Summary
Questo protocollo descrive un test comparativo, utilizzando attività complesse mitocondriali CI+CIII e CII+CIII in presenza o assenza di Na+, per studiare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati.
Abstract
I pool di ubichinone (CoQ) nella membrana mitocondriale interna (IMM) sono parzialmente segmentati in enzimi del complesso I o FAD-dipendenti. Tale suddivisione può essere facilmente valutata mediante un saggio comparativo che utilizza NADH o succinato come donatori di elettroni nei mitocondri congelati-scongelati, in cui viene misurata la riduzione del citocromo c (cyt c). Il test si basa sull'effetto di Na+ sull'IMM, diminuendone la fluidità. Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi e le attività della succinato-cyt c ossidoreduttasi in presenza di NaCl o KCl. Le reazioni, che si basano sulla miscela di reagenti in una cuvetta in modo graduale, vengono misurate spettrofotometricamente durante 4 minuti in presenza di Na+ o K+. La stessa miscela viene eseguita in parallelo in presenza degli specifici inibitori enzimatici al fine di sottrarre la variazione aspecifica dell'assorbanza. L'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi non diminuisce in presenza di nessuno di questi cationi. Tuttavia, l'attività della succinato-cit c ossidoreduttasi diminuisce in presenza di NaCl. Questo semplice esperimento evidenzia: 1) l'effetto di Na+ nel diminuire la fluidità IMM e il trasferimento di CoQ; 2) che il supercomplesso I+III2 protegge il trasferimento di ubichinone (CoQ) dall'essere influenzato dall'abbassamento della fluidità IMM; 3) che il trasferimento di CoQ tra CI e CIII è funzionalmente diverso dal trasferimento di CoQ tra CII e CIII. Questi fatti supportano l'esistenza di pool di CoQ funzionalmente differenziati nell'IMM e mostrano che possono essere regolati dal mutevole ambiente Na+ dei mitocondri.
Introduction
Il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è la principale via che guida la sintesi dell'adenosina trifosfato (ATP), la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il consumo di equivalenti riducenti, come nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) o succinato, da parte dei mitocondri. Il sistema OXPHOS è composto da cinque complessi proteici: il Complesso I (CI) ossida il NADH e riduce il CoQ in ubichinolo (CoQH2). Il Complesso II (CII) ossida il succinato in fumarato e riduce il CoQ in CoQH2. Il Complesso III (CIII) ossida nuovamente il CoQH2 in CoQ, riducendo il citocromo c (cyt c). Infine, il complesso IV (CIV) ossida cyt c e riduce l'ossigeno in acqua. Questa catena di ossidoriduzione, la cosiddetta catena di trasporto degli elettroni (mETC), è accoppiata al pompaggio di H + attraverso l'IMM, che crea un gradiente elettrochimico utilizzato dal complesso V (CV) per fosforilare l'adenosina difosfato (ADP) in ATP.
I complessi mETC possono essere soli nell'IMM o assemblarsi in strutture quaternarie chiamate supercomplessi. CIV può assemblarsi con CIII, formando il III2+IV o Q-respirasome (in quanto è in grado di respirare in presenza di CoQH2)1,2,3 o formando omodimeri o omooligomeri4. CIII può interagire con CI, formando il supercomplesso I+III25. Infine, CI è anche in grado di interagire con il Q-respirasome, costruendo l'I+III2+IV o N-respirasome (in quanto può respirare consumando NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ e cyt c sono portatori mobili di elettroni incaricati di trasferire elettroni da CI/CII a CIII e da CIII a CIV, rispettivamente. Se i supercomplessi impongano o meno una restrizione locale funzionale per questi vettori è stato oggetto di intenso dibattito negli ultimi due decenni 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, diversi gruppi indipendenti hanno dimostrato che CoQ e cyt c possono essere segmentati funzionalmente in pool nell'IMM. Per quanto riguarda il CoQ, può essere segmentato funzionalmente in uno specifico pool di CoQ per CI (CoQNAD) e un altro pool dedicato agli enzimi FAD-dipendenti (CoQFAD)1,7,12,18,19. Tuttavia, al fine di differenziare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, è stata richiesta la sovraespressione dell'ossidasi alternativa (AOX) e la generazione di specifici mutanti del mtDNA, che possono assemblare CI in assenza di CIII, 1,19,20.
