Summary
Внеклеточное истощение флуоресцентно меченой глюкозы коррелирует с поглощением глюкозы и может быть использовано для высокопроизводительного скрининга поглощения глюкозы в иссеченных органах и клеточных культурах.
Abstract
Продолжающаяся во всем мире эпидемия диабета увеличивает спрос на выявление экологических, пищевых, эндокринных, генетических и эпигенетических факторов, влияющих на поглощение глюкозы. Измерение внутриклеточной флуоресценции является широко используемым методом для проверки поглощения флуоресцентно меченой глюкозы (FD-глюкозы) в клетках in vitro или для визуализации тканей, потребляющих глюкозу in vivo. Этот анализ оценивает поглощение глюкозы в выбранный момент времени. Внутриклеточный анализ предполагает, что метаболизм FD-глюкозы медленнее, чем метаболизм эндогенной глюкозы, которая участвует в катаболических и анаболических реакциях и передаче сигналов. Однако динамический метаболизм глюкозы также изменяет механизмы поглощения, что потребует кинетических измерений поглощения глюкозы в ответ на различные факторы. В данной статье описан метод измерения внеклеточного истощения FD-глюкозы и подтверждена его корреляция с внутриклеточным поглощением FD-глюкозы в клетках и тканях ex vivo. Внеклеточное истощение глюкозы может быть потенциально применимо для высокопроизводительных кинетических и дозозависимых исследований, а также для выявления соединений с гликемической активностью и их тканеспецифическими эффектами.
Introduction
Спрос на измерение поглощения глюкозы растет вместе с острой необходимостью борьбы с эпидемическим ростом множества заболеваний, зависящих от метаболизма глюкозы. Основные механизмы дегенеративных метаболических заболеваний, неврологических и когнитивных расстройств1, воспалительных2 и инфекционных заболеваний3, рака 4,5, а также старения6 зависят от метаболизма глюкозы для получения энергии и ее хранения, анаболических процессов, модификации белка и генов, передачи сигналов, регуляции генов и синтеза и репликации нуклеиновых кислот 7,8,9 . Сахарный диабет (СД) напрямую связан с нарушением регуляции поглощения глюкозы. СД представляет собой спектр хронических заболеваний, таких как сахарный диабет 1 типа, -2 и -3, гестационный диабет, диабет зрелости молодых людей и другие типы этого заболевания, вызванные экологическими и / или генетическими факторами. В 2016 году первый Глобальный доклад ВОЗ о диабете продемонстрировал, что число взрослых, живущих с наиболее распространенным СД, увеличилось почти в четыре раза с 1980 года до 422 миллионов взрослых10, и это число пациентов с СД растет экспоненциально в течение последних нескольких десятилетий. Только в 2019 году, по оценкам, 1,5 миллиона смертей были непосредственно вызваны СД10. Этот резкий всплеск связан с ростом СД 2 типа и условиями, приводящими к нему, включая избыточный вес и ожирение10. Пандемия COVID-19 выявила двукратное увеличение смертности у пациентов с СД по сравнению с населением в целом, что свидетельствует о глубокой, но плохо изученной роли метаболизма глюкозы в иммуннойзащите 3. Профилактика, ранняя диагностика и лечение СД, ожирения и других заболеваний требуют оптимизации измерений поглощения глюкозы различными тканями и выявления факторов окружающей среды11, питания12, эндокриннойсистемы 13, генетической14 и эпигенетической15 факторов, влияющих на поглощение глюкозы.
В исследованиях внутриклеточное и/или тканевое поглощение глюкозы обычно измеряется флуоресцентно меченой глюкозой (FD-глюкоза) in vitro 16,17,18 и in vivo19. FD-глюкоза стала предпочтительным методом по сравнению с более точными методами с использованием радиоактивно меченой глюкозы20, аналитического масс-спектроскопического анализа21, метаболомики22, методов ядерного магнитного резонанса23 и позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ / КТ) 5,24. В отличие от поглощения глюкозы FD, аналитические методы, требующие большего количества биологического материала, могут включать многоступенчатую подготовку образцов, дорогостоящие инструменты и сложный анализ данных. Эффективные и недорогие измерения поглощения FD-глюкозы в клеточных культурах использовались в экспериментах по доказательству концепции и могут потребовать подтверждения другими методами.
