Summary
荧光标记的葡萄糖的细胞外消耗与葡萄糖摄取相关，可用于切除器官和细胞培养物中葡萄糖摄取的高通量筛选。
Abstract
糖尿病的持续全球流行增加了对识别影响葡萄糖摄取的环境，营养，内分泌，遗传和表观遗传因素的需求。细胞内荧光的测量是一种广泛使用的方法，用于在 体外测试细胞中荧光标记的葡萄糖（FD-葡萄糖）的摄取，或用于 在体内对消耗葡萄糖的组织进行成像。该测定在选定的时间点评估葡萄糖摄取。细胞内分析假设FD-葡萄糖的代谢慢于内源性葡萄糖的代谢，内源性葡萄糖参与分解代谢和合成代谢反应和信号传导。然而，动态葡萄糖代谢也会改变摄取机制，这需要对不同因素的葡萄糖摄取进行动力学测量。本文介绍了一种测量细胞外FD-葡萄糖消耗的方法，并验证了其与细胞和组织 离体细胞中细胞内FD-葡萄糖摄取的相关性。细胞外葡萄糖消耗可能潜在地适用于高通量动力学和剂量依赖性研究，以及鉴定具有血糖活性的化合物及其组织特异性作用。
Introduction
对测量葡萄糖摄取的需求随着解决依赖葡萄糖代谢的多种疾病的流行病增加的迫切需要而增加。退行性代谢性疾病、神经和认知障碍1、炎症2 和传染病3、癌症4、5 以及衰老6 的潜在机制取决于葡萄糖代谢的能量及其储存、合成代谢过程、蛋白质和基因修饰、信号传导、基因调节以及核酸的合成和复制7，8，9.糖尿病（DM）与葡萄糖摄取调节功能障碍直接相关。糖尿病是一系列慢性疾病，如1型，-2型和-3型糖尿病，妊娠期糖尿病，年轻人的成熟期发病型糖尿病，以及由环境和/或遗传因素诱导的其他类型的这种疾病。2016年，世卫组织第一份关于糖尿病的全球报告显示，自1980年以来，患有最广泛糖尿病的成年人数量几乎翻了两番，达到4.22亿成年人10人，而这一糖尿病患者人数在过去几十年中呈指数级增长。仅在2019年，估计就有150万例死亡是由10地中海米直接造成的。这种戏剧性的激增是由于2型糖尿病的增加和驱动它的条件，包括超重和肥胖10。COVID-19大流行显示，与普通人群相比，糖尿病患者的死亡率增加了两倍，这表明葡萄糖代谢在免疫防御中的作用深刻但知之甚少3。糖尿病、肥胖症和其他疾病的预防、早期诊断和治疗需要优化不同组织对葡萄糖摄取的测量，并确定影响葡萄糖摄取的环境11、营养12、内分泌13、遗传14 和表观遗传15 个因素。
在研究中，细胞内和/或组织对葡萄糖的摄取通常通过体外16，17，18和体内19中的荧光标记葡萄糖（FD-葡萄糖）来测量。与使用放射性标记葡萄糖20，分析质谱分析21，代谢组学22，核磁共振方法23和正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET / CT）5，24的更精确方法相比，FD-葡萄糖成为首选方法。与FD-葡萄糖摄取不同，需要更多生物材料的分析方法可能涉及多步骤样品制备，昂贵的仪器和复杂的数据分析。细胞培养物中FD-葡萄糖摄取的有效且廉价的测量已被用于概念验证实验，并且可能需要通过其他方法进行验证。
FD-葡萄糖应用于葡萄糖摄取研究的基础是与内源性葡萄糖25相比，FD-葡萄糖的代谢减少。尽管如此，内源性葡萄糖和FD-葡萄糖都动态分布在所有细胞区室中，用于合成代谢，分解代谢和信号传导过程。FD-葡萄糖的区室化和时间依赖性处理25 干扰荧光测量，并且是在高通量筛选实验，动力学分析，3D细胞培养，共培养和组织外植体实验中使用该测定的主要限制因素。在这里，我们提供的数据证明了FD-葡萄糖的细胞外消耗与其细胞内摄取之间存在高度相关性，这表明FD-葡萄糖的细胞外消耗作为细胞内葡萄糖摄取的替代测量。应用葡萄糖细胞外消耗的测量来验证用胰岛素治疗的小鼠和实验药物18 中葡萄糖摄取的组织特异性差异，以提供该方法的原理证明。