Il meccanismo di produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) durante l'ipossia era sconosciuto fino a poco tempo fa. In caso di ipossia acuta, l'IC subisce la transizione attiva/disattivativa (A/D), che comporta la diminuzione della sua attività di pompaggio H+ della NADH-CoQ ossidoreduttasi. Tale diminuzione del pompaggio H+ acidifica la matrice mitocondriale e dissolve parzialmente i precipitati calcio-fosfato nella matrice mitocondriale, rilasciando Ca2+ solubile. Questo aumento di Ca2+ solubile attiva lo scambiatore Na+/Ca2+ (NCLX), che estrude Ca2+ in cambio di Na+. L'aumento mitocondriale di Na+ interagisce con i fosfolipidi nel lato interno dell'IMM, diminuendone la fluidità e il trasferimento di CoQ tra CII e CIII, producendo infine anione superossido, un segnale redox21. È interessante notare che il trasferimento di CoQ è diminuito solo tra CII e CIII, ma non tra CI e CIII, evidenziando che 1) Na + è stato in grado di modulare solo uno dei pool coQ esistenti nei mitocondri; 2) esistono pool di CoQ funzionalmente differenziati nell'IMM. Pertanto, un protocollo ampiamente utilizzato per lo studio delle attività enzimatiche mitocondriali può essere utilizzato per valutare l'esistenza dei pool di CoQ menzionati.
L'attuale protocollo si basa sulla misura della riduzione del cyt c ossidato, il substrato del CIII, per assorbanza in presenza di succinato (cioè substrato CII) o NADH (cioè substrato CI). Lo stesso campione è diviso in due, uno dei quali sarà trattato con KCl e l'altro con la stessa concentrazione di NaCl. In questo modo, dato che Na+ diminuisce la fluidità IMM, se coQ esistesse in un pool unico nell'IMM, sia CI+CIII che CII+CIII diminuirebbero in presenza di Na+. Tuttavia, se il CoQ esistesse in pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, l'effetto di Na+ sarebbe per lo più (o solo) evidente sull'attività CII+CIII, ma non sull'IC+CIII. Come recentemente pubblicato21, Na+ influisce solo sul trasferimento di CoQ tra CII e CIII (Figura 1C,D), ma non tra CI e CIII (Figura 1A,B).
Questo protocollo, insieme a una panoplia di tecniche, è stato utilizzato per confermare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati nell'IMM, uno dedicato all'IC (cioè CoQNAD) e un altro dedicato agli enzimi legati alla FAD (cioè CoQFAD)1,3,7; un'osservazione che, sebbene continui ad essere discussa22, è stata corroborata indipendentemente da diversi gruppi 7,19. Pertanto, il superassemblaggio di CI in supercomplessi influisce sulla mobilità locale del CoQ, facilitandone l'utilizzo da parte del CIII all'interno del supercomplesso 1,7,13,14,23,24,25.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato etico istituzionale del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spagna, in conformità con la direttiva dell'Unione europea del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e con il regio decreto spagnolo del 1 ° febbraio 2013 (53/2013). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza.
NOTA: Questo test comparativo per studiare la segmentazione dei pool di CoQ mitocondriale è descritto come segue:
1. Quantificazione delle proteine
- Congelare e scongelare i mitocondri isolati26 da un fegato di topo selvatico tre volte (cioè membrane mitocondriali) prima della sperimentazione per rendere gli organelli permeabili ai substrati di reazione.
- Quantificare la quantità proteica del campione di mitocondri isolati con i metodi bradford o acido bicinchoninico (BCA). Nel caso di Bradford, aggiungere 2 μL di campione in 1 mL di 1x reagente bradford.
