Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen vergleichenden Assay, der mitochondriale komplexe Aktivitäten CI+CIII und CII+CIII in Gegenwart oder Abwesenheit von Na+ verwendet, um die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools zu untersuchen.
Abstract
Ubichinon (CoQ) -Pools in der inneren mitochondrialen Membran (IMM) sind teilweise zu komplexen I- oder FAD-abhängigen Enzymen segmentiert. Eine solche Unterteilung kann leicht durch einen vergleichenden Assay mit NADH oder Succinat als Elektronendonatoren in gefroren-aufgetauten Mitochondrien beurteilt werden, in denen die Reduktion von Cytochrom c (Cyt c) gemessen wird. Der Assay stützt sich auf die Wirkung von Na+ auf das IMM und verringert seine Fließfähigkeit. Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der NADH-Cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivität und der Succinat-Cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivitäten in Gegenwart von NaCl oder KCl vor. Die Reaktionen, die schrittweise auf die Mischung von Reagenzien in einer Küvette angewiesen sind, werden spektralphotometrisch während 4 min in Gegenwart von Na+ oder K+ gemessen. Die gleiche Mischung wird parallel in Gegenwart der spezifischen Enzyminhibitoren durchgeführt, um die unspezifische Absorptionsänderung abzuziehen. Die Aktivität der NADH-cyt-c-Oxidoreduktase nimmt in Gegenwart eines dieser Kationen nicht ab. Die Aktivität der Succinat-c-Oxidoreduktase nimmt jedoch in Gegenwart von NaCl ab. Dieses einfache Experiment hebt hervor: 1) die Wirkung von Na + bei der Verringerung der IMM-Fließfähigkeit und des CoQ-Transfers; 2) dass der Superkomplex I+III 2 den Ubichinon-Transfer (CoQ) davor schützt, durch eine Verringerung der IMM-Fließfähigkeit beeinträchtigt zu werden; 3) dass sich die CoQ-Übertragung zwischen CI und CIII funktionell von der CoQ-Übertragung zwischen CII und CIII unterscheidet. Diese Tatsachen unterstützen die Existenz funktional differenzierter CoQ-Pools im IMM und zeigen, dass diese durch die sich verändernde Na+-Umgebung der Mitochondrien reguliert werden können.
Introduction
Das mitochondriale oxidative Phosphorylierungssystem (OXPHOS) ist der Hauptweg, der die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP), die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den Verbrauch von reduzierenden Äquivalenten wie Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) oder Succinat durch Mitochondrien antreibt. Das OXPHOS-System besteht aus fünf Proteinkomplexen: Komplex I (CI) oxidiert NADH und reduziert CoQ in Ubiquinol (CoQH2). Komplex II (CII) oxidiert Succinat zu Fumarat und reduziert CoQ in CoQH2. Komplex III (CIII) oxidiertCoQH 2 wieder zu CoQ und reduziert Cytochrom c (Cyt c). Schließlich oxidiert Komplex IV (CIV) Cyt c und reduziert Sauerstoff zu Wasser. Diese Oxidoreduktionskette, die sogenannte Elektronentransportkette (mETC ), ist an das Pumpen von H+ über das IMM gekoppelt, wodurch ein elektrochemischer Gradient erzeugt wird, der vom Komplex V (CV) verwendet wird, um Adenosindiphosphat (ADP) zu ATP zu phosphorylieren.
mETC-Komplexe können entweder allein im IMM sein oder sich zu quartären Strukturen zusammensetzen, die als Superkomplexe bezeichnet werden. CIV kann sich mit CIII zusammensetzen, indem es das III 2 + IV- oder Q-Respirasom bildet (da es in Gegenwart von CoQH 2) 1,2,3 atmen kann oder Homodimere oder Homooligomere4 bildet. CIII kann mit CI interagieren und bildet den Superkomplex I+III25. Schließlich ist CI auch in der Lage, mit dem Q-Respirasom zu interagieren und das I + III2 + IV- oder N-Respirasom zu bauen (da es NADH verbrauchen kann) 1,6,7,8,9,10.
