Summary
O esgotamento extracelular da glicose fluorescente se correlaciona com a absorção de glicose e pode ser usado para triagem de alto rendimento da absorção de glicose em órgãos excisados e culturas celulares.
Abstract
A epidemia mundial de diabetes aumenta a demanda pela identificação de fatores ambientais, nutricionais, endócrinos, genéticos e epigenéticos que afetam a absorção de glicose. A medição da fluorescência intracelular é um método amplamente utilizado para testar a absorção de glicose fluorescente (FD-glicose) em células in vitro, ou para tecidos que consomem glicose em imagens in vivo. Este ensaio avalia a absorção de glicose em um ponto de tempo escolhido. A análise intracelular pressupõe que o metabolismo da fd-glicose é mais lento do que o da glicose endógena, que participa de reações catabólicas e anabólicos e sinalização. No entanto, o metabolismo dinâmico da glicose também altera os mecanismos de absorção, o que exigiria medidas cinéticas de absorção de glicose em resposta a diferentes fatores. Este artigo descreve um método para medir o esgotamento extracelular da glicose FD e valida sua correlação com a absorção intracelular de FD-glicose em células e tecidos ex vivo. O esgotamento extracelular da glicose pode ser potencialmente aplicável para estudos cinéticos e dependentes de doses de alta produtividade, bem como identificar compostos com atividade glicêmica e seus efeitos específicos do tecido.
Introduction
A demanda por medição da absorção de glicose aumenta juntamente com a necessidade crítica de enfrentar um aumento epidêmico em uma infinidade de doenças dependentes do metabolismo da glicose. Os mecanismos subjacentes de doenças metabólicas degenerativas, distúrbios neurológicos e cognitivos1, inflamatório2 e doenças infecciosas3, câncer 4,5, bem como envelhecimento6, dependem do metabolismo de glicose para energia e seu armazenamento, processos anabólicos, inflamação de proteínas e genes, sinalização, regulação de genes e síntese de ácidos nucleicos e replicação 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) está diretamente relacionada ao mau funcionamento da regulação da absorção de glicose. DM é um espectro de doenças crônicas como tipo-1, -2 e -3 diabetes mellitus, diabetes gestacional, diabetes de início de maturidade dos jovens e outros tipos dessa doença induzidas por fatores ambientais e/ou genéticos. Em 2016, o primeiro relatório global da OMS sobre diabetes demonstrou que o número de adultos vivendo com o DM mais difundido quase quadruplicou desde 1980 para 422 milhões de adultos10, e esse número de pacientes com DM tem aumentado exponencialmente nas últimas décadas. Só em 2019, a estimativa de 1,5 milhão de mortes foi diretamente causada pelo DM10. Esse aumento dramático deve-se ao aumento do DM tipo 2 e às condições que o conduzem, incluindo sobrepeso e obesidade10. A pandemia COVID-19 revelou um aumento de duas vezes na mortalidade em pacientes com DM em comparação com a população geral, sugerindo o papel profundo, mas mal compreendido, do metabolismo da glicose na defesa imunológica3. Prevenção, diagnóstico precoce e tratamento de DM, obesidade e outras doenças requerem otimização das medidas de captação de glicose por diferentes tecidos, e identificação de fatores ambientais11, nutricionais12, endócrinos13,genéticos 14 e15 fatores epigenéticos que afetam a captação de glicose.
Em pesquisa, a absorção intracelular e/ou tecidual de glicose é comumente medida por glicose fluorescente (FD-glicose) in vitro 16,17,18 e in vivo19. A fD-glicose tornou-se um método preferido em comparação com métodos mais precisos usando glicose radioativamente rotulada20, análise de espectroscopia de massa analítica21, metabolômica22, métodos de ressonância magnética nuclear23 e tomografia/tomografia computadorizada de emissão de pósitrons (PET/CT)5,24. Ao contrário da absorção de glicose FD, métodos analíticos que requerem mais material biológico podem envolver uma preparação de amostras em várias etapas, instrumentos caros e análise de dados complexos. Medições eficazes e baratas da absorção de FD-glicose nas culturas celulares têm sido utilizadas em experimentos de prova de conceito e podem exigir validação por outros métodos.
