Summary
이 프로토콜은 Na+의 존재 또는 부재 하에 미토콘드리아 복합 활성 CI+CIII 및 CII+CIII를 사용하여 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 연구하는 비교 분석을 기술한다.
Abstract
내부 미토콘드리아 막 (IMM)의 유비퀴논 (CoQ) 풀은 부분적으로 복합체 I 또는 FAD 의존성 효소로 분할된다. 이러한 세분은 동결-해동된 미토콘드리아에서 전자 공여체로서 NADH 또는 숙시네이트를 사용하는 비교 검정에 의해 용이하게 평가될 수 있으며, 여기서 시토크롬 c(cyt c) 감소가 측정된다. 이 분석은 IMM에 대한 Na+의 효과에 의존하여 유동성을 감소시킵니다. 여기에서, NaCl 또는 KCl의 존재 하에서 NADH-cyt c 산화환원효소 활성 및 숙시네이트-cyt c 산화환원효소 활성을 측정하기 위한 프로토콜을 제시한다. 단계적으로 큐벳 내의 시약의 혼합물에 의존하는 반응은 Na+ 또는 K+의 존재하에 4분 동안 분광광도법으로 측정된다. 동일한 혼합물은 흡광도의 비특이적 변화를 뺄 수 있도록 특정 효소 억제제의 존재 하에 병렬로 수행된다. NADH-cyt c 산화환원효소 활성은 이들 양이온 중 임의의 존재하에서 감소하지 않는다. 그러나, 숙시네이트-cyt c 옥시도리덕타제 활성은 NaCl의 존재하에서 감소한다. 이 간단한 실험은 다음을 강조합니다 : 1) IMM 유동성 및 CoQ 전달을 감소시키는 Na +의 효과; 2) 초복합 I+III2가 유비퀴논(CoQ) 전달이 IMM 유동성을 저하시킴으로써 영향을 받지 않도록 보호한다는 것; 3) CII와 CIII 사이의 CoQ 전송이 CII와 CIII 사이의 CoQ 전달과 기능적으로 다르다는 것. 이러한 사실은 IMM에서 기능적으로 차별화 된 CoQ 풀의 존재를 뒷받침하며 미토콘드리아의 변화하는 Na + 환경에 의해 조절 될 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
미토콘드리아 산화 인산화 시스템 (OXPHOS)은 미토콘드리아에 의한 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 합성, 반응성 산소 종 (ROS) 생산, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NADH) 또는 숙시네이트와 같은 환원 등가물의 소비를 유도하는 주요 경로이다. OXPHOS 시스템은 다섯 가지 단백질 복합체로 구성됩니다 : 복합체 I (CI)는 NADH를 산화시키고 CoQ를 유비퀴놀 (CoQH2)로 환원시킵니다. 콤플렉스 II (CII)는 숙시네이트를 푸마레이트로 산화시키고 CoQ를 CoQH2로 환원시킵니다. 콤플렉스 III (CIII)은 CoQH2를 다시 CoQ로 산화시켜 시토크롬 c (cyt c)를 감소시킵니다. 마지막으로, 복합 IV (CIV)는 cyt c를 산화시키고 산소를 물로 감소시킵니다. 이른바 전자 수송 사슬(mETC)이라고 불리는 이 산화환원 사슬은 IMM을 가로질러 H+의 펌핑에 결합되며, 이는 아데노신 디포스페이트(ADP)를 ATP로 인산화시키기 위해 복합 V(CV)에 의해 사용되는 전기화학적 구배를 생성한다.
mETC 복합체는 IMM에서 단독으로 있거나 수퍼 콤플렉스라는 사차 구조로 조립 될 수 있습니다. CIV는 CIII와 함께 조립하여III2+IV 또는 Q-레스피라솜(CoQH2의 존재하에 호흡할 수 있기 때문에)1,2,3을 형성하거나 동종이량체 또는 호모올리고머(4)를 형성할 수 있다. CIII는 CI와 상호 작용하여 초복합체 I+III25를 형성할 수 있다. 마지막으로, CI는 또한 Q-respirasome과 상호 작용하여 I + III2 + IV 또는 N- 스피라솜 (NADH 소모를 호흡 할 수 있음) 1,6,7,8,9,10을 구축 할 수 있습니다.