Основой применения FD-глюкозы для исследований поглощения глюкозы является сниженный метаболизм FD-глюкозы по сравнению с эндогенной глюкозой25. Тем не менее, как эндогенная глюкоза, так и FD-глюкоза динамически распределяются между всеми клеточными компартментами для использования в анаболических, катаболических и сигнальных процессах. Компартментализация и зависящая от времени обработка25 FD-глюкозы вмешиваются в измерения флуоресценции и представляют собой основные ограничивающие факторы для использования этого анализа в высокопроизводительных скрининговых экспериментах, кинетическом анализе, 3D-культуре клеток, ко-культурах и экспериментах с тканевым эксплантом. Здесь мы приводим данные, демонстрирующие высокую корреляцию между внеклеточным истощением FD-глюкозы и ее внутриклеточным поглощением, предполагая внеклеточное истощение FD-глюкозы в качестве суррогатного измерения внутриклеточного поглощения глюкозы. Измерение внеклеточного истощения глюкозы было применено для подтверждения тканеспецифических различий в поглощении глюкозы у мышей, получавших инсулин и экспериментальный препарат18 , чтобы обеспечить доказательство принципа этого метода.
Текущий протокол описывает внутриклеточные и внеклеточные (рисунок 1) измерения поглощения глюкозы FD в клетках 3T3-L1. Разделы протокола 1-7 объясняют культуру и рост клеток в течение 48 ч; клеточное голодание, стимуляция и базовые внеклеточные измерения; и постстимуляционные измерения внеклеточной FD-глюкозы и внутриклеточные измерения FD-глюкозы и белка. Раздел 8 протокола описывает измерение ex vivo внеклеточного поглощения FD-глюкозы в тканях, рассеченных у мышей ob/ob в присутствии и отсутствии инсулина и аминокислотного соединения 2 (AAC2), описанного в другом месте18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Огайо (OSU, протокол 2007A0262-R4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться в шкафу биобезопасности класса II с включенным воздуходувкой и выключенным светом.
1. Подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы перечислены в Таблице материалов.
- Готовят среду 1, центрифугированную среду 2, а также растворы для хранения и рабочих растворов флуоресцентной 2-дезокси-2-[(7-нитро-2,1,3-бензокадиазол-4-ил)амино]-D-глюкозы (2-NBDG или FD-глюкозы) согласно Таблице 1 в шкафу биобезопасности класса II. Защитите FD-глюкозу от света на протяжении всего эксперимента, выключив все огни под капотом.
- Используйте готовые к использованию реагенты для клеточных культур: трипсин-ЭДТА, фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) и не содержащий глюкозы и фенола red-free's Modified Eagle Medium от Dulbecco (далее — dmEM без глюкозы).
- Используйте 20 мл буфера лизиса радиоиммунопреципитации (RIPA).
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах внеклеточное истощение и внутриклеточное поглощение различных доз FD-глюкозы сравниваются в фибробластах 3T3-L1 с стимуляцией инсулина и без нее (рисунок 2).
2. 3T3-L1 клеточная культура и поддержание
- Культивируйте фибробласты мыши 3T3-L1 путем покрытия 1 х 106 клеток, разбавленных в 20 мл среды 1 в двух 96-луночных пластинах. Пластина 100 мкл клеточной суспензии на лунку, обеспечивающая поддержание однородности этой суспензии путем перемешивания. Выращивайте клетки в течение 48 ч в инкубаторе 37 °C (5% CO2 и 95% влажности) без изменения среды до слияния около 70%-80%.
- Поддерживайте клетки сливающимися и постными, культивируя их в одной и той же среде в течение 48 ч. Варьируйте время инкубации от 24-72 ч в зависимости от желаемого катаболического состояния натощак.
3. Голодание клеток 3T3-L1
- Декант среды из ячеек в 96-луночных пластинах. Впитайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами.
- Промыть 96-луночную пластину 100 мкл PBS на скважину и впитать оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами.
- Добавьте 100 мкл бессглюкового DMEM на лунку и инкубируйте в течение 40 мин. Регулируйте время инкубации в зависимости от типа клеток, стимулов и желаемого уровня голодания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может потребовать оптимизации в зависимости от сезона.