- Dividere il campione in quattro sottocampioni da 20 μg ciascuno (vale a dire: A, B, C, D; Figura 2A).
2. Misurazione dell'attività CI+CIII
NOTA: questa parte del protocollo utilizza i campioni A e B per misurare l'attività CI+CIII (Figura 2B).
- Dividere i campioni A e B in due sottocampioni da 10 μg ciascuno (vale a dire A1, A2, B1 e B2). Mescolare ciascuno dei sottocampioni in una cuvetta da 1 mL con 30 μL di cyt c (10 mg/mL), 10 μL di 100 mM di malonato e aggiungere il tampone preriscaldato C1/C2 (Tabella 1) a 37 °C fino a 980 μL (979 μL per le cuvette A2 e B2).
ATTENZIONE: Questa fase prevede l'uso dei reagenti tossici malonato e cianuro di potassio.
NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve essere preparato fresco mescolando 10 mg di cyt c in 1 mL di soluzione 10 mM K2HPO4 , pH regolato a 7,2 e deve essere mantenuto nel ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. - Aggiungere 10 μL di 1 M KCl nelle cuvette A1 e A2 e aggiungere 10 μL di 1 M NaCl nelle cuvette B1 e B2.
- Aggiungere 1 μL di 1 mM di rotenone nella cuvetta contenente i sottocampioni A2 e B2.
ATTENZIONE: Questo passaggio prevede l'uso del reagente tossico rotenone. - Subito prima della misurazione, aggiungere 10 μL di NADH (10 mM) in tutte le cuvette.
NOTA: I 10 μL vengono preferibilmente aggiunti sul gradino della cuvetta, quindi la reazione inizia al momento della miscelazione. - Mescolare la cuvetta capovolgendola con cura tre volte. Posizionarlo nel lettore di cuvette ad assorbanza (spettrofotometro UV/VISJASCO).
- Fare clic su Misura > Parametri > Generale e impostare i parametri di misurazione su Lunghezza d'onda: 550 nm e Tempo: 4 minuti di lettura; premere i pulsanti Accetta e Start per iniziare l'esperimento.
- Al termine della misurazione, salvare la pendenza comprendente l'aumento lineare dell'assorbanza facendo clic su File e Salva con nome. La pendenza può anche essere raccolta manualmente.
3. Misurazione dell'attività CII+CIII
NOTA: questa parte del protocollo utilizza i campioni C e D per misurare l'attività CII+CIII (Figura 2C).
- Dividere i campioni C e D in due sottocampioni da 10 μg ciascuno (vale a dire C1, C2, D1 e D2). Mescolare ciascuno dei sottocampioni in una cuvetta da 1 mL con 30 μL di cyt c (10 mg/mL), 1 μL di 1 mM di rotenone e aggiungere tampone C1/C2 preriscaldato a 37 °C fino a 980 μL (970 μL per le cuvette C2 e D2).
ATTENZIONE: Questo passaggio prevede l'uso dei reagenti tossici cianuro di potassio e rotenone.
NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve essere preparato fresco mescolando 10 mg di cyt c in 1 mL di soluzione 10 mM K2HPO4 , pH regolato a 7,2 e deve essere mantenuto nel ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. - Aggiungere 10 μL di 1 M KCl nelle cuvette C1 e C2 e aggiungere 10 μL di 1 M NaCl nelle cuvette D1 e D2.
- Aggiungere 1 μL di 1 mM di antimicina A nella cuvetta contenente i sottocampioni C2 e D2.
ATTENZIONE: Questa fase prevede l'uso del reagente tossico antimicina A. - Subito prima della misurazione, aggiungere 10 μL di succinato (1 M) in tutte le cuvette.
NOTA: I 10 μL vengono preferibilmente aggiunti sul gradino della cuvetta, quindi la reazione inizia al momento della miscelazione. - Mescolare la cuvetta con cura, capovolgendola tre volte. Posizionarlo nel lettore di cuvette ad assorbanza (spettrofotometro UV/VIS).
