 mL de Medio 1 en dos placas de 96 pocillos. Placa 100 μL de suspensión celular por pocillo, asegurando mantener la homogeneidad de esta suspensión mediante mezcla. Cultivar células durante 48 h en una incubadora de 37 °C (5% de CO2 y 95% de humedad) sin cambiar de medio hasta aproximadamente un 70%-80% de confluencia.
- Mantener las células confluentes y en ayunas cultivándolas en el mismo medio durante 48 h. Variar el tiempo de incubación de 24-72 h dependiendo del estado catabólico de ayuno deseado.
3. Inanición de células 3T3-L1
- Medios de decantación de las células en las placas de 96 pocillos. Absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.
- Enjuague la placa de 96 pocillos con 100 μL de PBS por pozo y absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.
- Añadir 100 μL de DMEM libre de glucosa por pocillo e incubar durante 40 min. Ajuste el tiempo de incubación según el tipo de célula, los estímulos y el nivel deseado de ayuno.
NOTA: El tiempo de incubación puede requerir optimización dependiendo de la temporada.
4. Preparación de soluciones de FD-glucosa con diferentes concentraciones
NOTA: El experimento de la Figura 2 examina los medios extracelulares e intercelulares con y sin estimulación con insulina.
- Use ocho réplicas (una fila en una placa de 96 pocillos) para cada condición de estimulación. Por lo tanto, prepare 1 ml para cada condición de estimulación (especificada en la Tabla 2 y más abajo).
- Use ocho condiciones de estimulación sin insulina: FD-glucosa de 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL y 0 μg/mL (control sin FD-glucosa) en una placa de 96 pocillos.
- Utilice ocho condiciones de estimulación con insulina (10 μg/mL, concentración final): FD-glucosa de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL y 0 μg/mL (control sin FD-glucosa) en otra placa de 96 pocillos.
- Para preparar las condiciones de estimulación, diluya 1 μL de solución de trabajo de 5 mg/ml de FD-glucosa (Tabla 1) en 999 μL de DMEM libre de glucosa para obtener 1 ml de solución de material de trabajo (dilución de 1:1000 o 5 μg/ml).
- Con esta solución de material de trabajo, prepare diluciones de FD-glucosa 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 y 1:100.000 para obtener 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL y 0,05 μg/mL (Tabla 2) en tubos de 2 mL inmediatamente antes de los experimentos en un gabinete de bioseguridad sin luces.
- Repita el paso 4.4 y agregue 1 μL de insulina (10 mg/ml, concentración final) a cada una de las condiciones especificadas anteriormente.
NOTA: La concentración final de insulina en estas muestras es de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Para lograr la homogeneización, agregue insulina a los tubos antes de agregar otras soluciones.
5. Tratamiento de células 3T3-L1 hambrientas
- Después de 40 min de incubación, decantar el DMEM libre de glucosa de cada pozo en placas de 96 pocillos y absorber el líquido restante con toallas de papel estériles.
- Agregue 100 μL (por pozo) cada uno de las diversas condiciones de tratamiento descritas anteriormente a los pozos a lo largo de una columna, y 100 μL (por pozo) de la misma condición de tratamiento a los pozos a lo largo de la fila (ocho réplicas) en ambas placas de 96 pocillos. Etiquete las placas que utilizaron las condiciones con y sin insulina. Agregue DMEM libre de glucosa solo a los pocillos de control (n = 8).
- Incubar la placa durante 40 min en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad) en la oscuridad.
6. Mediciones extracelulares e intercelulares para células 3T3-L1 estimuladas
- Después de que las células hayan sido estimuladas durante 40 minutos, transfiera los medios de estimulación de ambas placas a nuevas placas de 96 pocillos manteniendo el mismo diseño experimental.
- Decantar cualquier solución restante de las placas originales estimuladas de 96 pocillos con células en toallas de papel estériles.
- Opcionalmente, lave las células con PBS. Retire el PBS y decante cualquier solución restante en toallas de papel estériles.
- Añadir 100 μL del tampón de lisis RIPA a cada pocillo. Opcionalmente, agregue el inhibidor de la proteasa al tampón RIPA para proteger las proteínas. Coloque las placas que contienen RIPA en un agitador durante 30 min.
- Utilizando un lector de microplacas (Tabla de Materiales), mida la fluorescencia en longitudes de onda de excitación (Ex) y emisión (Em) de 485 y 535 nm, respectivamente, primero en el medio que contiene FD-glucosa extracelular, y luego, la placa con células lisadas con RIPA al final de la incubación de 30 minutos (ver paso 6.4).