目前的方案描述了3T3-L1细胞中FD-葡萄糖摄取的细胞内和细胞外（图1）测量。方案1-7解释了细胞的培养和生长48小时;细胞饥饿，刺激和基线细胞外测量;和细胞外FD-葡萄糖的刺激后测量和FD-葡萄糖和蛋白质的细胞内测量。协议第8部分描述了在存在和不存在胰岛素和氨基酸化合物2（AAC2）的情况下从ob / ob小鼠解剖的组织中FD-葡萄糖的细胞外摄取的体外测量，该方法在其他地方描述18。
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Protocol
动物研究由俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会批准（OSU，协议2007A0262-R4）。
注意：所有程序必须在鼓风机打开和熄灯的II类生物安全柜中完成。
1. 材料准备
注：所有材料均列在 材料表中。
- 根据 表 1，在II类生物安全柜中制备培养基1，离心培养基2，并将荧光2-脱氧-2-[（7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑-4-基）氨基]-D-葡萄糖（2-NBDG或FD-葡萄糖）储存和工作溶液。通过关闭引擎盖下的所有灯，在整个实验过程中保护FD-葡萄糖免受光照。
- 使用即用型细胞培养试剂：胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以及无葡萄糖和无酚红杜贝科的改性 Eagle 培养基（以下简称无葡萄糖 DMEM）。
- 使用20 mL放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液。
注意：在以下部分中，比较了有和没有胰岛素刺激的3T3-L1成纤维细胞中不同FD-葡萄糖剂量的细胞外消耗和细胞内摄取（图2）。
2. 3T3-L1细胞培养与维护
- 通过在两个96 孔板中将稀释在20mL培养基1中的1×10 6个细胞来培养3T3-L1小鼠成纤维细胞。每孔板100μL细胞悬浮液，确保通过混合保持该悬浮液的均匀性。在37°C培养箱（5%CO2 和95%湿度）中培养细胞48小时，而不改变培养基，直到约70%-80%汇合。
- 通过将细胞在同一培养基中培养48小时来维持细胞汇合和禁食。根据所需的空腹分解代谢状态，将孵育时间从24-72小时改变。
3. 3T3-L1细胞饥饿
- 从96孔板中的细胞中滗出培养基。使用无菌纸巾吸收剩余的液体。
- 用每孔100μLPBS冲洗96孔板，并用无菌纸巾吸收剩余的液体。
- 每孔加入100μL无葡萄糖DMEM并孵育40分钟。根据细胞类型，刺激和所需的禁食水平调整孵育时间。
注意：根据季节的不同，孵化时间可能需要优化。
4. 不同浓度FD-葡萄糖溶液的制备
注意： 图2 中的实验检查了有和没有胰岛素刺激的细胞外和细胞间培养基。
- 对每种刺激条件使用八个重复（96孔板中的一行）。因此，为每种刺激条件准备1 mL（在 表2 和下表中指定）。
- 在一个 96 孔板中使用 8 种无胰岛素的刺激条件：2.5 微克/毫升、1 微克/毫升、0.5 微克/毫升、0.2 微克/毫升、0.1 微克/毫升、0.05 微克/毫升和 0 微克/毫升（不含 FD 葡萄糖的对照）。
- 使用八种刺激条件与胰岛素（10微克/毫升，终浓度）：在另一个96孔板中，FD-葡萄糖为2.5微克/毫升，1微克/毫升，0.5微克/毫升，0.2微克/毫升，0.1微克/毫升，0.05微克/毫升和0微克/毫升（不含FD-葡萄糖的对照）。
- 为了制备刺激条件，在999μL无葡萄糖DMEM中稀释1μL5mg / mL FD-葡萄糖工作溶液（表1），以获得1mL工作储备溶液（1：1000稀释或5μg/ mL）。
- 使用该工作储备溶液，在2 mL管中制备1：2000，1：5000，1：10，000，1：25，000，1：50，000和1：100，000稀释的FD-葡萄糖，以获得2.5μg/ mL，1μg/ mL，0.5μg/ mL，0.2μg/ mL，0.1μg/ mL和0.05μg/ mL（表2）在实验前立即在没有灯的生物安全柜中。
