Summary
Die extrazelluläre Erschöpfung von fluoreszenzmarkierter Glukose korreliert mit der Glukoseaufnahme und könnte für das Hochdurchsatz-Screening der Glukoseaufnahme in ausgeschnittenen Organen und Zellkulturen verwendet werden.
Abstract
Die anhaltende weltweite Diabetes-Epidemie erhöht die Nachfrage nach der Identifizierung von umweltbedingten, ernährungsphysiologischen, endokrinen, genetischen und epigenetischen Faktoren, die die Glukoseaufnahme beeinflussen. Die Messung der intrazellulären Fluoreszenz ist eine weit verbreitete Methode, um die Aufnahme von fluoreszenzmarkierter Glukose (FD-Glukose) in Zellen in vitro zu testen oder um glukoseverbrauchende Gewebe in vivo abzubilden. Dieser Assay bewertet die Glukoseaufnahme zu einem ausgewählten Zeitpunkt. Die intrazelluläre Analyse geht davon aus, dass der Stoffwechsel von FD-Glukose langsamer ist als der von endogener Glukose, die an katabolen und anabolen Reaktionen und Signalen beteiligt ist. Der dynamische Glukosestoffwechsel verändert jedoch auch die Aufnahmemechanismen, was kinetische Messungen der Glukoseaufnahme als Reaktion auf verschiedene Faktoren erfordern würde. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des extrazellulären FD-Glukose-Abbaus und validiert ihre Korrelation mit der intrazellulären FD-Glukose-Aufnahme in Zellen und Geweben ex vivo. Der extrazelluläre Glukosemangel kann potenziell für kinetische und dosisabhängige Hochdurchsatzstudien sowie für die Identifizierung von Verbindungen mit glykämischer Aktivität und ihren gewebespezifischen Wirkungen geeignet sein.
Introduction
Die Nachfrage nach der Messung der Glukoseaufnahme steigt zusammen mit der dringenden Notwendigkeit, einen epidemischen Anstieg einer Vielzahl von Krankheiten, die vom Glukosestoffwechsel abhängen, anzugehen. Zugrunde liegende Mechanismen von degenerativen Stoffwechselerkrankungen, neurologischen und kognitiven Störungen1, entzündlichen 2 und Infektionskrankheiten3, Krebs4,5 sowie Alterung6, hängen vom Glukosestoffwechsel für Energie und deren Speicherung, anabole Prozesse, Protein- und Genmodifikation, Signalisierung, Regulation von Genen und Nukleinsäuresynthese und Replikation ab 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) steht in direktem Zusammenhang mit einer Fehlfunktion der Regulation der Glukoseaufnahme. DM ist ein Spektrum chronischer Krankheiten wie Typ-1-, -2- und -3-Diabetes mellitus, Schwangerschaftsdiabetes, Altersdiabetes der Jungen und andere Arten dieser Krankheit, die durch Umwelt- und / oder genetische Faktoren induziert werden. Im Jahr 2016 zeigte der erste globale Bericht der WHO über Diabetes, dass sich die Zahl der Erwachsenen, die mit der am weitesten verbreiteten DM leben, seit 1980 auf 422 Millionen Erwachsene fast vervierfachthat 10, und diese Zahl der DM-Patienten ist in den letzten Jahrzehnten exponentiell gestiegen. Allein im Jahr 2019 wurden schätzungsweise1,5 Millionen Todesfälle direkt durch 10 DM verursacht. Dieser dramatische Aufschwung ist auf den Anstieg der Typ-2-DM und die Bedingungen zurückzuführen, die sie antreiben, einschließlich Übergewicht und Fettleibigkeit10. Die COVID-19-Pandemie zeigte einen zweifachen Anstieg der Mortalität bei Patienten mit DM im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung, was auf die tiefgreifende, aber wenig verstandene Rolle des Glukosestoffwechsels bei der Immunabwehrhindeutet 3. Prävention, Früherkennung und Behandlung von DM, Fettleibigkeit und anderen Krankheiten erfordern die Optimierung von Messungen der Glukoseaufnahme durch verschiedene Gewebe und die Identifizierung von Umweltfaktoren 11, Ernährung 12, endokrine13, genetische14 und epigenetische 15, die die Glukoseaufnahme beeinflussen.