7. Normalización basada en proteínas de la absorción intracelular de glucosa
NOTA: La absorción intracelular de FD-glucosa depende del número de células. Los niveles de proteínas en los lisados celulares son proporcionales a los números celulares que permiten normalizar los niveles intracelulares de FD-glucosa al número de células en cada pozo.
- Realice el ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Cuantificar las concentraciones de proteínas en cada pocillo que contenga células lisadas con RIPA.
- Utilice 10 μL del homogeneizado RIPA y mida las concentraciones de proteínas por triplicado para aumentar la precisión de las mediciones en placas de 96 pocillos.
- Cuantificar la proteína en función de los estándares de proteínas (proteína 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 μg/ml) analizadas junto con muestras en cada placa de 96 pocillos.
- Medir la absorbancia a 562 nm y cuantificar las concentraciones de proteínas en cada muestra en función de la fórmula de regresión lineal obtenida para el estándar de proteínas.
- Normalizar los niveles de FD-glucosa intracelular mediante el uso de valor fluorescente/concentración de proteínas en cada pocillo. El agotamiento extracelular de la DF-glucosa no requiere normalización.
- Opcionalmente, utilice los valores basales medios en muestras de control para una normalización adicional (100%).
8. Medición ex vivo del agotamiento extracelular de la glucosa FD en órganos
- Pretratar ratones con compuestos que estimulen el metabolismo de la glucosa antes de la disección de órganos, de la siguiente manera.
- Use ratones machos Lepob de nueve semanas de edad (n = 11). Alimente a todos los ratones con una dieta regular de chow antes del experimento.
- Asigne ratones al azar en tres grupos para inyecciones intraperitoneales (i.p.).
- Inyectar ratones del grupo control Lepob con 0,1 ml de PBS estéril (n = 4).
- Inyectar ratones del grupo de insulina Lepob con 0,1 ml de PBS estéril, que contiene 12 UI de insulina humana por gramo de peso corporal (BW) (n = 3).
- Inyectar ratones del grupo AAC2 Lepob con 0,1 ml de PBS estéril, que contenga 0,1 nmol AAC2 por gramo de peso corporal (BW) (n = 4).
- Después de 15 min, someter a los ratones a la inhalación de isoflurano al 5% y sangre exsanguinada por punción cardíaca de los animales anestesiados26.
- Diseccionar el tejido adiposo blanco epididemal visceral (200 mg), el hígado (200 mg) y todo el cerebro de cada animal. Utilice una campana de bioseguridad de Clase II para el manejo de tejidos.
- Preparar la solución de trabajo de FD-glucosa (0,29 mM) en DMEM libre de glucosa en un gabinete de Bioseguridad Clase II sin luz.
- Mida la fluorescencia de la solución de trabajo de FD-glucosa (0,29 mM) a longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente, utilizando un lector de microplacas.
- Incubar los tejidos/órganos cosechados en una placa de 6 pocillos que contenga PBS durante 1 min. Maneje cada tejido u órgano en un pozo separado.
- Después de 1 min, coloque cada pañuelo en una toalla de papel estéril para absorber PBS. Transfiera tejidos/órganos a una placa separada de 6 pocillos que contenga 4.000 μL de DMEM libre de glucosa e incube durante 2 min.
- Después de 2 min, retire y transfiera los tejidos a los pocillos de una placa de 6 pocillos que contenga 0,29 mM de solución de trabajo de FD-glucosa (1 ml/pomo). Incubar las placas de 6 pocillos que contienen tejidos en solución de trabajo de glucosa FD a 37 °C (5% de CO2 y 95% de humedad).
- Recolectar 100 μL de solución de trabajo de glucosa FD de cada pozo después de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 min de incubación, para analizar la cinética del agotamiento extracelular de la glucosa FD. Agitar antes y después de la recolección.
- Transfiera 100 μL de solución de trabajo de glucosa FD a placas de 96 pocillos para medir la fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente, utilizando un lector de microplacas.
- Normalizar la fluorescencia al valor de 0 min (100%) para cada órgano en cada animal (Figura 3).
