Summary
Ekstracellulær udtømning af fluorescerende mærket glucose korrelerer med glukoseoptagelse og kan bruges til screening med høj kapacitet af glukoseoptagelse i udskårne organer og cellekulturer.
Abstract
Den igangværende verdensomspændende epidemi af diabetes øger efterspørgslen efter identifikation af miljømæssige, ernæringsmæssige, endokrine, genetiske og epigenetiske faktorer, der påvirker glukoseoptagelsen. Måling af intracellulær fluorescens er en meget anvendt metode til at teste optagelsen af fluorescerende mærket glucose (FD-glucose) i celler in vitro eller til billeddannelse af glukoseforbrugende væv in vivo. Dette assay vurderer glukoseoptagelsen på et valgt tidspunkt. Den intracellulære analyse antager, at metabolismen af FD-glucose er langsommere end for endogen glucose, som deltager i kataboliske og anabolske reaktioner og signalering. Dynamisk glukosemetabolisme ændrer imidlertid også optagelsesmekanismer, hvilket ville kræve kinetiske målinger af glukoseoptagelse som reaktion på forskellige faktorer. Denne artikel beskriver en metode til måling af ekstracellulær FD-glucoseudtømning og validerer dens korrelation med intracellulær FD-glucoseoptagelse i celler og væv ex vivo. Ekstracellulær glucoseudtømning kan potentielt anvendes til kinetiske og dosisafhængige undersøgelser med høj kapacitet samt identifikation af forbindelser med glykæmisk aktivitet og deres vævsspecifikke virkninger.
Introduction
Efterspørgslen efter måling af glukoseoptagelse stiger sammen med det kritiske behov for at tackle en epidemisk stigning i en lang række sygdomme, der er afhængige af glukosemetabolisme. Underliggende mekanismer for degenerative metaboliske sygdomme, neurologiske og kognitive lidelser1,inflammatoriske 2 og infektionssygdomme3, kræft 4,5 samt aldring6 afhænger af glukosemetabolisme til energi og dens opbevaring, anabolske processer, protein og genmodifikation, signalering, regulering af gener og nukleinsyresyntese og replikation 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) er direkte relateret til funktionsfejl i glukoseoptagelsesregulering. DM er et spektrum af kroniske sygdomme som type-1, -2 og -3 diabetes mellitus, svangerskabsdiabetes, modenhedsdiabetes hos de unge og andre typer af denne sygdom induceret af miljømæssige og / eller genetiske faktorer. I 2016 viste den første WHO Global-rapport om diabetes, at antallet af voksne, der lever med den mest udbredte DM, næsten er firedoblet siden 1980 til 422 millioner voksne10, og dette antal DM-patienter er steget eksponentielt i de sidste par årtier. Alene i 2019 var et skøn på 1,5 millioner dødsfald direkte forårsaget af DM10. Denne dramatiske stigning skyldes stigningen i type-2 DM og de forhold, der driver den, herunder overvægt og fedme10. COVID-19-pandemien afslørede en dobbelt stigning i dødeligheden hos patienter med DM sammenlignet med den generelle befolkning, hvilket tyder på den dybe, men dårligt forståede rolle, som glukosemetabolisme spiller i immunforsvaret3. Forebyggelse, tidlig diagnose og behandling af DM, fedme og andre sygdomme kræver optimering af målinger af glukoseoptagelse af forskellige væv og identifikation af miljømæssige11, ernæringsmæssige12, endokrine13, genetiske14 og epigenetiske15 faktorer, der påvirker glukoseoptagelsen.
I forskning måles intracellulær og / eller vævsoptagelse af glucose almindeligvis ved fluorescerende mærket glucose (FD-glucose) in vitro 16,17,18 og in vivo19. FD-glucose blev en foretrukken metode sammenlignet med mere præcise metoder ved anvendelse af radioaktivt mærket glucose20, analytisk massespektroskopianalyse21, metabolomics22, nukleare magnetiske resonansmetoder23 og positronemissionstomografi / computertomografi (PET / CT) 5,24. I modsætning til FD-glukoseoptagelse kan analytiske metoder, der kræver mere biologisk materiale, involvere en flertrins prøveforberedelse, dyre instrumenter og kompleks dataanalyse. Effektive og billige målinger af FD-glukoseoptagelse i cellekulturer er blevet anvendt i proof-of-concept eksperimenter og kan kræve validering ved andre metoder.