A base da aplicação de FD-glicose para estudos de absorção de glicose é o metabolismo reduzido de FD-glicose em comparação com a glicose endógena25. No entanto, tanto a glicose endógena quanto a fd-glicose são distribuídas dinamicamente entre todos os compartimentos celulares para uso em processos anabólicos, catabólicos e de sinalização. A compartimentação e o processamento dependente do tempo25 de FD-glicose interferem nas medidas de fluorescência, e representam os principais fatores limitadores para o uso deste ensaio em experimentos de triagem de alto rendimento, análise cinética, cultura celular 3D, co-culturas e experimentos de explant tecidual. Aqui, fornecemos dados demonstrando uma alta correlação entre o esgotamento extracelular da glicemia FD e sua absorção intracelular, sugerindo o esgotamento extracelular da fd-glicose como uma medida substituta para absorção intracelular de glicose. A medição do esgotamento extracelular da glicose foi aplicada para validar diferenças específicas de tecido na absorção de glicose em camundongos tratados com insulina e uma droga experimental18 para fornecer uma prova de princípio deste método.
O protocolo atual descreve medições intracelulares e extracelulares (Figura 1) da absorção de fd-glicose em células 3T3-L1. As seções de protocolo 1-7 explicam a cultura e o crescimento das células por 48 h; fome celular, estimulação e medidas extracelulares de linha de base; e medidas pós-estimulação de medidas extracelulares de FD-glicose e medidas intracelulares de FD-glicose e proteína. A seção 8 do protocolo descreve a medição ex vivo da absorção extracelular de fd-glicose em tecidos dissecados de camundongos ob/ob na presença e ausência de insulina e composto de aminoácidos 2 (AAC2) descritos em outros lugares18.
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Protocol
Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).
NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um armário de biossegurança classe II com o soprador ligado e as luzes apagadas.
1. Preparação de materiais
NOTA: Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais.
- Prepare o Medium 1, centrifugação Média 2, e soluções de armazenamento e trabalho fluorescentes de fluorescente 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glicose (2-NBDG ou FD-glicose) de acordo com a Tabela 1 em um armário de biossegurança classe II. Proteja a glicose FD da luz durante todo o experimento, desligando todas as luzes sob o capô.
- Use reagentes prontos para a cultura celular: Trypsin-EDTA, soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e sem glicose e sem fenol Dulbecco's Modified Eagle Medium (doravante, DMEM sem glicose).
- Use 20 mL de teste de radioimunoprecipitação (RIPA) tampão de lise.
NOTA: Nas seções a seguir, o esgotamento extracelular e a absorção intracelular de diferentes doses de FD-glicose são comparados em fibroblastos 3T3-L1 com e sem estimulação de insulina (Figura 2).
2. Cultura e manutenção celular 3T3-L1
- Fibroblastos de camundongos 3T3-L1 por revestimento de 1 x 106 células diluídas em 20 mL de Medium 1 em duas placas de 96 poços. Placa 100 μL de suspensão celular por poço, garantindo manter a homogeneidade desta suspensão misturando. Cultivar células por 48 h em uma incubadora de 37 °C (5% de CO2 e 95% de umidade) sem alterar a mídia até cerca de 70%-80% de confluência.
- Mantenha as células confluentes e jejuadas, culminando-as no mesmo meio por 48 h. Varie o tempo de incubação de 24-72 h, dependendo do estado catabólico de jejum desejado.
3. Fome de células 3T3-L1
- Mídia decantada de células nas placas de 96 poços. Absorva o fluido restante usando toalhas de papel estéreis.
- Enxágüe a placa de 96 poços com 100 μL de PBS por poço e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis.
- Adicione 100 μL de DMEM sem glicose por poço e incubar por 40 minutos. Ajuste o tempo de incubação dependendo do tipo celular, estímulos e nível de jejum desejado.
NOTA: O tempo de incubação pode exigir otimização dependendo da estação.