4. Приготовление растворов FD-глюкозы с различными концентрациями
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент на рисунке 2 исследует внеклеточные и межклеточные среды со стимуляцией инсулином и без нее.
- Используйте восемь реплик (один ряд в 96-луночной пластине) для каждого условия стимуляции. Поэтому подготовьте по 1 мл для каждого условия стимуляции (указанного в таблице 2 и ниже).
- Используйте восемь состояний стимуляции без инсулина: FD-глюкоза 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл и 0 мкг/мл (контроль без FD-глюкозы) в одной 96-луночной пластине.
- Используйте восемь состояний стимуляции инсулином (10 мкг/мл, конечная концентрация): FD-глюкоза 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл и 0 мкг/мл (контроль без FD-глюкозы) в другой 96-луночной пластине.
- Для подготовки условий стимуляции разводят 1 мкл 5 мг/мл рабочего раствора ФД-глюкозы (таблица 1) в 999 мкл бессглюкового ДМЭМ для получения 1 мл рабочего раствора (разведение 1:1000 или 5 мкг/мл).
- Используя этот рабочий раствор, приготовьте разведения FD-глюкозы 1:2000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 и 1:100 000 для получения 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,1 мкг/мл и 0,05 мкг/мл (таблица 2) непосредственно перед экспериментами в шкафу биобезопасности без освещения.
- Повторите этап 4.4 и добавьте 1 мкл инсулина (10 мг/мл, конечная концентрация) к каждому из условий, указанных выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация инсулина в этих образцах составляет 10 мкг/мл = 1,7 нмоль/мл. Для достижения гомогенизации добавляют инсулин в пробирки перед добавлением других растворов.
5. Лечение голодающих клеток 3T3-L1
- После 40 мин инкубации декантируйте бессглюкообразный DMEM из каждой лунки в 96-луночные пластины и впитайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами.
- Добавьте 100 мкл (на скважину) из различных условий обработки, описанных выше, к скважинам вдоль одной колонны и 100 мкл (на скважину) из того же условия обработки к скважинам вдоль ряда (восемь реплик) в обеих 96-луночных пластинах. Пометьте пластины, которые использовали условия с инсулином и без него. Добавьте только безглюковый DMEM в контрольные колодцы (n = 8).
- Инкубируйте пластину в течение 40 мин в инкубаторе клеточной культуры (37 °C, 5% CO2 и 95% влажности) в темноте.
6. Внеклеточные и межклеточные измерения для стимулированных клеток 3T3-L1
- После того, как клетки были стимулированы в течение 40 мин, перенесите стимулирующие среды с обеих пластин в новые 96-луночные пластины, сохраняя ту же экспериментальную компоновку.
- Деканировать любой оставшийся раствор из оригинальных стимулированных 96-луночных пластин с ячейками на стерильных бумажных полотенцах.
- Опционально промыть ячейки с помощью PBS. Удалите PBS и нанесите оставшийся раствор на стерильные бумажные полотенца.
- Добавьте 100 мкл буфера лизиса RIPA в каждую скважину. Необязательно добавьте ингибитор протеазы в буфер RIPA для защиты белков. Поместите пластины, содержащие RIPA, в шейкер на 30 мин.
- Используя микропластинчатый считыватель (Таблица материалов), измеряют флуоресценцию при возбуждении (Ex) и излучении (Em) длин волн 485 и 535 нм соответственно сначала в среде, содержащей внеклеточную FD-глюкозу, а затем на пластине с RIPA-лизированными клетками в конце 30 мин инкубации (см. этап 6.4).
7. Нормализация внутриклеточного поглощения глюкозы на белковой основе
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриклеточное поглощение глюкозы FD зависит от количества клеток. Уровни белка в клеточных лизатах пропорциональны количеству клеток, что позволяет нормализовать внутриклеточные уровни FD-глюкозы до количества клеток в каждой лунке.
- Выполните анализ белка BCA в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Количественно оцените концентрации белка в каждой лунке, содержащей RIPA-лизированные клетки.
- Используйте 10 мкл гомогената RIPA и измеряйте концентрации белка в трех экземплярах для повышения точности измерений в 96-луночных пластинах.
- Количественная оценка белка на основе белковых стандартов (0, 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мкг/мл белка), проанализированных вместе с образцами на каждой 96-луночной пластине.