Grundlaget for FD-glucoseapplikation til glukoseoptagelsesundersøgelser er den reducerede metabolisme af FD-glucose sammenlignet med endogen glucose25. Ikke desto mindre er både endogen glucose og FD-glucose dynamisk fordelt mellem alle cellulære rum til brug i anabolske, kataboliske og signalprocesser. Compartmentalisering og tidsafhængig behandling25 af FD-glucose interfererer med fluorescensmålingerne og repræsenterer de vigtigste begrænsende faktorer for brugen af dette assay i screeningseksperimenter med høj kapacitet, kinetisk analyse, 3D-cellekultur, co-kulturer og vævseksplosive eksperimenter. Her leverer vi data, der viser en høj korrelation mellem den ekstracellulære udtømning af FD-glucose og dens intracellulære optagelse, hvilket tyder på den ekstracellulære udtømning af FD-glucose som en surrogatmåling for intracellulær glukoseoptagelse. Målingen af ekstracellulær udtømning af glucose blev anvendt til at validere vævsspecifikke forskelle i glukoseoptagelse hos mus behandlet med insulin og et eksperimentelt lægemiddel18 for at tilvejebringe et proof-of-principle for denne metode.
Den nuværende protokol beskriver intracellulære og ekstracellulære (figur 1) målinger af FD-glucoseoptagelse i 3T3-L1-celler. Protokolafsnit 1-7 forklarer dyrkning og vækst af celler i 48 timer; celle sult, stimulering og baseline ekstracellulære målinger; og poststimuleringsmålinger af ekstracellulær FD-glucose og intracellulære målinger af FD-glucose og protein. Protokolafsnit 8 beskriver ex vivo-målingen af ekstracellulær optagelse af FD-glucose i væv dissekeret fra ob/ob-mus i nærvær og fravær af insulin og aminosyreforbindelse 2 (AAC2) beskrevet andetsteds18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Ohio State University (OSU, protokol 2007A0262-R4).
BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres i et klasse II biosikkerhedsskab med blæseren tændt og lyset slukket.
1. Forberedelse af materialer
BEMÆRK: Alle materialer er angivet i materialetabellen.
- Der fremstilles medium 1, centrifugeringsmedium 2 og opbevarings- og arbejdsopløsninger af fluorescerende 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG eller FD-glucose) i henhold til tabel 1 i et klasse II biosikkerhedsskab. Beskyt FD-glukose mod lys under hele eksperimentet ved at slukke for alle lysene under emhætten.
- Brug brug brugsklare cellekulturreagenser: Trypsin-EDTA, fosfatbufferet saltvand (PBS) og glucosefri og phenol rødfri Dulbecco's Modified Eagle Medium (herefter glucosefri DMEM).
- Brug 20 ml radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer.
BEMÆRK: I de følgende afsnit sammenlignes ekstracellulær udtømning og intracellulær optagelse af forskellige FD-glucosedoser i 3T3-L1 fibroblaster med og uden insulinstimulering (figur 2).
2. 3T3-L1 cellekultur og vedligeholdelse
- Kultur 3T3-L1 musefibroblaster ved plettering af 1 x 106 celler fortyndet i 20 ml medium 1 i to 96-brøndplader. Plade 100 μL cellesuspension pr. brønd, der sikrer, at homogeniteten af denne suspension opretholdes ved blanding. Dyrk celler i 48 timer i en 37 ° C inkubator (5% CO2 og 95% fugtighed) uden at skifte medie indtil ca. 70% -80% sammenløb.
- Vedligehold celler sammenflydende og fastende ved at dyrke dem i samme medium i 48 timer. Varier inkubationstiden fra 24-72 timer afhængigt af den ønskede fastende kataboliske tilstand.
3. Sult af 3T3-L1 celler
- Dekanter medier fra celler i pladerne med 96 brønde. Absorber den resterende væske ved hjælp af sterile papirhåndklæder.
- Pladen med 96 brønde skylles med 100 μL PBS pr. brønd, og den resterende væske absorberes med sterile køkkenrulle.
- Tilsæt 100 μL glukosefri DMEM pr. brønd og inkuber i 40 minutter. Juster inkubationstiden afhængigt af celletype, stimuli og ønsket fasteniveau.
