Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Human Sciences, The Ohio State University

Summary

يرتبط النضوب خارج الخلية للجلوكوز الموسوم بالفلورسنت بامتصاص الجلوكوز ويمكن استخدامه للفحص عالي الإنتاجية لامتصاص الجلوكوز في الأعضاء المستثناة ومزارع الخلايا.

Abstract

يزيد وباء السكري المستمر في جميع أنحاء العالم من الطلب على تحديد العوامل البيئية والغذائية والغدد الصماء والوراثية واللاجينية التي تؤثر على امتصاص الجلوكوز. يعد قياس التألق داخل الخلايا طريقة تستخدم على نطاق واسع لاختبار امتصاص الجلوكوز المسمى بالفلورسنت (FD-glucose) في الخلايا في المختبر ، أو لتصوير الأنسجة المستهلكة للجلوكوز في الجسم الحي. يقيم هذا الفحص امتصاص الجلوكوز في نقطة زمنية مختارة. يفترض التحليل داخل الخلايا أن عملية التمثيل الغذائي للجلوكوز FD أبطأ من استقلاب الجلوكوز الداخلي ، الذي يشارك في التفاعلات والإشارات الهدامة والمبتنائية. ومع ذلك ، فإن استقلاب الجلوكوز الديناميكي يغير أيضا آليات الامتصاص ، الأمر الذي يتطلب قياسات حركية لامتصاص الجلوكوز استجابة لعوامل مختلفة. توضح هذه المقالة طريقة لقياس استنفاد الجلوكوز FD-CELLULAR والتحقق من ارتباطها بامتصاص الجلوكوز FD-داخل الخلايا في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي. قد يكون استنفاد الجلوكوز خارج الخلية قابلا للتطبيق على الدراسات الحركية عالية الإنتاجية والمعتمدة على الجرعة ، بالإضافة إلى تحديد المركبات ذات النشاط الجلايسيمي وآثارها الخاصة بالأنسجة.

Introduction

يرتفع الطلب على قياس امتصاص الجلوكوز جنبا إلى جنب مع الحاجة الماسة لمعالجة الزيادة الوبائية في العديد من الأمراض التي تعتمد على استقلاب الجلوكوز. تعتمد الآليات الكامنة وراء الأمراض الأيضية التنكسية والاضطرابات العصبية والمعرفية1 والالتهابات2 والأمراض المعدية3 والسرطان4,5 ، وكذلك الشيخوخة6 ، على استقلاب الجلوكوز للطاقة وتخزينها ، وعمليات الابتنائية ، والبروتين ، وتعديل الجينات ، والإشارات ، وتنظيم الجينات ، وتخليق الأحماض النووية وتكرارها 7,8,9 . يرتبط داء السكري (DM) ارتباطا مباشرا بخلل في تنظيم امتصاص الجلوكوز. DM هو مجموعة من الأمراض المزمنة مثل داء السكري من النوع 1 و -2 و -3 ، وسكري الحمل ، ومرض السكري عند بدء النضج لدى الشباب ، وأنواع أخرى من هذا المرض الناجم عن العوامل البيئية و / أو الوراثية. في عام 2016 ، أظهر أول تقرير عالمي لمنظمة الصحة العالمية عن مرض السكري أن عدد البالغين الذين يعيشون مع DM الأكثر انتشارا قد تضاعف أربع مرات تقريبا منذ عام 1980 إلى 422 مليون بالغ10 ، وهذا العدد من مرضى DM آخذ في الارتفاع بشكل كبير على مدى العقود القليلة الماضية. في عام 2019 وحده ، كان تقدير 1.5 مليون حالة وفاة ناتجا مباشرة عن DM10. ويرجع هذا الارتفاع الكبير إلى ارتفاع النوع 2 DM والظروف التي تقوده ، بما في ذلك زيادة الوزن والسمنة10. كشفت جائحة COVID-19 عن زيادة بمقدار الضعف في معدل الوفيات لدى المرضى الذين يعانون من DM مقارنة بعامة السكان ، مما يشير إلى الدور العميق ولكن غير المفهوم جيدا لاستقلاب الجلوكوز في الدفاع المناعي3. تتطلب الوقاية والتشخيص المبكر والعلاج من DM والسمنة والأمراض الأخرى تحسين قياسات امتصاص الجلوكوز بواسطة الأنسجة المختلفة ، وتحديد العوامل البيئية11 والغذائية 12 والغدد الصماء 13 والجينية14 والعوامل اللاجينية 15 التي تؤثر على امتصاص الجلوكوز.

