Summary
Denne protokol beskriver et komparativt assay ved hjælp af mitokondrielle komplekse aktiviteter CI + CIII og CII + CIII i nærvær eller fravær af Na + for at studere eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer.
Abstract
Ubiquinon (CoQ) puljer i den indre mitokondriemembran (IMM) er delvist segmenteret til enten komplekse I eller FAD-afhængige enzymer. En sådan opdeling kan let vurderes ved et komparativt assay ved anvendelse af NADH eller succinat som elektrondonorer i frosne optøede mitokondrier, hvor cytokrom c (cyt c) reduktion måles. Assayet er afhængig af effekten af Na + på IMM, hvilket reducerer dets fluiditet. Her præsenterer vi en protokol til måling af NADH-cyt c oxidoreduktaseaktivitet og succinat-cyt c oxidoreduktaseaktiviteter i nærvær af NaCl eller KCl. Reaktionerne, der er afhængige af blandingen af reagenser i en kuvette trinvist, måles spektrofotometrisk i løbet af 4 minutter i nærværelse af Na+ eller K+. Den samme blanding udføres parallelt i nærvær af de specifikke enzymhæmmere for at trække den uspecifikke ændring i absorbans fra. NADH-cyt c oxidoreduktaseaktivitet falder ikke i nærvær af nogen af disse kationer. Imidlertid falder succinat-cyt c oxidoreductaseaktiviteten i nærvær af NaCl. Dette enkle eksperiment fremhæver: 1) effekten af Na + i faldende IMM-fluiditet og CoQ-overførsel; 2) at superkompleks I+III2 beskytter ubiquinon (CoQ) overførsel mod at blive påvirket af sænkning af IMM fluiditeten; 3) at CoQ-overførslen mellem CI og CIII er funktionelt forskellig fra CoQ-overførslen mellem CII og CIII. Disse fakta understøtter eksistensen af funktionelt differentierede CoQ-puljer i IMM og viser, at de kan reguleres af mitokondriernes skiftende Na+- miljø.
Introduction
Mitokondrielt oxidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) er den vigtigste vej, der driver adenosintrifosfatsyntese (ATP), reaktiv iltartsproduktion (ROS) og forbrug af reducerende ækvivalenter, såsom nikotinamid adenindinukleotid (NADH) eller succinat, af mitokondrier. OXPHOS-systemet består af fem proteinkomplekser: Kompleks I (CI) oxiderer NADH og reducerer CoQ til ubiquinol (CoQH2). Kompleks II (CII) oxiderer succinat tilfumarat og reducerer CoQ til CoQH2. Kompleks III (CIII) oxiderer CoQH2 tilbage til CoQ, hvilket reducerer cytokrom c (cyt c). Endelig oxiderer kompleks IV (CIV) cyt c og reducerer ilt til vand. Denne oxidoreduktionskæde, den såkaldte elektrontransportkæde (mETC), er koblet til pumpning af H + over IMM, hvilket skaber en elektrokemisk gradient, der anvendes af kompleks V (CV) til fosforylat adenosindiphosphat (ADP) i ATP.
mETC-komplekser kan enten være alene i IMM eller samles i kvaternære strukturer kaldet superkomplekser. CIV kan samles med CIII og danne III2+IV eller Q-respirasomet (da det er i stand til at respirere i nærvær af CoQH2)1,2,3 eller danne homodimerer eller homooligomerer4. CIII kan interagere med CI og danne superkomplekset I+ III25. Endelig er CI også i stand til at interagere med Q-respirasomet og opbygge I + III2 + IV eller N-respirasomet (da det kan respirere forbrugende NADH) 1,6,7,8,9,10.