CoQ와 cyt c는 각각 CI/CII에서 CIII로, CIII에서 CIV로 전자를 전달하는 역할을 하는 이동 전자 운반체입니다. 초복합체가 이들 담체에 대해 기능적 국부적 제한을 부과하는지 여부는 지난 20년간 2,7,11,12,13,14,15,16,17 동안 격렬한 논쟁의 문제였다. 그러나 몇몇 독립 그룹은 CoQ 및 cyt c가 IMM의 풀로 기능적으로 분할 될 수 있음을 입증했습니다. CoQ와 관련하여, 기능적으로 CI (CoQ NAD)에 대한 특정 CoQ 풀과 FAD 의존성 효소 (CoQFAD)1,7,12,18,19에 전념하는 또 다른 풀로 분할될 수 있다. 그러나, 부분적으로 분절된 기능적 CoQ 풀의 존재를 분화시키기 위해, 대체 옥시다제(AOX)의 과발현 및 CIII의 부재 하에 CI를 조립할 수 있는 특정 mtDNA 돌연변이체의 생성은 1,19,20개가 요구되었다.
저산소증 동안 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 메커니즘은 최근까지 알려지지 않았다. 급성 저산소증시, CI는 활성/비활성(A/D) 전이를 겪는데, 이는 H+ 펌핑 NADH-CoQ 산화환원효소 활성의 감소를 수반한다. 이러한 H+ 펌핑의 감소는 미토콘드리아 매트릭스를 산성화시키고 미토콘드리아 매트릭스에 칼슘-포스페이트 침전물을 부분적으로 용해시켜 가용성Ca2+를 방출한다. 가용성Ca2+의 이러한 증가는 Na+/Ca2+ 교환기(NCLX)를 활성화시키며, 이는 Na+와 교환하여Ca2+를 밀어낸다. 미토콘드리아 Na+ 증가는 IMM의 내측에서 인지질과 상호작용하여 CII와 CIII 사이의 유동성 및 CoQ 전달을 감소시키고, 최종적으로 산화환원 신호(21)인 슈퍼옥사이드 음이온을 생성한다. 흥미롭게도, CoQ 전달은 CII와 CIII 사이에서만 감소되었지만 CI와 CIII 사이에는 감소하지 않았으며, 1) Na+는 미토콘드리아의 기존 CoQ 풀 중 하나만 변조 할 수 있었다는 것을 강조했다. 2) IMM에는 기능적으로 차별화된 CoQ 풀이 존재한다. 따라서, 미토콘드리아 효소 활성의 연구를 위해 널리 사용되는 프로토콜이 언급된 CoQ 풀의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다.
현재의 프로토콜은 숙시네이트 (즉, CII 기질) 또는 NADH (즉, CI 기질)의 존재 하에서의 흡광도에 의한 CIII의 기질인 산화된 cyt c의 환원의 측정에 기초한다. 동일한 샘플은 두 개로 나뉘며, 그 중 하나는 KCl로 처리되고 다른 하나는 동일한 농도의 NaCl로 처리됩니다. 이런 식으로, Na+가 IMM 유동성을 감소시킨다는 점을 감안할 때, CoQ가 IMM의 고유한 풀에 존재한다면, CI+CIII와 CII+CIII 둘 다 Na+의 존재하에서 감소할 것이다. 그러나 CoQ가 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀에 존재한다면, Na+의 효과는 CII+CIII 활성에 대해 대부분 (또는 만) 명백할 것이지만, CI+CIII에는 미치지 못할 것이다. 최근 발표된21과 같이 Na+는 CII와 CIII 간의 CoQ 전달에만 영향을 미치지만(그림 1C,D), CI와 CIII 간에는 영향을 미치지 않습니다(그림 1A,B).