في الأبحاث ، يتم قياس امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا و / أو الأنسجة بشكل شائع بواسطة الجلوكوز المسمى بالفلورسنت (FD-glucose) في المختبر16،17،18 وفي الجسم الحي19. أصبح FD-glucose طريقة مفضلة مقارنة بالطرق الأكثر دقة باستخدام الجلوكوز 20 المسمى إشعاعيا ، وتحليل التحليل الطيفي للكتلةالتحليلي 21 ، والأيض 22 ، وطرق الرنين المغناطيسي النووي 23 ، والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب (PET / CT) 5,24. على عكس امتصاص الجلوكوز FD ، قد تتضمن الطرق التحليلية التي تتطلب المزيد من المواد البيولوجية إعداد عينة متعددة الخطوات ، وأدوات باهظة الثمن ، وتحليل البيانات المعقدة. تم استخدام قياسات فعالة وغير مكلفة لامتصاص الجلوكوز FD في مزارع الخلايا في تجارب إثبات المفهوم وقد تتطلب التحقق من الصحة بطرق أخرى.

أساس تطبيق FD-glucose لدراسات امتصاص الجلوكوز هو انخفاض التمثيل الغذائي للجلوكوز FD-glucose مقارنة بالجلوكوز الداخلي25. ومع ذلك ، يتم توزيع كل من الجلوكوز الداخلي والجلوكوز FD ديناميكيا بين جميع المقصورات الخلوية للاستخدام في العمليات الابتنائية والهدامية والإشارات. يتداخل التقسيم والمعالجة المعتمدة على الوقت25 من FD-glucose مع قياسات التألق ، ويمثل العوامل المحددة الرئيسية لاستخدام هذا الفحص في تجارب الفحص عالية الإنتاجية ، والتحليل الحركي ، وزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، والثقافات المشتركة ، وتجارب إكسبورت الأنسجة. هنا ، نقدم بيانات توضح وجود علاقة عالية بين استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من الجلوكوز FD وامتصاصه داخل الخلايا ، مما يشير إلى استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من الجلوكوز FD كقياس بديل لامتصاص الجلوكوز داخل الخلايا. تم تطبيق قياس استنفاد الجلوكوز خارج الخلية للتحقق من صحة الاختلافات الخاصة بالأنسجة في امتصاص الجلوكوز في الفئران المعالجة بالأنسولين ودواء تجريبي18 لتوفير دليل على مبدأ هذه الطريقة.

يصف البروتوكول الحالي قياسات داخل الخلايا وخارجها (الشكل 1) لامتصاص الجلوكوز FD في خلايا 3T3-L1. تشرح أقسام البروتوكول 1-7 زراعة الخلايا ونموها لمدة 48 ساعة ؛ تجويع الخلايا ، والتحفيز ، والقياسات الأساسية خارج الخلية ؛ وقياسات ما بعد التحفيز لجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية والقياسات داخل الخلايا لجلوكوز FD والبروتين. يصف قسم البروتوكول 8 القياس خارج الجسم الحي للامتصاص خارج الخلية من الجلوكوز FD في الأنسجة التي تم تشريحها من الفئران ob / ob في وجود وغياب الأنسولين ومركب الأحماض الأمينية 2 (AAC2) الموصوف في مكان آخر18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها بجامعة ولاية أوهايو (OSU ، البروتوكول 2007A0262-R4).

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية مع تشغيل المنفاخ وإطفاء الأنوار.

1. إعداد المواد

ملاحظة: جميع المواد مدرجة في جدول المواد.

  1. إعداد الوسط 1 ، الطرد المركزي المتوسط 2 ، وحلول التخزين والعمل من الفلورسنت 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG أو FD-glucose) وفقا للجدول 1 في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية. حماية FD-glucose من الضوء طوال التجربة عن طريق إطفاء جميع الأضواء تحت غطاء المحرك.
  2. استخدم كواشف زراعة الخلايا الجاهزة للاستخدام: التربسين-EDTA ، المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) ، ووسط النسر المعدل الخالي من الجلوكوز والخالي من الفينول الأحمر من Dulbecco (فيما يلي ، DMEM الخالي من الجلوكوز).
  3. استخدم 20 مل من المخزن المؤقت لتحليل الترسبات المناعية الإشعاعية (RIPA).
    ملاحظة: في الأقسام التالية، تتم مقارنة النضوب خارج الخلية والامتصاص داخل الخلايا لجرعات مختلفة من الجلوكوز FD-glucose في الخلايا الليفية 3T3-L1 مع وبدون تحفيز الأنسولين (الشكل 2).

2. 3T3-L1 زراعة الخلايا وصيانتها

  1. استزراع الخلايا الليفية للماوس 3T3-L1 عن طريق طلاء 1 × 106 خلايا مخففة في 20 مل من المتوسط 1 في لوحين 96 بئرا. لوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر ، مما يضمن الحفاظ على تجانس هذا التعليق عن طريق الخلط. تنمو الخلايا لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية (5٪ CO2 ورطوبة 95٪) دون تغيير الوسائط حتى حوالي 70٪ -80٪ التقاء.
  2. الحفاظ على الخلايا ملتقية وصائمة عن طريق زراعتها في نفس الوسط لمدة 48 ساعة. تختلف مدة الحضانة من 24-72 ساعة اعتمادا على حالة هدم الصيام المطلوبة.