In der Forschung wird die intrazelluläre und/oder Gewebeaufnahme von Glukose üblicherweise durch fluoreszenzmarkierte Glukose (FD-Glukose) in vitro 16,17,18 und in vivo 19 gemessen. FD-Glucose wurde zu einer bevorzugten Methode im Vergleich zu präziseren Methoden mit radioaktiv markierter Glukose 20, analytischer Massenspektroskopieanalyse 21, Metabolomik 22, Kernspinresonanzmethoden 23 und Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)5,24. Im Gegensatz zur Aufnahme von FD-Glukose können analytische Methoden, die mehr biologisches Material erfordern, eine mehrstufige Probenvorbereitung, teure Instrumente und komplexe Datenanalysen umfassen. Effektive und kostengünstige Messungen der FD-Glukoseaufnahme in Zellkulturen wurden in Proof-of-Concept-Experimenten verwendet und erfordern möglicherweise eine Validierung durch andere Methoden.
Die Grundlage der FD-Glukoseanwendung für Glukoseaufnahmestudien ist der reduzierte Metabolismus von FD-Glukose im Vergleich zu endogener Glukose25. Nichtsdestotrotz sind sowohl endogene Glukose als auch FD-Glukose dynamisch auf alle zellulären Kompartimente verteilt, um sie in anabolen, katabolen und Signalprozessen einzusetzen. Die Kompartimentierung und zeitabhängige Verarbeitung25 von FD-Glucose stören die Fluoreszenzmessungen und stellen die wichtigsten limitierenden Faktoren für die Verwendung dieses Assays in Hochdurchsatz-Screening-Experimenten, kinetischen Analysen, 3D-Zellkulturen, Co-Kulturen und Gewebeexplantationsexperimenten dar. Hier liefern wir Daten, die eine hohe Korrelation zwischen dem extrazellulären Abbau von FD-Glukose und seiner intrazellulären Aufnahme zeigen, was auf den extrazellulären Abbau von FD-Glucose als Ersatzmessung für die intrazelluläre Glukoseaufnahme hindeutet. Die Messung des extrazellulären Erschöpfungs von Glukose wurde angewendet, um gewebespezifische Unterschiede in der Glukoseaufnahme bei Mäusen, die mit Insulin behandelt wurden, und einem experimentellen Medikament18 zu validieren, um einen Proof-of-Principle dieser Methode zu liefern.
Das aktuelle Protokoll beschreibt intrazelluläre und extrazelluläre (Abbildung 1) Messungen der FD-Glukoseaufnahme in 3T3-L1-Zellen. Protokollabschnitte 1-7 erklären die Kultur und das Wachstum von Zellen für 48 h; Zellhunger, Stimulation und extrazelluläre Basismessungen; und Poststimulationsmessungen von extrazellulärer FD-Glucose und intrazellulären Messungen von FD-Glucose und Protein. Protokollabschnitt 8 beschreibt die Ex-vivo-Messung der extrazellulären Aufnahme von FD-Glucose in Geweben, die von ob /ob-Mäusen in Gegenwart und Abwesenheit von Insulin und Aminosäureverbindung 2 (AAC2) seziert wurden, wie an anderer Stelle18 beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (OSU, Protokoll 2007A0262-R4) genehmigt.
HINWEIS: Alle Verfahren müssen in einer Biosicherheitskabine der Klasse II mit eingeschaltetem Gebläse und ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden.
1. Vorbereitung der Materialien
HINWEIS: Alle Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
- Herstellung von Medium 1, Zentrifugationsmedium 2 und Lager- und Arbeitslösungen von fluoreszierender 2-Desoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-amino]-D-glucose (2-NBDG oder FD-Glucose) gemäß Tabelle 1 in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II. Schützen Sie FD-Glukose während des gesamten Experiments vor Licht, indem Sie alle Lichter unter der Haube ausschalten.
- Verwenden Sie gebrauchsfertige Zellkulturreagenzien: Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und glukosefreies und phenolrotfreies Dulbecco's Modified Eagle Medium (im Folgenden glukosefreies DMEM).
- Verwenden Sie 20 ml RIPA-Lysepuffer (Radioimmunprecipitation Assay).
HINWEIS: In den folgenden Abschnitten werden extrazelluläre Depletion und intrazelluläre Aufnahme verschiedener FD-Glukosedosen in 3T3-L1-Fibroblasten mit und ohne Insulinstimulation verglichen (Abbildung 2).
