Summary
L’épuisement extracellulaire du glucose marqué par fluorescence est en corrélation avec l’absorption du glucose et pourrait être utilisé pour le dépistage à haut débit de l’absorption du glucose dans les organes excisés et les cultures cellulaires.
Abstract
L’épidémie mondiale de diabète en cours augmente la demande d’identification des facteurs environnementaux, nutritionnels, endocriniens, génétiques et épigénétiques affectant l’absorption du glucose. La mesure de la fluorescence intracellulaire est une méthode largement utilisée pour tester l’absorption du glucose marqué par fluorescence (FD-glucose) dans les cellules in vitro, ou pour l’imagerie des tissus consommateurs de glucose in vivo. Ce test évalue l’absorption du glucose à un moment choisi. L’analyse intracellulaire suppose que le métabolisme du FD-glucose est plus lent que celui du glucose endogène, qui participe aux réactions cataboliques et anabolisantes et à la signalisation. Cependant, le métabolisme dynamique du glucose modifie également les mécanismes d’absorption, ce qui nécessiterait des mesures cinétiques de l’absorption du glucose en réponse à différents facteurs. Cet article décrit une méthode de mesure de l’épuisement extracellulaire du FD-glucose et valide sa corrélation avec l’absorption intracellulaire du FD-glucose dans les cellules et les tissus ex vivo. L’épuisement extracellulaire du glucose peut être potentiellement applicable pour les études cinétiques et dose-dépendantes à haut débit, ainsi que pour l’identification des composés ayant une activité glycémique et leurs effets spécifiques aux tissus.
Introduction
La demande pour mesurer l’absorption du glucose augmente avec le besoin critique de faire face à une augmentation épidémique d’une multitude de maladies dépendantes du métabolisme du glucose. Les mécanismes sous-jacents des maladies métaboliques dégénératives, des troubles neurologiques et cognitifs1, des maladies inflammatoires2 et infectieuses3, du cancer 4,5, ainsi que du vieillissement 6, dépendent du métabolisme du glucose pour l’énergie et son stockage, les processus anabolisants, la modification des protéines et des gènes, la signalisation, la régulation des gènes et la synthèse et la réplication des acides nucléiques 7,8,9 . Le diabète sucré (DM) est directement lié à un dysfonctionnement de la régulation de l’absorption du glucose. Le DM est un spectre de maladies chroniques telles que le diabète sucré de type 1, -2 et -3, le diabète gestationnel, le diabète de maturité des jeunes et d’autres types de cette maladie induite par des facteurs environnementaux et / ou génétiques. En 2016, le premier rapport mondial de l’OMS sur le diabète a démontré que le nombre d’adultes vivant avec le DIABÈTE le plus répandu a presque quadruplé depuis 1980 pour atteindre 422 millions d’adultes10, et ce nombre de patients atteints de diabète a augmenté de façon exponentielle au cours des dernières décennies. Rien qu’en 2019, on estime à 1,5 million le nombre de décès directement causés par10 DM. Cette recrudescence spectaculaire est due à l’augmentation du diabète de type 2 et aux conditions qui l’animent, notamment le surpoids et l’obésité10. La pandémie de COVID-19 a révélé une double augmentation de la mortalité chez les patients atteints de DM par rapport à la population générale, suggérant le rôle profond mais mal compris du métabolisme du glucose dans la défense immunitaire3. La prévention, le diagnostic précoce et le traitement de la DM, de l’obésité et d’autres maladies nécessitent l’optimisation des mesures de l’absorption du glucose par différents tissus et l’identification des facteursenvironnementaux 11,nutritionnels 12, endocriniens13, génétiques 14 et épigénétiques15 affectant l’absorption du glucose.