- Измерьте абсорбцию при 562 нм и количественно оцените концентрации белка в каждом образце на основе формулы линейной регрессии, полученной для белкового стандарта.
- Нормализовать уровни внутриклеточной FD-глюкозы с помощью флуоресцентного значения/концентрации белка в каждой лунке. Внеклеточное FD-истощение глюкозы не требует нормализации.
- При необходимости используйте средние базовые значения в контрольных выборках для дополнительной нормализации (100%).
8. Ex vivo измерение внеклеточного истощения глюкозы FD в органах
- Предварительно обработайте мышей соединениями, стимулирующими метаболизм глюкозы перед рассечением органа, следующим образом.
- Используйте девятинедельный Lepob самцов мышей (n = 11). Кормите всех мышей регулярной диетой чау-чау перед экспериментом.
- Назначают мышам случайным образом в три группы для внутрибрюшинных (в..) инъекций.
- Вводят мышам из контрольной группы Lepob 0,1 мл стерильного PBS (n=4).
- Вводят мышам из группы инсулина Lepob 0,1 мл стерильного PBS, содержащего 12 МЕ человеческого инсулина на грамм массы тела (BW) (n=3).
- Вводят мышам из группы AAC2 Lepob 0,1 мл стерильного PBS, содержащего 0,1 нмоль AAC2 на грамм массы тела (BW) (n = 4).
- Через 15 мин подвергают мышей вдыханию 5% изофлурана и экссангинатной крови путем пункции сердца у обезболенных животных26.
- Рассечение висцеральной эпидидимальной белой жировой ткани (200 мг), печени (200 мг) и всего мозга каждого животного. Используйте капюшон биобезопасности класса II для обработки тканей.
- Готовят FD-глюкозу (0,29 мМ) рабочим раствором в бессглюковом DMEM в шкафу биобезопасности класса II без света.
- Измеряют флуоресценцию рабочего раствора FD-глюкозы (0,29 мМ) при волнах возбуждения и излучения 485 и 535 нм соответственно с помощью микропластинчатого считывателя.
- Инкубируйте извлеченные ткани/органы в 6-луночной пластине, содержащей PBS, в течение 1 мин. Обработайте каждую ткань или орган в отдельном колодце.
- Через 1 мин поместите каждую салфетку на стерильное бумажное полотенце, чтобы впитать PBS. Переведите ткани/органы в отдельную 6-луночную пластину, содержащую 4000 мкл бессглюкового ДМЭМ, и инкубируйте в течение 2 мин.
- Через 2 мин удалить и перенести ткани в лунки из 6-луночной пластины, содержащей 0,29 мМ FD-рабочего раствора глюкозы (1 мл/лунка). Инкубируют 6-луночные пластины, содержащие ткани, в рабочем растворе FD-глюкозы при 37 °C (5% CO2 и 95% влажности).
- Собирают 100 мкл рабочего раствора FD-глюкозы из каждой лунки после 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 мин инкубации, чтобы проанализировать кинетику внеклеточного истощения глюкозы FD. Встряхните до и после сбора.
- Перенесите 100 мкл рабочего раствора FD-глюкозы в 96-луночные пластины для измерения флуоресценции при волнах возбуждения и излучения 485 и 535 нм соответственно с помощью микропластичного считывателя.
- Нормализуйте флуоресценцию до значения 0 мин (100%) для каждого органа у каждого животного (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Внутриклеточное потребление и внеклеточное истощение глюкозы измеряли в преадипоцитах 3T3-L1 в ответ на различные концентрации FD-глюкозы (рисунок 2) с стимуляцией инсулина и без нее. Рисунок 2А демонстрирует дозозависимое увеличение внутриклеточного поглощения FD-глюкозы, которое было значительно увеличено в присутствии инсулина. Сопутствующее снижение внеклеточной FD-глюкозы в тех же клетках показано на рисунке 2B, где стимуляция инсулина привела к значительному снижению внеклеточного уровня глюкозы FD по сравнению с образцами без стимуляции инсулина. Внутриклеточное потребление FD-глюкозы коррелировало с внеклеточным истощением FD-глюкозы дозозависимым образом в образцах с инсулином и без него (рисунок 2C). Таким образом, внеклеточное истощение FD-глюкозы может измерять изменение поглощения глюкозы с сопоставимой точностью (R2 = 0,99, P < 0,001) с внутриклеточным поглощением глюкозы FD.