CoQ und cyt c sind mobile Elektronenträger, die für die Übertragung von Elektronen von CI/CII auf CIII bzw. von CIII auf CIV verantwortlich sind. Ob Superkomplexe eine funktionelle lokale Einschränkung für diese Träger darstellen oder nicht, wurde in den letzten zwei Jahrzehntenintensiv diskutiert 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Mehrere unabhängige Gruppen haben jedoch gezeigt, dass CoQ und cyt c im IMM funktional in Pools segmentiert werden können. In Bezug auf das CoQ kann es funktional in einen spezifischen CoQ-Pool für CI (CoQNAD) und einen weiteren Pool für FAD-abhängige Enzyme (CoQFAD) 1,7,12,18,19 unterteilt werden. Um jedoch die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools zu unterscheiden, waren die Überexpression der alternativen Oxidase (AOX) und die Erzeugung spezifischer mtDNA-Mutanten, die CI in Abwesenheit von CIII zusammensetzen können,erforderlich 1,19,20.
Der Mechanismus der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) während der Hypoxie war bis vor kurzem unbekannt. Bei akuter Hypoxie durchläuft CI den aktiven/deaktiven (A/D) Übergang, bei dem die H+-Pump-NADH-CoQ-Oxidoreduktase-Aktivität abnimmt. Eine solche Abnahme des H+-Pumpens säuert die mitochondriale Matrix an und löst die Calcium-Phosphat-Ausscheidungen in der mitochondrialen Matrix teilweise auf, wobei lösliches Ca2 + freigesetzt wird. Dieser Anstieg des löslichen Ca 2+ aktiviert den Na+/Ca 2+ Wärmetauscher (NCLX), der Ca 2+ im Austausch gegen Na+ extrudiert. Der mitochondriale Na+-Anstieg interagiert mit Phospholipiden in der Innenseite des IMM, verringert seine Fließfähigkeit und den CoQ-Transfer zwischen CII und CII und erzeugt schließlich Superoxid-Anion, ein Redoxsignal21. Interessanterweise war der CoQ-Transfer nur zwischen CII und CII vermindert, aber nicht zwischen CI und CIII, was hervorhebt, dass 1) Na+ nur einen der vorhandenen CoQ-Pools in den Mitochondrien modulieren konnte; 2) es gibt funktional differenzierte CoQ-Pools im IMM. So kann ein weit verbreitetes Protokoll zur Untersuchung mitochondrialer Enzymaktivitäten verwendet werden, um die Existenz der genannten CoQ-Pools zu beurteilen.
Das aktuelle Protokoll basiert auf der Messung der Reduktion von oxidiertem Cyt c, dem Substrat von CIII, durch Absorption in Gegenwart von Succinat (d.h. CII-Substrat) oder NADH (d.h. CI-Substrat). Die gleiche Probe wird in zwei geteilt, von denen eine mit KCl und die andere mit der gleichen Konzentration von NaCl behandelt wird. Auf diese Weise, da Na + die IMM-Fluidität verringert, würden sowohl CI+CIII als auch CII+CIII in Gegenwart von Na+ abnehmen, wenn CoQ in einem einzigartigen Pool im IMM vorhanden wäre. Wenn CoQ jedoch in teilweise segmentierten funktionalen CoQ-Pools vorhanden wäre, wäre die Wirkung von Na+ hauptsächlich (oder nur) auf die CII+CIII-Aktivität offensichtlich, nicht jedoch auf die CI+CIII. Wie kürzlich veröffentlicht21, betrifft Na+ nur den CoQ-Transfer zwischen CII und CIII (Abbildung 1C,D), nicht aber zwischen CI und CIII (Abbildung 1A,B).
Dieses Protokoll wurde zusammen mit einer Reihe von Techniken verwendet, um die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools im IMM zu bestätigen, von denen einer für CI (dh CoQNAD) und ein anderer für FAD-verknüpfte Enzyme (dh CoQFAD) bestimmt ist)1,3,7; Eine Beobachtung, die, obwohl sie weiterhin diskutiert wird22, von mehreren Gruppen unabhängig voneinander bestätigtwurde 7,19. So wirkt sich die Superassemblierung von CI zu Superkomplexen auf die lokale Mobilität von CoQ aus und erleichtert seine Verwendung durch das CIII innerhalb des Superkomplexes 1,7,13,14,23,24,25.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission des Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spanien, in Übereinstimmung mit der Richtlinie der Europäischen Union vom 22. September 2010 (2010/63/EU) und dem spanischen Königlichen Erlass vom 1. Februar 2013 (53/2013) genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren.
HINWEIS: Dieser vergleichende Assay zur Untersuchung der Segmentierung von mitochondrialen CoQ-Pools wird wie folgt beschrieben:
1. Proteinquantifizierung
- Frieren und tauen Sie die isolierten Mitochondrien26 dreimal aus einer Wildtyp-Mausleber (d.h. mitochondriale Membranen) auf, bevor Sie experimentieren, um die Organellen für die Reaktionssubstrate durchlässig zu machen.
- Quantifizieren Sie die Proteinmenge der isolierten Mitochondrienprobe mit Bradford- oder Bicinchoninsäure (BCA) -Methoden. Im Fall von Bradford 2 μL Probe in 1 ml 1x Bradford-Reagenz geben.
- Teilen Sie die Probe in vier Teilproben von je 20 μg auf (nämlich: A, B, C, D; Abbildung 2A).
2. Messung der CI+CIII-Aktivität
HINWEIS: In diesem Teil des Protokolls werden die Proben A und B verwendet, um die CI+CIII-Aktivität zu messen (Abbildung 2B).
- Teilen Sie die Proben A und B in zwei Teilproben von je 10 μg auf (nämlich A1, A2, B1 und B2). Mischen Sie jede der Teilproben in einer 1-ml-Küvette mit 30 μl Cyt c (10 mg/ml), 10 μL 100 mM Malonat und fügen Sie vorgewärmten C1/C2-Puffer (Tabelle 1) bei 37 °C bis zu 980 μL (979 μL für Küvetten A2 und B2) hinzu.
VORSICHT: Dieser Schritt beinhaltet die Verwendung der toxischen Reagenzien Malonat und Kaliumcyanid.
HINWEIS: cyt c (10 mg/ml) muss frisch zubereitet werden, indem 10 mg cyt c in 1 ml 10 mM K 2 HPO 4-Lösung gemischt werden, derpH-Wert auf7,2eingestellt ist, und es muss während des gesamten Experiments in Eis gehalten werden. - 10 μL 1 M KCl in die Küvetten A1 und A2 und 10 μL 1 M NaCl in die Küvetten B1 und B2 geben.
- 1 μL 1 mM Rotenon in die Küvette geben, die die Teilproben A2 und B2 enthält.
VORSICHT: Dieser Schritt beinhaltet die Verwendung des toxischen Reagetikums Rotenon. - Unmittelbar vor der Messung 10 μL NADH (10 mM) in alle Küvetten geben.
HINWEIS: Die 10 μL werden vorzugsweise auf der Stufe der Küvette zugegeben, so dass die Reaktion beim Mischen beginnt. - Mischen Sie die Küvette, indem Sie sie dreimal vorsichtig umdrehen. Legen Sie es in den Absorptionsküvettenleser (UV/VISJASCO-Spektralphotometer).
- Klicken Sie auf Messen > Parameter > Allgemein und stellen Sie die Messparameter auf Wellenlänge: 550 nm und Zeit: 4 min Ablesung ein; Drücken Sie die Schaltflächen Akzeptieren und Start , um den Vorgang zu starten.
- Speichern Sie am Ende der Messung die Steigung, die die lineare Erhöhung der Absorption umfasst, indem Sie auf Datei und Speichern unter klicken. Die Piste kann auch manuell erfasst werden.
3. Messung der CII+CIII-Aktivität
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls verwendet die Proben C und D, um die CII+CIII-Aktivität zu messen (Abbildung 2C).
- Teilen Sie die Proben C und D in zwei Teilproben von je 10 μg auf (nämlich C1, C2, D1 und D2). Mischen Sie jede der Teilproben in einer 1-ml-Küvette mit 30 μL Cyt c (10 mg/ml), 1 μL 1 mM Rotenon und fügen Sie vorgewärmten C1/C2-Puffer bei 37 °C bis zu 980 μL (970 μL für Küvetten C2 und D2) hinzu.
VORSICHT: Dieser Schritt beinhaltet die Verwendung der toxischen Reagenzien Kaliumcyanid und Rotenon.
HINWEIS: cyt c (10 mg/ml) muss frisch zubereitet werden, indem 10 mg cyt c in 1 ml 10 mM K 2 HPO 4-Lösung gemischt werden, derpH-Wert auf7,2eingestellt ist, und es muss während des gesamten Experiments in Eis gehalten werden. - 10 μL 1 M KCl in die Küvetten C1 und C2 und 10 μL 1 M NaCl in die Küvetten D1 und D2 geben.
- 1 μL 1 mM Antimycin A in die Küvette geben, die die Teilproben C2 und D2 enthält.
VORSICHT: Dieser Schritt beinhaltet die Verwendung des toxischen Reagetikums Antimycin A. - Unmittelbar vor der Messung 10 μL Succinat (1 M) in alle Küvetten geben.
HINWEIS: Die 10 μL werden vorzugsweise auf der Stufe der Küvette zugegeben, so dass die Reaktion beim Mischen beginnt. - Mischen Sie die Küvette vorsichtig und drehen Sie sie dreimal um. Legen Sie es in den Absorptionsküvettenleser (UV/VIS-Spektralphotometer).
- Klicken Sie auf Messen > Parameter > Allgemein und stellen Sie die Messparameter auf Wellenlänge: 550 nm und Zeit: 4 min Ablesung ein; Drücken Sie die Schaltflächen Akzeptieren und Start , um den Vorgang zu starten.
- Speichern Sie am Ende der Messung die Steigung, die die lineare Erhöhung der Absorption umfasst, indem Sie auf Datei und Speichern unter klicken. Die Piste kann auch manuell erfasst werden.
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Representative Results
Typische Ergebnisse dieses Protokolls sind unten dargestellt (Abbildung 3). Da die reduzierte Cyt-c-Absorption bei 550 nm liegt, müssen alle ungehemmten Teilproben eine Erhöhung der Absorption bei 550 nm aufweisen. Inhibitierte Teilproben zeigen idealerweise eine flache oder leicht zunehmende Steigung (Abbildung 3). Steigungen aus gehemmten Teilproben sind von ungehemmten Teilproben zu subtrahieren.
Die Proben A und B, die beide durch ihre entsprechende Hemmung korrigiert wurden und die NADH:cyt c Oxidoreduktase-Aktivität darstellen, weisen eine ähnliche Steigung auf (Abbildung 3A). Die Teilproben C und D, die beide durch ihre entsprechende Hemmung korrigiert wurden und die Succinat-c-Oxidoreduktase-Aktivität darstellen, unterscheiden sich jedoch dadurch, dass die Aktivität der Teilprobe C höher ist als die Aktivität der Teilstichprobe D (Abbildung 3B). Beachten Sie, dass die basale Absorption zwischen den Proben leicht unterschiedlich sein kann (Abbildung 3A).
Diese Ergebnisse (d. h. Steigungen, die bereits durch ihren Inhibitor korrigiert wurden; Tabelle 2) kann dargestellt werden, indem die Menge des verwendeten Proteins (0,01 mg) als A.U./Min/mg-Protein dividiert wird. Aus diesem Wert kann die Reduktionsrate von Cyt c mit Hilfe des Lamber-Beer-Gesetzes21 weiter berechnet werden.
Wichtig ist, dass diese Ergebnisse je nach mehreren Faktoren variieren können: (i) Herkunft der Proben. Da verschiedene Gewebe und Zelltypen eine variable Zusammensetzung von OXPHOS-Komplexen und Superkomplexen aufweisen, können absolute Werte und relative Veränderungen zwischen den Proben variieren. (ii) Da verschiedene Gewebe eine variable Zusammensetzung von OXPHOS-Komplexen und Superkomplexen aufweisen können, kann die Zugabe von mehr gefroren-aufgetauten Mitochondrien (zur Kompensation niedrigerer absoluter Werte eines bestimmten Gewebes) zu der Reaktionsmischung einen sekundären Effekt haben, nämlich dass das Verhältnis von Na+ oder K+ pro mg Protein/Phospholipid in der Probe abnimmt. Daher ist Vorsicht geboten, wenn entweder die Menge der Mitochondrien oder die der Probe zugesetzte Na+/K+-Konzentration variiert wird. (iii) Interexperimentelle Variationen können sich aus der Dauer und Temperatur von Gefrier-Tau-Zyklen, Reagenzien-Handelschargen oder variierenden Lagerpuffern isolierter Mitochondrien ergeben.
Abbildung 1: Na+ verringert spezifisch den Elektronentransfer zwischen CII und CIII, aber nicht zwischen CI und CIII. (A) Schematische Darstellung des Elektronentransfers zwischen NADH und Cyt c, der durch die CoQNAD im Superkomplex I+III2 erfolgt. (B) Der Elektronentransfer zwischen NADH und Cyt c, der durch das CoQNAD im Superkomplex I+III2 stattfindet, wird durch intramitochondriales Na+ nicht beeinflusst. (C) Schematische Darstellung des Elektronentransfers zwischen Succinat und Cyt c, der durch die CoQFAD in CII erfolgt. (D) Der Elektronentransfer zwischen NADH und Cyt c, der durch die CoQ-FAD im Superkomplex I+III2 stattfindet, wird durch ein hohes intramitochondriales Na+ verringert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Protokolls von der Unterteilung der ursprünglichen Stichprobe bis zur kinetischen Messung. (A) Schematische Darstellung der Teilstichprobenteilung, wobei der gleiche Ursprung aller Teilstichproben hervorgehoben wird. B) Schema der aufeinanderfolgenden Schritte der Zugabe von Reagenzien für die CI+CIII-Aktivität in den Teilproben A1 und B1. Der rote Kreis stellt die Stelle dar, an der NADH idealerweise hinzugefügt werden sollte. Beachten Sie, dass der einzige Unterschied zu den Teilproben A2 und B2 die zusätzliche Zugabe von Rotenon in letzterem ist. C) Schema der aufeinanderfolgenden Schritte der Zugabe von Reagenzien für die CII+CIII-Aktivität in den Teilproben C1 und D1. Der rote Kreis stellt die Stelle dar, an der idealerweise Succinat hinzugefügt werden sollte. Beachten Sie, dass der einzige Unterschied zu den Unterproben C2 und D2 die zusätzliche Zugabe von Antimycin A in letzterem ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Wirkung von Na+ auf die Cyt-c-Reduktion durch mitochondriale Membranen der Mausleber bei NADH- oder Succinataddition. (A) Repräsentative Spuren, die die Wirkung von Na+ auf die Cyt-c-Reduktion durch mitochondriale Membranen der Mausleber zeigen, die NADH oxidieren. (B) Repräsentative Spuren, die die Wirkung von Na+ auf die Cyt-C-Reduktion durch mitochondriale Membranen der Mausleber zeigen, die Succinat oxidieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Verbindung | Konzentration |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN | 3 mM |
| Rinderserumalbumin (BSA) | 2,5 mg/ml |
Tabelle 1: Zusammensetzung des C1/C2-Puffers. Die Pufferzusammensetzung wird in molaren Konzentrationen dargestellt.
| Erwartete Raten | +KCl (Mittelwert) | +KCl (SD) | +NaCl (Mittelwert) | +NaCl (SD) | Mann-Whitney P Wert |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Individuelle Werte | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Individuelle Werte | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tabelle 2: Erwartete Zinsbandbreiten Die Erwartungswerte für jede Aktivität werden in beliebigen Einheiten dargestellt. Der entsprechende statistische Test zwischen +KCl und +NaCl wird ebenfalls vorgestellt. "n" steht für die Anzahl der Replikate.
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Discussion
Obwohl dieses Protokoll ein sehr einfaches Verfahren darstellt, um die Existenz der teilweise segmentierten CoQ-Pools zu identifizieren, gibt es einige kritische Schritte, die berücksichtigt werden müssen. Substrate (d. h. NADH oder Succinat) werden vorzugsweise zuletzt zugegeben, da eine Autooxidation dieser Verbindungen auftreten kann. Das Umdrehen der Küvette muss vorsichtig sein, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, die das Lesen beeinträchtigen können.
Darüber hinaus weist die vorliegende Technik einige Einschränkungen auf, die erwähnenswert sind. Messungen werden nicht in intakten Mitochondrien durchgeführt. So kann der künstliche Gehalt und der Anteil des Puffers zu Unterschieden mit der nativen Umgebung der Mitochondrien führen.
Reagenzien werden im Übermaß zugegeben, und sie stellen möglicherweise nicht die wahre Verfügbarkeit von Substraten in intaktem Gewebe dar.
Aktuelle Methoden implizieren die Generierung und Verwendung sehr spezifischer genetischer Modelle und Geräte, die in vielen Labors nicht ohne weiteres verfügbar sind1. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige und einfach durchzuführende Methode, um die Existenz der teilweise differenzierten CoQ-Pools mit breit verfügbaren Reagenzien und Werkzeugen zu messen. Daher ist es möglich, dass es in zukünftigen Studien angewendet werden kann, die genetische Modelle von mitochondrialen Erkrankungen vergleichen.
Die Mobilität der mobilen Elektronenträger im mETC ist immer noch ein stark diskutiertes Thema 25,27, obwohl die Existenz von teilweise differenzierten Pools akzeptiert wird 7,12,18,28,29. In jüngster Zeit haben hochauflösende Respirometrie und detaillierte biochemische Charakterisierung mehrerer OXPHOS-Mutanten, die AOX1 exprimieren, zusammen mit verfeinerten Kryoelektronenmikroskopie-Studien, die das natürliche Lipidmilieu7 erhalten, Licht in die Diskussion gebracht. Dies wirft heftige Argumente für die Existenz von teilweise segmentierten funktionalen CoQ-Pools auf.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass physiologische Reize durch die verschiedenen CoQ-Pools reguliert werden; insbesondere die akute hypoxische Reaktion, die durch intramitochondriales Na + angetrieben wird. Höhere Na+-Spiegel in Mitochondrien während der Hypoxie verringern den Elektronentransfer zwischen CII und CIII, entkoppeln den Q-Zyklus auf der Ebene von CIII und erzeugen ein Superoxidanion. Im Gegensatz dazu nahm der Elektronentransfer zwischen CI und CIII nicht ab21. Das vorliegende Protokoll erläutert ausführlich das Verfahren, mit dem diese Ergebnisse erzielt wurden.
Weitere Kontrollen können auf das aktuelle Protokoll angewendet werden, wenn die zu untersuchende Behandlung in Zellule oder in vivo durchgeführt wird, bei denen es sich um die isolierten komplexen Aktivitäten von CI, CII und CIII handelt, da ihre individuellen Mengen oder einzelnen Aktivitäten zusammen mit der Behandlung variieren können. Nach einem sehr ähnlichen Verfahren wie oben beschrieben, wurden bei keiner dieser isolierten Aktivitäten21 Unterschiede bei Vorhandensein oder Fehlen von Na+ beobachtet. Zu beachten ist, dass beschrieben wurde, dass Na+ den D/A-Übergang um 30 erhöhen kann. Das Protokoll, das für diese Beobachtung verwendet wurde, beinhaltete jedoch die Verwendung von submitochondrialen Partikeln (SMPs), während unser Protokoll mitochondriale Membranen verwendet, was die Notwendigkeit des Membranpotentials im gesamten IMM für den berücksichtigten Effekt30 hervorhebt.
Es sollte beachtet werden, dass Frost-Tau-Zyklen die Membranen nicht wie Reinigungsmittel auflösen, so dass einzelne Komplexe und Superkomplexe immer noch an Phospholipid-Doppelschichten gebunden sind. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass der Sauerstoffverbrauch von gefroren-aufgetauten Mitochondrien durch CI oder CII in Gegenwart von Cytochrom c31 gemessen werden kann. Wenn es einen Effekt von Gefrier-Tau-Zyklen auf die CII+CIII-Aktivität gäbe, würde dies nicht nur in "NaCl 10 mM"-Proben zu sehen sein, sondern auch in "KCl 10 mM"-Proben. Dies würde entweder die Messung unmöglich machen (da CII durch Membranzersetzung von CIII getrennt würde) oder bis zu einem Punkt sinken, an dem Unterschiede zwischen K+ und Na+ nicht mehr zu sehen wären. Wie in Abbildung 2B zu sehen ist, ist dies jedoch nicht der Fall. Die Zugabe von KCl im Protokoll soll mögliche Auswirkungen der Osmolarität oder der Ionenstärke auf die gemessenen Aktivitäten verwerfen. Die endgültige Osmolarität in beiden Fällen, "10 mM KCl " Probe und "10 mM NaCl" Probe, ist gleich (116 mEq/L) und der einzige Unterschied zwischen den Proben ist das Vorhandensein von 10 mM K+ oder 10 mM Na+. Wenn jedoch K+-Kationen aus dem Puffer eine Wirkung hätten, würde sich dies sowohl in "KCl 10 mM"- als auch in "NaCl 10 mM"-Proben manifestieren, wodurch ein solcher Effekt in beiden Proben nicht erkennbar wäre.
Für die Fähigkeit der verschiedenen Kationen, Phospholipide zu binden, ist in der Tat die Koordinationschemie und der Ionenradius jedes Kations entscheidend (wie experimentell in unserer Originalarbeit21 und theoretisch in Böckmann et al.32 hervorgehoben). Während K+ eine durchschnittliche Koordinationszahl von sechs aufweist, beträgt die durchschnittliche Koordinationszahl von Na+ fünf, was zu einer anderen koordinationskomplexen Geometrie führt, die sich in sehr unterschiedlichen Effekten von K+ und Na+ auf eine Phospholipid-Doppelschicht33 niederschlägt.
Es sollte auch beachtet werden, dass der Ionenradius von K + und Na + unterschiedlich ist. Während K+ einen Ionenradius von 280 pm hat, hat Na+ einen Ionenradius von 227 pm. Dieser Unterschied wirkt sich direkt auf ihre Wechselwirkung mit Anionen (oder Zwetterionen) aus, da ein niedrigerer Ionenradius (dh weniger Elektronenschalen) zu einer stärkeren Wechselwirkung mit einem negativ geladenen Molekül führt, da der positive Ionenkern stärker exponiert ist, als ob er zusätzliche Elektronenschalen (dh einen höheren Ionenradius) hätte. Tatsächlich sind alle Kationen möglicherweise in der Lage, mit Phospholipiden zu interagieren; jedoch nur solche mit spezifischen chemisch-physikalischen Eigenschaften können spezifische Wirkungen auf eine Phospholipid-Doppelschicht wie Na+ haben.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez und E. R. Martínez-Jimenez für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt von MICIN: RTI2018-099357-B-I00 und HFSP (RGP0016/2018). Das CNIC wird vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dem Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) und der Pro CNIC Foundation unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Abbildung 2 erstellt mit BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
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