Summary
蛍光標識されたグルコースの細胞外枯渇は、グルコース取り込みと相関し、摘出した臓器および細胞培養物におけるグルコース取り込みのハイスループットスクリーニングに使用することができる。
Abstract
糖尿病の世界的な流行が続いているため、グルコースの取り込みに影響を与える環境的、栄養的、内分泌的、遺伝的、およびエピジェネティックな要因の同定に対する需要が高まっています。細胞内蛍光の測定は、インビトロで細胞内の蛍光標識グルコース(FD-グルコース)の取り込みをテストするため、または インビボでグルコースを消費する組織をイメージングするために広く使用されている 方法です。このアッセイは、選択された時点におけるグルコース取り込みを評価する。細胞内分析は、FD-グルコースの代謝が内因性グルコースの代謝よりも遅いと仮定し、これは異化および同化反応およびシグナル伝達に関与する。しかし、動的グルコース代謝はまた、取り込み機構を変化させ、これは異なる因子に応答してグルコース取り込みの速度論的測定を必要とするであろう。本稿では、細胞外FD-グルコース枯渇を測定する方法について説明し、 エキソビボの細胞および組織における細胞内FD-グルコース取り込みとの相関を検証します。細胞外グルコース枯渇は、ハイスループットの動態学的および用量依存的研究、ならびに血糖活性およびそれらの組織特異的効果を有する化合物の同定に潜在的に適用され得る。
Introduction
グルコース取り込みを測定するための需要は、グルコース代謝に依存する多数の疾患の流行の増加に対処するための重要な必要性とともに上昇する。変性代謝疾患の根底にあるメカニズムは、神経学的および認知障害1、炎症性2および感染症3、癌4、5、ならびに加齢6について、エネルギーおよびその貯蔵、同化プロセス、タンパク質、および遺伝子修飾、シグナル伝達、遺伝子の調節、ならびに核酸合成および複製のためのグルコース代謝に依存する7,8,9.真性糖尿病(DM)は、グルコース取り込み調節の機能不全に直接関係している。DMは、1型、-2型、および-3型真性糖尿病、妊娠糖尿病、若年者の成熟発症糖尿病、および環境的および/または遺伝的要因によって誘発される他のタイプのこの疾患などの慢性疾患のスペクトルである。2016年、糖尿病に関する最初のWHOグローバルレポートは、最も広範なDMとともに生きる成人の数が1980年以来ほぼ4倍に増加し、成人10人の4億2,200万人に増加し、このDM患者の数は過去数十年間指数関数的に増加していることを実証しました。2019年だけでも、推定150万人の死亡がDM10によって直接引き起こされました。この劇的な上昇は、タイプ2 DMの増加と、太りすぎや肥満を含むそれを駆動する状態によるものです10。COVID-19のパンデミックは、一般集団と比較してDM患者の死亡率が2倍に増加することを明らかにし、免疫防御におけるグルコース代謝の深遠でありながらあまり理解されていない役割を示唆しています3。DM、肥満、およびその他の疾患の予防、早期診断、および治療には、異なる組織によるグルコース取り込みの測定の最適化、およびグルコース取り込みに影響を及ぼす環境11、栄養12、内分泌13、遺伝的14、およびエピジェネティック15因子の同定が必要である。
研究において、グルコースの細胞内および/または組織内取り込みは、一般に、インビトロ16、17、18およびインビボ19で蛍光標識されたグルコース(FD-グルコース)によって測定される。FD-グルコースは、放射性標識グルコース20、分析質量分析21、メタボロミクス22、核磁気共鳴法23、陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法(PET/CT)5,24を用いたより正確な方法と比較して好ましい方法となった。FD-グルコース取り込みとは異なり、より多くの生物学的材料を必要とする分析方法は、多段階のサンプル調製、高価な機器、および複雑なデータ分析を含む可能性がある。細胞培養におけるFD-グルコース取り込みの効果的かつ安価な測定は、概念実証実験で利用されており、他の方法による検証が必要な場合がある。