- 重复步骤4.4，并向上述每种条件下加入1μL胰岛素（10mg / mL，终浓度）。
注意：这些样品中胰岛素的最终浓度为10微克/毫升= 1.7纳摩尔/毫升。为了实现均质化，在添加其他溶液之前将胰岛素添加到管中。
5. 治疗饥饿的3T3-L1细胞
- 孵育40分钟后，将每个孔中的无葡萄糖DMEM倾倒在96孔板中，并用无菌纸巾吸收剩余的液体。
- 从上述各种处理条件中各向沿一列的孔中加入100μL（每孔），并从相同的处理条件向沿两个96孔板的行孔（8个重复）加入100μL（每孔）。标记利用胰岛素和不含胰岛素的条件的板。将无葡萄糖DMEM单独添加到对照孔中（n = 8）。
- 在黑暗中的细胞培养箱（37°C，5%CO2和95%湿度）中孵育板40分钟。
6. 受激3T3-L1细胞的细胞外和细胞间测量
- 在细胞被刺激40分钟后，将刺激培养基从两个板转移到新的96孔板中，保持相同的实验布局。
- 从原始的受刺激的96孔板中倾析任何剩余的溶液，并在无菌纸巾上加入细胞。
- 或者，用PBS清洗电池。取出PBS并将任何剩余的溶液倒在无菌纸巾上。
- 向每个孔中加入100μL RIPA裂解缓冲液。任选地，将蛋白酶抑制剂添加到RIPA缓冲液中以保护蛋白质。将含有RIPA的板放入振荡器中30分钟。
- 使用酶标仪（材料表），首先在含有细胞外FD-葡萄糖的培养基中分别测量激发（Ex）和发射（Em）波长为485和535nm的荧光，然后在30分钟孵育结束时用RIPA裂解的细胞平板（参见步骤6.4）。
7. 基于蛋白质的细胞内葡萄糖摄取正常化
注意：细胞内FD-葡萄糖摄取取决于细胞数量。细胞裂解物中的蛋白质水平与细胞数量成正比，细胞数量允许将细胞内FD-葡萄糖水平与每个孔中的细胞数量归一化。
- 根据制造商的说明进行BCA蛋白测定（参见 材料表）。量化含有RIPA裂解细胞的每个孔中的蛋白质浓度。
- 使用10μL RIPA匀浆物，一式三份测量蛋白质浓度，以提高96孔板测量的准确性。
- 根据蛋白质标准品（0、10、20、30、40、50 和 60 μg/mL 蛋白质）与每个 96 孔板上的样品一起分析蛋白质定量。
- 测量562nm处的吸光度，并根据为蛋白质标准品获得的线性回归公式量化每个样品中的蛋白质浓度。
- 通过使用每个孔中的荧光值/蛋白质浓度来使细胞内FD-葡萄糖的水平正常化。细胞外 FD-葡萄糖耗竭不需要正常化。
- （可选）使用对照样本中的平均基线值进行额外的归一化 （100%）。
8. 器官细胞外FD葡萄糖消耗的 离体 测量
- 在器官解剖前用刺激葡萄糖代谢的化合物预处理小鼠，如下所示。
- 使用9周大 的Lepob 雄性小鼠（n = 11）。在实验前用常规的chow饮食喂养所有小鼠。
- 将小鼠随机分成三组进行腹膜内（IP）注射。
- 向来自对照 Lepob 组的小鼠注射0.1mL无菌PBS（n = 4）。
- 向来自胰岛素 Lepob 组的小鼠注射0.1mL无菌PBS，每克体重（BW）含有12 IU人胰岛素（n = 3）。
- 向来自AAC2 Lepob 组的小鼠注射0.1mL无菌PBS，每克体重（BW）含有0.1 nmol AAC2（n = 4）。
- 15分钟后，通过心脏穿刺从麻醉动物26中吸入5%异氟醚和血外血。
- 夹层内脏表皮白色脂肪组织（200毫克），肝脏（200毫克）和每只动物的全脑。使用II类生物安全罩进行组织处理。
- 在没有光的II类生物安全柜中制备无葡萄糖DMEM中的FD-葡萄糖（0.29 mM）工作溶液。
- 使用酶标仪分别在485和535nm的激发和发射波长下测量FD-葡萄糖工作溶液（0.29 mM）的荧光。
- 将收获的组织/器官在含有PBS的6孔板中孵育1分钟。在单独的孔中处理每个组织或器官。