Dans la recherche, l’absorption intracellulaire et / ou tissulaire du glucose est généralement mesurée par le glucose marqué par fluorescence (FD-glucose) in vitro 16,17,18 et in vivo19. Le FD-glucose est devenu une méthode préférée par rapport aux méthodes plus précises utilisant le glucose20 marqué radioactivement, l’analyse par spectroscopie de masse analytique21, la métabolomique22, les méthodes de résonance magnétique nucléaire23 et la tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (TEP / CT) 5,24. Contrairement à l’absorption du glucose FD, les méthodes d’analyse nécessitant plus de matériel biologique peuvent impliquer une préparation d’échantillon en plusieurs étapes, des instruments coûteux et une analyse complexe des données. Des mesures efficaces et peu coûteuses de l’absorption du FD-glucose dans les cultures cellulaires ont été utilisées dans des expériences de preuve de concept et peuvent nécessiter une validation par d’autres méthodes.
La base de l’application de FD-glucose pour les études d’absorption du glucose est le métabolisme réduit du FD-glucose par rapport au glucose endogène25. Néanmoins, le glucose endogène et le FD-glucose sont répartis dynamiquement entre tous les compartiments cellulaires pour une utilisation dans les processus anabolisants, cataboliques et de signalisation. Le compartimentage et le traitement dépendant du temps25 du FD-glucose interfèrent avec les mesures de fluorescence et représentent les principaux facteurs limitant l’utilisation de ce test dans les expériences de criblage à haut débit, l’analyse cinétique, la culture cellulaire 3D, les co-cultures et les expériences d’explantation tissulaire. Ici, nous fournissons des données démontrant une forte corrélation entre l’épuisement extracellulaire du FD-glucose et son absorption intracellulaire, suggérant l’épuisement extracellulaire du FD-glucose comme mesure de substitution de l’absorption intracellulaire du glucose. La mesure de l’épuisement extracellulaire du glucose a été appliquée pour valider les différences tissulaires dans l’absorption du glucose chez les souris traitées avec de l’insuline et un médicament expérimental18 pour fournir une preuve de principe de cette méthode.
Le protocole actuel décrit les mesures intracellulaires et extracellulaires (Figure 1) de l’absorption du FD-glucose dans les cellules 3T3-L1. Les sections 1 à 7 du protocole expliquent la culture et la croissance des cellules pendant 48 h; la famine cellulaire, la stimulation et les mesures extracellulaires de base; et les mesures post-stimulation du FD-glucose extracellulaire et les mesures intracellulaires du FD-glucose et des protéines. La section 8 du protocole décrit la mesure ex vivo de l’absorption extracellulaire du FD-glucose dans les tissus disséqués de souris ob/ob en présence et en l’absence d’insuline et de composé d’acides aminés 2 (CAA2) décrite ailleurs18.
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Protocol
Les études sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Ohio State University (OSU, protocole 2007A0262-R4).
REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité de classe II avec le ventilateur allumé et les lumières éteintes.
1. Préparation des matériaux
REMARQUE : Tous les matériaux sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
- Préparer le milieu 1, le milieu de centrifugation 2 et les solutions de stockage et de travail du 2-désoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose fluorescent (2-NBDG ou FD-glucose) conformément au tableau 1 dans une armoire de biosécurité de classe II. Protégez le FD-glucose de la lumière tout au long de l’expérience en éteignant toutes les lumières sous le capot.
- Utilisez des réactifs de culture cellulaire prêts à l’emploi : Trypsine-EDTA, solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et milieu Eagle modifié de Dulbecco sans glucose et sans phénol rouge (ci-après, DMEM sans glucose).
- Utilisez 20 mL de tampon de lyse par dosage radioimmunoprécipitation (RIPA).
REMARQUE: Dans les sections suivantes, l’épuisement extracellulaire et l’absorption intracellulaire de différentes doses de FD-glucose sont comparés dans les fibroblastes 3T3-L1 avec et sans stimulation par insuline (Figure 2).