Затем была разработана экспериментальная установка для проверки внеклеточного применения поглощения глюкозы FD в кинетических исследованиях, изучающих различные ткани при стимуляции каноническими и экспериментальными индукторами поглощения глюкозы (рисунок 3). Мы выбрали мышиную модель резистентности к инсулину Lepob в периферических тканях, включая висцеральную белую жировуюткань 27,28. Хорошо установленные реакции на инсулин у этих мышей сравнивали с эффектами нового соединения AAC2, действующего как на периферические, так и на нервные ткани через рецептор лептина и транспортер глюкозы GLUT1 зависимые механизмы18. Мышам Lepob вводили инсулин или AAC2. Органы рассекались через 15 мин после инъекции. Затем кинетика внеклеточного истощения FD-глюкозы была изучена в висцеральном жире, печени и мозге ex vivo (рисунок 3). В соответствии с сообщенной резистентностью к инсулину в периферических тканях внеклеточная FD-глюкоза не истощалась в нестимулированном контрольном висцеральном жире в течение 120 мин инкубации (рисунок 3А). Напротив, предварительная обработка мышей инсулином или AAC2 перед рассечением приводила к значительному истощению внеклеточной FD-глюкозы в течение временного интервала 30 мин и 60 мин соответственно.
Поглощение глюкозы печенью использует транспортеры глюкозы, включая GLUT2, что не зависит от стимуляции инсулина29,30. Соответственно, внеклеточная FD-глюкоза первоначально не была истощена в инсулин-стимулированных эксплантах печени по сравнению с нестимулированными эксплантами печени (Рисунок 3B), хотя значительное истощение FD-глюкозы наблюдалось после 120 мин инкубации в экспланте печени, стимулируемом инсулином, по сравнению с исходными уровнями (0 мин). С другой стороны, внеклеточная глюкоза FD была значительно снижена зависящим от времени образом в эксплантатах печени, предварительно обработанных AAC2.
В головном мозге основным транспортером является GLUT1 среди других транспортеров31. Кинетика истощения FD-глюкозы разительно отличалась в мозге по сравнению с другими тканями (рисунок 3C). Значительное истощение глюкозы наблюдалось во внеклеточной среде, содержащей необработанный мозг, после 60 мин инкубации (от 100% при 0 мин до 78%). Среда, инкубированная с мозгом мышей Lepob , получавших инсулин, показала умеренное, но значительное линейное снижение FD-глюкозы (со 100% через 0 мин до 95%). AAC2-стимулируемый мозг приводит к глубокому быстрому снижению внеклеточной FD-глюкозы в течение первых 20 мин (со 100% через 0 мин до 67,4%). Вместе измерения внеклеточного истощения глюкозы подтверждают ранее сообщенные различия в поглощении глюкозы в этих тканях in vivo32.
Рисунок 1: Принцип внеклеточного метода FD-глюкозоразрушающего истощения. Клетки, культивируемые в 96-луночном формате, подходят для этого анализа. Чтобы выжить, клетки поглощают глюкозу, и этот приток снижает уровень внеклеточной глюкозы. Замена глюкозы на FD-глюкозу позволяет контролировать эти изменения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Истощение внеклеточной FD-глюкозы коррелировало с внутриклеточным поглощением in vitro. Преадипоциты 3T3-L1 инкубировали в безглюсодержащей среде в течение 40 мин перед инкубацией с различными концентрациями FD-глюкозы с инсулином и без него (1,7 мМ; инкубация 40 мин). (А, Б) Дозозависимое поглощение FD-глюкозы (A) и внеклеточное FD-истощение глюкозы (B) в контроле (т.е. без инсулина) (заштрихованные батончики) и инсулин-стимулированные клетки (черные полосы). Поглощение глюкозы FD нормализовалось концентрациями белка. Данные показаны в % от значения, измеренного в контрольной инкубации без FD-глюкозы (среднее значение SD, n = 8 на состояние). Значимость исследовалась с помощью непарного т-теста. (C) Корреляция между внутриклеточным и внеклеточным FD-глюкозой (%) измеряется с (квадратами) или без (кругами) инсулина в экспериментах, описанных в (A) и (B). Корреляция Пирсона, P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Кинетика внеклеточного FD-истощения глюкозы в различных органах ex vivo. (А-С) Мышам Lepob вводили транспортный (PBS, n = 4), инсулин (12 МЕ/кг BW, n = 3) и AAC2 (1 нмоль/г BW, n = 3). Через 15 мин ткани рассекали и изолировали. Экспланты (А) висцерального жира, (В) печени и (С) мозга инкубировали в FD-глюкозе (0,29 мМ). Кинетику внеклеточного истощения глюкозы измеряли в аликвотах среды в разные моменты времени. Данные (среднее значение SD) показаны как % флуоресценции в каждом органе через 0 мин инкубации. Значение P < 0,05, непарный T-тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение/Среда | Компоненты |