이 프로토콜은, 기술의 파노플리와 함께, IMM에서 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 확인하는데 사용되어왔으며, 하나는 CI (즉, CoQ NAD)에 전용이고, 다른 하나는FAD 결합 효소 (즉, CoQFAD)에 전념한다 1,3,7; 22 번 논의가 계속되고 있지만 여러 그룹 7,19에 의해 독립적으로 확증되었다는 관찰. 따라서, CI를 초복합체로 수퍼 어셈블리하는 것은 CoQ의 로컬 이동성에 영향을 미치며, 초복합체1,7,13,14,23,24,25 내에서 CIII에 의한 사용을 용이하게 한다.
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Protocol
모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 2010년 9월 22일 유럽 연합 지침(2010/63/UE)과 2013년 2월 1일(53/2013)의 스페인 왕실 법령에 따라 스페인 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III(CNIC)의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 사용 된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
참고: 미토콘드리아 CoQ 풀의 세분화를 연구하기 위한 이 비교 분석은 다음과 같이 기술된다:
1. 단백질 정량화
- 실험 전에 야생형 마우스 간(즉, 미토콘드리아 막)으로부터 분리된 미토콘드리아(26 )를 세 번 동결 및 해동하여 소기관을 반응 기질에 투과성으로 만든다.
- 분리된 미토콘드리아 샘플의 단백질 양을 브래드포드 또는 비친코닌산(BCA) 방법에 의해 정량한다. 브래드포드의 경우, 샘플 2μL를 1x 브래드포드 시약 1mL에 첨가한다.
- 샘플을 각각 20 μg의 네 개의 서브샘플로 분할한다(즉: A, B, C, D; 도 2A).
2. CI+CIII 활성 측정
참고: 프로토콜의 이 부분은 샘플 A와 B를 사용하여 CI+CIII 활동을 측정합니다(그림 2B).
- 샘플 A 및 B를 각각 10 μg의 2개의 서브샘플(즉, A1, A2, B1 및 B2)로 분할한다. 각 서브샘플을 1mL 큐벳에 30μL의 cyt c (10mg/mL), 100mM 말로네이트 10μL와 혼합하고, 37°C에서 최대 980μL(큐벳 A2 및 B2의 경우 979μL)까지 예열된 C1/C2 완충액(표 1)을 첨가한다.
주의: 이 단계는 독성 시약 말로네이트와 시안화칼륨의 사용을 포함합니다.
참고: cyt c (10 mg/mL)는 10 mMK2HPO4 용액 1 mL에 cyt c 10 mg을 혼합하여 신선하게 준비해야 하며, pH는 7.2로 조정되어야 하며, 실험 내내 얼음 속에 유지되어야 합니다. - 큐벳 A1 및 A2에 10μL의 1M KCl을 첨가하고, 큐벳 B1 및 B2에 10μL의 1M NaCl을 첨가한다.
- 1 μL의 1 mM 로테논을 서브샘플 A2 및 B2를 함유하는 큐벳에 첨가한다.
주의: 이 단계는 독성 시약 로테논을 사용하는 것을 포함합니다. - 측정 직전에 10 μL의 NADH (10 mM)를 모든 큐벳에 첨가하십시오.
참고: 10 μL는 큐벳의 단계에서 첨가되는 것이 바람직하므로, 혼합시 반응이 시작된다. - 큐벳을 조심스럽게 세 번 뒤집어 섞는다. 흡광도 큐벳 리더기(UV/VISJASCO 분광광도계)에 보관하십시오.