3. تجويع خلايا 3T3-L1

  1. صب الوسائط من الخلايا في لوحات 96 بئر. امتص السائل المتبقي باستخدام مناشف ورقية معقمة.
  2. شطف طبق 96 بئر مع 100 ميكرولتر من PBS لكل بئر وامتصاص السائل المتبقي مع المناشف الورقية المعقمة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز لكل بئر واحتضنه لمدة 40 دقيقة. اضبط وقت الحضانة اعتمادا على نوع الخلية والمحفزات والمستوى المطلوب من الصيام.
    ملاحظة: قد يتطلب وقت الحضانة التحسين اعتمادا على الموسم.

4. إعداد حلول الجلوكوز FD بتركيزات مختلفة

ملاحظة: تفحص التجربة في الشكل 2 الوسائط خارج الخلية وبين الخلايا مع وبدون تحفيز مع الأنسولين.

  1. استخدم ثمانية نسخ متماثلة (صف واحد في صفيحة 96 بئرا) لكل حالة تحفيز. لذلك ، قم بإعداد 1 مل لكل حالة تحفيز (محددة في الجدول 2 وأدناه).
  2. استخدم ثمانية شروط تحفيز بدون أنسولين: FD-glucose من 2.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.05 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل (التحكم بدون FD-glucose) في لوحة واحدة 96 بئر.
  3. استخدم ثمانية شروط تحفيز مع الأنسولين (10 ميكروغرام / مل ، التركيز النهائي): FD-glucose من 2.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.05 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل (التحكم بدون FD-glucose) في لوحة أخرى من 96 بئرا.
  4. لإعداد ظروف التحفيز ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose 5 mg / mL (الجدول 1) في 999 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز للحصول على 1 مل من محلول مخزون العمل (1: 1000 تخفيف أو 5 ميكروغرام / مل).
    1. باستخدام حل مخزون العمل هذا ، قم بإعداد 1:2000 و 1:5000 و 1:10,000 و 1:25,000 و 1:50,000 و 1:100,000 تخفيف من الجلوكوز FD للحصول على 2.5 ميكروغرام / مل ، و 1 ميكروغرام / مل ، و 0.5 ميكروغرام / مل ، و 0.2 ميكروغرام / مل ، و 0.1 ميكروغرام / مل ، و 0.05 ميكروغرام / مل (الجدول 2) في أنبوبين مل مباشرة قبل التجارب في خزانة السلامة الأحيائية بدون أضواء.
  5. كرر الخطوة 4.4 وأضف 1 ميكرولتر من الأنسولين (10 ملغم / مل ، التركيز النهائي) إلى كل شرط من الشروط المحددة أعلاه.
    ملاحظة: التركيز النهائي للأنسولين في هذه العينات هو 10 ميكروغرام/مل = 1.7 نانومول/مل. لتحقيق التجانس ، أضف الأنسولين إلى الأنابيب قبل إضافة حلول أخرى.

5. علاج الخلايا 3T3-L1 الجائعة

  1. بعد 40 دقيقة من الحضانة ، قم بصب DMEM الخالي من الجلوكوز من كل بئر في ألواح 96 بئرا وامتص السائل المتبقي بمناشف ورقية معقمة.
  2. أضف 100 ميكرولتر (لكل بئر) من كل من ظروف المعالجة المختلفة الموضحة أعلاه إلى الآبار على طول عمود واحد ، و 100 ميكرولتر (لكل بئر) من نفس حالة المعالجة إلى الآبار على طول الصف (ثمانية تكرارات) في كل من لوحات 96 بئرا. قم بتسمية الألواح التي استخدمت الظروف مع الأنسولين وبدونه. أضف DMEM الخالي من الجلوكوز وحده إلى آبار التحكم (n = 8).
  3. احتضن اللوحة لمدة 40 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 95٪ رطوبة) في الظلام.

6. قياسات خارج الخلية وبين الخلايا لخلايا 3T3-L1 المحفزة

  1. بعد تحفيز الخلايا لمدة 40 دقيقة ، انقل وسائط التحفيز من كلا اللوحتين إلى لوحات جديدة من 96 بئرا تحافظ على نفس التخطيط التجريبي.
  2. قم بصب أي محلول متبقي من لوحات 96-well الأصلية المحفزة بخلايا على مناشف ورقية معقمة.
  3. اختياريا ، اغسل الخلايا باستخدام PBS. قم بإزالة PBS وصب أي محلول متبقي على مناشف ورقية معقمة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل RIPA إلى كل بئر. اختياريا، أضف مثبط الأنزيم البروتيني إلى مخزن RIPA المخزن المؤقت لحماية البروتينات. ضع الأطباق التي تحتوي على RIPA في شاكر لمدة 30 دقيقة.
  5. باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة (جدول المواد) ، قم بقياس التألق عند الإثارة (Ex) والأطوال الموجية للانبعاث (Em) من 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، أولا في الوسط الذي يحتوي على FD-glucose خارج الخلية ، ثم اللوحة ذات الخلايا التي تحلل RIPA في نهاية حضانة 30 دقيقة (انظر الخطوة 6.4).

