Summary
Этот протокол описывает сравнительный анализ с использованием митохондриальных комплексных активностей CI+CIII и CII+CIII при наличии или отсутствии Na+, для изучения существования частично сегментированных функциональных пулов CoQ.
Abstract
Пулы убихинона (CoQ) во внутренней митохондриальной мембране (IMM) частично сегментированы либо сложными I, либо FAD-зависимыми ферментами. Такое деление может быть легко оценено сравнительным анализом с использованием NADH или сукцината в качестве доноров электронов в замороженных-размороженных митохондриях, в которых измеряется снижение цитохрома c (cyt c). Анализ опирается на влияние Na+ на ИММ, уменьшая его текучесть. Здесь мы представляем протокол для измерения активности NADH-цит c оксидоредуктазы и сукцинат-цит c оксидоредуктазы в присутствии NaCl или KCl. Реакции, которые полагаются на смесь реагентов в кювете ступенчатым образом, измеряют спектрофотометрически в течение 4 мин в присутствии Na+ или K+. Ту же смесь выполняют параллельно в присутствии специфических ингибиторов фермента с целью вычитания неспецифического изменения абсорбции. Активность NADH-cyt c оксидоредуктазы не снижается в присутствии ни одного из этих катионов. Однако сукцинат-цистая активность c оксидоредуктазы снижается в присутствии NaCl. Этот простой эксперимент подчеркивает: 1) влияние Na+ на снижение текучести ИММ и перенос CoQ; 2) что суперкомплекс I+III2 защищает перенос убихинона (CoQ) от воздействия снижения текучести ИММ; 3) что передача CoQ между CI и CIII функционально отличается от передачи CoQ между CII и CIII. Эти факты подтверждают существование функционально дифференцированных пулов CoQ в IMM и показывают, что они могут регулироваться изменяющейся средой Na+ митохондрий.
Introduction
Митохондриальная система окислительного фосфорилирования (OXPHOS) является основным путем, стимулирующим синтез аденозинтрифосфата (АТФ), производство активных форм кислорода (АФК) и потребление митохондриями восстановительных эквивалентов, таких как никотинамидадениндинуклеотид (NADH) или сукцинат. Система OXPHOS состоит из пяти белковых комплексов: комплекс I (CI) окисляет NADH и восстанавливает CoQ в убихинол (CoQH2). Комплекс II (CII) окисляет сукцинат в фумарат и восстанавливает CoQ до CoQH2. Комплекс III (CIII) окисляет CoQH2 обратно в CoQ, уменьшая цитохром c (cyt c). Наконец, комплекс IV (CIV) окисляет цист c и уменьшает содержание кислорода в воде. Эта цепь оксидоредукции, так называемая цепь переноса электронов (mETC), связана с перекачкой H+ через ИММ, что создает электрохимический градиент, используемый комплексом V (CV) для фосфорилирования аденозиндифосфата (АДФ) в АТФ.
Комплексы mETC могут быть либо одиночными в IMM, либо собираться в четвертичные структуры, называемые суперкомплексами. CIV может собираться с CIII, образуя III2+IV или Q-респирасому (так как она способна вдыхаться в присутствии CoQH2)1,2,3 или образуя гомодимеры или гомолигомеры 4. CIII может взаимодействовать с CI, образуя суперкомплекс I+III25. Наконец, CI также способен взаимодействовать с Q-респирасомой, создавая I+III2+IV или N-респирасому (так как она может вдыхаться, потребляя NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ и cyt c являются подвижными носителями электронов, отвечающими за перенос электронов из CI/CII в CIII и из CIII в CIV, соответственно. Вопрос о том, налагают ли суперкомплексы функциональное локальное ограничение для этих носителей, был предметом интенсивных дебатов в течение последних двух десятилетий 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Тем не менее, несколько независимых групп продемонстрировали, что CoQ и cyt c могут быть функционально сегментированы в пулы в IMM. В отношении CoQ он может быть функционально сегментирован в определенный пул CoQ для CI (CoQNAD) и другой пул, предназначенный для FAD-зависимых ферментов (CoQFAD)1,7,12,18,19. Однако для того, чтобы дифференцировать существование частично сегментированных функциональных пулов CoQ, потребовалась сверхэкспрессия альтернативной оксидазы (AOX) и генерация специфических мутантов мтДНК, которые могут собирать CI в отсутствие CIII, 1,19,20.