グルコース取り込み研究のためのFD-グルコース適用の基礎は、内因性グルコースと比較してFD-グルコースの代謝の低下である25。それにもかかわらず、内因性グルコースおよびFDグルコースの両方が、同化、異化、およびシグナル伝達プロセスで使用するために、すべての細胞コンパートメント間で動的に分布する。FD-グルコースの区画化および時間依存性処理25 は、蛍光測定を妨害し、ハイスループットスクリーニング実験、速度論的分析、3D細胞培養、共培養、および組織外植実験におけるこのアッセイの使用のための主要な制限因子を表す。ここでは、FD-グルコースの細胞外枯渇とその細胞内取り込みとの間に高い相関関係を示すデータを提供し、細胞内グルコース取り込みの代理測定としてのFD-グルコースの細胞外枯渇を示唆する。グルコースの細胞外枯渇の測定を、インスリンおよび実験薬物18 で処置したマウスにおけるグルコース取り込みの組織特異的差異を検証するために適用し、この方法の原理証明を提供する。
現在のプロトコールは、3T3-L1細胞におけるFDグルコース取り込みの細胞内および細胞外(図1)測定値を記載している。プロトコルセクション1〜7は、48時間の細胞の培養および増殖を説明する。細胞飢餓、刺激、およびベースライン細胞外測定;細胞外FD-グルコースの刺激後測定およびFD-グルコースおよびタンパク質の細胞内測定。プロトコールセクション8は、他の箇所に記載されるインスリンおよびアミノ酸化合物2(AAC2)の存在下および非存在下でob/obマウスから解剖された組織におけるFDグルコースの細胞外取り込みのエクスビボ測定を記載している18。
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Protocol
動物実験は、オハイオ州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会(OSU、プロトコル2007A0262-R4)によって承認された。
メモ:すべての手順は、送風機がオンでライトが消灯したクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
1. 資料作成
メモ: すべての材料は、 材料の表にリストされています。
- 培地1、遠心分離培地2、およびクラスIIバイオセーフティキャビネット内で表1に従って蛍光2−デオキシ−2−[(7−ニトロ−2,1,3−ベンゾオキサジアゾール−4−イル)アミノ]−D−グルコース(2−NBDGまたは FD グルコース)の貯蔵および作業溶液を調製する。フードの下のすべてのライトをオフにして、実験を通してFD-グルコースを光から保護します。
- すぐに使用できる細胞培養試薬を使用する:トリプシン-EDTA、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、およびグルコースフリーおよびフェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地(以下、グルコースフリーDMEM)。
- 20 mL のラジオイムノ沈降アッセイ (RIPA) 溶解バッファーを使用します。
注:以下のセクションでは、インスリン刺激の有無にかかわらず、3T3-L1線維芽細胞において、異なるFD-グルコース用量の細胞外枯渇および細胞内取り込みを比較します(図2)。
2. 3T3-L1細胞の培養と維持
- 20 mLの培地1で希釈した1 x 106細胞を2つの96 ウェルプレートにプレーティングして3T3−L1マウス線維芽細胞を培養する。1ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液をプレートに、混合することによってこの懸濁液の均質性を維持するようにする。約70%〜80%のコンフルエントになるまで培地を交換せずに、37°Cのインキュベーター(5%CO2 および湿度95%)中で48時間細胞を増殖させる。
- 細胞をコンフルエントに保ち、同じ培地で48時間培養して絶食させる。所望の空腹時異化状態に応じて、インキュベーション時間を24〜72時間から変化させる。
3. 3T3-L1細胞の飢餓
- 96ウェルプレート内の細胞からの培地をデカントする。滅菌ペーパータオルを使用して残りの液体を吸収します。
- 96ウェルプレートを1ウェルあたり100μLのPBSですすぎ、残りの液体を滅菌ペーパータオルで吸収します。
- 1ウェルあたり100μLのグルコースフリーDMEMを加え、40分間インキュベートする。細胞の種類、刺激、および所望の空腹時レベルに応じてインキュベーションの時間を調整します。
注:インキュベーションの時間は、季節によっては最適化が必要な場合があります。
4. 異なる濃度のFD-グルコース溶液の調製
注: 図2 の実験は、インスリンによる刺激の有無にかかわらず、細胞外および細胞間培地を調べます。