7. التطبيع القائم على البروتين لامتصاص الجلوكوز داخل الخلايا

ملاحظة: يعتمد امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا على رقم الخلية. تتناسب مستويات البروتين في المحللات الخلوية مع أعداد الخلايا التي تسمح بتطبيع مستويات الجلوكوز FD-glucose داخل الخلايا إلى عدد الخلايا في كل بئر.

  1. قم بإجراء فحص بروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). حدد تركيزات البروتين في كل بئر يحتوي على خلايا RIPA-lysed.
  2. استخدم 10 ميكرولتر من متجانس RIPA وقم بقياس تركيزات البروتين في ثلاثة أضعاف لزيادة دقة القياسات في لوحات 96 بئرا.
  3. حدد كمية البروتين استنادا إلى معايير البروتين (0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 50 و 60 ميكروغرام / مل من البروتين) التي تم تحليلها مع عينات على كل طبق من 96 بئرا.
  4. قياس الامتصاص عند 562 نانومتر وتحديد تركيزات البروتين في كل عينة بناء على صيغة الانحدار الخطي التي تم الحصول عليها لمعيار البروتين.
  5. تطبيع مستويات الجلوكوز FD-الجلوكوز داخل الخلايا باستخدام قيمة الفلورسنت / تركيز البروتين في كل بئر. استنزاف الجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية لا يتطلب التطبيع.
  6. اختياريا، استخدم متوسط قيم خط الأساس في عينات التحكم للتطبيع الإضافي (100٪).

8. القياس خارج الجسم الحي لاستنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية في الأعضاء

  1. عالج الفئران مسبقا بمركبات تحفز استقلاب الجلوكوز قبل تشريح العضو ، على النحو التالي.
  2. استخدم الفئران الذكور Lepob البالغة من العمر تسعة أسابيع (n = 11). إطعام جميع الفئران مع اتباع نظام غذائي تشاو منتظم قبل التجربة.
  3. قم بتعيين الفئران عشوائيا إلى ثلاث مجموعات للحقن داخل الصفاق (i.p).
    1. حقن الفئران من مجموعة Lepob الضابطة مع 0.1 مل من PBS المعقمة (n = 4).
    2. حقن الفئران من مجموعة الأنسولين Lepob مع 0.1 مل من PBS المعقمة ، التي تحتوي على 12 وحدة دولية من الأنسولين البشري لكل غرام من وزن الجسم (BW) (n = 3).
    3. حقن الفئران من مجموعة AAC2 Lepob مع 0.1 مل من PBS المعقمة ، التي تحتوي على 0.1 نانومول AAC2 لكل غرام من وزن الجسم (BW) (n = 4).
  4. بعد 15 دقيقة ، تخضع الفئران لاستنشاق 5٪ من الأيزوفلوران وإخراج الدم عن طريق ثقب القلب من الحيوانات المخدرة26.
  5. تشريح الأنسجة الدهنية البيضاء الحشوية (200 ملغ) والكبد (200 ملغ) والدماغ كله من كل. استخدم غطاء أمان أحيائي من الفئة الثانية لمعالجة الأنسجة.
  6. قم بإعداد محلول عمل FD-glucose (0.29 mM) في DMEM الخالي من الجلوكوز في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية بدون ضوء.
  7. قم بقياس تألق محلول عمل FD-glucose (0.29 mM) عند الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات من 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام قارئ microplate.
  8. احتضان الأنسجة / الأعضاء التي تم حصادها في صفيحة من 6 آبار تحتوي على PBS لمدة 1 دقيقة. تعامل مع كل نسيج أو عضو في بئر منفصل.
  9. بعد 1 دقيقة ، ضع كل منديل على منشفة ورقية معقمة لامتصاص PBS. انقل الأنسجة / الأعضاء إلى صفيحة منفصلة من 6 آبار تحتوي على 4000 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز واحتضنها لمدة 2 دقيقة.
  10. بعد 2 دقيقة ، قم بإزالة الأنسجة ونقلها إلى آبار صفيحة من 6 آبار تحتوي على محلول عمل 0.29 mM FD-glucose (1 مل / بئر). احتضان لوحات 6 آبار تحتوي على أنسجة في محلول عمل FD-glucose عند 37 درجة مئوية (5٪ CO2 ورطوبة 95٪).
  11. جمع 100 ميكرولتر من محلول عمل الجلوكوز FD-glucose من كل بئر بعد 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة من الحضانة ، لتحليل حركية استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية. رجه قبل وبعد التجميع.
  12. انقل 100 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose إلى صفائح 96 بئرا لقياس التألق عند الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات البالغة 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام قارئ microplate.
  13. تطبيع التألق إلى قيمة 0 دقيقة (100٪) لكل عضو في كل (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم قياس المدخول داخل الخلايا واستنفاد الجلوكوز خارج الخلية في الخلايا الدهنية 3T3-L1 ، استجابة لتركيزات مختلفة من الجلوكوز FD (الشكل 2) مع وبدون تحفيز الأنسولين. يوضح الشكل 2A زيادة تعتمد على الجرعة في امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا ، والذي زاد بشكل كبير في وجود الأنسولين. يظهر الانخفاض المصاحب في الجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية في نفس الخلايا في الشكل 2B ، حيث أدى تحفيز الأنسولين إلى انخفاض كبير في مستويات الجلوكوز FD-GLUCOSE خارج الخلية مقارنة بالعينات بدون تحفيز الأنسولين. ارتبط تناول الجلوكوز داخل الخلايا بالنضوب خارج الخلية ل FD-glucose بطريقة تعتمد على الجرعة في العينات التي تحتوي على الأنسولين وبدونه (الشكل 2C). وبالتالي ، يمكن أن يقيس استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من FD-glucose تغيرا في امتصاص الجلوكوز بدقة مماثلة (R2 = 0.99 ، P < 0.001) مثل امتصاص الجلوكوز FD-glucose داخل الخلايا.