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Representative Results
La ingesta intracelular y el agotamiento extracelular de glucosa se midieron en preadipocitos 3T3-L1, en respuesta a diferentes concentraciones de DF-glucosa (Figura 2) con y sin estimulación con insulina. La Figura 2A demuestra un aumento dependiente de la dosis en la absorción intracelular de FD-glucosa, que aumentó significativamente en presencia de insulina. La disminución concomitante de la glucosa FD extracelular en las mismas células se muestra en la Figura 2B, donde la estimulación con insulina condujo a una disminución significativa de los niveles extracelulares de FD-glucosa en comparación con las muestras sin estimulación con insulina. La ingesta intracelular de FD-glucosa se correlacionó con el agotamiento extracelular de FD-glucosa de manera dosis-dependiente en muestras con y sin insulina (Figura 2C). Por lo tanto, el agotamiento extracelular de la glucosa FD puede medir un cambio en la absorción de glucosa con una precisión comparable (R2 = 0,99, P < 0,001) como la absorción intracelular de FD-glucosa.
A continuación, se desarrolló un entorno experimental para validar la aplicación de la absorción extracelular de FD-glucosa en estudios cinéticos que examinaron diferentes tejidos tras la estimulación con inductores canónicos y experimentales de la absorción de glucosa (Figura 3). Se seleccionó el modelo de ratón Lepob de resistencia a la insulina en tejidos periféricos, incluyendo tejido adiposo blanco visceral27,28. Las respuestas bien establecidas a la insulina en estos ratones se compararon con los efectos del nuevo compuesto AAC2, que actúa sobre los tejidos periféricos y nerviosos a través de los mecanismos dependientes del receptor de leptina y el transportador de glucosa GLUT118. A los ratones Lepob se les inyectó insulina o AAC2. Los órganos fueron diseccionados 15 minutos después de la inyección. Luego, se estudió la cinética del agotamiento extracelular de la FD-glucosa en grasa visceral, hígado y cerebro ex vivo (Figura 3). De acuerdo con la resistencia a la insulina reportada en tejidos periféricos, la FD-glucosa extracelular no se agotó en la grasa visceral de control no estimulada durante 120 min de incubación (Figura 3A). Por el contrario, el pretratamiento de ratones con insulina o AAC2 antes de la disección condujo a un agotamiento significativo de la glucosa FD extracelular en un intervalo de tiempo de 30 min y 60 min, respectivamente.
La absorción hepática de glucosa utiliza transportadores de glucosa, incluido GLUT2, que es independiente de la estimulación con insulina29,30. En consecuencia, la FD-glucosa extracelular no se agotó inicialmente en los explantes hepáticos estimulados por insulina en comparación con los explantes hepáticos no estimulados (Figura 3B), aunque se observó un agotamiento significativo de la glucosa FD después de 120 min de incubación en el explante hepático estimulado con insulina en comparación con los niveles iniciales (0 min). Por otro lado, la glucosa HF extracelular se redujo significativamente de manera dependiente del tiempo en explantes hepáticos pretratados con AAC2.
En el cerebro, el principal transportador es GLUT1 entre otros transportadores31. La cinética de agotamiento de la glucosa FD fue sorprendentemente diferente en el cerebro en comparación con otros tejidos (Figura 3C). El agotamiento significativo de la glucosa se observó en el medio extracelular que contiene el cerebro no tratado después de 60 min de incubación (del 100% a 0 min al 78%). El medio incubado con cerebros de ratones Lepob tratados con insulina ha mostrado una disminución lineal moderada pero significativa de la glucosa FD (del 100% a los 0 min al 95%). Los cerebros estimulados por AAC2 conducen a una profunda disminución rápida de la glucosa FD extracelular durante los primeros 20 minutos (del 100% a los 0 minutos al 67,4%). En conjunto, las mediciones del agotamiento extracelular de la glucosa apoyan las diferencias previamente informadas en la absorción de glucosa en estos tejidos in vivo32.