- Fare clic su Misura > Parametri > Generale e impostare i parametri di misura su Lunghezza d'onda: 550 nm e Tempo: 4 minuti di lettura; premere i pulsanti Accetta e Start per iniziare l'esperimento.
- Al termine della misurazione, salvare la pendenza comprendente l'aumento lineare dell'assorbanza facendo clic su File e Salva con nome. La pendenza può anche essere raccolta manualmente.
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Representative Results
I risultati tipici di questo protocollo sono rappresentati di seguito (Figura 3). Poiché l'assorbanza cyt c ridotta si trova a 550 nm, tutti i sottocampioni disinibiti devono mostrare un aumento dell'assorbanza a 550 nm. I sottocampioni inibiti mostrano idealmente una pendenza piatta o leggermente crescente (Figura 3). Le pendenze dei sottocampioni inibiti devono essere sottratte dai sottocampioni disinibiti.
I campioni A e B, entrambi corretti dalla corrispondente inibizione e che rappresentano l'attività della NADH:cyt c ossidoreduttasi, hanno una pendenza simile (Figura 3A). Tuttavia, i sottocampioni C e D, entrambi corretti dalla loro corrispondente inibizione e che rappresentano l'attività della succinato:cyt c ossidoreduttasi, sono diversi, in quanto l'attività del sottocampione C è superiore all'attività del sottocampione D (Figura 3B). Si noti che l'assorbanza basale può essere leggermente diversa tra i campioni (Figura 3A).
Questi risultati (cioè pendenze già corrette dal loro inibitore; Tabella 2) può essere rappresentato dividendo la quantità di proteine utilizzate (0,01 mg) come proteina a.u./min/mg. Da questo valore, il tasso di riduzione cyt c può essere ulteriormente calcolato utilizzando la legge Lamber-Beer21.
È importante sottolineare che questi risultati possono variare in base a diversi fattori: (i) Origine dei campioni. Dato che diversi tessuti e tipi di cellule hanno una composizione variabile di complessi e supercomplessi OXPHOS, i valori assoluti e le relative variazioni possono variare tra i campioni. (ii) Dato che tessuti diversi possono avere una composizione variabile di complessi e supercomplessi OXPHOS, l'aggiunta di più mitocondri congelati-scongelati (per compensare valori assoluti più bassi di un certo tessuto) alla miscela di reazione può avere un effetto secondario, che è che il rapporto di Na + o K + per mg di proteina / fosfolipide nel campione diminuisce. Pertanto, si deve prestare attenzione quando si varia la quantità di mitocondri o la concentrazione di Na + / K + aggiunta al campione. (iii) La variazione interesperimentale può derivare dalla durata e dalla temperatura dei cicli di congelamento-disgelo, dal lotto commerciale dei reagenti o dal tampone di stoccaggio variabile dei mitocondri isolati.