BEMÆRK: Inkubationstidspunktet kan kræve optimering afhængigt af sæsonen.
4. Fremstilling af FD-glucoseopløsninger med forskellige koncentrationer
BEMÆRK: Eksperimentet i figur 2 undersøger ekstracellulære og intercellulære medier med og uden stimulering med insulin.
- Brug otte replikater (en række i en 96-brøndplade) for hver stimuleringstilstand. Forbered derfor 1 ml for hver stimuleringstilstand (specificeret i tabel 2 og nedenfor).
- Brug otte stimuleringsbetingelser uden insulin: FD-glucose på 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml og 0 μg / ml (kontrol uden FD-glucose) i en 96-brøndplade.
- Brug otte stimuleringsbetingelser med insulin (10 μg / ml, slutkoncentration): FD-glucose på 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml og 0 μg / ml (kontrol uden FD-glucose) i en anden 96-brøndplade.
- For at forberede stimuleringsbetingelserne fortyndes 1 μL 5 mg/ml FD-glucosearbejdsopløsning (tabel 1) i 999 μL glucosefri DMEM for at opnå 1 ml arbejdslageropløsning (1:1000 fortynding eller 5 μg/ml).
- Ved hjælp af denne arbejdslageropløsning forberedes 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 og 1:100.000 fortyndinger af FD-glucose for at opnå 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml og 0,05 μg/ml (tabel 2) i 2 ml rør umiddelbart før forsøg i et biosikkerhedsskab uden lys.
- Trin 4.4 gentages, og der tilsættes 1 μL insulin (10 mg/ml, slutkoncentration) til hver af de ovenfor angivne betingelser.
BEMÆRK: Den endelige koncentration af insulin i disse prøver er 10 μg/ml = 1,7 nmol/ml. For at opnå homogenisering tilsættes insulin til rørene, inden der tilsættes andre opløsninger.
5. Behandling af sultne 3T3-L1 celler
- Efter 40 minutters inkubation dekanteres den glukosefri DMEM fra hver brønd i plader med 96 brønde og absorberer den resterende væske med sterile papirhåndklæder.
- Der tilsættes 100 μL (pr. brønd) fra de forskellige behandlingsbetingelser, der er beskrevet ovenfor, til brønde langs en kolonne og 100 μL (pr. brønd) fra samme behandlingstilstand til brøndene langs rækken (otte replikater) i begge 96-brøndplader. Mærk pladerne, der udnyttede betingelserne med og uden insulin. Tilsæt glukosefri DMEM alene til kontrolbrøndene (n = 8).
- Inkuber pladen i 40 minutter i en cellekulturinkubator (37 °C, 5 % CO2 og 95 % fugtighed) i mørke.
6. Ekstracellulære og intercellulære målinger for stimulerede 3T3-L1 celler
- Når cellerne er blevet stimuleret i 40 minutter, overføres stimuleringsmediet fra begge plader til nye 96-brøndplader, der opretholder det samme eksperimentelle layout.
- Dekanter enhver resterende opløsning fra de originale stimulerede 96-brøndplader med celler på sterile papirhåndklæder.
- Vask eventuelt celler med PBS. Fjern PBS og dekanter eventuel resterende opløsning på sterile papirhåndklæder.
- Der tilsættes 100 μL RIPA lysis-buffer til hver brønd. Eventuelt tilsættes proteasehæmmer til RIPA-bufferen for at beskytte proteiner. Anbring plader indeholdende RIPA i en ryster i 30 min.
- Ved hjælp af en mikropladelæser (Materialetabel) måles fluorescens ved excitationsbølgelængder (Ex) og emissionsbølgelængder (Em) på henholdsvis 485 og 535 nm først i mediet indeholdende ekstracellulær FD-glucose og derefter pladen med RIPA-lysede celler i slutningen af 30 minutters inkubation (se trin 6.4).
7. Proteinbaseret normalisering af intracellulær glukoseoptagelse
BEMÆRK: Intracellulær FD-glukoseoptagelse afhænger af cellenummeret. Proteinniveauer i cellulære lysater er proportionale med cellenumrene, der tillader normalisering af intracellulære FD-glucoseniveauer til antallet af celler i hver brønd.
- Udfør BCA-proteinassay i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel). Kvantificer proteinkoncentrationerne i hver brønd indeholdende RIPA-lysede celler.