CoQ og cyt c er mobile elektronbærere, der har ansvaret for at overføre elektroner fra henholdsvis CI / CII til CIII og fra CIII til CIV. Hvorvidt superkomplekser pålægger en funktionel lokal begrænsning for disse luftfartsselskaber har været et spørgsmål om intens debat gennem de sidste to årtier 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flere uafhængige grupper har imidlertid vist, at CoQ og cyt c funktionelt kan segmenteres i puljer i IMM. Med hensyn til CoQ kan den funktionelt segmenteres i en specifik CoQ-pulje for CI (CoQNAD) og en anden pulje dedikeret til FAD-afhængige enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. For at differentiere eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer var overekspression af den alternative oxidase (AOX) og generering af specifikke mtDNA-mutanter, som kan samle CI i fravær af CIII, imidlertid påkrævet 1,19,20.
Mekanismen for reaktiv iltart (ROS) produktion under hypoxi var ukendt indtil for nylig. Ved akut hypoxi gennemgår CI den aktive/deaktive (A/D) overgang, som indebærer et fald i dets H+ -pumpende NADH-CoQ oxidoreduktaseaktivitet. Et sådant fald i H + -pumpning syrner mitokondriematrixen og opløser delvist calciumphosphatudfælderne i mitokondriematrixen og frigiver opløselig Ca2+. Denne stigning i opløselig Ca2+ aktiverer Na+/Ca2+- veksleren (NCLX), som ekstruderer Ca2+ i bytte for Na+. Mitokondriel Na + -stigning interagerer med phospholipider i indersiden af IMM, hvilket reducerer dets fluiditet og CoQ-overførsel mellem CII og CIII, hvilket endelig producerer superoxidanion, et redoxsignal21. Interessant nok blev CoQ-overførslen kun formindsket mellem CII og CIII, men ikke mellem CI og CIII, hvilket fremhævede, at 1) Na + kun var i stand til at modulere en af de eksisterende CoQ-puljer i mitokondrierne; 2) der findes funktionelt differentierede CoQ-puljer i IMM. Således kan en meget anvendt protokol til undersøgelse af mitokondrielle enzymaktiviteter anvendes til at vurdere eksistensen af de nævnte CoQ-puljer.
Den nuværende protokol er baseret på måling af reduktionen af oxideret cyt c, substratet af CIII, ved absorbans i nærvær af succinat (dvs. CII-substrat) eller NADH (dvs. CI-substrat). Den samme prøve er opdelt i to, hvoraf den ene vil blive behandlet med KCl, og den anden med samme koncentration af NaCl. På denne måde, da Na + reducerer IMM-fluiditeten, hvis CoQ eksisterede i en unik pulje i IMM, ville både CI + CIII og CII + CIII falde i nærvær af Na +. Hvis CoQ eksisterede i delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer, ville effekten af Na+ imidlertid for det meste (eller kun) være tydelig på CII+CIII-aktiviteten, men ikke på CI+CIII. Som nyligt offentliggjort21 påvirker Na+ kun CoQ-overførslen mellem CII og CIII (figur 1C,D), men ikke mellem CI og CIII (figur 1A,B).
Denne protokol er sammen med et panoply af teknikker blevet brugt til at bekræfte eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer i IMM, en dedikeret til CI (dvs. CoQNAD) og en anden dedikeret til FAD-bundne enzymer (dvs. CoQFAD)1,3,7; en bemærkning, der, selv om den fortsat debatteres22, er blevet bekræftet uafhængigt af flere grupper 7,19. Således påvirker supermonteringen af CI i superkomplekser coq's lokale mobilitet, hvilket letter brugen af CIII inden for superkomplekset 1,7,13,14,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen i pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af den institutionelle etiske komité ved Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spanien, i overensstemmelse med EU-direktivet af 22. september 2010 (2010/63/UE) og med det spanske kongelige dekret af 1. februar 2013 (53/2013). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere antallet af anvendte dyr og deres lidelse.
BEMÆRK: Dette komparative assay til undersøgelse af segmenteringen af mitokondrielle CoQ-puljer beskrives som følger:
1. Proteinkvantificering
- Frys og optø de isolerede mitokondrier26 fra en vildtype muselever tre gange (dvs. mitokondriemembraner), før du eksperimenterer for at gøre organellerne gennemtrængelige for reaktionssubstraterne.