Figura 1: Na+ diminuisce specificamente il trasferimento di elettroni tra CII e CIII, ma non tra CI e CIII. (A) Rappresentazione schematica del trasferimento di elettroni tra NADH e cyt c, che avviene attraverso il CoQNAD nel supercomplesso I+III2. (B) Il trasferimento di elettroni tra NADH e cyt c, che avviene attraverso il CoQNAD nel supercomplesso I+III2, non è influenzato dal Na+ intramitocondriale. (C) Rappresentazione schematica del trasferimento di elettroni tra succinato e cyt c, che avviene attraverso il CoQFAD in CII. (D) Il trasferimento di elettroni tra NADH e cyt c, che avviene attraverso il CoQFAD nel supercomplesso I+III2, è diminuito dall'elevato Na+ intramitocondriale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica del protocollo dalla suddivisione del campione originale alla misura cinetica. (A) Rappresentazione schematica della divisione del sottocampione, evidenziando la stessa origine di tutti i sottocampioni. (B) Schema delle fasi successive delle aggiunte del reagente per l'attività CI+CIII nei sottocampioni A1 e B1. Il cerchio rosso rappresenta la posizione in cui idealmente dovrebbe essere aggiunto NADH. Si noti che l'unica differenza con i sottocampioni A2 e B2 è l'aggiunta extra di rotenone in quest'ultimo. C) Schema delle fasi successive delle aggiunte di reagenti per l'attività CII+CIII nei sottocampioni C1 e D1. Il cerchio rosso rappresenta la posizione in cui idealmente dovrebbe essere aggiunto il succinato. Si noti che l'unica differenza con i sottocampioni C2 e D2 è l'aggiunta extra di antimicina A in quest'ultimo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetto di Na+ sulla riduzione di cyt c da parte delle membrane mitocondriali epatiche di topo su NADH o aggiunta di succinato. (A) Tracce rappresentative che mostrano l'effetto di Na+ sulla riduzione di cyt c da parte delle membrane mitocondriali epatiche di topo che ossidano il NADH. (B) Tracce rappresentative che mostrano l'effetto di Na+ sulla riduzione di cyt c da parte delle membrane mitocondriali del fegato di topo che ossidano il succinato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Composto | Concentrazione |
| K2HPO4 | 25 metri quadrati |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN · | 3 mM |
| Albumina sierica bovina (BSA) | 2,5 mg/ml |
Tabella 1: Composizione del buffer C1/C2. La composizione del tampone è presentata in concentrazioni molari.
| Tariffe previste | +KCl (Media) | +KCl (SD) | +NaCl (Media) | +NaCl (SD) | Valore P di Mann-Whitney |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Valori individuali | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Valori individuali | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tabella 2: Intervalli di tassi attesi. I valori attesi per ogni attività sono presentati in unità arbitrarie. Viene inoltre presentato il test statistico corrispondente tra +KCl e +NaCl. "n" rappresenta il numero di repliche.
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Discussion
Sebbene questo protocollo rappresenti una procedura molto semplice per identificare l'esistenza dei pool di CoQ parzialmente segmentati, ci sono alcuni passaggi critici da prendere in considerazione. I substrati (cioè NADH o succinato) sono preferibilmente aggiunti per ultimi poiché può verificarsi l'autoossidazione di questi composti. Il capovolgimento della cuvetta deve essere attento per evitare la formazione di bolle che potrebbero interferire con la lettura.
Inoltre, la presente tecnica presenta alcune limitazioni che vale la pena menzionare. Le misurazioni non vengono eseguite nei mitocondri intatti. Pertanto, il contenuto artificiale e la proporzione del tampone possono causare differenze con l'ambiente nativo dei mitocondri.
I reagenti vengono aggiunti in eccesso e potrebbero non rappresentare la reale disponibilità di substrati nei tessuti intatti.
I metodi attuali implicano la generazione e l'uso di modelli genetici e attrezzature molto specifici che non sono prontamente disponibili in molti laboratori1. Questo protocollo fornisce un metodo affidabile e facile da fare per misurare l'esistenza dei pool di CoQ parzialmente differenziati utilizzando reagenti e strumenti ampiamente disponibili. Pertanto, è possibile che possa essere applicato in studi futuri che confrontano modelli genetici di malattia mitocondriale.
La mobilità dei portatori mobili di elettroni nel mETC è ancora un argomento molto dibattuto25,27, anche se l'esistenza di pool parzialmente differenziati sta diventando accettata 7,12,18,28,29. Recentemente, la respirometria ad alta risoluzione e la caratterizzazione biochimica dettagliata di diversi mutanti OXPHOS che esprimono AOX1, insieme a raffinati studi di microscopia crioelettronica che preservano l'ambiente lipidico naturale7, hanno portato luce nella discussione. Ciò pone argomenti pesanti a favore dell'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati.
Inoltre, gli stimoli fisiologici hanno dimostrato di essere regolati dai diversi pool di CoQ; in particolare, la risposta ipossica acuta guidata da Na+ intramitocondriale. Livelli più elevati di Na+ nei mitocondri durante l'ipossia diminuiscono il trasferimento di elettroni tra CII e CIII, disaccoppiando il ciclo Q a livello di CIII e producendo un anione superossido. Al contrario, il trasferimento di elettroni tra CI e CIII non è diminuitodi 21. L'attuale protocollo spiega ampiamente la procedura con cui sono stati ottenuti questi risultati.