- 各刺激条件に対して8回の反復(96ウェルプレートで1列)を使用します。そこで、各刺激条件( 下記表2 に規定)ごとに1mLを用意する。
- インスリンを含まない8つの刺激条件を使用します:1つの96ウェルプレートで、2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg/mL(FD-グルコースを含まない対照)のFDグルコース。
- インスリン(10 μg/mL、最終濃度)で8つの刺激条件を使用します:FD-グルコース 2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg/mL(FD-グルコースを含まない対照)を別の96ウェルプレートで使用してください。
- 刺激条件を調製するには、1 μL の 5 mg/mL FD-グルコース作動溶液 (表 1) を 999 μL のグルコース非含有 DMEM に希釈し、1 mL の作業原液 (1:1000 希釈または 5 μg/mL) を得ます。
- この作業ストック溶液を用いて、FD-グルコースの希釈液を1:2000、1:5000、1:10,000、1:25,000、1:50,000、および1:100,000希釈して、照明のないバイオセーフティキャビネットでの実験の直前に、2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、および0.05 μg/mL(表2)の希釈液を2 mLチューブに調製します。
- ステップ4.4を繰り返し、上記の各条件に1 μLのインスリン(10 mg/mL、最終濃度)を追加します。
注:これらのサンプル中のインスリンの最終濃度は、10 μg/mL = 1.7 nmol/mLです。均質化を達成するために、他の溶液を加える前にチューブにインスリンを加える。
5. 飢餓状態の3T3-L1細胞の治療
- 40分間のインキュベーション後、各ウェルからグルコースフリーDMEMを96ウェルプレートにデカントし、残りの流体を滅菌ペーパータオルで吸収する。
- 上記のさまざまな処理条件からそれぞれ 100 μL (ウェルあたり) を 1 カラムに沿ったウェルに、同じ処理条件から 100 μL (ウェルあたり) を行に沿ってウェルに 100 μL (1 ウェルあたり) ずつ追加します (8 回の反復) 両方の 96 ウェルプレートで。インスリンの有無にかかわらず条件を利用したプレートにラベルを付けます。グルコースフリーDMEMのみをコントロールウェルに加える(n=8)。
- プレートを暗所で細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2、および湿度95%)で40分間インキュベートする。
6. 刺激型3T3-L1細胞の細胞外および細胞間測定
- 細胞を40分間刺激した後、刺激培地を両方のプレートから同じ実験レイアウトを維持した新しい96ウェルプレートに移す。
- 元の刺激された96ウェルプレートからの残りの溶液を滅菌ペーパータオル上の細胞でデカントする。
- 任意選択で、PBSで細胞を洗浄する。PBSを取り出し、滅菌ペーパータオルに残っている溶液をデカントします。
- 各ウェルに100 μLのRIPA溶解バッファーを追加します。任意選択で、タンパク質を保護するためにRIPA緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を加える。RIPAを含むプレートをシェーカーに30分間入れます。
- マイクロプレートリーダー(材料表)を用いて、まず細胞外FDグルコースを含む培地中で、それぞれ485nmおよび535nmの励起(Ex)および発光(Em)波長での蛍光を測定し、次いで、プレートを30分間インキュベーションの終了時にRIPA溶解細胞と共に測定する(ステップ6.4参照)。
7. 細胞内グルコース取り込みのタンパク質ベースの正常化
注:細胞内FD-グルコース取り込みは細胞数に依存する。細胞溶解物中のタンパク質レベルは、細胞内FD-グルコースレベルを各ウェルの細胞数に正規化することを可能にする細胞数に比例する。
- 製造業者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを行う( 材料表を参照)。RIPA溶解細胞を含む各ウェル中のタンパク質濃度を定量する。
- 10 μL の RIPA ホモジネートを使用し、タンパク質濃度を 3 連で測定して、96 ウェルプレートでの測定精度を高めます。