- 일반에서 측정 > 매개 변수 > 클릭하고 파장 : 550nm 및 시간 : 판독 4 분으로 측정 매개 변수를 설정하십시오. 수락 및 시작 단추를 눌러 실험을 시작합니다.
- 측정이 끝나면 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울 기를 저장합니다. 경사면은 수동으로 수집 할 수도 있습니다.
3. CII+CIII 활동 측정
참고: 프로토콜의 이 부분은 샘플 C와 D를 사용하여 CII+CIII 활동을 측정합니다(그림 2C).
- 샘플 C 및 D를 각각 10μg의 두 개의 서브샘플(즉, C1, C2, D1 및 D2)로 분할합니다. 각 서브샘플을 1 mL 큐벳에 30 μL의 cyt c (10 mg/mL), 1 μL의 1 mM 로테논과 혼합하고, 37°C에서 최대 980 μL까지 예열된 C1/C2 완충액을 첨가한다(큐벳 C2 및 D2의 경우 970 μL).
주의: 이 단계는 독성 시약 시안화 칼륨 및 로테논을 사용하는 것을 포함합니다.
참고: cyt c (10 mg/mL)는 10 mMK2HPO4 용액 1 mL에 cyt c 10 mg을 혼합하여 신선하게 준비해야 하며, pH는 7.2로 조정되어야 하며, 실험 내내 얼음 속에 유지되어야 합니다. - 큐벳 C1 및 C2에 10μL의 1M KCl을 첨가하고, 큐벳 D1 및 D2에 1M NaCl 10μL를 첨가한다.
- 1 μL의 1 mM 안티마이신 A를 서브샘플 C2 및 D2를 함유하는 큐벳에 첨가한다.
주의: 이 단계는 독성 시약 항마이신 A의 사용을 포함한다. - 측정 직전에 10μL의 숙시네이트(1M)를 모든 큐벳에 첨가하십시오.
참고: 10 μL는 큐벳의 단계에서 첨가되는 것이 바람직하므로, 혼합시 반응이 시작된다. - 큐벳을 조심스럽게 섞어서 세 번 뒤집습니다. 흡광도 큐벳 리더기(UV/VIS 분광광도계)에 넣습니다.
- 일반에서 측정 > 매개 변수 > 클릭하고 파장 : 550nm, 시간 : 판독 4 분으로 측정 매개 변수를 설정하십시오. 수락 및 시작 단추를 눌러 실험을 시작합니다.
- 측정이 끝나면 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울 기를 저장합니다. 경사면은 수동으로 수집 할 수도 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 일반적인 결과는 아래에 나와 있습니다(그림 3). 감소된 cyt c 흡광도가 550 nm에서 위치함에 따라, 억제되지 않은 모든 서브샘플은 550 nm에서 흡광도의 증가를 보여줘야 한다. 억제된 서브샘플은 이상적으로 평탄한 선 또는 약간 증가하는 기울기를 보여준다(그림 3). 억제된 하위샘플로부터의 기울기는 억제되지 않은 서브샘플로부터 차감되어야 한다.
샘플 A 및 B는 둘 다 그들의 특파원 억제에 의해 보정되고 NADH:cyt c 산화환원효소 활성을 나타내지만, 유사한 기울기를 갖는다(도 3A). 그러나, 하위샘플 C 및 D는, 둘 다 그들의 특파원 억제에 의해 보정되고 숙시네이트:cyt c 산화환원효소 활성을 나타내지만, 서브샘플 C의 활성이 서브샘플 D의 활성보다 높다는 점에서 다르다(도 3B). 기본 흡광도는 샘플 간에 약간 다를 수 있습니다(그림 3A).
이러한 결과 (즉, 그들의 억제제에 의해 이미 보정된 기울기; 표 2) 사용 된 단백질 양 (0.01 mg)을 a.u./min/mg 단백질로 나눠서 나타낼 수 있습니다. 이 값으로부터, cyt c 감소율은 램버-맥주 법칙(Lamber-Beer law)21을 사용하여 추가로 계산될 수 있다.