- Brug 10 μL RIPA-homogenatet, og mål proteinkoncentrationer i tre eksemplarer for at øge nøjagtigheden af målinger i plader med 96 brønde.
- Kvantificer protein baseret på proteinstandarder (0, 10, 20, 30, 40, 50 og 60 μg / ml protein) analyseret sammen med prøver på hver 96-brøndplade.
- Absorbansen måles ved 562 nm, og proteinkoncentrationerne i hver prøve kvantificeres baseret på den lineære regressionsformel, der er opnået for proteinstandarden.
- Normaliser niveauerne af intracellulær FD-glucose ved hjælp af fluorescerende værdi / proteinkoncentration i hver brønd. Ekstracellulær FD-glucose udtømning kræver ikke normalisering.
- Brug eventuelt de gennemsnitlige baselineværdier i kontrolprøver til yderligere normalisering (100%).
8. Ex vivo-måling af ekstracellulær FD-glukoseudtømning i organer
- Forbehandle mus med forbindelser, der stimulerer glukosemetabolismen før organdissektionen, som følger.
- Brug ni uger gamle Lepob hanmus (n = 11). Foder alle mus med en regelmæssig chow diæt før eksperimentet.
- Tildel mus tilfældigt i tre grupper til intraperitoneale (i.p.) injektioner.
- Injicer mus fra kontrolgruppen Lepob med 0,1 ml steril PBS (n = 4).
- Injicer mus fra insulin Lepob-gruppen med 0,1 ml steril PBS, der indeholder 12 IE humant insulin pr. gram legemsvægt (BW) (n = 3).
- Injicer mus fra AAC2 Lepob-gruppen med 0,1 ml steril PBS, indeholdende 0,1 nmol AAC2 pr. gram legemsvægt (BW) (n = 4).
- Efter 15 min, udsætte mus for indånding af 5% isofluran og exsanguinate blod ved hjertepunktur fra de bedøvede dyr26.
- Dissekere visceralt epidydmalt hvidt fedtvæv (200 mg), lever (200 mg) og hele hjernen fra hvert dyr. Brug en klasse II biosikkerhedshætte til vævshåndtering.
- Forbered FD-glucose (0,29 mM) arbejdsløsning i glukosefri DMEM i et klasse II biosikkerhedsskab uden lys.
- Fluorescensen af FD-glucose arbejdsløsning (0,29 mM) måles ved excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 485 og 535 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
- Inkuber de høstede væv/organer i en 6-brønds plade indeholdende PBS i 1 min. Håndter hvert væv eller organ i en separat brønd.
- Efter 1 min anbringes hvert væv på et sterilt køkkenrulle for at absorbere PBS. Overfør væv / organer til en separat 6-brønds plade indeholdende 4.000 μL glukosefri DMEM og inkuberes i 2 minutter.
- Efter 2 min fjernes og overføres vævene til brønde i en 6-brøndplade indeholdende 0,29 mM FD-glucose arbejdsløsning (1 ml / brønd). Inkuber 6-brøndpladerne indeholdende væv i FD-glucose arbejdsløsning ved 37 ° C (5% CO2 og 95% fugtighed).
- Saml 100 μL FD-glucose arbejdsløsning fra hver brønd efter 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutters inkubation for at analysere kinetikken af ekstracellulær FD-glucoseudtømning. Ryst før og efter indsamling.
- Overfør 100 μL FD-glucose arbejdsløsning til 96-brøndplader for at måle fluorescensen ved excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 485 og 535 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
- Normaliser fluorescens til 0 minutters værdi (100%) for hvert organ i hvert dyr (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intracellulært indtag og ekstracellulær glucoseudtømning blev målt i 3T3-L1 præadipocytter som reaktion på forskellige koncentrationer af FD-glucose (figur 2) med og uden insulinstimulering. Figur 2A viser en dosisafhængig stigning i den intracellulære optagelse af FD-glucose, som blev signifikant øget i nærvær af insulin. Det samtidige fald i ekstracellulær FD-glucose i de samme celler er vist i figur 2B, hvor insulinstimulering førte til signifikant nedsatte ekstracellulære FD-glucoseniveauer sammenlignet med prøverne uden insulinstimulering. Det intracellulære indtag af FD-glucose korrelerede med den ekstracellulære udtømning af FD-glucose på en dosisafhængig måde i prøver med og uden insulin (figur 2C). Således kan ekstracellulær udtømning af FD-glucose måle en ændring i glukoseoptagelse med sammenlignelig nøjagtighed (R2 = 0,99, P < 0,001) som intracellulær FD-glucoseoptagelse.