- 1分钟后，将每张纸巾放在无菌纸巾上以吸收PBS。将组织/器官转移到含有4，000μL无葡萄糖DMEM的单独6孔板中，并孵育2分钟。
- 2分钟后，取出组织并将其转移到含有0.29mM FD-葡萄糖工作溶液（1mL /孔）的6孔板的孔中。将含有组织的6孔板在37°C（5%CO2 和95%湿度）下孵育在FD-葡萄糖工作溶液中。
- 在孵育0，10，20，30，40，60，90和120分钟后从每个孔中收集100μLFD-葡萄糖工作溶液，以分析细胞外FD葡萄糖消耗的动力学。收集前后摇晃。
- 使用酶标仪将100μLFD-葡萄糖工作溶液转移到96孔板中，以分别测量485和535nm的激发和发射波长下的荧光。
- 将荧光归一化为每只动物中每个器官的0分钟值（100%）（图3）。
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Representative Results
在3T3-L1前脂肪细胞中测量细胞内摄入和细胞外葡萄糖消耗，以响应不同浓度的FD-葡萄糖（图2），有和没有胰岛素刺激。 图2A 显示FD-葡萄糖细胞内摄取的剂量依赖性增加，在胰岛素存在下显着增加。 图2B显示了相同细胞中细胞外FD-葡萄糖的伴随降低，其中胰岛素刺激导致细胞外FD-葡萄糖水平显着降低，与没有胰岛素刺激的样品相比。在有胰岛素和没有胰岛素的样品中，FD-葡萄糖的细胞内摄入与FD-葡萄糖的细胞外消耗以剂量依赖性方式相关（图2C）。因此，FD-葡萄糖的细胞外消耗可以测量葡萄糖摄取的变化，其准确性（R2 = 0.99，P < 0.001）与细胞内FD-葡萄糖摄取相当。
接下来，开发了一个实验设置来验证细胞外FD-葡萄糖摄取在动力学研究中的应用，该动力学研究在用糖摄取的规范和实验诱导剂刺激时检查不同的组织（图3）。我们选择了外周组织中胰岛素抵抗的 Lepob 小鼠模型，包括内脏白色脂肪组织27，28。将这些小鼠对胰岛素的良好反应与新型化合物AAC2的作用进行比较，AAC2 通过 瘦素受体和葡萄糖转运蛋白GLUT1依赖机制作用于外周和神经组织18。 将Lepob 小鼠注射胰岛素或AAC2。注射后15分钟解剖器官。然后，在内脏脂肪，肝脏和脑 体外 研究细胞外FD-葡萄糖消耗的动力学（图3）。与外周组织中报告的胰岛素抵抗一致，在孵育120分钟内，细胞外FD-葡萄糖在非刺激对照内脏脂肪中未耗尽（图3A）。相反，在解剖前用胰岛素或AAC2预处理小鼠分别导致细胞外FD-葡萄糖在30分钟和60分钟的时间间隔内显着消耗。
肝脏对葡萄糖的摄取利用葡萄糖转运蛋白，包括GLUT2，其与胰岛素刺激无关29，30。因此，与非刺激的肝脏外植体相比，胰岛素刺激的肝脏外植体中最初没有耗尽细胞外FD-葡萄糖（图3B），尽管在用胰岛素刺激的肝脏外植体中孵育120分钟后观察到FD-葡萄糖的显着消耗与初始水平（0分钟）相比。另一方面，在用AAC2预处理的肝脏外植体中，细胞外FD葡萄糖以时间依赖性方式显着降低。
在大脑中，主要的转运蛋白是GLUT1和其他转运蛋白31。与其他组织相比，大脑中的FD-葡萄糖消耗动力学显着不同（图3C）。在孵育60分钟后，在含有未处理的大脑的细胞外培养基中观察到葡萄糖的显着消耗（从0分钟时的100%到78%）。与来自胰岛素处理的Lepob小鼠的大脑孵育的培养基显示出FD-葡萄糖的适度但显着的线性降低（从0分钟时的100%降至95%）。AAC2刺激的大脑导致细胞外FD-葡萄糖在前20分钟内显着快速下降（从0分钟的100%降至67.4%）。总之，细胞外葡萄糖消耗的测量支持先前报道的体内这些组织中葡萄糖摄取的差异32。
图1：细胞外FD-葡萄糖消耗法的原理。 以96孔格式培养的细胞适用于该测定。为了生存，细胞吸收葡萄糖，这种涌入降低了细胞外葡萄糖的水平。用FD-葡萄糖替代葡萄糖可以监测这些变化。 请点击此处查看此图的大图。