Механизм производства активных форм кислорода (АФК) во время гипоксии был неизвестен до недавнего времени. При острой гипоксии ДИ претерпевает активный/деактивный (A/D) переход, который включает в себя снижение его H+ , перекачивающей NADH-CoQ оксидоредуктазы. Такое снижение накачки H+ подкисляет митохондриальный матрикс и частично растворяет кальциево-фосфатные осадки в митохондриальном матриксе, высвобождая растворимый Ca2+. Это увеличение растворимого Ca2+ активирует теплообменник Na+/Ca2+ (NCLX), который выдавливает Ca2+ в обмен на Na+. Митохондриальное увеличение Na+ взаимодействует с фосфолипидами во внутренней части ИММ, уменьшая его текучесть и перенос CoQ между CII и CIII, в конечном итоге производя супероксидный анион, окислительно-восстановительный сигнал21. Интересно, что перенос CoQ был уменьшен только между CII и CIII, но не между CI и CIII, подчеркивая, что 1) Na+ смог модулировать только один из существующих пулов CoQ в митохондриях; 2) в IMM существуют функционально дифференцированные пулы CoQ. Таким образом, широко используемый протокол для изучения активности митохондриальных ферментов может быть использован для оценки существования упомянутых пулов CoQ.
Текущий протокол основан на измерении восстановления окисленной циты c, субстрата CIII, путем поглощения в присутствии сукцината (т.е. субстрата CII) или NADH (т.е. субстрата CI). Один и тот же образец делится на два, один из которых будет обработан KCl, а другой с одинаковой концентрацией NaCl. Таким образом, учитывая, что Na+ уменьшает текучесть ИММ, если бы CoQ существовал в уникальном пуле в IMM, как CI+CIII, так и CII+CIII уменьшались бы в присутствии Na+. Однако, если бы CoQ существовал в частично сегментированных функциональных пулах CoQ, влияние Na+ было бы в основном (или только) очевидно на активность CII+CIII, но не на CI+CIII. Как недавно опубликовано21, Na+ влияет только на перенос CoQ между CII и CIII (рисунок 1C,D), но не между CI и CIII (рисунок 1A,B).
Этот протокол вместе с целым рядом методов был использован для подтверждения существования частично сегментированных функциональных пулов CoQ в IMM, один из которых посвящен CI (т.е. CoQNAD), а другой - ферментам, связанным с FAD (т.е. CoQFAD)1,3,7; замечание, которое, хотя оно и продолжает обсуждаться22, было независимо подтверждено несколькими группами 7,19. Таким образом, суперсборка CI в суперкомплексы влияет на локальную мобильность CoQ, облегчая его использование CIII в рамках суперкомплекса 1,7,13,14,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены институциональным комитетом по этике Национального центра исследований сердечно-сосудистых заболеваний Карлоса III (CNIC), Испания, в соответствии с Директивой Европейского союза от 22 сентября 2010 года (2010/63/UE) и Испанским королевским указом от 1 февраля 2013 года (53/2013). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и их страдания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот сравнительный анализ для изучения сегментации митохондриальных пулов CoQ описывается следующим образом:
1. Количественная оценка белка
- Заморозьте и разморозьте изолированные митохондрии26 из печени мыши дикого типа три раза (т.е. митохондриальные мембраны) перед экспериментами, чтобы сделать органеллы проницаемыми для реакционных субстратов.
- Количественно оценить количество белка в изолированном образце митохондрий методами Брэдфорда или Бицинхониновой кислоты (BCA). В случае Брэдфорда добавьте 2 мкл образца в 1 мл 1x реагента Брэдфорда.