- Kvantificering af proteinmængden af den isolerede mitokondrierprøve ved Bradford- eller Bicinchoninsyre (BCA) metoder. I Bradfords tilfælde tilsættes 2 μL prøve i 1 ml 1x Bradford-reagens.
- Opdel prøven i fire delprøver på hver 20 μg (nemlig: A, B, C, D; Figur 2A).
2. Måling af CI+CIII-aktivitet
BEMÆRK: Denne del af protokollen bruger prøve A og B til at måle CI + CIII-aktivitet (figur 2B).
- Opdel prøver A og B i to delprøver på hver 10 μg (nemlig A1, A2, B1 og B2). Hver af delprøverne blandes i en 1 ml kuvette med 30 μL cyt c (10 mg/ml), 10 μL 100 mM malonat, og der tilsættes forvarmet C1/C2-buffer (tabel 1) ved 37 °C op til 980 μL (979 μL for kuvetter A2 og B2).
FORSIGTIG: Dette trin involverer anvendelse af de giftige reagenser malonat og kaliumcyanid.
BEMÆRK: Cyt c (10 mg/ml) skal fremstilles frisk ved at blande 10 mg cyt c i 1 ml 10 mMK2HPO4-opløsning , pH justeret til 7,2, og det skal opretholdes i is under hele forsøget. - Der tilsættes 10 μL 1 M KCl i kuvetter A1 og A2, og der tilsættes 10 μL 1 M NaCl i kuvetter B1 og B2.
- Der tilsættes 1 μL 1 mM rotenon i kuvetten, der indeholder delprøveplet a2 og B2.
FORSIGTIG: Dette trin involverer brugen af det giftige reagens rotenon. - Lige før målingen tilsættes 10 μL NADH (10 mM) i alle kuvetter.
BEMÆRK: De 10 μL tilsættes fortrinsvis på kuvettens trin, så reaktionen starter ved blanding. - Bland kuvetten ved forsigtigt at vende den tre gange. Anbring den i kuvettelæseren til absorbans (UV/VISJASCO-spektrofotometer).
- Klik på Mål > parametre > Generelt og indstil måleparametrene til Bølgelængde: 550 nm og Tid: 4 minutters læsning; tryk på knapperne Accepter og Start for at starte eksperimentet.
- I slutningen af målingen skal du gemme hældningen, der omfatter den lineære stigning i absorbansen, ved at klikke på Filer og Gem som. Hældningen kan også indsamles manuelt.
3. Måling af CII+CIII-aktivitet
BEMÆRK: Denne del af protokollen bruger prøver C og D til at måle CII + CIII-aktivitet (figur 2C).
- Opdel prøver C og D i to delprøver på hver 10 μg (nemlig C1, C2, D1 og D2). Hver af delprøverne blandes i en 1 ml kuvette med 30 μL cyt c (10 mg/ml), 1 μL 1 mM rotenon, og der tilsættes forvarmet C1/C2-buffer ved 37 °C op til 980 μL (970 μL for kuvetter C2 og D2).
FORSIGTIG: Dette trin involverer anvendelse af de giftige reagenser kaliumcyanid og rotenon.
BEMÆRK: Cyt c (10 mg/ml) skal fremstilles frisk ved at blande 10 mg cyt c i 1 ml 10 mMK2HPO4-opløsning , pH justeret til 7,2, og det skal opretholdes i is under hele forsøget. - Der tilsættes 10 μL 1 M KCl i kuvetter C1 og C2, og der tilsættes 10 μL 1 M NaCl i kuvetter D1 og D2.
- Der tilsættes 1 μL 1 mM antimycin A i kuvetten, der indeholder delprøvepletter C2 og D2.
FORSIGTIG: Dette trin involverer anvendelse af det giftige reagens antimycin A. - Lige før målingen tilsættes 10 μL succinat (1 M) i alle kuvetter.
BEMÆRK: De 10 μL tilsættes fortrinsvis på kuvettens trin, så reaktionen starter ved blanding. - Bland kuvetten forsigtigt, vend den tre gange. Anbring den i kuvettelæseren til absorbans (UV/VIS-spektrofotometer).