4. Preparação de soluções de FD-glicose com diferentes concentrações
NOTA: O experimento na Figura 2 examina mídias extracelulares e intercelulares com e sem estimulação com insulina.
- Use oito réplicas (uma linha em uma placa de 96 poços) para cada condição de estimulação. Portanto, prepare 1 mL para cada condição de estimulação (especificada na Tabela 2 e abaixo).
- Use oito condições de estimulação sem insulina: FD-glicose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg /mL (controle sem FD-glicose) em uma placa de 96 poços.
- Use oito condições de estimulação com insulina (10 μg/mL, concentração final): FD-glicose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg/mL (controle sem FD-glicose) em outra placa de 96 poços.
- Para preparar as condições de estimulação, diluir 1 μL de solução de trabalho de 5 mg/mL FD-glicose (Tabela 1) em 999 μL de DMEM sem glicose para obter 1 mL de solução de estoque de trabalho (1:1000 diluição ou 5 μg/mL).
- Usando esta solução de estoque de trabalho, prepare 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000, e 1:100.000 diluições de FD-glicose para obter 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,05 μg/mL (Tabela 2) em tubos de 2 mL imediatamente antes de experimentos em um armário de biossegurança sem luzes.
- Repita o passo 4.4 e adicione 1 μL de insulina (10 mg/mL, concentração final) a cada uma das condições especificadas acima.
NOTA: A concentração final de insulina nestas amostras é de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Para alcançar a homogeneização, adicione insulina aos tubos antes de adicionar outras soluções.
5. Tratar células 3T3-L1 famintas
- Após 40 minutos de incubação, decante o DMEM livre de glicose de cada poço em placas de 96 poços e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis.
- Adicione 100 μL (por poço) cada um das várias condições de tratamento descritas acima a poços ao longo de uma coluna, e 100 μL (por poço) da mesma condição de tratamento aos poços ao longo da linha (oito réplicas) em ambas as placas de 96 poços. Rotule as placas que utilizaram as condições com e sem insulina. Adicione DMEM sem glicose sozinho aos poços de controle (n = 8).
- Incubar a placa por 40 minutos em uma incubadora de cultura celular (37 °C, 5% DE CO2 e 95% de umidade) no escuro.
6. Medidas extracelulares e intercelulares para células 3T3-L1 estimuladas
- Depois que as células tiverem sido estimuladas por 40 minutos, transfira a mídia de estimulação de ambas as placas para novas placas de 96 poços mantendo o mesmo layout experimental.
- Decante qualquer solução remanescente das placas originais estimuladas de 96 poços com células em toalhas de papel estéreis.
- Opcionalmente, lave as células com PBS. Remova o PBS e decante qualquer solução restante em toalhas de papel estéreis.
- Adicione 100 μL do tampão de lise RIPA a cada poço. Opcionalmente, adicione o inibidor de protease ao tampão RIPA para proteger as proteínas. Coloque placas contendo RIPA em um shaker por 30 minutos.
- Utilizando um leitor de microplaca (Tabela de Materiais), meça fluorescência na excitação (Ex) e comprimentos de onda (Em) de 485 e 535 nm, respectivamente, primeiro no meio contendo fd-glicose extracelular, e depois, a placa com células ripa-lysed no final de 30 min de incubação (ver passo 6.4).
7. Normalização à base de proteínas da absorção de glicose intracelular
NOTA: A absorção intracelular de glicose FD depende do número da célula. Os níveis de proteína nos lises celulares são proporcionais aos números de células que permitem a normalização dos níveis intracelulares de glicose FD ao número de células em cada poço.
- Realize o ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Quantifique as concentrações proteicas em cada poço contendo células com tinta RIPA.
- Use 10 μL do HOMOGENate RIPA e meça concentrações proteicas em triplicado para aumentar a precisão das medições em placas de 96 poços.
- Quantifique a proteína com base nos padrões proteicos (0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 μg/mL de proteína) analisadas juntamente com amostras em cada placa de 96 poços.
- Meça a absorvância em 562 nm e quantifique concentrações proteicas em cada amostra com base na fórmula de regressão linear obtida para o padrão proteico.
- Normalize os níveis de glicemia intracelular usando valor/concentração de proteína fluorescente em cada poço. O esgotamento extracelular da glicose FD não requer normalização.
- Opcionalmente, use os valores médios da linha de base nas amostras de controle para normalização adicional (100%).
8. Medição ex vivo do esgotamento extracelular da glicose FD em órgãos
- Pré-trar camundongos com compostos estimulando o metabolismo da glicose antes da dissecção do órgão, da seguinte forma.
- Use camundongos machos Lepob de nove semanas de idade (n = 11). Alimente todos os ratos com uma dieta regular de comida antes do experimento.
- Atribua camundongos aleatoriamente em três grupos para injeções intraperitoneais (i.p.).
- Injete camundongos do grupo lepob controle com 0,1 mL de PBS estéril (n = 4).
- Injete camundongos do grupo insulina Lepob com 0,1 mL de PBS estéril, contendo 12 UI insulina humana por grama de peso corporal (BW) (n= 3).
- Injete camundongos do grupo AAC2 Lepob com 0,1 mL de PBS estéril, contendo 0,1 nmol AAC2 por grama de peso corporal (BW) (n = 4).
- Após 15 min, submeter camundongos à inalação de 5% de isoflurane e sangue exsanguinado por punção cardíaca dos animais anestesiados26.
- Disseque tecido adiposo branco epidídmico visceral (200 mgs), fígado (200 mgs) e cérebro inteiro de cada animal. Use uma capa de biossegurança classe II para manuseio de tecidos.
- Prepare a solução de trabalho FD-glicose (0,29 mM) em DMEM sem glicose em um gabinete de biossegurança classe II sem luz.
- Meça a fluorescência da solução de trabalho fd-glicose (0,29 mM) em comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nm, respectivamente, utilizando um leitor de microplaca.
- Incubar os tecidos/órgãos colhidos em uma placa de 6 poços contendo PBS por 1 min. Manuseie cada tecido ou órgão em um poço separado.
- Após 1 min, coloque cada tecido em uma toalha de papel estéril para absorver PBS. Transfira tecidos/órgãos para uma placa separada de 6 poços contendo 4.000 μL de DMEM sem glicose e incubar por 2 min.
- Após 2 min, remova e transfira os tecidos para poços de uma placa de 6 poços contendo solução de trabalho de 0,29 mM FD-glicose (1 mL/well). Incubar as placas de 6 poços contendo tecidos na solução de trabalho fd-glicose a 37 °C (5% DE CO2 e 95% de umidade).
- Colete 100 μL de solução de trabalho fd-glicose de cada poço após 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min de incubação, para analisar a cinética do esgotamento de glicose FD extracelular. Agite antes e depois da coleta.
- Transfira 100 μL de solução de trabalho fd-glicose em placas de 96 poços para medir a fluorescência em comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nm, respectivamente, usando um leitor de microplaca.
- Normalizar a fluorescência ao valor de 0 min (100%) para cada órgão em cada animal (Figura 3).
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Representative Results
A ingestão intracelular e o esgotamento extracelular da glicose foram medidos em pré-adipócitos 3T3-L1, em resposta a diferentes concentrações de FD-glicose (Figura 2) com e sem estimulação de insulina. A Figura 2A demonstra um aumento dependente de dose na absorção intracelular da fd-glicose, que foi significativamente aumentada na presença de insulina. A diminuição concomitante da glicemia de FD extracelular nas mesmas células é mostrada na Figura 2B, onde a estimulação da insulina levou a uma redução significativa dos níveis extracelulares de FD-glicose em comparação com as amostras sem estimulação de insulina. A ingestão intracelular de FD-glicose correlacionada com o esgotamento extracelular da fd-glicose de forma dependente de dose em amostras com e sem insulina (Figura 2C). Assim, o esgotamento extracelular da fd-glicose pode medir uma mudança na absorção de glicose com precisão comparável (R2 = 0,99, P < 0,001) como absorção intracelular de FD-glicose.
Em seguida, foi desenvolvido um cenário experimental para validar a aplicação extracelular de absorção de FD-glicose em estudos cinéticos examinando diferentes tecidos após a estimulação com indutores canônicos e experimentais de absorção de glicose (Figura 3). Selecionamos o modelo lepob mouse de resistência à insulina em tecidos periféricos, incluindo tecido adiposo branco visceral27,28. As respostas bem estabelecidas à insulina nesses camundongos foram comparadas com os efeitos do novo composto AAC2, agindo tanto em tecidos periféricos quanto nervosos através do receptor de leptina e do transportador de glicose GLUT1 mecanismos dependentes18. Lepob camundongos foram i.p. injetados com insulina ou AAC2. Os órgãos foram dissecados 15 minutos após a injeção. Em seguida, a cinética do esgotamento extracelular da FD-glicose foi estudada em gordura visceral, fígado e ex vivo cerebral (Figura 3). De acordo com a resistência à insulina relatada em tecidos periféricos, a glicemia extracelular não foi esgotada em gordura visceral de controle não estimulada durante 120 minutos de incubação (Figura 3A). Em contraste, o pré-tratamento de camundongos com insulina ou AAC2 antes da dissecção levou ao esgotamento significativo da glicemia extracelular de FD dentro de um intervalo de tempo de 30 minutos e 60 min, respectivamente.
A absorção hepática de glicose utiliza transportadores de glicose, incluindo o GLUT2, que é independente da estimulação da insulina29,30. Assim, a glicemia de FD extracelular inicialmente não foi esgotada em explantas hepáticas estimuladas pela insulina em comparação com explants hepáticas não estimuladas (Figura 3B), embora o esgotamento significativo da fd-glicose tenha sido observado após 120 minutos de incubação em explant hepática estimulada com insulina em comparação com os níveis iniciais (0 min). Por outro lado, a glicose FD extracelular foi significativamente diminuída de forma dependente do tempo em explants hepáticas pré-tratadas com AAC2.
No cérebro, o principal transportador é o GLUT1 entre outros transportadores31. A cinética de esgotamento de fd-glicose foi notavelmente diferente no cérebro em comparação com outros tecidos (Figura 3C). O esgotamento significativo da glicose foi observado no meio extracelular contendo o cérebro não tratado após 60 minutos de incubação (de 100% a 0 min a 78%). O meio incubado com cérebros de camundongos lepob tratados com insulina mostrou uma redução linear moderada, mas significativa na glicemia FD (de 100% a 0 min a 95%). Os cérebros estimulados pelo AAC2 levam a uma profunda rápida diminuição da glicemia de FD extracelular durante os primeiros 20 minutos (de 100% a 0 min para 67,4%). Juntas, as medidas de esgotamento extracelular da glicose suportam as diferenças relatadas anteriormente na absorção de glicose nesses tecidos in vivo32.
Figura 1: Princípio do método de esgotamento extracelular FD-glicose. Células cultivadas em formato 96-well são adequadas para este ensaio. Para sobreviver, as células tomam glicose e esse fluxo diminui os níveis de glicose extracelular. A substituição da glicose por FD-glicose permite o monitoramento dessas alterações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esgotamento da glicemia de FD extracelular correlacionada com a absorção intracelular in vitro. 3T3-L1 pré-adipócitos foram incubados em um meio livre de glicose por 40 minutos antes da incubação com diferentes concentrações de FD-glicose com e sem insulina (1,7 mM; incubação de 40 min). (A, B) Absorção dependente de dose de FD-glicose (A) e esgotamento extracelular de fd-glicose (B) no controle (ou seja, sem insulina) (barras eclodidas) e células estimuladas por insulina (barras pretas). A absorção de FD-glicose foi normalizada por concentrações proteicas. Os dados são mostrados como % do valor medido no controle incubado sem FD-glicose (SD médio, n = 8 por condição). A significância foi examinada pelo teste t não pago. (C) Correlação entre medidas intracelulares e extracelulares de FD-glicose (%) com (quadrados) ou sem (círculos) insulina em experimentos descritos em (A) e (B). Correlação de Pearson, P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cinética do esgotamento extracelular de FD-glicose em diferentes órgãos ex vivo. (A-C) Os camundongos lepob foram injetados com veículo (PBS, n = 4), insulina (12 UI/kg BW, n = 3) e AAC2 (1 nmol/g BW, n = 3). Após 15 min, os tecidos foram dissecados e isolados. Explantas de (A) gordura visceral, (B) fígado e (C) cérebro foram incubadas em FD-glicose (0,29 mM). A cinética do esgotamento da glicose extracelular foi medida em alíquotas do meio em diferentes pontos de tempo. Os dados (SD médios) são mostrados como % de fluorescência em cada órgão a 0 min de incubação. Significância P < 0,05, teste t não pago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução/Meio | Componentes |