- 分析したタンパク質標準物質(0、10、20、30、40、50、および60 μg/mLタンパク質)と各96ウェルプレート上のサンプルに基づいてタンパク質を定量します。
- 562nmの吸光度を測定し、タンパク質標準品について得られた線形回帰式に基づいて各サンプル中のタンパク質濃度を定量する。
- 各ウェルの蛍光値/タンパク質濃度を使用して、細胞内FD-グルコースのレベルを正常化する。細胞外FD-グルコース枯渇は正常化を必要としない。
- 必要に応じて、追加の正規化(100%)のために対照サンプルの平均ベースライン値を使用します。
8. 臓器における細胞外FDグルコース枯渇の Ex vivo 測定
- 以下のように、臓器郭清の前に糖代謝を刺激する化合物でマウスを前処理する。
- 9週齢の Lepob 雄マウス(n=11)を使用する。実験の前に、すべてのマウスに通常のチャウ食を与えてください。
- マウスを腹腔内(i.p.)注射のために3つのグループにランダムに割り当てる。
- 対照 Lepob 群のマウスに0.1mLの滅菌PBS(n = 4)を注射する。
- インスリンLep ob群のマウスに、体重1グラムあたり12IUのヒトインスリン(BW)を含む0.1mLの滅菌PBSを注射する(n = 3)。
- AAC2 Lepob 群のマウスに、体重1グラム当たり0.1nmolのAAC2(BW)を含む0.1mLの滅菌PBSを注射する(n = 4)。
- 15分後、対象マウスを5%イソフルランの吸入にかけ、麻酔した動物26から心臓穿刺により血液を除血した。
- 各動物の内臓上体白脂肪組織(200mg)、肝臓(200mg)、および全脳を解剖する。組織処理にはクラスIIバイオセーフティフードを使用してください。
- FD-グルコース(0.29 mM)作業溶液をグルコースフリーDMEM中で、光のないクラスIIバイオセーフティキャビネットで調製します。
- マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長がそれぞれ485 nmおよび535 nmのFD-グルコース作動溶液(0.29 mM)の蛍光を測定します。
- 採取した組織/臓器をPBSを含む6ウェルプレートで1分間インキュベートします。各組織または器官を別々の井戸で処理します。
- 1分後、各ティッシュを滅菌ペーパータオルの上に置き、PBSを吸収します。組織/臓器を4,000 μLのグルコースフリーDMEMを含む別の6ウェルプレートに移し、2分間インキュベートします。
- 2分後、組織を除去し、0.29 mM FD-グルコース作業溶液(1 mL/ウェル)を含む6ウェルプレートのウェルに移します。組織を含む6ウェルプレートをFD-グルコース作業溶液中で37°C(5%CO2 および湿度95%)でインキュベートする。
- 0、10、20、30、40、60、90、および120分のインキュベーション後に各ウェルから100μLのFDグルコース作動溶液を採取し、細胞外FDグルコース枯渇の動態を分析した。収集前後に振る。
- 100 μLのFD-グルコース作動溶液を96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長がそれぞれ485nmおよび535nmの蛍光を測定しました。
- 各動物の各臓器について蛍光を0分値(100%)に正規化します(図3)。
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Representative Results
細胞内摂取および細胞外グルコース枯渇は、インスリン刺激の有無にかかわらず、異なる濃度のFDグルコース(図2)に応答して、3T3−L1前駆脂肪細胞において測定された。 図2Aは 、FD−グルコースの細胞内取り込みの用量依存的増加を示し、これはインスリンの存在下で有意に増加した。同じ細胞における細胞外FD-グルコースの付随する減少を 図2Bに示し、ここでインスリン刺激は、インスリン刺激のないサンプルと比較して細胞外FD-グルコースレベルの有意な減少をもたらした。FD-グルコースの細胞内摂取は、インスリンの有無にかかわらずサンプルにおける用量依存的にFD-グルコースの細胞外枯渇と相関していた(図2C)。したがって、FD-グルコースの細胞外枯渇は、細胞内FD-グルコース取り込みと同等の精度(R2 =0.99、P<0.001)でグルコース取り込みの変化を測定することができる。