2. 3T3-L1 Zellkultur und Wartung
- Kultur 3T3-L1 Maus-Fibroblasten durch Beschichtung von 1 x 106 Zellen, verdünnt in 20 ml Medium 1 in zwei 96-Well-Platten. Platte 100 μL Zellsuspension pro Well, um sicherzustellen, dass die Homogenität dieser Suspension durch Mischen erhalten bleibt. Züchten Sie Zellen für 48 h in einem 37 °C Inkubator (5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit) ohne Medienwechsel bis etwa 70% -80% Zusammenfluss.
- Halten Sie die Zellen zusammenfließend und nüchtern, indem Sie sie 48 h lang im selben Medium kultivieren. Variieren Sie die Inkubationszeit von 24-72 h je nach gewünschtem katabolen Fastenzustand.
3. Verhungern von 3T3-L1-Zellen
- Dekantieren Sie Medien aus Zellen in den 96-Well-Platten. Nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf.
- Spülen Sie die 96-Well-Platte mit 100 μL PBS pro Well ab und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern.
- 100 μL glucosefreies DMEM pro Bohrung hinzufügen und 40 min inkubieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Inkubation in Abhängigkeit von Zelltyp, Reizen und gewünschtem Fastengrad an.
HINWEIS: Der Zeitpunkt der Inkubation kann je nach Jahreszeit optimiert werden.
4. Herstellung von FD-Glucose-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen
HINWEIS: Das Experiment in Abbildung 2 untersucht extrazelluläre und interzelluläre Medien mit und ohne Stimulation mit Insulin.
- Verwenden Sie acht Replikate (eine Reihe in einer 96-Well-Platte) für jede Stimulationsbedingung. Bereiten Sie daher 1 ml für jede Stimulationsbedingung vor (siehe Tabelle 2 und unten).
- Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen ohne Insulin: FD-Glukose von 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml und 0 μg / ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer 96-Well-Platte.
- Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen mit Insulin (10 μg / ml, Endkonzentration): FD-Glukose von 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml und 0 μg / ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer weiteren 96-Well-Platte.
- Zur Vorbereitung der Stimulationsbedingungen verdünnen Sie 1 μL 5 mg/ml FD-Glucose-Arbeitslösung (Tabelle 1) in 999 μL glukosefreiem DMEM, um 1 ml Arbeitsmateriallösung (1:1000 Verdünnung oder 5 μg/ml) zu erhalten.
- Bereiten Sie mit dieser Arbeitsstofflösung 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 und 1:100.000 Verdünnungen von FD-Glucose vor, um 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml und 0,05 μg/ml (Tabelle 2) in 2 ml-Röhrchen unmittelbar vor Experimenten in einer Biosicherheitswerkbank ohne Licht zu erhalten.
- Wiederholen Sie Schritt 4.4 und fügen Sie 1 μl Insulin (10 mg/ml, Endkonzentration) zu jeder der oben genannten Bedingungen hinzu.
HINWEIS: Die endgültige Insulinkonzentration in diesen Proben beträgt 10 μg/ml = 1,7 nmol/ml. Um eine Homogenisierung zu erreichen, fügen Sie Insulin zu den Röhrchen hinzu, bevor Sie andere Lösungen hinzufügen.
5. Behandlung von verhungerten 3T3-L1-Zellen
- Dekantieren Sie nach 40 Minuten Inkubation das glukosefreie DMEM aus jedem Bohrloch in 96-Well-Platten und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern.
- Fügen Sie jeweils 100 μL (pro Well) aus den verschiedenen oben beschriebenen Behandlungsbedingungen zu Bohrlöchern entlang einer Spalte hinzu und 100 μL (pro Well) von der gleichen Behandlungsbedingung zu den Wells entlang der Reihe (acht Replikate) in beiden 96-Well-Platten. Beschriften Sie die Platten, die die Bedingungen mit und ohne Insulin verwendet haben. Fügen Sie den Kontrollquellen (n = 8) allein glukosefreies DMEM hinzu.
- Inkubieren Sie die Platte für 40 min in einem Zellkultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit) im Dunkeln.
6. Extrazelluläre und interzelluläre Messungen für stimulierte 3T3-L1-Zellen
- Nachdem die Zellen für 40 min stimuliert wurden, übertragen Sie die Stimulationsmedien von beiden Platten in neue 96-Well-Platten, die das gleiche experimentelle Layout beibehalten.
- Dekantieren Sie die verbleibende Lösung aus den ursprünglich stimulierten 96-Well-Platten mit Zellen auf sterilen Papiertüchern.