Dernæst blev der udviklet en eksperimentel indstilling til validering af ekstracellulær FD-glucoseoptagelsesapplikation i kinetiske undersøgelser, der undersøgte forskellige væv ved stimulering med kanoniske og eksperimentelle inducere af glukoseoptagelse (figur 3). Vi valgte Lepob-musemodellen af insulinresistens i perifert væv, herunder visceralt hvidt fedtvæv27,28. De veletablerede reaktioner på insulin hos disse mus blev sammenlignet med virkningerne af det nye stof AAC2, der virker på både perifert og nervøst væv via leptinreceptor og glukosetransportør GLUT1-afhængige mekanismer18. Lepob mus blev i.p. injiceret med insulin eller AAC2. Organer blev dissekeret 15 minutter efter injektion. Derefter blev kinetikken af ekstracellulær FD-glucoseudtømning undersøgt i visceralt fedt, lever og hjerne ex vivo (figur 3). I overensstemmelse med den rapporterede insulinresistens i perifert væv blev ekstracellulær FD-glucose ikke udtømt i ikke-stimuleret kontrolvisceralt fedt under 120 minutters inkubation (figur 3A). I modsætning hertil førte forbehandling af mus med insulin eller AAC2 før dissektionen til signifikant udtømning af ekstracellulær FD-glucose inden for et tidsinterval på henholdsvis 30 minutter og 60 minutter.
Leveroptagelse af glukose anvender glukosetransportører, herunder GLUT2, der er uafhængig af insulinstimulering 29,30. Følgelig blev ekstracellulær FD-glucose oprindeligt ikke udtømt i insulinstimulerede levereksplosioner sammenlignet med ikke-stimulerede levereksplolanter (figur 3B), selvom signifikant udtømning af FD-glucose blev observeret efter 120 minutters inkubation i levereksplolant stimuleret med insulin sammenlignet med de indledende niveauer (0 min). På den anden side blev ekstracellulær FD-glucose signifikant reduceret på en tidsafhængig måde i levereksplolanter forbehandlet med AAC2.
I hjernen er hovedtransportøren GLUT1 blandt andre transportører31. FD-glucoseudtømningskinetikken var påfaldende forskellig i hjernen sammenlignet med andet væv (figur 3C). Den signifikante udtømning af glucose blev observeret i det ekstracellulære medium indeholdende den ikke-behandlede hjerne efter 60 minutters inkubation (fra 100% ved 0 min til 78%). Mediet inkuberet med hjerner fra insulinbehandlede Lepob-mus har vist moderat, men et signifikant lineært fald i FD-glucose (fra 100% ved 0 min til 95%). AAC2-stimulerede hjerner fører til et dybtgående hurtigt fald i ekstracellulær FD-glucose i løbet af de første 20 minutter (fra 100% ved 0 min til 67,4%). Sammen understøtter målinger af ekstracellulær glukoseudtømning de tidligere rapporterede forskelle i glukoseoptagelse i disse væv in vivo32.