بعد ذلك ، تم تطوير إعداد تجريبي للتحقق من صحة تطبيق امتصاص الجلوكوز FD خارج الخلية في الدراسات الحركية التي تفحص الأنسجة المختلفة عند التحفيز باستخدام المحفزات القانونية والتجريبية لامتصاص الجلوكوز (الشكل 3). اخترنا نموذج Lepob mouse لمقاومة الأنسولين في الأنسجة الطرفية ، بما في ذلك الأنسجة الدهنية البيضاء الحشوية27,28. تمت مقارنة الاستجابات الراسخة للأنسولين في هذه الفئران مع تأثيرات المركب الجديد AAC2 ، الذي يعمل على كل من الأنسجة الطرفية والعصبية عبر مستقبلات اللبتين والآليات المعتمدة على ناقل الجلوكوز GLUT118. تم حقن الفئران Lepob بالأنسولين أو AAC2. تم تشريح الأعضاء بعد 15 دقيقة من الحقن. بعد ذلك ، تمت دراسة حركية استنفاد الجلوكوز خارج الخلية FD في الدهون الحشوية والكبد والدماغ خارج الجسم الحي (الشكل 3). وبالاتفاق مع مقاومة الأنسولين المبلغ عنها في الأنسجة الطرفية، لم يستنفد الجلوكوز خارج الخلية في الدهون الحشوية الضابطة غير المحفزة خلال 120 دقيقة من الحضانة (الشكل 3 ألف). في المقابل ، أدت المعالجة المسبقة للفئران بالأنسولين أو AAC2 قبل التشريح إلى استنفاد كبير لجلوكوز FD-glucose خارج الخلية في غضون فترة زمنية مدتها 30 دقيقة و 60 دقيقة ، على التوالي.

يستخدم امتصاص الكبد للجلوكوز ناقلات الجلوكوز ، بما في ذلك GLUT2 ، المستقلة عن تحفيز الأنسولين29,30. وبناء على ذلك، لم يستنفد الجلوكوز FD-glucose خارج الخلية في البداية في إكسبرازات الكبد المحفزة بالأنسولين مقارنة بإكسبسترات الكبد غير المحفزة (الشكل 3B)، على الرغم من ملاحظة استنزاف كبير لجلوكوز FD بعد 120 دقيقة من الحضانة في زراعة الكبد المحفزة بالأنسولين مقارنة بالمستويات الأولية (0 دقيقة). من ناحية أخرى ، انخفض الجلوكوز FD خارج الخلية بشكل كبير بطريقة تعتمد على الوقت في الكبد المعالج مسبقا باستخدام AAC2.

في الدماغ ، الناقل الرئيسي هو GLUT1 بين الناقلين الآخرين31. كانت حركية استنفاد الجلوكوز FD-glucose مختلفة بشكل لافت للنظر في الدماغ مقارنة بالأنسجة الأخرى (الشكل 3C). لوحظ استنفاد كبير للجلوكوز في الوسط خارج الخلية الذي يحتوي على الدماغ غير المعالج بعد 60 دقيقة من الحضانة (من 100٪ في 0 دقيقة إلى 78٪). أظهرت الوسائط المحتضنة مع أدمغة من فئران Lepob المعالجة بالأنسولين انخفاضا خطيا معتدلا ولكن كبيرا في الجلوكوز FD (من 100٪ عند 0 دقيقة إلى 95٪). تؤدي الأدمغة المحفزة ب AAC2 إلى انخفاض سريع عميق في الجلوكوز FD-glucose خارج الخلية خلال أول 20 دقيقة (من 100٪ عند 0 دقيقة إلى 67.4٪). معا ، تدعم قياسات استنفاد الجلوكوز خارج الخلية الاختلافات المبلغ عنها سابقا في امتصاص الجلوكوز في هذه الأنسجة في الجسم الحي32.