- Optional Zellen mit PBS waschen. Entfernen Sie PBS und dekantieren Sie die verbleibende Lösung auf sterile Papiertücher.
- Fügen Sie 100 μL des RIPA-Lysepuffers zu jeder Vertiefung hinzu. Fügen Sie optional Proteasehemmer zum RIPA-Puffer hinzu, um Proteine zu schützen. Legen Sie Platten mit RIPA für 30 min in einen Shaker.
- Messen Sie mit einem Mikroplattenleser (Table of Materials) die Fluoreszenz bei Anregungs- (Ex) und Emissionswellenlängen (Em) von 485 bzw. 535 nm, zuerst in dem Medium, das extrazelluläre FD-Glukose enthält, und dann die Platte mit RIPA-lysierten Zellen am Ende der 30-minütigen Inkubation (siehe Schritt 6.4).
7. Proteinbasierte Normalisierung der intrazellulären Glukoseaufnahme
HINWEIS: Die intrazelluläre FD-Glukoseaufnahme hängt von der Zellzahl ab. Die Proteinspiegel in zellulären Lysaten sind proportional zu den Zellzahlen, die es ermöglichen, den intrazellulären FD-Glukosespiegel auf die Anzahl der Zellen in jedem Brunnen zu normalisieren.
- Führen Sie den BCA-Proteinassay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen in jedem Bohrloch, das RIPA-lysierte Zellen enthält.
- Verwenden Sie 10 μL des RIPA-Homogenats und messen Sie Proteinkonzentrationen in dreifacher Reihenfolge, um die Genauigkeit der Messungen in 96-Well-Platten zu erhöhen.
- Quantifizieren Sie das Protein basierend auf Proteinstandards (0, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 μg / ml-Protein), die zusammen mit Proben auf jeder 96-Well-Platte analysiert werden.
- Messen Sie die Absorption bei 562 nm und quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen in jeder Probe basierend auf der linearen Regressionsformel, die für den Proteinstandard erhalten wurde.
- Normalisieren Sie den Gehalt an intrazellulärer FD-Glukose, indem Sie den Fluoreszenzwert / die Proteinkonzentration in jedem Brunnen verwenden. Der extrazelluläre FD-Glukose-Abbau erfordert keine Normalisierung.
- Optional können Sie die durchschnittlichen Basiswerte in Kontrollstichproben für eine zusätzliche Normalisierung (100 %) verwenden.
8. Ex-vivo-Messung des extrazellulären FD-Glukosemangels in Organen
- Behandeln Sie Mäuse mit Verbindungen, die den Glukosestoffwechsel vor der Organdissektion stimulieren, wie folgt.
- Verwenden Sie neun Wochen alte männliche Lep-ob-Mäuse (n = 11). Füttern Sie alle Mäuse vor dem Experiment mit einer regelmäßigen Chow-Diät.
- Weisen Sie Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen für intraperitoneale (i.p.) Injektionen ein.
- Injizieren Sie Mäuse aus der Kontrollgruppe Lepob mit 0,1 ml sterilem PBS (n = 4).
- Injizieren Sie Mäusen aus der Insulin-Lep-ob-Gruppe 0,1 ml steriles PBS, das 12 IE Humaninsulin pro Gramm Körpergewicht (BW) enthält (n = 3).
- Injizieren Sie Mäuse aus der AAC2 Lepob-Gruppe mit 0,1 ml sterilem PBS, das 0,1 nmol AAC2 pro Gramm Körpergewicht (BW) (n = 4) enthält.
- Nach 15 min inhalieren Mäuse 5% Isofluran und Exsanguinatblut durch Herzpunktion von den betäubten Tieren26.
- Sezieren Sie viszerales epidydimales weißes Fettgewebe (200 mg), Leber (200 mg) und das ganze Gehirn von jedem Tier. Verwenden Sie eine Biosicherheitshaube der Klasse II für die Handhabung von Geweben.
- Bereiten Sie FD-Glucose (0,29 mM) Arbeitslösung in glukosefreiem DMEM in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II ohne Licht vor.
- Messen Sie die Fluoreszenz der FD-Glucose-Arbeitslösung (0,29 mM) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm mit einem Mikroplattenleser.
- Inkubieren Sie die entnommenen Gewebe / Organe in einer 6-Well-Platte, die PBS enthält, für 1 min. Behandeln Sie jedes Gewebe oder Organ in einem separaten Brunnen.