次に、グルコース取り込みの正準誘導物質および実験的誘導物質による刺激時に異なる組織を調べる動態学的研究における細胞外FD-グルコース取り込みの適用を検証するための実験環境が開発された(図3)。我々は、内臓白色脂肪組織を含む末梢組織におけるインスリン抵抗性の Lepob マウスモデルを選択した27、28。これらのマウスにおけるインスリンに対する十分に確立された応答を、レプチン受容体およびグルコーストランスポーターGLUT1依存性機構 を介して 末梢組織および神経組織の両方に作用する新規化合物AAC2の効果と比較した18。 Lepob マウスに、インスリンまたはAAC2をi.p.注射した。臓器は注射後15分で解剖した。次に、細胞外FD-グルコース枯渇の動態を、内臓脂肪、肝臓、および脳 のエクスビボ で研究した(図3)。末梢組織における報告されたインスリン抵抗性と一致して、細胞外FDグルコースは、120分間のインキュベーション中に非刺激対照内臓脂肪において枯渇しなかった(図3A)。対照的に、解剖前のインスリンまたはAAC2によるマウスの前処置は、それぞれ30分および60分の時間間隔内で細胞外FDグルコースの有意な枯渇をもたらした。
グルコースの肝臓取り込みは、インスリン刺激とは無関係であるGLUT2を含むグルコーストランスポーターを利用する29、30。したがって、細胞外FD-グルコースは、インスリン刺激肝外植体では、非刺激肝外植体と比較して、最初は枯渇しなかったが(図3B)、FD-グルコースの有意な枯渇は、初期レベル(0分)と比較してインスリンで刺激された肝外植体におけるインキュベーションの120分後に観察された。一方、細胞外FDグルコースは、AAC2で前処理した肝外植物において時間依存的に有意に減少した。
脳において、主なトランスポーターは、他のトランスポーター31の中でもGLUT1である。FD-グルコース枯渇動態は、他の組織と比較して脳内で著しく異なっていた(図3C)。グルコースの有意な枯渇は、60分間のインキュベーション後(0分間で100%から78%)に非処置の脳を含む細胞外培地において観察された。インスリン処置Lepobマウス由来の脳と共にインキュベートした培地は、FDグルコースの中等度であるが有意な線形減少(0分で100%から95%まで)を示した。AAC2刺激を受けた脳は、最初の20分間(0分間の100%から67.4%)の間に細胞外FDグルコースの急激な急速な減少をもたらす。一緒になって、細胞外グルコース枯渇の測定は、インビボでのこれらの組織におけるグルコース取り込みにおける以前に報告された差異を支持する32。
図1:細胞外FD-グルコース枯渇法の原理 96ウェルフォーマットで培養された細胞は、このアッセイに適している。生き残るために、細胞はグルコースを摂取し、この流入は細胞外グルコースのレベルを低下させる。グルコースをFD-グルコースで置き換えると、これらの変化を監視することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3T3-L1前駆脂肪細胞を、インスリンの有無にかかわらず異なる濃度のFD-グルコースと共にインキュベートする前にグルコース非含有培地中で40分間インキュベートした(1.7mM;40分間インキュベーション)。(A、B)対照(すなわち、インスリンなし)(斜線の棒)およびインスリン刺激細胞(黒い棒)におけるFDグルコース(A)および細胞外FDグルコース枯渇(B)の用量依存的取り込み。FDグルコースの取り込みは、タンパク質濃度によって標準化された。データは、FDグルコースなしでインキュベートされたコントロールで測定された値の%として示される(平均SD、条件当たりn=8)。有意性は、不対t検定により調べた。(C)細胞内および細胞外FDグルコース間の相関(%)は、(A)および(B)に記載の実験においてインスリン(四角)または有無(丸)で測定する。ピアソン相関、P < 0.001.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:エクスビボの異なる器官における細胞外FDグルコース枯渇の動態。 (A-C)Lepobマウスにビヒクル(PBS、n = 4)、インスリン(12IU/kg BW、n = 3)、およびAAC2(1 nmol/g BW、n = 3)を注射した。15分後、組織を解剖し、単離した。(A)内臓脂肪、(B)肝臓、および(C)脳の外植体をFD-グルコース(0.29 mM)中でインキュベートした。細胞外グルコース枯渇の動態を、異なる時点で培地のアリコートで測定した。データ(平均SD)は、0分間のインキュベーションにおける各器官における蛍光の%として示される。有意性P<0.05、不対応のt検定。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ソリューション/メディア | コンポーネント |