Figure 1
الشكل 1: مبدأ طريقة استنفاد الجلوكوز FD-CELLULAR خارج الخلية. الخلايا المستزرعة في شكل 96 بئرا مناسبة لهذا الفحص. للبقاء على قيد الحياة ، تستهلك الخلايا الجلوكوز وهذا التدفق يقلل من مستويات الجلوكوز خارج الخلية. يسمح استبدال الجلوكوز بجلوكوز FD-glucose بمراقبة هذه التغييرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ارتبط استنفاد الجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية بالامتصاص داخل الخلايا في المختبر. تم احتضان الخلايا البدائية 3T3-L1 في وسط خال من الجلوكوز لمدة 40 دقيقة قبل الحضانة بتركيزات مختلفة من الجلوكوز FD مع الأنسولين وبدونه (1.7 mM ؛ 40 دقيقة حضانة). (أ، ب) الامتصاص المعتمد على الجرعة من FD-glucose (A) واستنفاد الجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية (B) في السيطرة (أي بدون الأنسولين) (قضبان الفقس) والخلايا المحفزة للأنسولين (القضبان السوداء). تم تطبيع امتصاص الجلوكوز FD بواسطة تركيزات البروتين. تظهر البيانات كنسبة مئوية من القيمة المقاسة في التحكم المحتضن بدون FD-glucose (متوسط SD ، n = 8 لكل حالة). تم فحص الأهمية عن طريق اختبار t غير المقترن. (ج) العلاقة بين الجلوكوز FD-glucose داخل الخلايا وخارجها (٪) يقيس مع الأنسولين (مربعات) أو بدون (دوائر) في التجارب الموصوفة في (A) و (B). علاقة بيرسون ، P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: حركية استنفاد الجلوكوز FD-CELLULAR في أعضاء مختلفة خارج الجسم الحي. (أ-ج) تم حقن فئران Lepob بالمركبة (PBS ، n = 4) ، الأنسولين (12 وحدة دولية / كجم BW ، n = 3) ، و AAC2 (1 nmol / g BW ، n = 3). بعد 15 دقيقة ، تم تشريح الأنسجة وعزلها. تم احتضان نباتات من (أ) الدهون الحشوية ، (ب) الكبد ، و (ج) الدماغ في الجلوكوز FD (0.29 ملليمتر). تم قياس حركية استنفاد الجلوكوز خارج الخلية في أليكوتس الوسط في نقاط زمنية مختلفة. تظهر البيانات (متوسط SD) كنسبة مئوية من التألق في كل عضو في 0 دقيقة من الحضانة. أهمية P < 0.05 ، اختبار t غير مقترن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الحل / المتوسطة مكونات
الإيثانول: DMSO (1:1/v/v) الإيثانول (200 ميكرولتر) و DMSO (200 ميكرولتر) في أنبوب 1-1.5 مل ؛ استخدام الإيثانول الصف زراعة الخلايا و DMSO
متوسط 1 DMEM (89 مل) ، البنسلين / الستربتومايسين (1٪) (1 مل) ومصل العجل (10٪) (10 مل) في أنبوب معقم 50 مل
جهاز طرد مركزي متوسط 2 DMEM (89 مل) ، البنسلين / الستربتومايسين (1٪) (1 مل) والمصل البقري (10٪) (10 مل) في أنبوب معقم 50 مل
تخزين محلول الجلوكوز FD 5 مجم / مل (14.5 ملليمتر) FD الجلوكوز (1 ملغ) والإيثانول: DMSO (1: 1 / v / v) (200 ميكرولتر) في أنبوب 0.5 مل ؛ يخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية، بشكل تفضيلي تحت جو الأرجون أو النيتروجين
محلول الجلوكوز FD-glucose العامل 5 ميكروغرام / مل (14.5 ملليمتر) تخزين محلول الجلوكوز FD 5 ملغ / مل (1 ميكرولتر) ، DMEM خالية من الجلوكوز (999 ميكرولتر) ؛ التحضير مباشرة قبل التجربة.

الجدول 1: إعداد وسائط الثقافة وحلول الجلوكوز FD.