| Этанол: DMSO (1: 1 / v / v) | Этанол (200 мкл) и ДМСО (200 мкл) в пробирке 1-1,5 мл; использовать этанол клеточной культуры и ДМСО |
| Средний 1 | DMEM (89 мл), пенициллин/стрептомицин (1%) (1 мл) и сыворотка теленка (10%) (10 мл) в стерильной 50 мл пробирке |
| Центрифугированная среда 2 | DMEM (89 мл), пенициллин/стрептомицин (1%) (1 мл) и бычья сыворотка (10%) (10 мл) в стерильной 50 мл пробирке |
| Хранение FD-раствор глюкозы 5 мг/мл (14,5 мМ) | FD глюкоза (1 мг) и этанол: DMSO (1: 1 / v / v) (200 мкл) в пробирке 0,5 мл; хранить при -80 °C, преимущественно в атмосфере аргона или азота |
| Рабочий раствор глюкозы FD 5 мкг/мл (14,5 мМ) | Хранение раствора глюкозы FD 5 мг/мл (1 мкл), глюкозобезопасного ДМЭМ (999 мкл); подготовить непосредственно перед экспериментом. |
Таблица 1: Приготовление питательных сред и растворов FD-глюкозы.
| Разбавление | Контроль | 1:2х103 | 1:5х103 | 1:1х104 | 1:2.5х104 | 1:5х104 | 1:1х105 |
| Концентрация (мкг/мл) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| Бессглюкобезодерный DMEM (мкл) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Глюкоза 5 мкг/мл (мкл) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Таблица 2: Приготовление растворов FD-глюкозы с различными концентрациями для экспериментов, показанных на фиг.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прямое сравнение внеклеточного истощения FD-глюкозы с нормализованным внутриклеточным поглощением глюкозы в культуре клеток показало высокую корреляцию, предполагая, что внеклеточное истощение глюкозы может быть суррогатным измерением для оценки поглощения глюкозы. Измерение внеклеточной FD-глюкозы может использовать широкий диапазон концентраций глюкозы FD, также 0,5-2,5 мкг FD-глюкозы / мл, по-видимому, обеспечивают оптимальный диапазон. Внеклеточный FD-глюкоза не требует нормализации количества клеток или концентраций белка, необходимых для внутриклеточного поглощения FD-глюкозы. Ожидаемым ограничением внеклеточных измерений FD-глюкозы является исследование активных агентов, индуцирующих формы кислорода, и следов крови внутри эксплантов, которые могут погасить флуоресценцию. Следует также учитывать другие факторы окружающей среды, влияющие на флуоресценцию, такие как свет. Длительное время обработки, необходимое при использовании нескольких тканевых эксплантов, может поставить под угрозу жизнеспособность тканей и метаболизм глюкозы. Это может быть дополнительным ограничением. Иссеченные ткани должны быть в небольшом диапазоне размеров (50-300 мг), чтобы обеспечить проницаемость глюкозы внутри ткани. Одновременная обработка тканей несколькими операторами может сократить время обработки. Хотя мы не измеряли поглощение глюкозы в тканевых эксплантах, накопленные наблюдения в культивируемых тканевых эксплантатах показывают, что они выживают в глюкозосодержащей среде до 17 дней с прогрессирующей потерей функциональности33. В этом протоколе короткое время инкубации эксплантов позволяет контролировать метаболизм глюкозы в относительно функциональных тканях. В тканях со сложной клеточной организацией, таких как мозг, размер представляет собой неразрешимое ограничение, поскольку распад сложной ткани и, как следствие, гибель клеток влияет на поглощение глюкозы. Однако инкубация мозга в течение 24 ч ранее использовалась для идентификации эндогенного регуляторного механизма, поддерживающего относительную физиологическую функциональность иссеченного мозга мыши в глюкозосодержащей среде34. Несмотря на это, упрощенная процедура и легкий доступ к внеклеточной FD-глюкозе могут позволить использовать этот анализ в высокопроизводительном формате. Сравнение базового и инсулин-стимулированного внеклеточного истощения глюкозы FD предполагает, что этот анализ может быть применен для выявления гуморальных, питательных, патогенных, факторов окружающей среды или фармацевтических препаратов, регулирующих поглощение глюкозы. Хотя этот анализ упрощает открытие, результаты требовали подтверждения с помощью количественной радиомаркировки20 аналитических методов 21,22,23 и/или методов визуализации 5,24 для строгого механистического выяснения путей.