- Разделите образец на четыре подвыборки по 20 мкг каждая (а именно: A, B, C, D; Рисунок 2А).
2. Измерение активности CI+CIII
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части протокола используются образцы A и B для измерения активности CI+CIII (рисунок 2B).
- Разделите образцы A и B на две подвыборки по 10 мкг каждая (а именно A1, A2, B1 и B2). Смешайте каждый из подвыборок в кювете объемом 1 мл с 30 мкл цит с (10 мг/мл), 10 мкл 100 мМ малоната и добавьте предварительно нагретый буфер C1/C2 (таблица 1) при 37 °C до 980 мкл (979 мкл для кювет A2 и B2).
ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичных реагентов малоната и цианида калия.
ПРИМЕЧАНИЕ: цит c (10 мг/мл) должен быть приготовлен свежим путем смешивания 10 мг cyt c в 1 мл 10 мМ K2HPO4 раствора, рН скорректирован до 7,2, и его необходимо поддерживать во льду на протяжении всего эксперимента. - Добавьте 10 мкл 1 M KCl в кюветах A1 и A2 и добавьте 10 мкл 1 M NaCl в кюветах B1 и B2.
- Добавьте 1 мкл ротенона 1 мМ в кювету, содержащую подвыборки A2 и B2.
ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичного реагента ротенона. - Непосредственно перед измерением добавьте 10 мкл NADH (10 мМ) во все кюветы.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл предпочтительно добавляют на стадии кюветы, поэтому реакция начинается при перемешивании. - Перемешайте кювету, аккуратно перевернув ее три раза. Поместите его в абсорбционный считыватель кюветы (спектрофотометр UV/VISJASCO).
- Нажмите « Измерить > параметры» > «Общие» и установите параметры измерения на длина волны: 550 нм и время: 4 минуты чтения; Нажмите кнопки Принять и Пуск , чтобы начать эксперимент.
- В конце измерения сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения, щелкнув Файл и Сохранить как. Уклон также можно собрать вручную.
3. Измерение активности CII+CIII
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола использует образцы C и D для измерения активности CII+CIII (рисунок 2C).
- Разделите образцы C и D на две подвыборки по 10 мкг каждая (а именно C1, C2, D1 и D2). Смешайте каждый из подобразцов в кювете объемом 1 мл с 30 мкл цит с (10 мг/мл), 1 мкл ротенона 1 мМ и добавьте предварительно нагретый буфер C1/C2 при 37 °C до 980 мкл (970 мкл для кювет C2 и D2).
ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичных реагентов цианистого калия и ротенона.
ПРИМЕЧАНИЕ: цит c (10 мг/мл) должен быть приготовлен свежим путем смешивания 10 мг cyt c в 1 мл 10 мМ K2HPO4 раствора, рН скорректирован до 7,2, и его необходимо поддерживать во льду на протяжении всего эксперимента. - Добавьте 10 мкл 1 M KCl в кюветах C1 и C2 и добавьте 10 мкл 1 M NaCl в кюветах D1 и D2.
- Добавьте 1 мкл 1 мМ антимицина А в кювету, содержащую подвыборки C2 и D2.
ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичного реагента антимицина А. - Непосредственно перед измерением добавьте 10 мкл сукцината (1 М) во все кюветы.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл предпочтительно добавляют на стадии кюветы, поэтому реакция начинается при перемешивании. - Тщательно перемешайте кювету, перевернув ее три раза. Поместите его в абсорбционный считыватель кюветы (УФ/ВИС спектрофотометр).
- Нажмите « Измерить > параметры» > «Общие» и установите параметры измерения на длина волны: 550 нм и время: 4 минуты чтения; Нажмите кнопки Принять и Пуск , чтобы начать эксперимент.