| エタノール:DMSO (1:1/v/v) | エタノール(200 μL)およびDMSO(200 μL)を1-1.5 mLチューブに入れます。細胞培養グレードのエタノールとDMSOを使用する |
| ミディアム1 | DMEM (89 mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) (1 mL) およびカーフ血清 (10%) (10 mL) を滅菌 50 mL チューブに入れた状態で |
| 遠心分離培地2 | DMEM (89 mL)、ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) (1 mL) およびウシ血清 (10%) (10 mL) を滅菌 50 mL チューブに入れた状態で |
| 貯蔵FDグルコース溶液5 mg/mL(14.5 mM) | FDグルコース(1mg)およびエタノール:DMSO(1:1/v/v)(200μL)(0.5mLチューブ中;-80 °C、アルゴンまたは窒素雰囲気下で優先的に保管する |
| 作業用FDグルコース溶液 5 μg/mL (14.5 mM) | 貯蔵FDグルコース溶液5 mg / mL(1 μL)、グルコースフリーDMEM(999 μL);実験直前に準備してください。 |
表1:培地およびFD-グルコース溶液の調製。
| 希釈 | コントロール | 1:2x103 | 1:5×103 | 1:1x104 | 1:2.5×104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| 濃度(μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| グルコースフリーDMEM(μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FDグルコース 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
表2: 図2に示す実験のための異なる濃度のFDグルコース溶液の調製。
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Discussion
細胞外FD-グルコース枯渇と細胞培養における正規化された細胞内グルコース取り込みとの直接比較は高い相関関係を示し、細胞外グルコース枯渇がグルコース取り込み評価のための代理測定である可能性があることを示唆した。細胞外FD-グルコースの測定には、広範囲のFDグルコース濃度を使用することができ、また、0.5-2.5μgのFD-グルコース/mLが最適な範囲を提供するようである。細胞外FD-グルコースは、細胞内FD-グルコース取り込みに必要な細胞数またはタンパク質濃度への正規化を必要としない。細胞外FD-グルコース測定の予想される限界は、活性酸素種誘導剤および蛍光を消光することができる外植体内の血液の痕跡の調査である。光などの蛍光に影響を与える他の環境要因も考慮する必要があります。複数の組織外植体を使用している間に必要な取り扱い時間が長くなると、組織の生存率とグルコース代謝が損なわれる可能性があります。これは追加の制限になる可能性があります。切除された組織は、組織内のグルコースの透過性を可能にするために、小さなサイズ範囲(50〜300mg)にある必要がある。複数のオペレータによる組織の同時処理により、処理時間を短縮できます。我々は、組織外植体内のグルコース取り込みを測定しなかったが、培養組織外植体における蓄積された観察は、それらが機能性の進行性の喪失を伴うグルコース含有培地中で最大17日間生存することを示唆している33。このプロトコールでは、外植体の短いインキュベーション時間により、比較的機能的な組織におけるグルコース代謝をモニタリングすることができる。脳のような複雑な細胞組織を有する組織では、複雑な組織の崩壊および結果として生じる細胞死がグルコースの取り込みに影響を与えるため、サイズは解決不可能な制限を提示する。