2. Culture cellulaire et entretien 3T3-L1
- Culture de fibroblastes de souris 3T3-L1 par placage de 1 x 106 cellules diluées dans 20 mL de Milieu 1 dans deux plaques de 96 puits. Plaque 100 μL de suspension cellulaire par puits, assurant le maintien de l’homogénéité de cette suspension par mélange. Cultiver des cellules pendant 48 h dans un incubateur à 37 °C (5 % deCO2 et 95 % d’humidité) sans changer de milieu jusqu’à environ 70 % à 80 % de confluence.
- Maintenir les cellules confluentes et à jeun en les cultivant dans le même milieu pendant 48 h. Variez le temps d’incubation de 24 à 72 h en fonction de l’état catabolique à jeun souhaité.
3. Famine des cellules 3T3-L1
- Milieux décantants des cellules dans les plaques de 96 puits. Absorbez le liquide restant à l’aide d’essuie-tout stériles.
- Rincez la plaque de 96 puits avec 100 μL de PBS par puits et absorbez le liquide restant avec des serviettes en papier stériles.
- Ajouter 100 μL de DMEM sans glucose par puits et incuber pendant 40 min. Ajustez le temps d’incubation en fonction du type de cellule, des stimuli et du niveau de jeûne souhaité.
REMARQUE: Le temps d’incubation peut nécessiter une optimisation en fonction de la saison.
4. Préparation de solutions de FD-glucose avec différentes concentrations
REMARQUE: L’expérience de la figure 2 examine les milieux extracellulaires et intercellulaires avec et sans stimulation avec l’insuline.
- Utilisez huit répliques (une rangée dans une plaque de 96 puits) pour chaque condition de stimulation. Par conséquent, préparez 1 mL pour chaque condition de stimulation (spécifiée dans le tableau 2 et ci-dessous).
- Utilisez huit conditions de stimulation sans insuline : FD-glucose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL et 0 μg/mL (témoin sans FD-glucose) dans une plaque de 96 puits.
- Utilisez huit conditions de stimulation avec de l’insuline (10 μg/mL, concentration finale) : FD-glucose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL et 0 μg/mL (contrôle sans FD-glucose) dans une autre plaque de 96 puits.
- Pour préparer les conditions de stimulation, diluer 1 μL de solution de travail FD-glucose de 5 mg/mL (tableau 1) dans 999 μL de DMEM sans glucose pour obtenir 1 mL de solution mère (dilution 1:1000 ou 5 μg/mL).
- À l’aide de cette solution mère de travail, préparer des dilutions de 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 et 1:100 000 de FD-glucose pour obtenir 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL et 0,05 μg/mL (tableau 2) dans des tubes de 2 mL immédiatement avant les expériences dans une armoire de biosécurité sans lumières.
- Répétez l’étape 4.4 et ajoutez 1 μL d’insuline (10 mg/mL, concentration finale) à chacune des conditions spécifiées ci-dessus.
REMARQUE : La concentration finale d’insuline dans ces échantillons est de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Pour obtenir l’homogénéisation, ajoutez de l’insuline aux tubes avant d’ajouter d’autres solutions.
5. Traiter les cellules 3T3-L1 affamées
- Après 40 min d’incubation, décanter le DMEM sans glucose de chaque puits dans des plaques de 96 puits et absorber le liquide restant avec des serviettes en papier stériles.
- Ajouter 100 μL (par puits) chacun des différentes conditions de traitement décrites ci-dessus aux puits le long d’une colonne, et 100 μL (par puits) de la même condition de traitement aux puits le long de la rangée (huit répliques) dans les deux plaques de 96 puits. Étiquetez les plaques qui ont utilisé les conditions avec et sans insuline. Ajouter le DMEM sans glucose seul aux puits témoins (n = 8).
- Incuber la plaque pendant 40 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité) dans l’obscurité.
6. Mesures extracellulaires et intercellulaires pour les cellules 3T3-L1 stimulées
- Une fois que les cellules ont été stimulées pendant 40 minutes, transférez le milieu de stimulation des deux plaques dans de nouvelles plaques de 96 puits en conservant la même disposition expérimentale.