Ulteriori controlli possono essere applicati al protocollo corrente se il trattamento in studio viene eseguito in cellule o in vivo, che sono le attività complesse isolate di CI, CII e CIII, poiché le loro quantità individuali o singole attività possono variare insieme al trattamento. Seguendo una procedura molto simile a quella sopra descritta, non sono state osservate differenze in nessuna di queste attività isolate21 in presenza o assenza di Na+. Da notare, è stato descritto che Na+ può aumentare la transizione D/A30. Tuttavia, il protocollo utilizzato in questa osservazione prevedeva l'uso di particelle sottocondriali (SMP), mentre il nostro protocollo utilizza membrane mitocondriali, evidenziando la necessità del potenziale di membrana attraverso l'IMM per l'effetto contabile30.
Va notato che i cicli di congelamento-disgelo non dissolvono le membrane come fanno i detergenti, quindi singoli complessi e supercomplessi sono ancora attaccati a doppi strati di fosfolipidi. Ciò è evidenziato dal fatto che il consumo di ossigeno nei mitocondri congelati-scongelati attraverso CI o CII può essere misurato in presenza di citocromo c31. Inoltre, se ci fosse un effetto dei cicli di congelamento-disgelo sull'attività CII+CIII, non solo sarebbe visto nei campioni "NaCl 10 mM", ma anche nei campioni "KCl 10 mM". Ciò renderebbe impossibile la misurazione (poiché CII sarebbe separato da CIII attraverso la decomposizione della membrana) o inferiore a un punto in cui le differenze tra K + e Na + non sarebbero visibili. Tuttavia, come si vede nella Figura 2B, questo non è il caso. L'aggiunta di KCl nel protocollo è progettata per scartare i possibili effetti dell'osmolarità o della forza ionica sulle attività misurate. L'osmolarità finale in entrambi i casi, campione "10 mM KCl" e campione "10 mM NaCl", è uguale (116 mEq/L) e l'unica differenza tra i campioni è la presenza di 10 mM K+ o 10 mM Na+. Tuttavia, se i cationi K+ dal tampone avessero un effetto, si manifesterebbe in entrambi i campioni "KCl 10 mM" e "NaCl 10 mM", rendendo tale effetto non individuabile in entrambi i campioni.
Nella capacità dei diversi cationi di legare i fosfolipidi, ciò che è effettivamente cruciale è la chimica di coordinazione e il raggio ionico di ciascun catione (come evidenziato sperimentalmente nel nostro articolo originale21, e teoricamente in Böckmann et al.32). Mentre K+ mostra un numero medio di coordinazione di sei, il numero medio di coordinazione Na+ è cinque, risultando in una diversa geometria complessa di coordinazione, che si traduce in effetti molto diversi di K+ e Na+ su un doppio strato fosfolipidico33.
Va anche notato che il raggio ionico di K + e Na + sono diversi. Mentre K+ ha un raggio ionico di 280 pm, Na+ ha un raggio ionico di 227 pm. Questa differenza influisce direttamente sulla loro interazione con gli anioni (o zwitterioni), poiché un raggio ionico più basso (cioè meno gusci di elettroni) si traduce in un'interazione più forte con una molecola caricata negativamente poiché il nucleo ionico positivo è più esposto come se avesse gusci di elettroni extra (cioè raggio ionico più alto). Infatti, tutti i cationi sono possibilmente in grado di interagire con i fosfolipidi; tuttavia, solo quelli con specifiche proprietà chimico-fisiche sono in grado di avere effetti specifici su un doppio strato fosfolipidico, come Na+.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., dr C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez per l'assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). Il CNIC è sostenuto dall'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dal Ministerio de Ciencia, dall'Innovación y Universidades (MCNU) e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figura 2 creata con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
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