중요하게도, 이러한 결과는 몇 가지 요인에 따라 달라질 수 있다: (i) 샘플의 기원. 상이한 조직 및 세포 유형이 OXPHOS 복합체 및 초복합체의 가변 조성을 갖는다는 것을 감안할 때, 절대값 및 상대적 변화는 샘플에 따라 달라질 수 있다. (ii) 상이한 조직이 OXPHOS 복합체 및 수퍼콤플렉스의 가변 조성을 가질 수 있다는 것을 감안할 때, 반응 혼합물에 더 많은 동결-해동된 미토콘드리아(특정 조직의 낮은 절대값을 보상하기 위해)를 첨가하는 것은 이차적인 효과를 가질 수 있으며, 이는 샘플에서 단백질/인지질의 mg당 Na+ 또는 K+의 비율이 감소한다는 것이다. 따라서 미토콘드리아의 양 또는 샘플에 첨가 된 Na + / K + 농도를 변경할 때는주의해야합니다. (iii) 실험간 변동은 동결-해동 주기, 시약 상업적 배치 또는 분리된 미토콘드리아의 다양한 저장 완충액의 지속 기간 및 온도로부터 발생할 수 있다.
그림 1: Na+는 CII와 CIII 사이의 전자 전달을 구체적으로 감소시키지만, CII와 CIII 사이는 감소시키지 않는다. (A) 초복합체 I+III2에서 CoQNAD를 통해 발생하는 NADH와 cyt c 사이의 전자 전달의 개략적인 표현. (B) 초복합체 I+III2에서 CoQNAD를 통해 발생하는 NADH와 cyt c 사이의 전자 전달은 트라미토콘드리아 Na+에 의해 영향을 받지 않는다. (c) CII에서 CoQFAD를 통해 발생하는 숙시네이트와 cyt c 사이의 전자 전달의 개략적인 표현. (d) 초복합체 I+III2에서 CoQFAD를 통해 발생하는 NADH와 cyt c 사이의 전자 전달은 높은 인트라미토콘드리아 Na+에 의해 감소된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 원래 샘플의 세분에서 동역학적 측정에 이르는 프로토콜의 개략적 표현 . (A) 모든 서브샘플의 동일한 기원을 강조하는 서브샘플 분할의 개략적 표현. (B) 서브샘플 A1 및 B1에서 CI+CIII 활성에 대한 시약의 첨가의 연속적인 단계의 계획. 빨간색 원은 NADH를 이상적으로 추가해야 하는 위치를 나타냅니다. 하위 샘플 A2 및 B2와의 유일한 차이점은 후자에 로테논을 추가로 추가한다는 것입니다. (c) 서브샘플 C1 및 D1에서 CII+CIII 활성에 대한 시약의 첨가의 연속적인 단계의 계획. 빨간색 원은 숙시네이트를 이상적으로 추가해야 하는 위치를 나타냅니다. 서브샘플 C2 및 D2와의 유일한 차이점은 후자에 항마이신 A를 추가로 첨가한다는 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: NADH 또는 숙시네이트 첨가에 대한 마우스 간 미토콘드리아 막에 의한 cyt c 감소에 대한 Na+의 효과. (a) NADH를 산화시키는 마우스 간 미토콘드리아 막에 의한 cyt c 감소에 대한 Na+의 효과를 나타내는 대표적인 흔적. (b) 숙시네이트를 산화시키는 마우스 간 미토콘드리아 막 산화에 의한 cyt c 감소에 대한 Na+의 효과를 나타내는 대표적인 흔적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화합물 | 농도 |
| K2HPO4 | 25 밀리지미터 |
| MgCl2 | 5 밀리지미터 |
| 증권 시세 표시기 | 3 밀리지미터 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 2.5 밀리그램/mL |
표 1: C1/C2 완충액의 조성. 완충액 조성물은 몰 농도로 제시된다.
| 예상 요금 | +KCl (평균) | +KCl (SD) | +NaCl (평균) | +NaCl (SD) | 만-휘트니 P 값 |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| 개별 값 | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| 개별 값 | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
표 2: 예상 요금 범위. 각 활동에 대한 예상 값은 임의의 단위로 표시됩니다. +KCl과 +NaCl 사이의 상응하는 통계적 검정이 또한 제시된다. "n"은 반복실험 횟수를 나타냅니다.