しかしながら、24時間の脳のインキュベーションは、内因性調節機構の同定のために以前に使用されており、グルコース含有培地34中で摘出したマウス脳の相対的な生理学的機能を支持する。いずれにせよ、細胞外FD-グルコースの簡素化された手順と容易なアクセス性により、このアッセイをハイスループット形式で使用することができます。塩基性およびインスリン刺激細胞外FD-グルコース枯渇の比較は、このアッセイが、液性、栄養、病原性、環境因子、またはグルコース取り込みを調節する医薬品を同定するために適用され得ることを示唆している。このアッセイは発見を単純化するが、この知見は、経路の厳密な機構学的解明のために定量的放射性標識20分析方法21、22、23および/またはイメージング法5、24による検証を必要とした。
このプロトコルの重要なステップには、基礎的および刺激されたFD-グルコース取り込みの両方に影響を与える合流点および空腹時時間の最適化が含まれる。これらのパラメータは、著者の観察に基づいて季節によっても影響を受ける可能性があります。さらに、異なる細胞型は、異なるグルコーストランスポーターおよび調節ホルモン/受容体相互作用を含むグルコース取り込みのための特定のメカニズムを使用する32、35、36。したがって、インスリン/GLUT4軸によって調節される筋肉または脂肪組織以外の組織を表す細胞培養物については、インスリン以外の陽性対照を考慮する必要がある。トラブルシューティングには、細胞の合流点を調整し、FD-グルコースによる絶食/再給餌の時間を最適化することも含まれます。さらに、細胞外グルコース測定の感度は、グルコース取り込みに必要な閾値レベルを考慮して、細胞外FD-グルコースのレベルを低下させることによって改善することができた。図 2 に記載した実験は、研究者がこのアッセイを他の細胞培養物やトラブルシューティングで使用するためにカスタマイズするのに役立ちます。
グルコース代謝の固有の変動性はまた、より高いサンプルサイズ(n = 5-8)を必要とした。FD-グルコース損失の細胞外測定は、タンパク質によって標準化されたFD-グルコースの細胞内取り込みと同じ精度を示したが、正規化はアッセイの変動性を低減することができる。タンパク質濃度の測定に加えて、細胞中のDNA含量の測定は、細胞番号37の別の信頼できる代理評価であり得る。
細胞外FD-グルコースは、動態測定のためにアクセス可能である。ここでは、細胞外FD-グルコースの速度論的測定の簡単な手順が、グルコース取り込みのメディエーターに対する器官特異的応答を同定するために開発されている。これらのエクスビトロ研究は、図3に示すように、FD-グルコースおよびエクスビボ動態測定への臓器の曝露と組み合わされたインビボでの様々な刺激に対する器官応答を直接試験することができる。エキソビボ研究はインビボ条件に完全には似ていませんが、複数の利点があります。器官外植体は、遺伝子発現の変化を示す不死細胞培養物とは異なり、複雑な多細胞初代細胞構造を維持する。現代の医薬品開発は、モデル生物、トランスクリプトームまたはメタボローム22に基づくグルコース取り込みの間接的評価、包括的インスリンクランプ技術38、または高価な画像化32を利用する。外植臓器における細胞外FD-グルコースの測定は、これらの技術に取って代わるものではありませんが、化合物、代謝産物、および遺伝子の迅速な評価を提供し、組織特異的な方法でグルコース取り込みを調節する新規治療標的の発見を容易にします。特定の組織におけるグルコース代謝に対処する安全な治療法の開発は、癌、認知症、老化、糖尿病、自己免疫疾患、肥満、およびその他の関連用途のための解決策を提供することができる。
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Disclosures
著者には開示すべき問題はなく、利益相反もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst AwardとKathleen Kelly Awardの支援を受けました。その他の支援には、国立研究資源センターUL1RR025755およびNIH医学研究ロードマップであるNCI P30CA16058(OSUCCC)が含まれていました。コンテンツは著者の責任であり、国立研究資源センターまたはNIHの公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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