- Nach 1 Minute legen Sie jedes Taschentuch auf ein steriles Papiertuch, um PBS zu absorbieren. Gewebe/Organe in eine separate 6-Well-Platte mit 4.000 μL glucosefreiem DMEM überführen und 2 min inkubieren.
- Nach 2 min entfernen und übertragen Sie das Gewebe in Vertiefungen einer 6-Well-Platte, die 0,29 mM FD-Glukose-Arbeitslösung (1 ml/Well) enthält. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten, die Gewebe enthalten, in FD-Glucose-Arbeitslösung bei 37 ° C (5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit).
- Sammeln Sie 100 μL FD-Glukose-Arbeitslösung aus jedem Bohrloch nach 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation, um die Kinetik der extrazellulären FD-Glukoseerschöpfung zu analysieren. Vor und nach dem Sammeln schütteln.
- Übertragen Sie 100 μL FD-Glucose-Arbeitslösung in 96-Well-Platten, um die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm mit einem Mikroplattenleser zu messen.
- Normalisieren Sie die Fluoreszenz auf den 0-Minuten-Wert (100%) für jedes Organ in jedem Tier (Abbildung 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die intrazelluläre Aufnahme und der extrazelluläre Glukosemangel wurden in 3T3-L1-Präadipozyten als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von FD-Glucose (Abbildung 2) mit und ohne Insulinstimulation gemessen. Abbildung 2A zeigt eine dosisabhängige Erhöhung der intrazellulären Aufnahme von FD-Glukose, die in Gegenwart von Insulin signifikant erhöht war. Die gleichzeitige Abnahme der extrazellulären FD-Glukose in denselben Zellen ist in Abbildung 2B dargestellt, wo die Insulinstimulation zu signifikant verringerten extrazellulären FD-Glukosespiegeln im Vergleich zu den Proben ohne Insulinstimulation führte. Die intrazelluläre Aufnahme von FD-Glucose korrelierte dosisabhängig mit dem extrazellulären Abbau von FD-Glucose in Proben mit und ohne Insulin (Abbildung 2C). So kann der extrazelluläre Abbau von FD-Glucose eine Änderung der Glukoseaufnahme mit vergleichbarer Genauigkeit (R2 = 0,99, P < 0,001) wie die intrazelluläre FD-Glukoseaufnahme messen.
Als nächstes wurde eine experimentelle Umgebung entwickelt, um die extrazelluläre FD-Glukoseaufnahmeanwendung in kinetischen Studien zu validieren, in denen verschiedene Gewebe bei der Stimulation mit kanonischen und experimentellen Induktoren der Glukoseaufnahme untersucht wurden (Abbildung 3). Wir wählten das Lepob Mausmodell der Insulinresistenz in peripheren Geweben, einschließlich viszeralem weißem Fettgewebe27,28. Die gut etablierten Reaktionen auf Insulin in diesen Mäusen wurden mit den Wirkungen der neuartigen Verbindung AAC2 verglichen, die sowohl auf periphere als auch auf Nervengewebe über Leptinrezeptor- und Glukosetransporter-GLUT1-abhängige Mechanismenwirkte 18. Lepob Mäusen wurde i.p. Insulin oder AAC2 injiziert. Organe wurden 15 Minuten nach der Injektion seziert. Dann wurde die Kinetik der extrazellulären FD-Glukose-Depletion in viszeralem Fett, Leber und Gehirn ex vivo untersucht (Abbildung 3). In Übereinstimmung mit der berichteten Insulinresistenz in peripheren Geweben wurde extrazelluläre FD-Glukose während 120 Minuten Inkubation nicht in nicht stimuliertem Kontrollviszeralfett erschöpft (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu führte die Vorbehandlung von Mäusen mit Insulin oder AAC2 vor der Dissektion zu einer signifikanten Erschöpfung der extrazellulären FD-Glukose innerhalb eines Zeitintervalls von 30 min bzw. 60 min.
Die Leberaufnahme von Glukose verwendet Glukosetransporter, einschließlich GLUT2, das unabhängig von der Insulinstimulationist 29,30. Dementsprechend war extrazelluläre FD-Glukose in insulinstimulierten Leberexplantaten im Vergleich zu nicht stimulierten Leberexplantationen zunächst nicht erschöpft (Abbildung 3B), obwohl eine signifikante Erschöpfung der FD-Glukose nach 120 min Inkubation in Leberexplantaten, die mit Insulin stimuliert wurden, im Vergleich zu den Ausgangswerten (0 min) beobachtet wurde. Auf der anderen Seite wurde die extrazelluläre FD-Glukose in Leberexplantaten, die mit AAC2 vorbehandelt wurden, zeitabhängig signifikant verringert.