- Décantez toute solution restante des plaques de 96 puits stimulées d’origine avec des cellules sur des serviettes en papier stériles.
- En option, lavez les cellules avec PBS. Retirez le PBS et décantez toute solution restante sur des serviettes en papier stériles.
- Ajouter 100 μL du tampon de lyse RIPA à chaque puits. Éventuellement, ajoutez un inhibiteur de protéase au tampon RIPA pour protéger les protéines. Placer les plaques contenant DU RIPA dans un agitateur pendant 30 min.
- À l’aide d’un lecteur de microplaques (Table des matériaux), mesurez la fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation (Ex) et d’émission (Em) de 485 et 535 nm, respectivement, d’abord dans le milieu contenant du FD-glucose extracellulaire, puis dans la plaque avec des cellules lysées RIPA à la fin de 30 min d’incubation (voir étape 6.4).
7. Normalisation à base de protéines de l’absorption intracellulaire du glucose
REMARQUE: L’absorption intracellulaire de FD-glucose dépend du nombre de cellules. Les niveaux de protéines dans les lysats cellulaires sont proportionnels au nombre de cellules qui permettent de normaliser les niveaux intracellulaires de GLUCOSE FD au nombre de cellules dans chaque puits.
- Effectuer un dosage des protéines BCA conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Quantifier les concentrations de protéines dans chaque puits contenant des cellules lysées RIPA.
- Utilisez 10 μL de l’homogénat RIPA et mesurez les concentrations de protéines en triple exemplaire pour augmenter la précision des mesures dans des plaques de 96 puits.
- Quantifier les protéines en fonction des étalons protéiques (protéines 0, 10, 20, 30, 40, 50 et 60 μg/mL) analysées avec des échantillons sur chaque plaque de 96 puits.
- Mesurer l’absorbance à 562 nm et quantifier les concentrations de protéines dans chaque échantillon en fonction de la formule de régression linéaire obtenue pour l’étalon protéique.
- Normaliser les niveaux de FD-glucose intracellulaire en utilisant la valeur fluorescente / concentration de protéines dans chaque puits. L’épuisement extracellulaire du FD-glucose ne nécessite pas de normalisation.
- Si vous le souhaitez, utilisez les valeurs de référence moyennes dans les échantillons de contrôle pour une normalisation supplémentaire (100 %).
8. Mesure ex vivo de l’épuisement extracellulaire du glucose FD dans les organes
- Prétraitez les souris avec des composés stimulant le métabolisme du glucose avant la dissection d’organe, comme suit.
- Utilisez des souris mâles Lepob âgées de neuf semaines (n = 11). Nourrissez toutes les souris avec un régime chow régulier avant l’expérience.
- Assignez des souris au hasard en trois groupes pour des injections intrapéritonéales (i.p.).
- Injecter des souris du groupe témoin Lepob avec 0,1 mL de PBS stérile (n = 4).
- Injecter à des souris du groupe insuline Lepob 0,1 mL de PBS stérile, contenant 12 UI d’insuline humaine par gramme de poids corporel (BW) (n = 3).
- Injecter des souris du groupe AAC2 Lepob avec 0,1 mL de PBS stérile, contenant 0,1 nmol AAC2 par gramme de poids corporel (BW) (n = 4).
- Après 15 min, soumettre les souris à l’inhalation de 5% d’isoflurane et d’exsanguinate de sang par ponction cardiaque des animaux anesthésiés26.
- Disséquer le tissu adipeux blanc épidydimal viscéral (200 mg), le foie (200 mg) et le cerveau entier de chaque animal. Utilisez une hotte de biosécurité de classe II pour la manipulation des tissus.
- Préparer la solution de travail FD-glucose (0,29 mM) dans du DMEM sans glucose dans une armoire de biosécurité de classe II sans lumière.