Критические шаги в этом протоколе включают оптимизацию слияния и времени голодания, которые влияют как на базальное, так и на стимулированное поглощение глюкозы FD. На эти параметры также может влиять сезон, основываясь на наблюдениях авторов. Кроме того, различные типы клеток используют специфические механизмы поглощения глюкозы, включая различные транспортеры глюкозы и регуляторные взаимодействия гормонов / рецепторов 32,35,36. Таким образом, положительные контрольные элементы, отличные от инсулина, должны рассматриваться для клеточных культур, представляющих ткани, отличные от мышечной или жировой ткани, регулируемые осями инсулина / GLUT4. Устранение неполадок также включает в себя регулировку слияния клеток и оптимизацию времени для голодания / повторного кормления с помощью FD-глюкозы. Кроме того, чувствительность внеклеточного измерения глюкозы может быть улучшена путем снижения уровня внеклеточной FD-глюкозы с учетом пороговых уровней, необходимых для поглощения глюкозы. Эксперимент, описанный на рисунке 2, может помочь исследователям настроить этот анализ для использования с другими клеточными культурами или устранения неполадок.
Внутренняя изменчивость метаболизма глюкозы также требовала более высокого размера выборки (n = 5-8). Хотя внеклеточные измерения потери FD-глюкозы показали ту же точность, что и внутриклеточное поглощение FD-глюкозы, нормализованной белком, нормализация может снизить вариабельность анализа. Помимо измерения концентраций белка, измерение содержания ДНК в клетке может быть еще одной достоверной суррогатной оценкой клеточного номера37.
Внеклеточный FD-глюкоза доступна для кинетических измерений. Здесь была разработана простая процедура кинетических измерений внеклеточной FD-глюкозы для выявления органоспецифических реакций на медиаторы поглощения глюкозы. Эти исследования ex vitro могут непосредственно проверить реакцию органов на различные стимулы in vivo, которые сочетаются с воздействием на органы FD-глюкозы и кинетических измерений ex vivo , как показано на рисунке 3. Хотя исследования ex vivo не полностью напоминают условия in vivo , они имеют множество преимуществ. Экспланты органов поддерживают сложную многоклеточную первичную клеточную структуру, в отличие от бессмертных клеточных культур, демонстрирующих измененную экспрессию генов. Современная разработка лекарств использует модельные организмы, косвенную оценку поглощения глюкозы на основе транскриптома или метаболома22, комплексный метод инсулинового зажима38 или дорогостоящую визуализацию32. Хотя измерение внеклеточной FD-глюкозы в эксплантированных органах не заменит эти технологии, оно обеспечит быструю оценку соединений, метаболитов и генов, чтобы облегчить открытие новых терапевтических мишеней, регулирующих поглощение глюкозы специфическим для ткани способом. Разработка безопасных методов лечения, направленных на метаболизм глюкозы в конкретных тканях, может предложить решение для рака, деменции, старения, диабета, аутоиммунных заболеваний, ожирения и других связанных применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет проблем с раскрытием и нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Проект был поддержан Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award и Kathleen Kelly Award. Другие виды поддержки включали Национальный центр исследовательских ресурсов UL1RR025755 и NCI P30CA16058 (OSUCCC), Дорожную карту NIH для медицинских исследований. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не отражает официальную точку зрения Национального центра исследовательских ресурсов или NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization.
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