Im Gehirn ist der Haupttransporter GLUT1 unter anderen Transportern31. Die Kinetik des FD-Glukoseabbaus unterschied sich im Gehirn im Vergleich zu anderem Gewebe auffallend (Abbildung 3C). Der signifikante Abbau von Glukose wurde in dem extrazellulären Medium beobachtet, das das nicht behandelte Gehirn nach 60 Minuten Inkubation enthielt (von 100% bei 0 min auf 78%). Das Medium, das mit Gehirnen von insulinbehandelten Lep-ob-Mäusen inkubiert wurde, zeigte eine moderate, aber signifikante lineare Abnahme der FD-Glukose (von 100% bei 0 min auf 95%). AAC2-stimulierte Gehirne führen zu einer tiefgreifenden schnellen Abnahme der extrazellulären FD-Glukose während der ersten 20 Minuten (von 100% bei 0 min auf 67,4%). Zusammen unterstützen Messungen des extrazellulären Glukosemangels die zuvor berichteten Unterschiede in der Glukoseaufnahme in diesen Geweben in vivo32.
Abbildung 1: Prinzip der extrazellulären FD-Glukose-Depilationsmethode. Zellen, die im 96-Well-Format kultiviert sind, eignen sich für diesen Assay. Um zu überleben, nehmen Zellen Glukose auf und dieser Zustrom verringert den Gehalt an extrazellulärer Glukose. Der Ersatz von Glukose durch FD-Glukose ermöglicht die Überwachung dieser Veränderungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Depletion von extrazellulärer FD-Glucose korrelierte mit der intrazellulären Aufnahme in vitro. 3T3-L1-Präadipozyten wurden vor der Inkubation in einem glukosefreien Medium für 40 min mit unterschiedlichen Konzentrationen von FD-Glucose mit und ohne Insulin (1,7 mM; 40 min Inkubation) inkubiert. (A, B) Dosisabhängige Aufnahme von FD-Glucose (A) und extrazellulärer FD-Glucose-Abbau (B) bei Kontrolle (d.h. ohne Insulin) (geschlüpfte Balken) und insulinstimulierte Zellen (schwarze Balken). Die FD-Glukoseaufnahme wurde durch Proteinkonzentrationen normalisiert. Die Daten werden in % des Wertes angegeben, der in einer ohne FD-Glucose inkubierten Kontrolle gemessen wird (Mittelwert SD, n = 8 pro Zustand). Die Signifikanz wurde mittels ungepaartem t-Test untersucht. (C) Korrelation zwischen intrazellulärer und extrazellulärer FD-Glucose (%) misst mit (Quadraten) oder ohne (Kreise) Insulin in Experimenten, die in (A) und (B) beschrieben sind. Pearson-Korrelation, P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Kinetik des extrazellulären FD-Glukose-Abbaus in verschiedenen Organen ex vivo. (A-C) Lep-ob-Mäuse wurden mit Vehikel (PBS, n = 4), Insulin (12 IE/kg BW, n = 3) und AAC2 (1 nmol/g BW, n = 3) injiziert. Nach 15 min wurden Gewebe seziert und isoliert. Explantationen von (A) viszeralem Fett, (B) Leber und (C) Gehirn wurden in FD-Glucose (0,29 mM) inkubiert. Die Kinetik des extrazellulären Glukosemangels wurde in Aliquots des Mediums zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Die Daten (mittlere SD) werden in % der Fluoreszenz in jedem Organ bei 0 min der Inkubation angegeben. Signifikanz P < 0,05, ungepaarter t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Lösung/Mittel | Komponenten |
| Ethanol: DMSO (1: 1 / v / v) | Ethanol (200 μL) und DMSO (200 μL) in 1-1,5 mL Röhrchen; Verwenden Sie Ethanol in Zellkulturqualität und DMSO |
| Mittel 1 | DMEM (89 ml), Penicillin/Streptomycin (1 %) (1 ml) und Kälberserum (10 %) (10 ml) im sterilen 50 ml-Röhrchen |
| Zentrifugationsmedium 2 | DMEM (89 ml), Penicillin/Streptomycin (1 %) (1 ml) und Rinderserum (10 %) (10 ml) im sterilen 50 ml Schlauch |
| Lagerung FD-Glukoselösung 5 mg/ml (14,5 mM) | FD-Glukose (1 mg) und Ethanol: DMSO (1: 1 / v / v) (200 μL) in 0,5 ml Röhrchen; bei -80 °C lagern, vorzugsweise unter Argon- oder Stickstoffatmosphäre |
| Arbeitende FD-Glucoselösung 5 μg/ml (14,5 mM) | Lagerung FD Glukoselösung 5 mg/ml (1 μL), Glukosefreies DMEM (999 μL); Bereiten Sie sich unmittelbar vor dem Experiment vor. |
Tabelle 1: Herstellung von Nährmedien und FD-Glucose-Lösungen.