- Mesurer la fluorescence de la solution de travail FD-glucose (0,29 mM) à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nm, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques.
- Incuber les tissus/organes prélevés dans une plaque de 6 puits contenant du PBS pendant 1 min. Manipulez chaque tissu ou organe dans un puits séparé.
- Après 1 min, placez chaque mouchoir sur une serviette en papier stérile pour absorber le PBS. Transférer les tissus/organes dans une plaque séparée de 6 puits contenant 4 000 μL de DMEM sans glucose et incuber pendant 2 min.
- Après 2 min, prélever et transférer les tissus dans les puits d’une plaque de 6 puits contenant 0,29 mM de solution de travail FD-glucose (1 mL/puits). Incuber les plaques de 6 puits contenant des tissus dans une solution de travail FD-glucose à 37 °C (5% de CO2 et 95% d’humidité).
- Recueillir 100 μL de solution de travail FD-glucose de chaque puits après 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min d’incubation, pour analyser la cinétique de l’épuisement extracellulaire du glucose FD. Agiter avant et après la collecte.
- Transférer 100 μL de solution de travail FD-glucose dans des plaques de 96 puits pour mesurer la fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nm, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques.
- Normaliser la fluorescence à la valeur de 0 min (100 %) pour chaque organe de chaque animal (Figure 3).
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Representative Results
L’apport intracellulaire et l’épuisement extracellulaire du glucose ont été mesurés dans les préadipocytes 3T3-L1, en réponse à différentes concentrations de GLUCOSE FD (Figure 2) avec et sans stimulation par l’insuline. La figure 2A montre une augmentation dose-dépendante de l’absorption intracellulaire du GLUCOSE FD, qui a été significativement augmentée en présence d’insuline. La diminution concomitante du FD-glucose extracellulaire dans les mêmes cellules est illustrée à la figure 2B, où la stimulation de l’insuline a entraîné une diminution significative des taux de FD-glucose extracellulaire par rapport aux échantillons sans stimulation à l’insuline. L’apport intracellulaire de FD-glucose était corrélé à l’épuisement extracellulaire du FD-glucose de manière dose-dépendante dans des échantillons avec et sans insuline (Figure 2C). Ainsi, l’épuisement extracellulaire du FD-glucose peut mesurer un changement dans l’absorption du glucose avec une précision comparable (R2 = 0,99, P < 0,001) que l’absorption intracellulaire du FD-glucose.
Ensuite, un cadre expérimental a été développé pour valider l’application extracellulaire de l’absorption du FD-glucose dans des études cinétiques examinant différents tissus lors de la stimulation avec des inducteurs canoniques et expérimentaux de l’absorption du glucose (Figure 3). Nous avons sélectionné le modèle murin Lepob de résistance à l’insuline dans les tissus périphériques, y compris le tissu adipeux blanc viscéral27,28. Les réponses bien établies à l’insuline chez ces souris ont été comparées aux effets du nouveau composé AAC2, agissant sur les tissus périphériques et nerveux via les mécanismes dépendants du récepteur de la leptine et du transporteur de glucose GLUT118. Des souris Lepob ont été injectées par i.p. avec de l’insuline ou de l’AAC2. Les organes ont été disséqués 15 minutes après l’injection. Ensuite, la cinétique de l’épuisement extracellulaire du FD-glucose a été étudiée dans la graisse viscérale, le foie et le cerveau ex vivo (Figure 3). En accord avec la résistance à l’insuline rapportée dans les tissus périphériques, le FD-glucose extracellulaire n’a pas été épuisé dans la graisse viscérale témoin non stimulée pendant 120 minutes d’incubation (Figure 3A). En revanche, le prétraitement de souris avec de l’insuline ou de l’AAC2 avant la dissection a entraîné un épuisement significatif du FD-glucose extracellulaire dans un intervalle de temps de 30 min et 60 min, respectivement.