- Klik på Mål > parametre > Generelt , og indstil måleparametrene til Bølgelængde: 550 nm og Tid: 4 minutters aflæsning; tryk på knapperne Accepter og Start for at starte eksperimentet.
- I slutningen af målingen skal du gemme hældningen, der omfatter den lineære stigning i absorbansen, ved at klikke på Filer og Gem som. Hældningen kan også indsamles manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske resultater fra denne protokol er repræsenteret nedenfor (figur 3). Da reduceret cyt c-absorbans lokaliserer sig ved 550 nm, skal alle uhæmmede delprøveudsempler vise en stigning i absorbansen ved 550 nm. Hæmmede delprøveudsempler viser ideelt set en flad linje eller lidt stigende hældning (figur 3). Skråninger fra hæmmede delprøveudtager skal trækkes fra uhæmmede delprøveudtager.
Prøver A og B, begge korrigeret af deres korrespondenthæmning, og som repræsenterer NADH:cyt c oxidoreduktaseaktivitet, har en lignende hældning (figur 3A). Deleksempler C og D, der begge korrigeres af deres korrespondenthæmning, og som repræsenterer succinat:cyt c oxidoreduktaseaktivitet, er imidlertid forskellige, idet aktiviteten af delprøve C er højere end aktiviteten af delprøve D (figur 3B). Bemærk, at basal absorbans kan være lidt forskellig mellem prøver (figur 3A).
Disse resultater (dvs. skråninger, der allerede er korrigeret af deres hæmmer; Tabel 2) kan repræsenteres ved at dividere mængden af anvendt protein (0,01 mg) som a.u./min/mg protein. Ud fra denne værdi kan cyt c-reduktionshastigheden beregnes yderligere ved hjælp af Lamber-Beer-loven21.
Det er vigtigt, at disse resultater kan variere afhængigt af flere faktorer: (i) Prøvernes oprindelse. I betragtning af at forskellige væv og celletyper har en variabel sammensætning af OXPHOS-komplekser og superkomplekser, kan absolutte værdier og relative ændringer variere på tværs af prøver. ii) Da forskellige væv kan have en variabel sammensætning af OXPHOS-komplekser og superkomplekser, kan tilsætning af flere frosne-optøede mitokondrier (for at kompensere for lavere absolutte værdier af et bestemt væv) til reaktionsblandingen have en sekundær virkning, idet forholdet mellem Na+ eller K+ pr. mg protein/phospholipid i prøven falder. Der skal derfor udvises forsigtighed, når enten mængden af mitokondrier eller Na+/K+-koncentrationen, der tilsættes prøven, varieres. iii) Intereksperimentmental variation kan opstå som følge af varigheden og temperaturen af fryse-optøningscyklusser, reagenser kommerciel batch eller varierende opbevaringsbuffer af isolerede mitokondrier.