Figura 1: Principio del método extracelular de agotamiento de la DF-glucosa. Las células cultivadas en formato de 96 pocillos son adecuadas para este ensayo. Para sobrevivir, las células absorben glucosa y esta afluencia disminuye los niveles de glucosa extracelular. La sustitución de la glucosa por FD-glucosa permite monitorizar estos cambios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El agotamiento de la glucosa FD extracelular se correlacionó con la captación intracelular in vitro. Los preadipocitos 3T3-L1 se incubaron en un medio libre de glucosa durante 40 min antes de la incubación con diferentes concentraciones de FD-glucosa con y sin insulina (1,7 mM; 40 min de incubación). (A, B) La absorción dependiente de la dosis de FD-glucosa (A) y el agotamiento extracelular de FD-glucosa (B) en control (es decir, sin insulina) (barras eclosionadas) y células estimuladas por insulina (barras negras). La absorción de glucosa FD se normalizó por las concentraciones de proteínas. Los datos se muestran como % del valor medido en control incubado sin FD-glucosa (MEDIA SD, n = 8 por condición). La significación se examinó mediante una prueba t no apareada. (C) Correlación entre las medidas intracelulares y extracelulares de DF-glucosa (%) con (cuadrados) o sin (círculos) insulina en experimentos descritos en (A) y (B). Correlación de Pearson, P < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cinética del agotamiento extracelular de la FD-glucosa en diferentes órganos ex vivo. (A-C) A los ratones Lepob se les inyectó vehículo (PBS, n = 4), insulina (12 UI/kg de peso corporal, n = 3) y AAC2 (1 nmol/g de peso corporal, n = 3). Después de 15 min, los tejidos fueron diseccionados y aislados. Los explantes de (A) grasa visceral, (B) hígado y (C) cerebro se incubaron en FD-glucosa (0,29 mM). La cinética del agotamiento extracelular de la glucosa se midió en alícuotas del medio en diferentes puntos temporales. Los datos (DE media) se muestran como % de fluorescencia en cada órgano a los 0 min de incubación. Significancia P < 0,05, prueba t no apareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución/Medio | Componentes |
| Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) | Etanol (200 μL) y DMSO (200 μL) en tubo de 1-1,5 ml; utilizar etanol de grado de cultivo celular y DMSO |
| Medio 1 | DMEM (89 ml), penicilina/estreptomicina (1%) (1 ml) y suero de ternero (10%) (10 ml) en tubo estéril de 50 ml |
| Medio de centrifugación 2 | DMEM (89 mL), Penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) y Suero bovino (10%) (10 mL) en tubo estéril de 50 mL |
| Almacenamiento FD-solución de glucosa 5 mg/ml (14,5 mM) | Glucosa FD (1 mg) y etanol: DMSO (1: 1 / v / v) (200 μL) en tubo de 0,5 ml; conservar a -80 °C, preferentemente bajo atmósfera de argón o nitrógeno |
| Solución de fluor glucosa de trabajo 5 μg/ml (14,5 mM) | Almacenamiento FD solución de glucosa 5 mg/ml (1 μL), DMEM libre de glucosa (999 μL); preparar inmediatamente antes del experimento. |
Tabla 1: Preparación de medios de cultivo y soluciones de FD-glucosa.
| Dilución | Control | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentración (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| DMEM libre de glucosa (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glucosa 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tabla 2: Preparación de soluciones de FD-glucosa con diferentes concentraciones para experimentos mostrados en la Figura 2.
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Discussion
La comparación directa del agotamiento extracelular de la glucosa FD con la absorción normalizada de glucosa intracelular en el cultivo celular mostró una alta correlación, lo que sugiere que el agotamiento extracelular de la glucosa podría ser una medida sustituta para la evaluación de la absorción de glucosa. La medición de la glucosa FD extracelular puede utilizar una amplia gama de concentraciones de glucosa FD, también 0.5-2.5 μg FD-glucosa / ml parecen proporcionar el rango óptimo. La FD-glucosa extracelular no requiere normalización al número celular o a las concentraciones de proteínas necesarias para la absorción intracelular de FD-glucosa. La limitación anticipada de las mediciones extracelulares de FD-glucosa es la investigación de agentes inductores de especies reactivas de oxígeno y los rastros de sangre dentro de los explantes que pueden apagar la fluorescencia. También se deben considerar otros factores ambientales que afectan la fluorescencia, como la luz. El tiempo de manipulación prolongado requerido mientras se usan múltiples explantes de tejido puede comprometer la viabilidad del tejido y el metabolismo de la glucosa. Esto podría ser una limitación adicional. Los tejidos extirpados deben estar en un rango de tamaño pequeño (50-300 mg) para permitir la permeabilidad de la glucosa dentro del tejido. La manipulación simultánea de tejidos por parte de múltiples operadores puede reducir el tiempo de manipulación. Aunque no medimos la captación de glucosa dentro de los explantes tisulares, las observaciones acumuladas en explantes tisulares cultivados sugieren que sobreviven en el medio que contiene glucosa hasta 17 días con la pérdida progresiva de funcionalidad33. En este protocolo, el corto tiempo de incubación para los explantes permite monitorear el metabolismo de la glucosa en tejidos relativamente funcionales. En los tejidos con organización celular compleja, como el cerebro, el tamaño presenta una limitación irresoluble, porque la desintegración del tejido complejo y la muerte celular resultante influyen en la absorción de glucosa. Sin embargo, la incubación del cerebro durante 24 h se ha utilizado previamente para la identificación del mecanismo regulador endógeno, apoyando la funcionalidad fisiológica relativa del cerebro de ratón extirpado en medio que contiene glucosa34. En cualquier caso, el procedimiento simplificado y la fácil accesibilidad de la glucosa FD extracelular pueden permitir el uso de este ensayo en un formato de alto rendimiento. La comparación del agotamiento de la glucosa-DF extracelular básica y estimulada por la insulina sugiere que este ensayo podría aplicarse para identificar factores humorales, nutricionales, patógenos, ambientales o farmacéuticos que regulan la absorción de glucosa. Aunque este ensayo simplifica el descubrimiento, los hallazgos requirieron validación con el radioetiquetado cuantitativo20 métodos analíticos 21,22,23 y/o métodos de imagen 5,24 para una elucidación mecanicista rigurosa de las vías.