L’absorption hépatique du glucose utilise des transporteurs de glucose, y compris GLUT2, qui est indépendant de la stimulation de l’insuline29,30. En conséquence, le FD-glucose extracellulaire n’était initialement pas appauvri en explants hépatiques stimulés par l’insuline par rapport aux explants hépatiques non stimulés (Figure 3B), bien qu’un épuisement significatif du FD-glucose ait été observé après 120 minutes d’incubation dans l’explantation hépatique stimulée par de l’insuline par rapport aux niveaux initiaux (0 min). D’autre part, le glucose FD extracellulaire a été significativement diminué de manière dépendante du temps dans les explantes hépatiques prétraitées avec AAC2.
Dans le cerveau, le transporteur principal est GLUT1 parmi les autres transporteurs31. La cinétique d’épuisement du FD-glucose était étonnamment différente dans le cerveau par rapport à d’autres tissus (Figure 3C). L’épuisement significatif du glucose a été observé dans le milieu extracellulaire contenant le cerveau non traité après 60 min d’incubation (de 100% à 0 min à 78%). Le milieu incubé avec des cerveaux de souris Lepob traitées à l’insuline a montré une diminution linéaire modérée mais significative du FD-glucose (de 100% à 0 min à 95%). Les cerveaux stimulés par l’AAC2 entraînent une diminution rapide et profonde du glucose FD extracellulaire au cours des 20 premières minutes (de 100% à 0 min à 67,4%). Ensemble, les mesures de l’épuisement extracellulaire du glucose soutiennent les différences précédemment signalées dans l’absorption du glucose dans ces tissus in vivo32.
Figure 1 : Principe de la méthode extracellulaire des déplétions FD-glucose. Les cellules cultivées au format 96 puits conviennent à ce test. Pour survivre, les cellules absorbent le glucose et cet afflux diminue les niveaux de glucose extracellulaire. Le remplacement du glucose par du FD-glucose permet de surveiller ces changements. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Épuisement du FD-glucose extracellulaire corrélé à l’absorption intracellulaire in vitro. Les préadipocytes 3T3-L1 ont été incubés dans un milieu sans glucose pendant 40 min avant l’incubation avec différentes concentrations de FD-glucose avec et sans insuline (1,7 mM ; 40 min d’incubation). (A, B) Absorption dose-dépendante du FD-glucose (A) et de l’épuisement extracellulaire du FD-glucose (B) dans le contrôle (c.-à-d. sans insuline) (barres hachurées) et les cellules stimulées par l’insuline (barres noires). L’absorption du FD-glucose a été normalisée par les concentrations de protéines. Les données sont présentées en % de la valeur mesurée chez le témoin incubé sans FD-glucose (ET moyenne, n = 8 par condition). La signification a été examinée par un test t non apparié. (C) Corrélation entre les mesures intracellulaires et extracellulaires du FD-glucose (%) avec (carrés) ou sans (cercles) d’insuline dans les expériences décrites aux points (A) et (B). Corrélation de Pearson, P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Cinétique de l’épuisement extracellulaire du FD-glucose dans différents organes ex vivo. (A-C) Des souris Lepob ont été injectées avec du véhicule (PBS, n = 4), de l’insuline (12 UI/kg p.c., n = 3) et de la CAA2 (1 nmol/g p.C., n = 3). Après 15 minutes, les tissus ont été disséqués et isolés. Des explants de graisse viscérale (A), de foie (B) et de cerveau (C) ont été incubés dans du glucose FD (0,29 mM). La cinétique de l’épuisement extracellulaire du glucose a été mesurée en aliquotes du milieu à différents moments. Les données (ET moyenne) sont indiquées en % de fluorescence dans chaque organe à 0 min d’incubation. Signification P < 0,05, test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution/Moyen | Composants |
| Éthanol:DMSO (1:1/v/v) | Éthanol (200 μL) et DMSO (200 μL) dans un tube de 1 à 1,5 mL; utiliser de l’éthanol et du DMSO de qualité de culture cellulaire |
| Moyenne 1 | DMEM (89 mL), pénicilline/streptomycine (1 %) (1 mL) et sérum de veau (10 %) (10 mL) dans un tube stérile de 50 mL |
| Milieu de centrifugation 2 | DMEM (89 mL), pénicilline/streptomycine (1 %) (1 mL) et sérum bovin (10 %) (10 mL) dans un tube stérile de 50 mL |
| Stockage de la solution FD-glucose 5 mg/mL (14,5 mM) | Glucose FD (1 mg) et éthanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) dans un tube de 0,5 mL; conserver à -80 °C, de préférence sous atmosphère d’argon ou d’azote |
| Solution de FD-glucose de travail 5 μg/mL (14,5 mM) | Stockage de la solution de glucose FD 5 mg/mL (1 μL), DMEM sans glucose (999 μL); préparer immédiatement avant l’expérience. |
Tableau 1 : Préparation des milieux de culture et des solutions de FD-glucose.