التخفيف تحكم 1:2x103 1:5x103 1:1x104 1:2.5x104 1:5x104 1:1x105
التركيز (ميكروغرام/مل) 0 2.5 1 0.5 0.2 0.1 0.05
DMEM الخالي من الجلوكوز (μL) 1000 500 800 900 960 980 990
FD الجلوكوز 5 ميكروغرام / مل (ميكرولتر) 0 500 200 100 40 20 10

الجدول 2: تحضير محاليل الجلوكوز FD-glucose بتركيزات مختلفة للتجارب الموضحة في الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أظهرت المقارنة المباشرة لاستنفاد الجلوكوز خارج الخلية مع امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا الطبيعي في مزرعة الخلايا وجود علاقة عالية ، مما يشير إلى أن استنفاد الجلوكوز خارج الخلية يمكن أن يكون قياسا بديلا لتقييم امتصاص الجلوكوز. يمكن أن يستخدم قياس الجلوكوز FD-glucose خارج الخلية مجموعة واسعة من تركيزات الجلوكوز FD ، كما يبدو أن 0.5-2.5 ميكروغرام FD-glucose / mL توفر النطاق الأمثل. لا يتطلب FD-glucose خارج الخلية تطبيع عدد الخلايا أو تركيزات البروتين اللازمة لامتصاص الجلوكوز FD-داخل الخلايا. الحد المتوقع من قياسات الجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية هو التحقيق في العوامل التفاعلية التي تحفز أنواع الأكسجين وآثار الدم داخل النباتات التي يمكن أن تطفئ التألق. وينبغي أيضا النظر في العوامل البيئية الأخرى التي تؤثر على التألق، مثل الضوء. يمكن أن يؤدي وقت المعالجة المطول المطلوب أثناء استخدام العديد من عمليات إزالة الأنسجة إلى الإضرار بصلاحية الأنسجة واستقلاب الجلوكوز. قد يكون هذا قيدا إضافيا. يجب أن تكون الأنسجة التي تم استئصالها في نطاق صغير الحجم (50-300 ملغ) للسماح بنفاذية الجلوكوز داخل الأنسجة. يمكن أن يؤدي التعامل المتزامن مع الأنسجة من قبل العديد من المشغلين إلى تقليل وقت المناولة. على الرغم من أننا لم نقيس امتصاص الجلوكوز داخل الأنسجة الخارجة ، إلا أن الملاحظات المتراكمة في نباتات الأنسجة المستزرعة تشير إلى أنها تعيش في الوسط المحتوي على الجلوكوز لمدة تصل إلى 17 يوما مع الفقدان التدريجي للوظائف33. في هذا البروتوكول ، يسمح وقت الحضانة القصير للنباتات بمراقبة استقلاب الجلوكوز في الأنسجة الوظيفية نسبيا. في الأنسجة ذات التنظيم الخلوي المعقد ، مثل الدماغ ، يمثل الحجم قيدا غير قابل للحل ، لأن تفكك الأنسجة المعقدة وما ينتج عنه من موت الخلايا يؤثر على امتصاص الجلوكوز. ومع ذلك ، فقد تم استخدام حضانة الدماغ لمدة 24 ساعة سابقا لتحديد الآلية التنظيمية الداخلية ، ودعم الوظائف الفسيولوجية النسبية لدماغ الفأر المستأصل في الوسط المحتوي على الجلوكوز34. بغض النظر عن ذلك ، يمكن أن يسمح الإجراء المبسط وسهولة الوصول إلى الجلوكوز FD-glucose خارج الخلية باستخدام هذا الفحص بتنسيق عالي الإنتاجية. تشير المقارنة بين استنفاد الجلوكوز الأساسي وتحفيز الأنسولين خارج الخلية إلى أنه يمكن تطبيق هذا الفحص لتحديد العوامل الخلطية أو التغذوية أو المسببة للأمراض أو البيئية أو الأدوية الصيدلانية التي تنظم امتصاص الجلوكوز. على الرغم من أن هذا الفحص يبسط الاكتشاف ، إلا أن النتائج تطلبت التحقق من الصحة باستخدام الوسم الإشعاعي الكمي20 طريقة تحليلية21،22،23 و / أو طرق التصوير5،24 للتوضيح الميكانيكي الدقيق للمسارات.

تشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول تحسين وقت الالتقاء والصيام الذي يؤثر على كل من امتصاص الجلوكوز القاعدي والمحفز. يمكن أن تتأثر هذه المعلمات أيضا بالموسم بناء على ملاحظات المؤلفين. علاوة على ذلك ، تستخدم أنواع الخلايا المختلفة آليات محددة لامتصاص الجلوكوز بما في ذلك ناقلات الجلوكوز المختلفة والتفاعلات التنظيمية للهرمونات / المستقبلات32،35،36. لذلك ، يجب النظر في ضوابط إيجابية أخرى غير الأنسولين لمزارع الخلايا التي تمثل الأنسجة الأخرى غير العضلات أو الأنسجة الدهنية التي تنظمها محاور الأنسولين / GLUT4. يتضمن استكشاف الأخطاء وإصلاحها أيضا ضبط التقاء الخلايا وتحسين وقت الصيام / إعادة التغذية باستخدام FD-glucose. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحسين حساسية قياس الجلوكوز خارج الخلية عن طريق تقليل مستويات الجلوكوز FD-Glucose خارج الخلية ، مع مراعاة مستويات العتبة المطلوبة لامتصاص الجلوكوز. يمكن أن تساعد التجربة الموضحة في الشكل 2 الباحثين على تخصيص هذا الفحص للاستخدام مع مزارع الخلايا الأخرى أو استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

كما تطلب التباين الجوهري لاستقلاب الجلوكوز حجم عينة أعلى (n = 5-8). على الرغم من أن القياسات خارج الخلية لفقدان الجلوكوز FD-glucose أظهرت نفس الدقة مثل امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا من FD-glucose الذي تم تطبيعه بواسطة البروتين ، إلا أن التطبيع يمكن أن يقلل من تباين المقايسة. بالإضافة إلى قياس تركيزات البروتين ، يمكن أن يكون قياس محتوى الحمض النووي في الخلية تقييما بديلا موثوقا به آخر للخلية رقم37.