| Etanol:DMSO (1:1/v/v) | Etanol (200 μL) e DMSO (200 μL) em tubo de 1-1,5 mL; usar etanol de grau de cultura celular e DMSO |
| Meio 1 | DMEM (89 mL), Penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) e soro de bezerro (10%) (10 mL) em tubo estéril de 50 mL |
| Centrifugação Média 2 | DMEM (89 mL), Penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) e soro bovino (10%) (10 mL) em tubo estéril de 50 mL |
| Solução de armazenamento FD-glicose 5 mg/mL (14,5 mM) | Glicose FD (1 mg) e Etanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) em tubo de 0,5 mL; armazenar a -80 °C, preferencialmente sob a atmosfera de argônio ou nitrogênio |
| Solução de glicemia FD de trabalho 5 μg/mL (14,5 mM) | Solução de glicose FD de armazenamento 5 mg/mL (1 μL), DMEM livre de glicose (999 μL); preparar imediatamente antes do experimento. |
Tabela 1: Preparação de mídias culturais e soluções de fd-glicose.
| Diluição | Controle | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentração (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| DMEM sem glicose (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glicose 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tabela 2: Preparação de soluções de FD-glicose com diferentes concentrações para experimentos mostrados na Figura 2.
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Discussion
A comparação direta do esgotamento extracelular da glicose FD com a absorção normalizada de glicose intracelular na cultura celular mostrou uma alta correlação, sugerindo que o esgotamento extracelular da glicose poderia ser uma medida substituta para a avaliação da absorção de glicose. A medição da glicemia de FD extracelular pode usar uma ampla gama de concentrações de glicose FD, também 0,5-2,5 μg FD-glicose/mL parecem fornecer a faixa ideal. A glicemia de FD extracelular não requer normalização para o número celular ou concentrações proteicas necessárias para a absorção intracelular de FD-glicose. A limitação antecipada das medições extracelulares de FD-glicose é a investigação de agentes indutores de oxigênio reativo e os vestígios de sangue dentro de explantas que podem saciar a fluorescência. Outros fatores ambientais que afetam a fluorescência, como a luz, também devem ser considerados. O tempo de manuseio prolongado necessário ao usar múltiplas explants teciduais pode comprometer a viabilidade tecidual e o metabolismo da glicose. Isso pode ser uma limitação adicional. Os tecidos excisados precisam estar em uma faixa de pequeno porte (50-300 mgs) para permitir a permeabilidade da glicose dentro do tecido. O manuseio simultâneo de tecidos por vários operadores pode reduzir o tempo de manuseio. Embora não tenhamos medido a absorção de glicose dentro das explantas teciduais, as observações acumuladas em explantas de tecidocultural sugerem que elas sobrevivem no meio contendo glicose por até 17 dias com a perda progressiva da funcionalidade33. Neste protocolo, o curto tempo de incubação para explants permite monitorar o metabolismo da glicose em tecidos relativamente funcionais. Nos tecidos com organização celular complexa, como o cérebro, o tamanho apresenta uma limitação insolúvel, pois a desintegração do tecido complexo e a morte celular resultante influenciam a absorção de glicose. No entanto, a incubação do cérebro por 24 horas tem sido previamente utilizada para identificação de mecanismo de regulação endógena, suportando a funcionalidade fisiológica relativa do cérebro do camundongo excisado no meio34 contendo glicose. Independentemente disso, o procedimento simplificado e a fácil acessibilidade da glicemia de FD extracelular podem permitir o uso deste ensaio em um formato de alto rendimento. A comparação do esgotamento extracelular de FD-glicose básico e estimulado pela insulina sugere que este ensaio poderia ser aplicado para identificar fatores humorísticos, nutricionais, patogênicos, ambientais ou medicamentos farmacêuticos que regulam a absorção de glicose. Embora este ensaio simplifique a descoberta, os achados exigiram validação com o radiolabeling quantitativo20 métodos analíticos 21,22,23 e/ou métodos de imagem 5,24 para rigorosa elucidação mecanicista das vias.