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Discussion
이 프로토콜은 부분적으로 분할된 CoQ 풀의 존재를 식별하는 매우 간단한 절차이지만, 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 기질 (즉, NADH 또는 숙시네이트)은 바람직하게는 이들 화합물의 자가산화가 발생할 수 있기 때문에 마지막으로 첨가된다. Cuvette의 뒤집기는 독서를 방해 할 수있는 거품의 형성을 피하기 위해주의해야합니다.
또한, 본 기술은 언급할 가치가 있는 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 측정은 손상되지 않은 미토콘드리아에서 수행되지 않습니다. 따라서, 완충제의 인위적인 함량 및 비율은 미토콘드리아의 천연 환경과의 차이를 초래할 수 있다.
시약은 과량으로 첨가되며, 이들은 무손상 조직에서 기질의 진정한 이용가능성을 나타내지 않을 수 있다.
현재의 방법은 많은 실험실에서 쉽게 구할 수없는 매우 구체적인 유전 모델 및 장비의 생성 및 사용을 의미합니다1. 이 프로토콜은 광범위하게 이용 가능한 시약 및 도구를 사용하여 부분적으로 차별화된 CoQ 풀의 존재를 측정하기 위한 안정적이고 쉬운 방법을 제공합니다. 따라서, 미토콘드리아 질환의 유전 모델을 비교하는 미래의 연구에 적용될 수 있다.
mETC에서 이동 전자 캐리어의 이동성은 여전히 논쟁의 여지가있는 주제25,27이지만, 부분적으로 차별화 된 풀의 존재는 받아 들여지고 있습니다7,12,18,28,29. 최근에, AOX1을 발현하는 몇몇 OXPHOS 돌연변이체의 고분해능 호흡측정법 및 상세한 생화학적 특성화와 천연 지질 환경을 보존하는 정제된 한전자현미경 연구(7)가 논의에 빛을 가져왔다. 이것은 부분적으로 분할 된 기능적 CoQ 풀의 존재에 찬성하는 무거운 논쟁을 제기합니다.
또한, 생리학적 자극은 상이한 CoQ 풀에 의해 조절되는 것으로 나타났다; 특히, 인트라미토콘드리아 Na+에 의해 유도되는 급성 저산소 반응. 저산소증 동안 미토콘드리아에서 더 높은 Na+ 수준은 CII와 CIII 사이의 전자 전달을 감소시키고, CIII의 수준에서 Q 사이클을 분리하고 수퍼옥사이드 음이온을 생성한다. 대조적으로, CII와 CIII 사이의 전자 전달은21을 감소시키지 않았다. 현재 프로토콜은 이러한 결과가 얻어지는 절차를 광범위하게 설명합니다.
추가 조절은 연구 중인 치료가 셀룰레 또는 생체내에서 수행되는 경우, CII, CII 및 CIII의 단리된 복합 활성이며, 이는 그들의 개별적인 양 또는 단일 활성이 치료와 함께 변할 수 있기 때문에 현재의 프로토콜에 적용될 수 있다. 전술한 바와 같이 매우 유사한 절차에 이어서, Na+의 존재 또는 부재 하에서의 이들 단리된 활동(21)의 어떠한 차이도 보이지 않았다. 참고로, Na+는 D/A 전이(30)를 증가시킬 수 있다고 설명되었다. 그러나이 관찰에 사용 된 프로토콜은 제출 토콘드리아 입자 (SMP)의 사용을 포함하는 반면, 우리의 프로토콜은 미토콘드리아 막을 사용하여 IMM을 통해 멤브레인 잠재력의 필요성을 강조합니다30.