يمكن الوصول إلى الجلوكوز FD-GLUCOSE خارج الخلية للقياسات الحركية. هنا ، تم تطوير إجراء بسيط للقياسات الحركية لجلوكوز FD-glucose خارج الخلية لتحديد الاستجابات الخاصة بالأعضاء لوسطاء امتصاص الجلوكوز. يمكن لهذه الدراسات خارج المختبر أن تختبر مباشرة استجابة الأعضاء لمختلف المحفزات في الجسم الحي التي يتم دمجها مع تعرض الأعضاء للقياسات الحركية FD-glucose و خارج الجسم الحي ، كما هو موضح في الشكل 3. على الرغم من أن الدراسات خارج الجسم الحي لا تشبه تماما في ظروف الجسم الحي ، إلا أن لها مزايا متعددة. تحافظ الخلايا الخارجية للأعضاء على بنية الخلايا الأولية المعقدة متعددة الخلايا ، على عكس مزارع الخلايا الخالدة التي تظهر تعبيرا جينيا متغيرا. يستخدم تطوير الأدوية الحديثة الكائنات الحية النموذجية ، والتقييم غير المباشر لامتصاص الجلوكوز على أساس النسخ أو الأيض22 ، أو تقنية مشبك الأنسولين الشاملة38 ، أو التصويرالمكلف 32. على الرغم من أن قياس الجلوكوز FD-glucose خارج الخلية في الأعضاء المزروعة لن يحل محل هذه التقنيات ، إلا أنه سيوفر تقييما سريعا للمركبات والتمثيل الغذائي والجينات لتسهيل اكتشاف أهداف علاجية جديدة تنظم امتصاص الجلوكوز بطريقة خاصة بالأنسجة. يمكن أن يوفر تطوير علاجات آمنة تعالج استقلاب الجلوكوز في أنسجة معينة حلا للسرطان والخرف والشيخوخة والسكري وأمراض المناعة الذاتية والسمنة وغيرها من التطبيقات ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي مشاكل للكشف عنها وليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم المشروع من قبل جائزة رالف وماريان فالك لمحفز البحوث الطبية وجائزة كاثلين كيلي. وشملت الإعانات الأخرى المركز الوطني للموارد البحثية UL1RR025755 و NCI P30CA16058 (OSUCCC) ، وخارطة طريق المعاهد الوطنية للصحة للبحوث الطبية. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل وجهات النظر الرسمية للمركز الوطني لموارد البحوث أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts ATCC CL-173 Cell line
96-well plates Falcon 353227 Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice Jackson Laboratory stock number 000632 Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) Fisher Scientific, US  B-SHT Device
Bovine serum Gibco/ThermoFisher 161790-060 Cell culture
Calf serum Gibco/ThermoFisher 26010-066 Cell culture
Cell incubator Forma Series II Water Jacket Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated) Envigo Teklad LM-485 Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma LifeScience D2650-100mL Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco/ThermoFisher  11965-092 Cell culture
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500mL Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) Sigma 72987-1MG Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM Gibco/ThermoFisher A14430-01 Cell culture
Human insulin 10 mg/mL MilliporeSigma, Cat N 91077C Cat N 91077C Reagent
Isoflurane, 5% Henry Schein NDC 11695-6776-2 Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco/ThermoFisher 15140-122 Cell culture
Phosphate buffered solution Sigma-Aldrich DA537-500 mL Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay ThermoFisher Cat N23225 Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer Santa Cruz Biotechnology sc-24948 Assay
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco/ThermoFisher  25300-054 Cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
  4. Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
  5. Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
  6. Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
  7. Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
  8. Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
  9. Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
  10. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
  11. Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
  12. Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
  13. Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
  14. Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
  15. Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
  16. Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
  17. Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
  18. Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
  19. Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
  20. Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
  21. Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
  22. Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
  23. Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
  24. Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
  25. Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
  26. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
  27. DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
  28. Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
  29. Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
  30. Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
  31. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
  32. Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
  33. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  34. de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
  35. Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
  36. Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
  37. Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
  38. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 182 ،
استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا <em>والأنسجة خارج الجسم الحي</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, S. B., Arnipalli, S.,… More

Kumar, S. B., Arnipalli, S., Abushukur, A., Carrau, S., Mehta, P., Ziouzenkova, O. Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo. J. Vis. Exp. (182), e63681, doi:10.3791/63681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter