Summary
Denne protokollen beskriver en komparativ analyse, ved hjelp av mitokondrie komplekse aktiviteter CI + CIII og CII + CIII i nærvær eller fravær av Na +, for å studere eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger.
Abstract
Ubiquinone (CoQ) bassenger i den indre mitokondriemembranen (IMM) er delvis segmentert til enten komplekse I- eller FAD-avhengige enzymer. Slike underavdelinger kan enkelt vurderes ved en komparativ analyse ved hjelp av NADH eller succinat som elektrondonorer i frosne mitokondrier, der cytokrom c (cyt c) reduksjon måles. Analysen er avhengig av effekten av Na+ på IMM, og reduserer flyten. Her presenterer vi en protokoll for å måle NADH-cyt c oxidoreductase aktivitet og succinate-cyt c oxidoreductase aktiviteter i nærvær av NaCl eller KCl. Reaksjonene, som er avhengige av blandingen av reagenser i en cuvette på en trinnvis måte, måles spektrofotometrisk i løpet av 4 minutter i nærvær av Na + eller K +. Den samme blandingen utføres parallelt i nærvær av de spesifikke enzymhemmerne for å trekke fra den uspesifiserte endringen i absorbans. NADH-cyt c oxidoreductase aktivitet reduseres ikke i nærvær av noen av disse kasjonene. Imidlertid reduseres succinate-cyt c oxidoreductase aktiviteten i nærvær av NaCl. Dette enkle eksperimentet fremhever: 1) effekten av Na + i avtagende IMM-fluiditet og CoQ-overføring; 2) at supercomplex I +III2 beskytter ubiquinone (CoQ) overføring fra å bli påvirket av å senke IMM-fluiditet; 3) at CoQ overføring mellom CI og CIII er funksjonelt forskjellig fra CoQ overføring mellom CII og CIII. Disse fakta støtter eksistensen av funksjonelt differensierte CoQ-bassenger i IMM og viser at de kan reguleres av det skiftende Na + -miljøet i mitokondrier.
Introduction
Mitokondrie oksidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) er hovedveien som driver adenosintrifosfat (ATP) syntese, reaktiv oksygenart (ROS) produksjon, og forbruk av redusere ekvivalenter, som nikotinamid adenin dinucleotide (NADH) eller succinat, av mitokondrier. OXPHOS-systemet består av fem proteinkomplekser: Kompleks I (CI) oksiderer NADH og reduserer CoQ til ubiquinol (CoQH2). Kompleks II (CII) oksiderer succinat til fumarat og reduserer CoQ til CoQH2. Kompleks III (CIII) oksiderer CoQH2 tilbake til CoQ, noe som reduserer cytokrom c (cyt c). Til slutt oksiderer komplekse IV (CIV) cyt c og reduserer oksygen til vann. Denne oksidoreduksjonskjeden, den såkalte elektrontransportkjeden (mETC), er koblet til pumping av H+ over IMM, noe som skaper en elektrokjemisk gradient som brukes av kompleks V (CV) til fosforylat adenosindifosfat (ADP) til ATP.
mETC-komplekser kan enten være alene i IMM eller samles i kvartære strukturer kalt superkompatibiliteter. CIV kan samles med CIII, danner III2 +IV eller Q-respirasome (som det er i stand til å respirere i nærvær av CoQH2)1,2,3 eller danner homodimers eller homooligomerer4. CIII kan samhandle med CI, og danner supercomplex I +III25. Til slutt er CI også i stand til å samhandle med Q-respirasome, bygge I + III2 + IV eller N-respirasome (som det kan respirere forbruker NADH) 1,6,7,8,9,10.
CoQ og cyt c er mobile elektronbærere som har ansvaret for å overføre elektroner fra CI / CII til CIII, og fra CIII til CIV, henholdsvis. Hvorvidt supercomplexes pålegger en funksjonell lokal begrensning for disse transportørene har vært et spørsmål om intens debatt gjennom de siste to tiårene 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flere uavhengige grupper har imidlertid vist at CoQ og cyt c kan segmenteres funksjonelt i bassenger i IMM. Når det gjelder CoQ, kan den segmenteres funksjonelt i et spesifikt CoQ-basseng for CI (CoQNAD) og et annet basseng dedikert til FAD-avhengige enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. For å skille mellom eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger, var imidlertid overekspressionen av den alternative oksidasen (AOX) og generasjonen av spesifikke mtDNA-mutanter, som kan montere CI i fravær av CIII, nødvendig 1,19,20.
Mekanismen for reaktiv oksygenart (ROS) produksjon under hypoksi var ukjent inntil nylig. Ved akutt hypoksi gjennomgår CI den aktive/deaktiveringsovergangen (A/D), som innebærer reduksjonen i H+ pumping av NADH-CoQ oksidoreductaseaktivitet. En slik reduksjon i H + pumping syrer mitokondriematrisen og oppløser delvis kalsiumfosfatutfellingene i mitokondriematrisen, og frigjør løselig Ca2 +. Denne økningen i løselig Ca2+ aktiverer Na +/Ca2+ veksler (NCLX), som ekstruderer Ca2+ i bytte mot Na+. Mitokondrie Na + økning samhandler med fosfolipider på innsiden av IMM, reduserer fluiditeten og CoQ-overføringen mellom CII og CIII, og produserer til slutt superoksidanion, et redokssignal21. Interessant nok ble CoQ-overføringen bare redusert mellom CII og CIII, men ikke mellom CI og CIII, og fremhevet at 1) Na + bare var i stand til å modulere ett av de eksisterende CoQ-bassengene i mitokondriene; 2) det finnes funksjonelt differensierte CoQ-bassenger i IMM. Dermed kan en mye brukt protokoll for studiet av mitokondrie enzymaktiviteter brukes til å vurdere eksistensen av de nevnte CoQ-bassengene.
Den nåværende protokollen er basert på måling av reduksjon av oksidert cyt c, substratet til CIII, ved absorbans i nærvær av succinat (dvs. CII substrat) eller NADH (dvs. CI-substrat). Den samme prøven er delt inn i to, hvorav den ene vil bli behandlet med KCl, og den andre med samme konsentrasjon av NaCl. På denne måten, gitt at Na + reduserer IMM-fluiditeten, hvis CoQ eksisterte i et unikt basseng i IMM, ville både CI + CIII og CII + CIII reduseres i nærvær av Na +. Imidlertid, hvis CoQ eksisterte i delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger, ville effekten av Na + for det meste (eller bare) være tydelig på CII + CIII-aktiviteten, men ikke på CI + CIII. Som nylig publisert21, påvirker Na + bare CoQ-overføringen mellom CII og CIII (figur 1C, D), men ikke mellom CI og CIII (figur 1A, B).
Denne protokollen, sammen med en panoply av teknikker, har blitt brukt til å bekrefte eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger i IMM, en dedikert til CI (dvs. CoQNAD), og en annen dedikert til FAD-tilknyttede enzymer (dvs. CoQFAD) 1,3,7; en observasjon om at selv om det fortsatt er debattert22, har blitt bekreftet uavhengig av flere grupper 7,19. Dermed påvirker supermonteringen av CI i superkompatibiliteter den lokale mobiliteten til CoQ, noe som letter bruken av CIII innenfor supercomplex 1,7,13,14,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført etter Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og ble godkjent av den institusjonelle etiske komiteen i Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spania, i samsvar med EU-direktivet 22. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere antall dyr som ble brukt og deres lidelse.
MERK: Denne komparative analysen for å studere segmentering av mitokondrie CoQ-bassenger er beskrevet som følger:
1. Protein kvantifisering
- Frys og tine de isolerte mitokondriene26 fra en vill-type muselever tre ganger (dvs. mitokondriemembraner) før eksperimentering for å gjøre organellene gjennomtrengelige for reaksjonssubstratene.
- Kvantifisere proteinmengden av den isolerte mitokondriprøven ved Bradford eller Bicinchoninic acid (BCA) metoder. Når det gjelder Bradford, tilsett 2 μL prøve i 1 ml 1 ml 1x Bradford-reagens.
- Del prøven i fire delsampler på 20 μg hver (nemlig: A, B, C, D; Figur 2A).
2. Måling av CI +CIII-aktivitet
MERK: Denne delen av protokollen bruker prøver A og B til å måle CI+CIII-aktivitet (figur 2B).
- Del prøver A og B i to delsampler på 10 μg hver (nemlig A1, A2, B1 og B2). Bland hver av undersamplene i en 1 ml cuvette med 30 μL cyt c (10 mg/ml), 10 μL 100 mM malonat, og tilsett forvarmet C1/C2-buffer (tabell 1) ved 37 °C opp til 980 μL (979 μL for cuvettes A2 og B2).
FORSIKTIG: Dette trinnet innebærer bruk av giftige reagenser malonat og kaliumcyanid.
MERK: cyt c (10 mg/ml) må tilberedes fersk ved å blande 10 mg cyt c i 1 ml 10 mM K2HPO4-oppløsning , pH justert til 7,2, og den må opprettholdes i is gjennom hele eksperimentet. - Tilsett 10 μL 1 M KCl i cuvettes A1 og A2, og tilsett 10 μL 1 M NaCl i cuvettes B1 og B2.
- Tilsett 1 μL 1 mM rotenon i cuvette som inneholder undersampler A2 og B2.
FORSIKTIG: Dette trinnet innebærer bruk av giftig reagensrotenon. - Rett før målingen, tilsett 10 μL NADH (10 mM) i alle cuvettes.
MERK: 10 μL tilsetts helst på trinnet i cuvette, slik at reaksjonen begynner ved blanding. - Bland cuvette ved å forsiktig snu den tre ganger. Plasser den i absorbans cuvette-leseren (UV/VISJASCO spektrofotometer).
- Klikk på Mål > Parametere > Generelt og sett måleparametrene ved Bølgelengde: 550 nm og Tid: 4 min lesing; Trykk på Godta - og Start-knappene for å starte eksperimentet.
- På slutten av målingen, lagre skråningen bestående av den lineære økningen av absorbans ved å klikke på Fil og Lagre som. Skråningen kan også samles manuelt.
3. Måling av CII+CIII-aktivitet
MERK: Denne delen av protokollen bruker prøver C og D til å måle CII+CIII-aktivitet (figur 2C).
- Del prøvene C og D i to delsampler på 10 μg hver (nemlig C1, C2, D1 og D2). Bland hver av undersamplene i en 1 ml cuvette med 30 μL cyt c (10 mg/ml), 1 μL 1 mM rotenon, og tilsett forvarmet C1/C2-buffer ved 37 °C opp til 980 μL (970 μL for cuvettes C2 og D2).
FORSIKTIG: Dette trinnet innebærer bruk av giftige reagenser kaliumcyanid og rotenon.
MERK: cyt c (10 mg/ml) må tilberedes fersk ved å blande 10 mg cyt c i 1 ml 10 mM K2HPO4-oppløsning , pH justert til 7,2, og den må opprettholdes i is gjennom hele eksperimentet. - Tilsett 10 μL 1 M KCl i cuvettes C1 og C2, og tilsett 10 μL 1 M NaCl i cuvettes D1 og D2.
- Tilsett 1 μL 1 mM antimycin A i cuvette som inneholder undersampler C2 og D2.
FORSIKTIG: Dette trinnet innebærer bruk av det giftige reagenset antimycin A. - Rett før målingen, tilsett 10 μL succinat (1 M) i alle cuvettes.
MERK: 10 μL tilsetts helst på trinnet i cuvette, slik at reaksjonen begynner ved blanding. - Bland cuvette forsiktig, snu den tre ganger. Plasser den i absorbans cuvette-leseren (UV/VIS spektrofotometer).
- Klikk på Mål > Parametere > Generelt og sett måleparametrene ved Bølgelengde: 550 nm og Tid: 4 min lesing; Trykk på Godta - og Start-knappene for å starte eksperimentet.
- På slutten av målingen, lagre skråningen bestående av den lineære økningen av absorbans ved å klikke på Fil og Lagre som. Skråningen kan også samles manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske resultater fra denne protokollen er representert nedenfor (figur 3). Ettersom redusert cyt c absorbans lokaliserer på 550 nm, alle uhemmede subsamples må vise en økning i absorbansen ved 550 nm. Hemmede undersampler viser ideelt sett en flat linje eller en litt økende skråning (figur 3). Skråninger fra hemmet undersampler skal trekkes fra uhemmede undersampler.
Prøver A og B, begge korrigert av deres korrespondenthemming og som representerer NADH: cyt c oxidoreductase aktivitet, har en lignende skråning (figur 3A). Imidlertid er subsamples C og D, begge korrigert av deres korrespondentinhibering og som representerer succinate:cyt c oxidoreductase aktivitet, forskjellige, ved at aktiviteten til subsample C er høyere enn aktiviteten til subsample D (figur 3B). Vær oppmerksom på at basalabsorbering kan være litt forskjellig mellom prøver (figur 3A).
Disse resultatene (dvs. bakker som allerede er korrigert av deres inhibitor; Tabell 2) kan representeres ved å dele mengden protein som brukes (0,01 mg) som a.u./min/mg protein. Fra denne verdien kan frekvensen av cyt c-reduksjon beregnes videre ved hjelp av Lamber-Beer-loven21.
Det er viktig at disse resultatene varierer avhengig av flere faktorer: (i) Opprinnelsen til prøvene. Gitt at forskjellige vev og celletyper har en variabel sammensetning av OXPHOS-komplekser og superkompatibiliteter, kan absolutte verdier og relative endringer variere på tvers av prøver. (ii) Gitt at forskjellige vev kan ha en variabel sammensetning av OXPHOS-komplekser og superkompatibiliteter, kan det å tilsette mer frosne mitokondrier (for å kompensere lavere absolutte verdier av et bestemt vev) til reaksjonsblandingen ha en sekundær effekt, noe som er at forholdet mellom Na + eller K + per mg protein / fosfolipid i prøven reduseres. Det bør derfor utvises forsiktighet når du varierer enten mengden mitokondrier eller Na+/K+- konsentrasjonen som legges til prøven. (iii) Interexperimental variasjon kan oppstå fra varighet og temperatur på fryse-tine sykluser, reagenser kommersiell batch, eller varierende lagringsbuffer av isolerte mitokondrier.
Figur 1: Na+ reduserer spesielt elektronoverføring mellom CII og CIII, men ikke mellom CI og CIII. (A) Skjematisk representasjon av elektronoverføringen mellom NADH og cyt c, som skjer gjennom CoQNAD i supercomplex I+III2. (B) Elektronoverføring mellom NADH og cyt c, som skjer gjennom CoQNAD i supercomplex I+III2, påvirkes ikke av intramitochondrial Na+. (C) Skjematisk representasjon av elektronoverføringen mellom succinat og cyt c, som skjer gjennom CoQFAD i CII. (D) Elektronoverføring mellom NADH og cyt c, som skjer gjennom CoQFAD i supercomplex I+III2, reduseres med høy intramitochondrial Na+. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk representasjon av protokollen fra underinndelingen av den opprinnelige prøven til den kinetiske målingen. (A) Skjematisk representasjon av undersampleringsdivisjonen, som fremhever samme opprinnelse for alle delsampler. (B) Ordning av de påfølgende trinnene i reagensets tillegg for CI + CIII-aktivitet i undersampler A1 og B1. Den røde sirkelen representerer stedet der NADH ideelt sett skal legges til. Merk at den eneste forskjellen med subsamples A2 og B2 er den ekstra tilsetningen av rotenon i sistnevnte. (C) Ordning av de påfølgende trinnene i reagensets tillegg for CII + CIII-aktivitet i undersampler C1 og D1. Den røde sirkelen representerer stedet der succinate ideelt sett skal legges til. Merk at den eneste forskjellen med subsamples C2 og D2 er det ekstra tilskuddet av antimycin A i sistnevnte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av Na+ på cyt c reduksjon ved muselever mitokondriemembraner på NADH eller succinate addisjon. (A) Representative spor som viser effekten av Na + på cyt c reduksjon av mus lever mitokondrie membraner oksiderende NADH. (B) Representative spor som viser effekten av Na + på cyt c reduksjon av musen lever mitokondrie membraner oksiderende succinate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sammensatt | Konsentrasjon |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN | 3 mM |
| Bovine serum albumin (BSA) | 2,5 mg/ml |
Tabell 1: Sammensetning av C1/C2-buffer. Buffersammensetning presenteres i molarkonsentrasjoner.
| Forventede satser | +KCl (gjennomsnitt) | +KCl (SD) | +NaCl (gjennomsnitt) | +NaCl (SD) | Mann-Whitney P-verdi |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Individuelle verdier | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Individuelle verdier | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tabell 2: Forventede takstområder. De forventede verdiene for hver aktivitet presenteres i vilkårlige enheter. Den tilsvarende statistiske testen mellom +KCl og +NaCl presenteres også. "n" representerer antall replikeringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om denne protokollen representerer en veldig grei prosedyre for å identifisere eksistensen av de delvis segmenterte CoQ-bassengene, er det noen få kritiske trinn å ta hensyn til. Substrater (dvs. NADH eller succinate) tilsettes fortrinnsvis sist siden autooksidasjon av disse forbindelsene kan forekomme. Cuvettes flipping må være forsiktig for å unngå dannelse av bobler som kan forstyrre avlesningen.
I tillegg presenterer den nåværende teknikken noen begrensninger som er verdt å nevne. Målinger utføres ikke i intakte mitokondrier. Dermed kan det kunstige innholdet og andelen av bufferen resultere i forskjeller med det opprinnelige miljøet av mitokondrier.
Reagenser tilsettes i overkant, og de kan ikke representere den sanne tilgjengeligheten av substrater i intakt vev.
Nåværende metoder innebærer generering og bruk av svært spesifikke genetiske modeller og utstyr som ikke er lett tilgjengelig i mange laboratorier1. Denne protokollen gir en pålitelig og enkel metode for å måle eksistensen av de delvis differensierte CoQ-bassengene ved hjelp av bredt tilgjengelige reagenser og verktøy. Dermed er det mulig at det kan brukes i fremtidige studier som sammenligner genetiske modeller av mitokondriesykdom.
Mobiliteten til de mobile elektronbærerne i mETC er fortsatt et svært omdiskutert tema25,27, selv om eksistensen av delvis differensierte bassenger blir akseptert 7,12,18,28,29. Nylig har høyoppløselig respirometri og detaljert biokjemisk karakterisering av flere OXPHOS-mutanter som uttrykker AOX1, sammen med raffinerte kryoelektronmikroskopistudier som bevarer det naturlige lipidmiljøet7, brakt lys inn i diskusjonen. Dette utgjør tunge argumenter til fordel for eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger.
I tillegg har fysiologiske stimuli vist seg å være regulert av de forskjellige CoQ-bassengene; spesielt den akutte hypoksiske responsen drevet av intramitochondrial Na +. Høyere Na+ nivåer i mitokondrier under hypoksi reduserer elektronoverføringen mellom CII og CIII, løsner Q-syklusen på CIII-nivået og produserer en superoksidanion. Elektronoverføring mellom CI og CIII ble derimot ikke redusertmed 21. Den nåværende protokollen forklarer i stor grad prosedyren som disse resultatene ble oppnådd ved.
Ytterligere kontroller kan brukes på den nåværende protokollen hvis behandlingen som studeres utføres i cellule eller in vivo, som er de isolerte komplekse aktivitetene til CI, CII og CIII, da deres individuelle mengder eller enkeltaktiviteter kan variere sammen med behandlingen. Etter en svært lik prosedyre som beskrevet ovenfor, ble det ikke sett forskjeller i noen av disse isolerte aktivitetene21 i nærvær eller fravær av Na +. For å merke seg har det blitt beskrevet at Na + kan øke D / A-overgangen30. Protokollen som ble brukt på denne observasjonen involverte imidlertid bruk av submitochondrial partikler (SMPer), mens vår protokoll bruker mitokondriemembraner, og fremhever nødvendigheten av membranpotensial på tvers av IMM for den beregnede effekten30.
Det skal bemerkes at fryse-tine sykluser ikke oppløse membranene som vaskemidler gjør, og dermed enkeltkomplekser og supercomplexes er fortsatt festet til fosfolipid bilayers. Dette fremgår av det faktum at frossen-tint mitokondrier oksygenforbruk gjennom enten CI eller CII kan måles i nærvær av cytokrom c31. I tillegg, hvis det var en effekt av fryse-tine sykluser på CII + CIII aktivitet, ville det ikke bare bli sett i "NaCl 10 mM" prøver, men også i "KCl 10 mM" prøver. Dette ville gjøre enten målingen umulig (da CII ville bli skilt fra CIII gjennom membrannedbrytning) eller lavere til et punkt der forskjeller mellom K + og Na + ikke ville bli sett. Som det fremgår av figur 2B, er dette imidlertid ikke tilfelle. Tilsetningen av KCl i protokollen er designet for å kaste bort mulige effekter av enten osmolaritet eller ionstyrke på de målte aktivitetene. Den endelige osmolariteten i begge tilfeller, "10 mM KCl" -prøve og "10 mM NaCl" -prøve, er lik (116 mEq / L) og den eneste forskjellen mellom prøver er tilstedeværelsen av 10 mM K + eller 10 mM Na +. Likevel, hvis K + kasjoner fra bufferen hadde en effekt, ville det manifestere seg i både "KCl 10 mM" og "NaCl 10 mM" -prøver, noe som gjør en slik effekt uutslettelig i begge prøvene.
I de ulike kationenes evne til å binde fosfolipider, er det som faktisk er avgjørende koordineringskjemien og den ioniske radiusen til hver kation (som fremhevet eksperimentelt i vårt opprinnelige papir21, og teoretisk i Böckmann et al.32). Mens K + viser et gjennomsnittlig koordineringsnummer på seks, er Na + gjennomsnittlig koordineringsnummer fem, noe som resulterer i en annen koordineringskompleksgeometri, som oversettes til svært forskjellige effekter av K + og Na + på en fosfolipid bilayer33.
Det skal også bemerkes at den ioniske radiusen til K + og Na + er forskjellige. Mens K+ har en ionisk radius på 280 pm, har Na+ en ionisk radius på 227 pm. Denne forskjellen påvirker direkte deres interaksjon med anioner (eller zwitterions), siden en lavere ionisk radius (dvs. mindre elektronskjell) resulterer i en sterkere interaksjon med et negativt ladet molekyl, da den positive ioniske kjernen er mer utsatt som om den hadde ekstra elektronskall (dvs. høyere ionisk radius). Faktisk er alle kasjoner muligens i stand til å samhandle med fosfolipider; Imidlertid er bare de med spesifikke kjemiske fysiske egenskaper i stand til å ha spesifikke effekter på en fosfolipid bilayer, for eksempel Na +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. Jimenez og E. R. Martínez-Jimenez for teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av MICIN: RTI2018-099357-B-I00 og HFSP (RGP0016/2018). CNIC støttes av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figur 2 opprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A.
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al.
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A.
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A.
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J.
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T.
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