동결 - 해동 사이클은 세제가하는 것처럼 막을 용해시키지 않으므로 단일 복합체와 수퍼 콤플렉스가 여전히 인지질 이중층에 부착되어 있다는 점에 유의해야합니다. 이것은 CI 또는 CII를 통한 동결 해동 된 미토콘드리아 산소 소비가 시토크롬 c31의 존재하에 측정 될 수 있다는 사실에 의해 입증됩니다. 또한, CII+CIII 활성에 대한 동결-해동 주기의 효과가 있다면, 그것은 "NaCl 10 mM" 샘플뿐만 아니라 "KCl 10 mM" 샘플에서도 볼 수 있을 것이다. 이것은 측정이 불가능하거나 (CII가 막 분해를 통해 CIII와 분리되기 때문에) K +와 Na + 사이의 차이가 보이지 않는 지점으로 낮아질 것입니다. 그러나, 도 2B에서 보는 바와 같이, 이것은 사실이 아니다. 프로토콜에 KCl을 첨가하는 것은 측정 된 활동에 대한 삼투압 또는 이온 강도의 가능한 효과를 버리도록 설계되었습니다. 두 경우 모두 "10 mM KCl" 샘플과 "10 mM NaCl" 샘플의 최종 삼투압은 동일하며(116 mEq/L), 샘플 간의 유일한 차이점은 10 mM K+ 또는 10 mM Na+의 존재입니다. 그럼에도 불구하고, 완충액으로부터의 K+ 양이온이 효과를 갖는다면, 그것은 "KCl 10 mM" 및 "NaCl 10 mM" 샘플 둘 다에서 나타날 것이고, 그러한 효과는 어느 샘플에서나 식별될 수 없게 만들 것이다.
인지질에 결합하는 다른 양이온의 능력에서 실제로 중요한 것은 각 양이온의 배위 화학과 이온 반경입니다 (우리의 원래 논문21에서 실험적으로 강조 표시된 바와 같이, 이론적으로 Böckmann et al.32). K+가 여섯 개의 평균 배위 수를 표시하는 반면, Na+ 평균 배위 수는 다섯 개이며, 이는 상이한 배위 복합 기하학적 구조를 초래하며, 이는 인지질 이중층(33)에 대한 K+ 및 Na+의 매우 상이한 효과로 변환된다.
또한 K +와 Na +의 이온 반경이 다르다 는 점에 유의해야합니다. K + 의 이온 반경은 280pm인 반면, Na+는 이온 반경이 227pm입니다. 이 차이는 음이온 (또는 zwitterions)과의 상호 작용에 직접적으로 영향을 미치는데, 이는 낮은 이온 반경 (즉, 더 적은 전자 껍질)은 양의 이온성 핵이 여분의 전자 껍질 (즉, 더 높은 이온 반경)을 가진 것처럼 더 많이 노출됨에 따라 음전하를 띤 분자와의 더 강한 상호 작용을 초래하기 때문입니다. 실제로, 모든 양이온은 아마도 인지질과 상호작용할 수 있다; 그러나 특정 화학적 물리적 특성을 가진 사람들 만이 Na +와 같은 인지질 이중층에 특정 영향을 줄 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
기술 지원을 위해 R. Martínez-de-Mena 박사, M. M. Muñoz-Hernandez, A., C. Jimenez 박사 및 E. R. Martínez-Jimenez 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 MICIN: RTI2018-099357-B-I00 및 HFSP (RGP0016/2018)에 의해 지원되었다. CNIC는 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) 및 Pro CNIC Foundation의 지원을 받으며 Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505)입니다. 그림 2는 BioRender.com 로 만들었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
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