Figur 1: Na+ reducerer specifikt elektronoverførslen mellem CII og CIII, men ikke mellem CI og CIII. (A) Skematisk repræsentation af elektronoverførslen mellem NADH og cyt c, der forekommer gennem CoQNAD i superkomplekset I + III2. (B) Elektronoverførsel mellem NADH og cyt c, der forekommer gennem CoQNAD i superkomplekset I + III2, påvirkes ikke af intramitokondriel Na +. (C) Skematisk repræsentation af elektronoverførslen mellem succinat og cyt c, der forekommer gennem CoQFAD i CII. (D) Elektronoverførsel mellem NADH og cyt c, der forekommer gennem CoQFAD i superkomplekset I + III2, reduceres med høj intramitokondriel Na +. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk repræsentation af protokollen fra underinddelingen af den oprindelige prøve til den kinetiske måling. (A) Skematisk repræsentation af delprøveinddelingen, der fremhæver den samme oprindelse af alle delprøver. B) Skema over de på hinanden følgende trin i reagensens tilføjelser til CI+CIII-aktivitet i delprøve A1 og B1. Den røde cirkel repræsenterer det sted, hvor NADH ideelt set skal tilføjes. Bemærk, at den eneste forskel med delprøvepletter A2 og B2 er den ekstra tilsætning af rotenon i sidstnævnte. C) Skema over de på hinanden følgende trin i reagensets tilføjelser til CII+CIII-aktivitet i delprøve C1 og D1. Den røde cirkel repræsenterer det sted, hvor succinat ideelt set skal tilføjes. Bemærk, at den eneste forskel med delprøvepletter C2 og D2 er den ekstra tilsætning af antimycin A i sidstnævnte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Effekt af Na+ på cyt c reduktion af muselever mitokondriemembraner ved NADH eller succinat tilsætning. (A) Repræsentative spor, der viser effekten af Na+ på cyt c-reduktion af muselevermitokondriemembraner, der oxiderer NADH. (B) Repræsentative spor, der viser virkningen af Na+ på cyt c-reduktion af muselevermitokondriemembraner, der oxiderer succinat. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forbindelse | Koncentration |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN | 3 mM |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | 2,5 mg/ml |
Tabel 1: Sammensætning af C1/C2-buffer. Buffersammensætning præsenteres i molære koncentrationer.
| Forventede satser | +KCl (Middelværdi) | +KCl (SD) | +NaCl (Middelværdi) | +NaCl (SD) | Mann-Whitney P værdi |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Individuelle værdier | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Individuelle værdier | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tabel 2: Forventede renteintervaller. De forventede værdier for hver aktivitet præsenteres i vilkårlige enheder. Den tilsvarende statistiske test mellem +KCl og +NaCl præsenteres også. "n" repræsenterer antallet af replikater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom denne protokol repræsenterer en meget ligetil procedure til at identificere eksistensen af de delvist segmenterede CoQ-puljer, er der et par kritiske trin, der skal tages i betragtning. Substrater (dvs. NADH eller succinat) tilsættes fortrinsvis sidst, da autooxidering af disse forbindelser kan forekomme. Cuvettes flipping skal være forsigtig for at undgå dannelse af bobler, der kan forstyrre læsningen.
Derudover præsenterer den nuværende teknik et par begrænsninger, som er værd at nævne. Målinger udføres ikke i intakte mitokondrier. Således kan bufferens kunstige indhold og andel resultere i forskelle med mitokondriernes oprindelige miljø.
Reagenser tilsættes i overskud, og de repræsenterer muligvis ikke den sande tilgængelighed af substrater i intakt væv.
Nuværende metoder indebærer generering og anvendelse af meget specifikke genetiske modeller og udstyr, der ikke er let tilgængelige i mange laboratorier1. Denne protokol giver en pålidelig og let at gøre metode til at måle eksistensen af de delvist differentierede CoQ-puljer ved hjælp af bredt tilgængelige reagenser og værktøjer. Det er således muligt, at det kan anvendes i fremtidige undersøgelser, der sammenligner genetiske modeller af mitokondriesygdom.
Mobiliteten af de mobile elektronbærere i mETC er stadig et meget debatteret emne 25,27, selvom eksistensen af delvist differentierede puljer bliver accepteret 7,12,18,28,29. For nylig har højopløselig respirometri og detaljeret biokemisk karakterisering af flere OXPHOS-mutanter, der udtrykker AOX1, sammen med raffinerede kryoelektronmikroskopiundersøgelser, der bevarer det naturlige lipidmiljø7, bragt lys ind i diskussionen. Dette udgør tunge argumenter til fordel for eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer.
Derudover har fysiologiske stimuli vist sig at være reguleret af de forskellige CoQ-puljer; især det akutte hypoxiske respons drevet af intramitokondriel Na+. Højere Na + -niveauer i mitokondrier under hypoxi reducerer elektronoverførslen mellem CII og CIII, afkoagulerer Q-cyklussen på niveauet af CIII og producerer en superoxidanion. I modsætning hertil faldt elektronoverførslen mellem CI og CIII ikke21. Den nuværende protokol forklarer udførligt den procedure, hvormed disse resultater blev opnået.