Los pasos críticos en este protocolo incluyen la optimización de la confluencia y el tiempo de ayuno que influyen en la absorción basal y estimulada de FD-glucosa. Estos parámetros también podrían verse afectados por la temporada según las observaciones de los autores. Además, los diferentes tipos de células utilizan mecanismos específicos para la absorción de glucosa, incluidos diferentes transportadores de glucosa e interacciones reguladoras hormona/receptor 32,35,36. Por lo tanto, se deben considerar controles positivos distintos de la insulina para los cultivos celulares que representan tejidos distintos del tejido muscular o adiposo regulado por ejes de insulina / GLUT4. La solución de problemas también incluye el ajuste de la confluencia celular y la optimización del tiempo de ayuno / realimentación con FD-glucosa. Además, la sensibilidad de la medición de glucosa extracelular podría mejorarse reduciendo los niveles de glucosa DF extracelular, teniendo en cuenta los niveles umbral requeridos para la absorción de glucosa. El experimento descrito en la Figura 2 puede ayudar a los investigadores a personalizar este ensayo para su uso con otros cultivos celulares o solución de problemas.
La variabilidad intrínseca del metabolismo de la glucosa también requirió un mayor tamaño de muestra (n = 5-8). Aunque las mediciones extracelulares de la pérdida de glucosa FD mostraron la misma precisión que la absorción intracelular de glucosa FD normalizada por proteína, la normalización puede reducir la variabilidad del ensayo. Además de la medición de las concentraciones de proteínas, la medición del contenido de ADN en la célula puede ser otra evaluación sustituta confiable de la célula número37.
La FD-glucosa extracelular es accesible para mediciones cinéticas. Aquí, se ha desarrollado un procedimiento simple de mediciones cinéticas de la glucosa FD extracelular para identificar respuestas específicas de órganos a mediadores de la absorción de glucosa. Estos estudios ex vitro pueden probar directamente la respuesta de los órganos a diversos estímulos in vivo que se combina con la exposición de los órganos a la glucosa FD y las mediciones cinéticas ex vivo , como se muestra en la Figura 3. Aunque los estudios ex vivo no se parecen completamente a las condiciones in vivo , tienen múltiples ventajas. Los explantes de órganos mantienen una estructura celular primaria multicelular compleja, a diferencia de los cultivos celulares inmortales que exhiben una expresión génica alterada. El desarrollo moderno de fármacos utiliza organismos modelo, evaluación indirecta de la absorción de glucosa basada en el transcriptoma o metaboloma22, técnica integral de pinza de insulina38 o imágenes costosas32. Aunque la medición de la glucosa FD extracelular en órganos explantados no reemplazará estas tecnologías, proporcionará una evaluación rápida de compuestos, metabolitos y genes para facilitar el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas que regulen la absorción de glucosa de una manera específica del tejido. El desarrollo de terapias seguras que aborden el metabolismo de la glucosa en tejidos específicos puede ofrecer una solución para el cáncer, la demencia, el envejecimiento, la diabetes, las enfermedades autoinmunes, la obesidad y otras aplicaciones relacionadas.
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Disclosures
Los autores no tienen problemas que revelar y no tienen conflicto de intereses.
Acknowledgments
El proyecto fue apoyado por Ralph y Marian Falk Medical Research Catalyst Award y Kathleen Kelly Award. Otros apoyos incluyeron el Centro Nacional de Recursos de Investigación UL1RR025755 y NCI P30CA16058 (OSUCCC), la Hoja de ruta de los NIH para la investigación médica. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa los puntos de vista oficiales del Centro Nacional de Recursos de Investigación o los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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