As etapas críticas deste protocolo incluem a otimização da confluência e do tempo de jejum que influenciam tanto a captação basal quanto a estimulada de FD-glicose. Esses parâmetros também podem ser afetados pela estação com base nas observações dos autores. Além disso, diferentes tipos de células utilizam mecanismos específicos para a absorção de glicose, incluindo diferentes transportadores de glicose e interações hormonais/receptoras regulatórias 32,35,36. Portanto, controles positivos que não sejam insulina precisam ser considerados para as culturas celulares que representam tecidos que não sejam tecidos musculares ou adiposos regulados por eixos de insulina/GLUT4. A solução de problemas também inclui ajustar a confluência celular e otimizar o tempo para jejum/realimentação com fd-glicose. Além disso, a sensibilidade da medição extracelular da glicose poderia ser melhorada reduzindo os níveis de fd-glicose extracelular, levando em consideração os níveis limiares necessários para a absorção de glicose. O experimento descrito na Figura 2 pode ajudar os pesquisadores a personalizar este ensaio para uso com outras culturas celulares ou solução de problemas.
A variabilidade intrínseca do metabolismo da glicose também exigiu um maior tamanho amostral (n = 5-8). Embora as medidas extracelulares da perda de fd-glicose tenham apresentado a mesma precisão que a absorção intracelular de FD-glicose normalizada por proteína, a normalização pode reduzir a variabilidade do ensaio. Além da medição das concentrações proteicas, a medição do conteúdo de DNA na célula pode ser outra avaliação confiável do númerocelular 37.
A glicemia-FD extracelular é acessível para medidas cinéticas. Aqui, um procedimento simples de medidas cinéticas de fd-glicose extracelular foi desenvolvido para identificar respostas específicas de órgãos aos mediadores da absorção de glicose. Esses estudos ex vitro podem testar diretamente a resposta dos órgãos a vários estímulos in vivo que são combinados com a exposição de órgãos a medidas cinéticas FD-glicose e ex vivo , como mostra a Figura 3. Embora os estudos ex vivo não se assemelhe totalmente às condições in vivo , eles têm múltiplas vantagens. Explanações de órgãos mantêm complexa estrutura celular primária multicelular, ao contrário das culturas celulares imortais que exibem expressão genética alterada. O desenvolvimento de medicamentos modernos utiliza organismos modelo, avaliação indireta da absorção de glicose com base em transcriptome ou metabolome22, técnica abrangente de grampo de insulina38 ou imagem cara32. Embora a medição da glicemia de FD extracelular em órgãos explantados não substitua essas tecnologias, fornecerá uma avaliação rápida de compostos, metabólitos e genes para facilitar a descoberta de novos alvos terapêuticos que regulam a absorção de glicose de forma específica do tecido. O desenvolvimento de terapias seguras que abordam o metabolismo da glicose em tecidos específicos pode oferecer uma solução para câncer, demência, envelhecimento, diabetes, doenças autoimunes, obesidade e outras aplicações relacionadas.
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Disclosures
Os autores não têm problemas para divulgar e não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
O projeto foi apoiado por Ralph e Marian Falk Medical Research Catalyst Award e Kathleen Kelly Award. Outros suportes incluíram o Centro Nacional de Recursos de Pesquisa UL1RR025755 e NCI P30CA16058 (OSUCCC), o Roteiro do NIH para Pesquisa Médica. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa as opiniões oficiais do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa ou do NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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