| Dilution | Contrôle | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentration (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| DMEM sans glucose (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glucose 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tableau 2 : Préparation de solutions de FD-glucose avec différentes concentrations pour les expériences illustrées à la figure 2.
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Discussion
La comparaison directe de l’épuisement extracellulaire du FD-glucose avec l’absorption intracellulaire normalisée du glucose dans la culture cellulaire a montré une corrélation élevée, suggérant que l’épuisement extracellulaire du glucose pourrait être une mesure de substitution pour l’évaluation de l’absorption du glucose. La mesure du GLUCOSE FD extracellulaire peut utiliser une large gamme de concentrations de glucose FD, également 0,5-2,5 μg FD-glucose / mL semblent fournir la plage optimale. Le FD-glucose extracellulaire ne nécessite pas de normalisation du nombre de cellules ou des concentrations de protéines nécessaires à l’absorption intracellulaire du FD-glucose. La limitation prévue des mesures extracellulaires du GLYCÉMIE-FD est l’étude des agents réactifs induisant des espèces de l’oxygène et des traces de sang dans les explants qui peuvent éteindre la fluorescence. D’autres facteurs environnementaux affectant la fluorescence, tels que la lumière, doivent également être pris en compte. Le temps de manipulation prolongé requis lors de l’utilisation de plusieurs explants tissulaires peut compromettre la viabilité des tissus et le métabolisme du glucose. Cela pourrait être une limitation supplémentaire. Les tissus excisés doivent être de petite taille (50-300 mg) pour permettre la perméabilité du glucose à l’intérieur du tissu. La manipulation simultanée des tissus par plusieurs opérateurs peut réduire le temps de manipulation. Bien que nous n’ayons pas mesuré l’absorption de glucose dans les explants tissulaires, les observations accumulées dans les explants tissulaires en culture suggèrent qu’elles survivent dans le milieu contenant du glucose jusqu’à 17 jours avec la perte progressive de fonctionnalité33. Dans ce protocole, le court temps d’incubation des explants permet de surveiller le métabolisme du glucose dans des tissus relativement fonctionnels. Dans les tissus à organisation cellulaire complexe, tels que le cerveau, la taille présente une limitation insoluble, car la désintégration des tissus complexes et la mort cellulaire qui en résulte influencent l’absorption du glucose. Cependant, l’incubation du cerveau pendant 24 heures a déjà été utilisée pour l’identification du mécanisme de régulation endogène, soutenant la fonctionnalité physiologique relative du cerveau de souris excisé dans le milieu contenant du glucose34. Quoi qu’il en soit, la procédure simplifiée et l’accessibilité facile du FD-glucose extracellulaire peuvent permettre d’utiliser ce test dans un format à haut débit. La comparaison de l’épuisement du FD-glucose extracellulaire basique et stimulé par l’insuline suggère que ce test pourrait être appliqué pour identifier les facteurs humoraux, nutritionnels, pathogènes, environnementaux ou pharmaceutiques régulant l’absorption du glucose. Bien que ce test simplifie la découverte, les résultats ont nécessité une validation avec le radiomarquage quantitatif20 méthodes analytiques 21,22,23 et / ou les méthodes d’imagerie 5,24 pour une élucidation mécaniste rigoureuse des voies.