图2：细胞外FD-葡萄糖的消耗与 体外细胞摄取相关，3T3-L1前脂肪细胞在无葡萄糖培养基中孵育40分钟，然后用不同浓度的FD-葡萄糖孵育有和没有胰岛素（1.7mM;40分钟孵育）。（一、二）对控制（即，无胰岛素）（孵化条）和胰岛素刺激细胞（黑条）的FD-葡萄糖（A）和细胞外FD-葡萄糖消耗（B）的剂量依赖性摄取。FD-葡萄糖摄取通过蛋白质浓度归一化。数据显示为在没有FD-葡萄糖的情况下孵育的对照组测量值的百分比（平均SD，每个条件n = 8）。通过未配对的t检验来检查重要性。（C）在（A）和（B）中描述的实验中，细胞内和细胞外FD-葡萄糖（%）之间的相关性测量使用（平方）或不使用（圆）胰岛素。皮尔逊相关性，P <0.001。 请点击此处查看此图的大图。
图3：不同器官离体细胞外FD-葡萄糖消耗的动力学。 （自动对照）向Lepob小鼠注射载体（PBS，n = 4），胰岛素（12 IU / kg BW，n = 3）和AAC2（1 nmol / g BW，n = 3）。15分钟后，解剖组织并分离。将（A）内脏脂肪，（B）肝脏和（C）脑的外植体在FD-葡萄糖（0.29mM）中孵育。在不同时间点以等分试样测量细胞外葡萄糖消耗的动力学。数据（平均SD）显示为孵育0分钟时每个器官中荧光的百分比。显著性 P < 0.05，未配对 t 检验。请点击此处查看此图的大图。
| 溶液/中等 | 组件 |
| 乙醇：非碳酸氢钠 （1：1/v/v） | 乙醇（200微升）和DMSO（200微升）在1-1.5毫升管中;使用细胞培养级乙醇和DMSO |
| 中 1 | DMEM （89 毫升）、青霉素/链霉素 （1%） （1 毫升） 和小牛血清 （10%） （10 毫升） 在无菌 50 毫升管中 |
| 离心介质2 | DMEM （89 毫升）、青霉素/链霉素 （1%） （1 毫升） 和牛血清 （10%） （10 毫升） 在无菌 50 毫升管中 |
| 储存 FD-葡萄糖溶液 5 毫克/毫升 （14.5 毫升） | FD葡萄糖（1毫克）和乙醇：DMSO（1：1 / v / v）（200μL）在0.5毫升管中;储存在-80°C，最好在氩气或氮气气氛下储存 |
| 工作FD-葡萄糖溶液 5 微克/毫升 （14.5 mM） | 储存FD葡萄糖溶液5毫克/毫升（1微升），无葡萄糖DMEM（999微升）;在实验前立即准备。 |
表1：培养基和FD-葡萄糖溶液的制备。
| 稀释 | 控制 | 1：2x103 | 1：5×103 | 1：1x104 | 1：2.5×104 | 1：5x104 | 1：1x105 |
| 浓度（微克/毫升） | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| 无葡萄糖 | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| 氟化镉葡萄糖 5 微克/毫升 （μL） | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
表2：用于实验的不同浓度的FD-葡萄糖溶液的制备 ，如图2所示。
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Discussion