Yderligere kontroller kan anvendes på den nuværende protokol, hvis den undersøgte behandling udføres i cellule eller in vivo, som er de isolerede komplekse aktiviteter af CI, CII og CIII, da deres individuelle mængder eller enkeltaktiviteter kan variere sammen med behandlingen. Efter en meget lignende procedure som beskrevet ovenfor blev der ikke set forskelle i nogen af disse isolerede aktiviteter21 i nærvær eller fravær af Na+. Bemærk, at det er blevet beskrevet, at Na+ kan øge D/A-overgangen30. Den protokol, der blev brugt til denne observation, involverede imidlertid brugen af submitokondrielle partikler (SMP'er), mens vores protokol bruger mitokondriemembraner, hvilket fremhæver nødvendigheden af membranpotentiale på tværs af IMM for den bogførte effekt30.
Det skal bemærkes, at fryse-optøningscyklusser ikke opløser membranerne, som vaskemidler gør, således at enkeltkomplekser og superkomplekser stadig er fastgjort til phospholipid-dobbeltlag. Dette fremgår af det faktum, at frosset-optøet mitokondrier iltforbrug gennem enten CI eller CII kan måles i nærvær af cytokrom c31. Derudover, hvis der var en effekt af fryse-optøningscyklusser på CII + CIII-aktivitet, ville det ikke kun ses i "NaCl 10 mM" -prøver, men også i "KCl 10 mM" -prøver. Dette ville enten gøre målingen umulig (da CII ville blive adskilt fra CIII gennem membranedbrydning) eller lavere til et punkt, hvor forskelle mellem K + og Na + ikke ville blive set. Som det fremgår af figur 2B, er dette imidlertid ikke tilfældet. Tilføjelsen af KCl i protokollen er designet til at kassere mulige virkninger af enten osmolaritet eller ionstyrke på de målte aktiviteter. Den endelige osmolaritet i begge tilfælde, "10 mM KCl" prøve og "10 mM NaCl" prøve, er ens (116 mEq / L), og den eneste forskel mellem prøver er tilstedeværelsen af 10 mM K + eller 10 mM Na +. Ikke desto mindre, hvis K + kationer fra bufferen havde en effekt, ville det manifestere sig i både "KCl 10 mM" og "NaCl 10 mM" prøver, hvilket gør en sådan effekt uercernibel i begge prøver.
I de forskellige kationers evne til at binde fosfolipider er det, der faktisk er afgørende, koordinationskemien og den ioniske radius for hver kation (som fremhævet eksperimentelt i vores originale papir21 og teoretisk i Böckmann et al.32). Mens K + viser et gennemsnitligt koordinationstal på seks, er na + gennemsnitlige koordinationstal fem, hvilket resulterer i en anden koordinationskompleks geometri, hvilket oversættes til meget forskellige virkninger af K + og Na + på et phospholipid dobbeltlag33.
Det skal også bemærkes, at den ioniske radius af K + og Na + er forskellige. Mens K + har en ionisk radius på 280 pm, har Na + en ionisk radius på 227 pm. Denne forskel påvirker direkte deres interaktion med anioner (eller zwitterioner), da en lavere ionisk radius (dvs. mindre elektronskaller) resulterer i en stærkere interaktion med et negativt ladet molekyle, da den positive ioniske kerne er mere udsat, som om den havde ekstra elektronskaller (dvs. højere ionisk radius). Faktisk er alle kationer muligvis i stand til at interagere med phospholipider; dog er det kun dem med specifikke kemisk-fysiske egenskaber, der er i stand til at have specifikke virkninger på et phospholipid-dobbeltlag, såsom Na +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez og E. R. Martínez-Jimenez for teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af MICIN: RTI2018-099357-B-I00 og HFSP (RGP0016/2018). CNIC støttes af Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figur 2 oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A.
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al.
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A.
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A.
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J.
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T.
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