Les étapes critiques de ce protocole comprennent l’optimisation de la confluence et du temps de jeûne qui influencent à la fois l’absorption basale et stimulée du FD-glucose. Ces paramètres pourraient également être affectés par la saison sur la base des observations des auteurs. De plus, différents types de cellules utilisent des mécanismes spécifiques pour l’absorption du glucose, y compris différents transporteurs de glucose et des interactions hormone/récepteur régulateur 32,35,36. Par conséquent, des témoins positifs autres que l’insuline doivent être envisagés pour les cultures cellulaires représentant des tissus autres que le muscle ou le tissu adipeux régulés par des axes insuline/GLUT4. Le dépannage comprend également l’ajustement de la confluence cellulaire et l’optimisation du temps de jeûne / réalimentation avec FD-glucose. En outre, la sensibilité de la mesure du glucose extracellulaire pourrait être améliorée en réduisant les niveaux de FD-glucose extracellulaire, en tenant compte des niveaux seuils requis pour l’absorption du glucose. L’expérience décrite à la figure 2 peut aider les chercheurs à personnaliser ce test pour une utilisation avec d’autres cultures cellulaires ou un dépannage.
La variabilité intrinsèque du métabolisme du glucose nécessitait également une taille d’échantillon plus élevée (n = 5-8). Bien que les mesures extracellulaires de la perte de glucose FD aient montré la même précision que l’absorption intracellulaire de FD-glucose normalisée par la protéine, la normalisation peut réduire la variabilité du test. En plus de la mesure des concentrations de protéines, la mesure de la teneur en ADN dans la cellule peut être une autre évaluation de substitution fiable de la cellule numéro37.
Le FD-glucose extracellulaire est accessible pour les mesures cinétiques. Ici, une procédure simple de mesures cinétiques du FD-glucose extracellulaire a été développée pour identifier les réponses spécifiques des organes aux médiateurs de l’absorption du glucose. Ces études ex vitro peuvent tester directement la réponse des organes à divers stimuli in vivo qui est combinée à l’exposition des organes au GLUCOSE FD et aux mesures cinétiques ex vivo , comme le montre la figure 3. Bien que les études ex vivo ne ressemblent pas entièrement aux conditions in vivo , elles présentent de multiples avantages. Les explants d’organes maintiennent une structure cellulaire primaire multicellulaire complexe, contrairement aux cultures cellulaires immortelles présentant une expression génétique altérée. Le développement de médicaments modernes utilise des organismes modèles, une évaluation indirecte de l’absorption du glucose basée sur le transcriptome ou le métabolome22, une technique complète de pince à insuline38 ou une imagerie coûteuse32. Bien que la mesure du FD-glucose extracellulaire dans les organes explantés ne remplacera pas ces technologies, elle fournira une évaluation rapide des composés, des métabolites et des gènes afin de faciliter la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques régulant l’absorption du glucose d’une manière spécifique aux tissus. Le développement de thérapies sûres traitant du métabolisme du glucose dans des tissus spécifiques peut offrir une solution pour le cancer, la démence, le vieillissement, le diabète, les maladies auto-immunes, l’obésité et d’autres applications connexes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun problème à divulguer et n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Le projet a été soutenu par le prix Ralph et Marian Falk Medical Research Catalyst et le prix Kathleen Kelly. Parmi les autres soutiens, citons le National Center for Research Resources UL1RR025755 et le NCI P30CA16058 (OSUCCC), la feuille de route des NIH pour la recherche médicale. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les points de vue officiels du National Center for Research Resources ou du NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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