| Verdünnung | Steuerung | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Konzentration (μg/ml) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| Glukosefreies DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD-Glukose 5 μg/ml (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tabelle 2: Herstellung von FD-Glucose-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen für Experimente in Abbildung 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der direkte Vergleich der extrazellulären FD-Glukose-Depletion mit der normalisierten intrazellulären Glukoseaufnahme in der Zellkultur zeigte eine hohe Korrelation, was darauf hindeutet, dass der extrazelluläre Glukosemangel eine Ersatzmessung für die Beurteilung der Glukoseaufnahme sein könnte. Die Messung von extrazellulärer FD-Glukose kann einen breiten Bereich von FD-Glukosekonzentrationen verwenden, auch 0,5-2,5 μg FD-Glukose / ml scheinen den optimalen Bereich zu liefern. Extrazelluläre FD-Glukose erfordert keine Normalisierung auf Zellzahl oder Proteinkonzentrationen, die für die intrazelluläre FD-Glukoseaufnahme notwendig sind. Die erwartete Einschränkung extrazellulärer FD-Glukosemessungen ist die Untersuchung von reaktiven Sauerstoffspezies-induzierenden Agenzien und den Spuren von Blut in Explantationen, die die Fluoreszenz löschen können. Andere Umweltfaktoren, die die Fluoreszenz beeinflussen, wie z. B. Licht, sollten ebenfalls berücksichtigt werden. Längere Handhabungszeit, die bei der Verwendung mehrerer Gewebeexplantationen erforderlich ist, kann die Lebensfähigkeit des Gewebes und den Glukosestoffwechsel beeinträchtigen. Dies könnte eine zusätzliche Einschränkung sein. Die ausgeschnittenen Gewebe müssen sich in einem kleinen Größenbereich (50-300 mg) befinden, um die Durchlässigkeit von Glukose im Gewebe zu ermöglichen. Die gleichzeitige Handhabung von Geweben durch mehrere Bediener kann die Handhabungszeit verkürzen. Obwohl wir die Glukoseaufnahme innerhalb der Gewebeexplantate nicht gemessen haben, deuten die gesammelten Beobachtungen in kultivierten Gewebeexplantationen darauf hin, dass sie in dem glukosehaltigen Medium bis zu 17 Tage mit dem fortschreitenden Funktionsverlustüberleben 33. In diesem Protokoll ermöglicht die kurze Inkubationszeit für Explantate die Überwachung des Glukosestoffwechsels in relativ funktionellen Geweben. In den Geweben mit komplexer zellulärer Organisation, wie dem Gehirn, stellt die Größe eine unauflösbare Einschränkung dar, da der Zerfall von komplexem Gewebe und der daraus resultierende Zelltod die Glukoseaufnahme beeinflusst. Die Inkubation des Gehirns für 24 h wurde jedoch bisher zur Identifizierung des endogenen Regulationsmechanismus verwendet, der die relative physiologische Funktionalität des ausgeschnittenen Mausgehirns in glukosehaltigem Medium34 unterstützt. Unabhängig davon können das vereinfachte Verfahren und der einfache Zugang zu extrazellulärer FD-Glucose die Verwendung dieses Assays in einem Hochdurchsatzformat ermöglichen. Der Vergleich der basischen und insulinstimulierten extrazellulären FD-Glukose-Depletion legt nahe, dass dieser Assay angewendet werden könnte, um humorale, ernährungsphysiologische, pathogene, Umweltfaktoren oder pharmazeutische Medikamente zu identifizieren, die die Glukoseaufnahme regulieren. Obwohl dieser Assay die Entdeckung vereinfacht, erforderten die Befunde eine Validierung mit der quantitativen radioaktiven Markierung 20 analytischer Methoden21,22,23 und/oder bildgebender Verfahren 5,24 zur rigorosen mechanistischen Aufklärung der Signalwege.