Figur 1: Princippet om den ekstracellulære FD-glucose udtømningsmetode. Celler dyrket i 96-brøndformat er egnede til dette assay. For at overleve optager celler glukose, og denne tilstrømning reducerer niveauerne af ekstracellulær glukose. Udskiftningen af glukose med FD-glucose muliggør overvågning af disse ændringer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udtømning af ekstracellulær FD-glucose korreleret med den intracellulære optagelse in vitro. 3T3-L1 preadipocytter blev inkuberet i et glucosefrit medium i 40 minutter før inkubation med forskellige koncentrationer af FD-glucose med og uden insulin (1,7 mM; 40 min inkubation). (A, B) Dosisafhængig optagelse af FD-glucose (A) og ekstracellulær FD-glucose udtømning (B) i kontrol (dvs. uden insulin) (klækkede stænger) og insulinstimulerede celler (sorte stænger). FD-glucoseoptagelsen blev normaliseret af proteinkoncentrationer. Data vises som % af værdien målt i kontrol inkuberet uden FD-glucose (gennemsnitlig SD, n = 8 pr. tilstand). Signifikansen blev undersøgt ved uparret t-test. (C) Korrelation mellem intracellulær og ekstracellulær FD-glucose (%) måler med (firkanter) eller uden (cirkler) insulin i forsøg beskrevet i (A) og (B). Pearson korrelation, P < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kinetik af ekstracellulær FD-glucose udtømning i forskellige organer ex vivo. (A-C) Lepob mus blev injiceret med køretøj (PBS, n = 4), insulin (12 IE / kg BW, n = 3) og AAC2 (1 nmol / g BW, n = 3). Efter 15 minutter blev væv dissekeret og isoleret. Explants af (A) visceralt fedt, (B) lever og (C) hjerne blev inkuberet i FD-glucose (0,29 mM). Kinetikken af ekstracellulær glucoseudtømning blev målt i aliquoter af mediet på forskellige tidspunkter. Data (gennemsnitlig SD) vises som % fluorescens i hvert organ ved 0 minutters inkubation. Signifikans P < 0,05, uparret t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning/medium | Komponenter |
| Ethanol:DMSO (1:1/v/v) | Ethanol (200 μL) og DMSO (200 μL) i 1-1,5 ml rør; brug ethanol af cellekulturkvalitet og DMSO |
| Mellem 1 | DMEM (89 ml), penicillin/streptomycin (1 %) (1 ml) og kalveserum (10 %) (10 ml) i sterilt 50 ml rør |
| Centrifugering Medium 2 | DMEM (89 ml), penicillin/streptomycin (1 %) (1 ml) og bovint serum (10 %) (10 ml) i sterilt 50 ml rør |
| Opbevaring FD-glucoseopløsning 5 mg / ml (14,5 mM) | FD-glucose (1 mg) og ethanol: DMSO (1: 1 / v / v) (200 μL) i 0,5 ml rør; lagre ved -80 °C, fortrinsvis i argon- eller nitrogenatmosfære |
| Arbejdende FD-glucoseopløsning 5 μg/ml (14,5 mM) | Opbevaring FD glucoseopløsning 5 mg / ml (1 μL), glucosefri DMEM (999 μL); forbered dig umiddelbart før eksperimentet. |
Tabel 1: Fremstilling af kulturmedier og FD-glucoseopløsninger.
| Fortynding | Kontrol | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Koncentration (μg/ml) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| Glukosefri DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD-glucose 5 μg/ml (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tabel 2: Fremstilling af FD-glucoseopløsninger med forskellige koncentrationer til forsøg vist i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den direkte sammenligning af ekstracellulær FD-glucose udtømning med normaliseret intracellulær glukoseoptagelse i cellekultur viste en høj korrelation, hvilket tyder på, at ekstracellulær glukoseudtømning kunne være en surrogatmåling til vurdering af glukoseoptagelse. Målingen af ekstracellulær FD-glucose kan anvende en bred vifte af FD-glucosekoncentrationer, også 0,5-2,5 μg FD-glucose / ml synes at give det optimale interval. Ekstracellulær FD-glucose kræver ikke normalisering til celleantal eller proteinkoncentrationer, der er nødvendige for intracellulær FD-glucoseoptagelse. Den forventede begrænsning af ekstracellulære FD-glukosemålinger er undersøgelsen af reaktive iltartsfremkaldende midler og spor af blod i explants, der kan slukke fluorescens. Andre miljøfaktorer, der påvirker fluorescens, såsom lys, bør også overvejes. Langvarig håndteringstid, der kræves, mens du bruger flere vævseksplosioner, kan kompromittere vævets levedygtighed og glukosemetabolisme. Dette kan være en yderligere begrænsning. De udskårne væv skal være i et lille størrelsesområde (50-300 mg) for at tillade permeabilitet af glukose inde i vævet. Samtidig håndtering af væv af flere operatører kan reducere håndteringstiden. Selvom vi ikke målte glukoseoptagelsen i vævseksplosatorerne, tyder de akkumulerede observationer i dyrkede vævseksplosatorer på, at de overlever i det glukoseholdige medium i op til 17 dage med det progressive tab af funktionalitet33. I denne protokol tillader den korte inkubationstid for explants overvågning af glukosemetabolisme i relativt funktionelle væv. I væv med kompleks cellulær organisation, såsom hjernen, udgør størrelsen en uløselig begrænsning, fordi opløsningen af komplekst væv og resulterende celledød påvirker glukoseoptagelsen. Inkubationen af hjernen i 24 timer er imidlertid tidligere blevet anvendt til identifikation af endogen reguleringsmekanisme, der understøtter relativ fysiologisk funktionalitet af udskåret musehjerne i glukoseholdigt medium34. Uanset hvad kan den forenklede procedure og lette tilgængelighed af ekstracellulær FD-glucose tillade brug af dette assay i et format med høj kapacitet. Sammenligningen af basisk og insulinstimuleret ekstracellulær FD-glucoseudtømning antyder, at dette assay kan anvendes til at identificere humorale, ernæringsmæssige, patogene, miljømæssige faktorer eller farmaceutiske lægemidler, der regulerer glukoseoptagelsen. Selvom dette assay forenkler opdagelsen, krævede resultaterne validering med den kvantitative radiomærkning20 analysemetoder 21,22,23 og / eller billeddannelsesmetoder 5,24 for streng mekanistisk belysning af veje.