细胞外FD-葡萄糖消耗与细胞培养中归一化的细胞内葡萄糖摄取的直接比较显示出高度相关性，这表明细胞外葡萄糖消耗可能是葡萄糖摄取评估的替代测量。细胞外FD-葡萄糖的测量可以使用广泛的FD葡萄糖浓度，并且0.5-2.5μg FD-葡萄糖/mL似乎提供了最佳范围。细胞外FD-葡萄糖不需要归一化为细胞内FD-葡萄糖摄取所需的细胞数量或蛋白质浓度。细胞外FD-葡萄糖测量的预期局限性是研究活性氧诱导剂和外植体内可以猝灭荧光的血液痕迹。还应考虑影响荧光的其他环境因素，如光。使用多个组织外植体所需的处理时间过长会损害组织活力和葡萄糖代谢。这可能是一个额外的限制。切除的组织需要在小尺寸范围内（50-300mg）以允许葡萄糖在组织内的渗透性。由多个操作员同时处理纸巾可以减少处理时间。虽然我们没有测量组织外植体内的葡萄糖摄取，但培养的组织外植体中的累积观察表明，它们在含葡萄糖的培养基中存活长达17天，功能逐渐丧失33。在该协议中，外植体的短孵育时间允许监测相对功能性组织中的葡萄糖代谢。在具有复杂细胞组织的组织中，例如大脑，其大小存在不可解决的限制，因为复杂组织的分解和导致的细胞死亡会影响葡萄糖摄取。然而，大脑孵育24小时先前已用于鉴定内源性调节机制，支持切除小鼠脑在含葡萄糖培养基34中的相对生理功能。无论如何，细胞外FD-葡萄糖的简化程序和易于访问可以允许以高通量形式使用该测定。碱性和胰岛素刺激的细胞外FD-葡萄糖消耗的比较表明，该测定可用于鉴定调节葡萄糖摄取的体液，营养，致病，环境因素或药物。虽然该测定简化了发现，但结果需要使用定量放射性标记20分析方法21，22，23和/或成像方法5，24进行验证，以严格地阐明通路的机制。
该协议中的关键步骤包括优化影响基础和刺激的FD-葡萄糖摄取的汇合和空腹时间。根据作者的观察，这些参数也可能受到季节的影响。此外，不同的细胞类型使用特定的葡萄糖摄取机制，包括不同的葡萄糖转运蛋白和调节激素/受体相互作用32，35，36。因此，对于代表由胰岛素/GLUT4 轴调节的肌肉或脂肪组织以外的组织的细胞培养物，需要考虑胰岛素以外的阳性对照。故障排除还包括调整细胞汇合度和优化使用FD-葡萄糖禁食/再喂养的时间。此外，通过降低细胞外FD-葡萄糖的水平，考虑到葡萄糖摄取所需的阈值水平，可以提高细胞外葡萄糖测量的灵敏度。 图2 中描述的实验可以帮助研究人员定制该测定以用于其他细胞培养物或故障排除。
葡萄糖代谢的内在变异性也需要更高的样本量（n = 5-8）。尽管FD-葡萄糖损失的细胞外测量表现出与细胞内通过蛋白质归一化的FD-葡萄糖摄取相同的准确性，但归一化可以减少测定变异性。除了测量蛋白质浓度外，细胞中DNA含量的测量还可以成为细胞编号37的另一种可靠的替代评估。
细胞外FD-葡萄糖可用于动力学测量。在这里，已经开发了一种简单的细胞外FD-葡萄糖动力学测量程序，以鉴定对葡萄糖摄取介质的器官特异性反应。这些 体外 研究可以直接测试器官对体内各种刺激的反应，这些刺激与器官暴露于FD-葡萄糖和离体 动力学测量相结合，如图 3所示。虽然 离体 研究并不完全类似于 体内 条件，但它们具有多种优点。器官外植体维持复杂的多细胞原代细胞结构，不像不朽的细胞培养物表现出改变的基因表达。现代药物开发利用模型生物，基于转录组或代谢组22的葡萄糖摄取间接评估，全面的胰岛素钳夹技术38或昂贵的成像32。虽然外植器官中细胞外FD-葡萄糖的测量不会取代这些技术，但它将提供对化合物，代谢物和基因的快速评估，以促进发现以组织特异性方式调节葡萄糖摄取的新型治疗靶点。开发解决特定组织中葡萄糖代谢的安全疗法可以为癌症，痴呆，衰老，糖尿病，自身免疫性疾病，肥胖症和其他相关应用提供解决方案。
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Disclosures
作者没有要披露的问题，也没有利益冲突。
Acknowledgments
该项目得到了拉尔夫和玛丽安·福克医学研究催化剂奖和凯瑟琳·凯利奖的支持。其他支持包括国家研究资源中心UL1RR025755和NCI P30CA16058（OSUCCC），即NIH医学研究路线图。内容仅由作者负责，不代表国家研究资源中心或NIH的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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