Zu den kritischen Schritten in diesem Protokoll gehört die Optimierung der Konfluenz- und Fastenzeit, die sowohl die basale als auch die stimulierte FD-Glukoseaufnahme beeinflussen. Diese Parameter könnten auch von der Jahreszeit beeinflusst werden, basierend auf den Beobachtungen der Autoren. Darüber hinaus verwenden verschiedene Zelltypen spezifische Mechanismen für die Glukoseaufnahme, einschließlich verschiedener Glukosetransporter und regulatorischer Hormon- / Rezeptorwechselwirkungen32,35,36. Daher müssen andere Positivkontrollen als Insulin für die Zellkulturen in Betracht gezogen werden, die andere Gewebe als Muskel- oder Fettgewebe darstellen, die durch Insulin / GLUT4-Achsen reguliert werden. Die Fehlerbehebung umfasst auch die Anpassung des Zellzusammenflusses und die Optimierung der Zeit für das Fasten/Wiederfüttern mit FD-Glukose. Darüber hinaus könnte die Empfindlichkeit der extrazellulären Glukosemessung verbessert werden, indem der Gehalt an extrazellulärer FD-Glukose unter Berücksichtigung der für die Glukoseaufnahme erforderlichen Schwellenwerte reduziert wird. Das in Abbildung 2 beschriebene Experiment kann Forschern helfen, diesen Assay für die Verwendung mit anderen Zellkulturen oder die Fehlerbehebung anzupassen.
Die intrinsische Variabilität des Glukosestoffwechsels erforderte auch eine höhere Stichprobengröße (n = 5-8). Obwohl extrazelluläre Messungen des FD-Glukoseverlustes die gleiche Genauigkeit aufwiesen wie die intrazelluläre Aufnahme von FD-Glukose, die durch Protein normalisiert wurde, kann die Normalisierung die Assay-Variabilität reduzieren. Neben der Messung der Proteinkonzentrationen kann die Messung des DNA-Gehalts in der Zelle eine weitere zuverlässige Ersatzbewertung der Zellzahl37 sein.
Extrazelluläre FD-Glucose ist für kinetische Messungen zugänglich. Hier wurde ein einfaches Verfahren der kinetischen Messung von extrazellulärer FD-Glucose entwickelt, um organspezifische Reaktionen auf Mediatoren der Glukoseaufnahme zu identifizieren. Diese Ex-vitro-Studien können die Reaktion der Organe auf verschiedene Reize in vivo direkt testen, die mit der Exposition von Organen gegenüber FD-Glukose und kinetischen Ex-vivo-Messungen kombiniert wird, wie in Abbildung 3 dargestellt. Obwohl Ex-vivo-Studien den In-vivo-Bedingungen nicht vollständig ähneln, haben sie mehrere Vorteile. Organexplantationen behalten eine komplexe mehrzellige primäre Zellstruktur bei, im Gegensatz zu unsterblichen Zellkulturen, die eine veränderte Genexpression aufweisen. Die moderne Arzneimittelentwicklung verwendet Modellorganismen, eine indirekte Bewertung der Glukoseaufnahme auf der Grundlage von Transkriptom oder Metabolom22, eine umfassende Insulinklemmtechnik 38 oder eine teure Bildgebung32. Obwohl die Messung von extrazellulärer FD-Glukose in explantierten Organen diese Technologien nicht ersetzen wird, wird sie eine schnelle Bewertung von Verbindungen, Metaboliten und Genen ermöglichen, um die Entdeckung neuartiger therapeutischer Ziele zu erleichtern, die die Glukoseaufnahme auf gewebespezifische Weise regulieren. Die Entwicklung sicherer Therapien, die den Glukosestoffwechsel in bestimmten Geweben ansprechen, kann eine Lösung für Krebs, Demenz, Alterung, Diabetes, Autoimmunerkrankungen, Fettleibigkeit und andere verwandte Anwendungen bieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autoren haben keine Probleme offenzulegen und haben keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Das Projekt wurde vom Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award und dem Kathleen Kelly Award unterstützt. Weitere Unterstützungen waren das National Center for Research Resources UL1RR025755 und NCI P30CA16058 (OSUCCC), die NIH Roadmap for Medical Research. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht die offiziellen Ansichten des National Center for Research Resources oder des NIH dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization.
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