De kritiske trin i denne protokol inkluderer optimering af sammenløb og fastetid, der påvirker både basal og stimuleret FD-glukoseoptagelse. Disse parametre kan også blive påvirket af sæson baseret på forfatternes observationer. Desuden bruger forskellige celletyper specifikke mekanismer til glukoseoptagelse, herunder forskellige glukosetransportører og regulatoriske hormon / receptorinteraktioner 32,35,36. Derfor skal der tages hensyn til andre positive kontroller end insulin for cellekulturer, der repræsenterer andet væv end muskel- eller fedtvæv reguleret af insulin/GLUT4-akser. Fejlfindingen omfatter også justering af cellesammenløb og optimering af tiden til faste/genfodring med FD-glukose. Derudover kan følsomheden af ekstracellulær glukosemåling forbedres ved at reducere niveauerne af ekstracellulær FD-glucose under hensyntagen til de tærskelniveauer, der kræves for glukoseoptagelse. Eksperimentet beskrevet i figur 2 kan hjælpe forskere med at tilpasse dette assay til brug med andre cellekulturer eller fejlfinding.
Den iboende variabilitet af glukosemetabolisme krævede også en højere prøvestørrelse (n = 5-8). Selvom ekstracellulære målinger af FD-glucosetab udviste samme nøjagtighed som intracellulær optagelse af FD-glucose normaliseret af protein, kan normaliseringen reducere assayvariationen. Ud over måling af proteinkoncentrationer kan måling af DNA-indhold i cellen være en anden pålidelig surrogatvurdering af celle nummer37.
Ekstracellulær FD-glucose er tilgængelig for kinetiske målinger. Her er der udviklet en simpel procedure for kinetiske målinger af ekstracellulær FD-glucose for at identificere organspecifikke reaktioner på mediatorer af glukoseoptagelse. Disse ex vitro-undersøgelser kan direkte teste organrespons på forskellige stimuli in vivo, der kombineres med organers eksponering for FD-glucose og ex vivo kinetiske målinger, som vist i figur 3. Selv om ex vivo-undersøgelser ikke fuldt ud ligner in vivo-betingelser , har de flere fordele. Organeksplosatorer opretholder kompleks flercellet primær cellestruktur, i modsætning til udødelige cellekulturer, der udviser ændret genekspression. Moderne lægemiddeludvikling anvender modelorganismer, indirekte vurdering af glukoseoptagelse baseret på transkriptom eller metabolom22, omfattende insulinklemmeteknik38 eller dyr billeddannelse32. Selvom måling af ekstracellulær FD-glucose i udplantede organer ikke vil erstatte disse teknologier, vil det give en hurtig vurdering af forbindelse, metabolit og gener for at lette opdagelsen af nye terapeutiske mål, der regulerer glukoseoptagelsen på en vævsspecifik måde. Udviklingen af sikre terapier, der adresserer glukosemetabolisme i specifikke væv, kan tilbyde en løsning til kræft, demens, aldring, diabetes, autoimmune sygdomme, fedme og andre relaterede applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen problemer at afsløre og har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Projektet blev støttet af Ralph og Marian Falk Medical Research Catalyst Award og Kathleen Kelly Award. Andre støtter omfattede National Center for Research Resources UL1RR025755 og NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Roadmap for Medical Research. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Center for Research Resources eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization.
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