- В конце измерения сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения, щелкнув Файл и Сохранить как. Уклон также можно собрать вручную.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные результаты этого протокола представлены ниже (рисунок 3). Поскольку пониженная абсорбция цит c находится на уровне 550 нм, все раскованные субвыборки должны показывать увеличение абсорбции на 550 нм. Ингибированные подвыборки в идеале показывают плоский или слегка увеличивающийся уклон (рисунок 3). Склоны из ингибированных подвыборок должны быть вычтены из раскованных субпроблей.
Образцы A и B, скорректированные их соответствующим ингибированием и представляющие активность NADH:cyt c оксидоредуктазы, имеют аналогичный наклон (рисунок 3A). Однако подвыборки C и D, скорректированные их соответствующим ингибированием и представляющие сукцинат:активность оксидоредуктазы cyt c, различны тем, что активность подвыборки C выше, чем активность субвыборки D (рисунок 3B). Обратите внимание, что базальная абсорбция может немного отличаться между образцами (рисунок 3A).
Эти результаты (т.е. склоны, уже скорректированные их ингибитором; Таблица 2) может быть представлен путем деления количества используемого белка (0,01 мг) на a.u./мин/мг белка. Исходя из этого значения, скорость редукции циты c может быть дополнительно рассчитана с использованием закона Ламбера-Бира21.
Важно отметить, что эти результаты могут варьироваться в зависимости от нескольких факторов: (i) Происхождение образцов. Учитывая, что различные ткани и типы клеток имеют переменный состав комплексов и суперкомплексов OXPHOS, абсолютные значения и относительные изменения могут варьироваться в зависимости от образцов. (ii) Учитывая, что различные ткани могут иметь переменный состав комплексов и суперкомплексов OXPHOS, добавление большего количества замороженных-размороженных митохондрий (для компенсации более низких абсолютных значений определенной ткани) к реакционной смеси может иметь вторичный эффект, который заключается в том, что соотношение Na+ или K+ на мг белка/фосфолипида в образце уменьшается. Таким образом, следует соблюдать осторожность при изменении количества митохондрий или концентрации Na+/K+ , добавленной к образцу. iii) Межэкспериментальные изменения могут возникать в зависимости от продолжительности и температуры циклов замораживания-оттаивания, коммерческой партии реагентов или изменяющегося буфера хранения изолированных митохондрий.
Рисунок 1: Na+ уменьшает специфически перенос электронов между CII и CIII, но не между CI и CIII. (A) Схематическое представление переноса электронов между NADH и cyt c, происходящего через CoQNAD в суперкомплексе I+III2. (B) Перенос электронов между NADH и cyt c, происходящий через CoQNAD в суперкомплексе I+III2, не зависит от интрамитохондриального Na+. (C) Схематическое изображение переноса электронов между сукцинатом и cyt c, происходящего через CoQFAD в CII. (D) Перенос электронов между NADH и cyt c, происходящий через CoQFAD в суперкомплексе I+III2, уменьшается высоким интрамитохондриальным Na+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схематическое представление протокола от подразделения исходного образца к кинетическому измерению. (А) Схематическое представление деления подвыборки, подчеркивающее одинаковое происхождение всех подвыборок. (B) Схема последовательных этапов добавления реагента для активности CI+CIII в подвыборках A1 и B1. Красный круг представляет место, где в идеале должен быть добавлен NADH. Отметим, что единственным отличием от подвыборок А2 и В2 является дополнительное добавление ротенона в последний. (C) Схема последовательных этапов добавления реагента для активности CII+CIII в подвыборках C1 и D1. Красный круг представляет место, куда в идеале должен быть добавлен сукцинат. Отметим, что единственным отличием с подвыборками С2 и D2 является дополнительное добавление антимицина А в последний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние Na+ на снижение цита c митохондриальными мембранами печени мыши при добавлении NADH или сукцината. (A) Репрезентативные следы, показывающие влияние Na+ на снижение цита C митохондриальными мембранами печени мыши, окисляющими NADH. (B) Репрезентативные следы, показывающие влияние Na+ на восстановление цита c митохондриальными мембранами печени мышей, окисляющими сукцинат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Соединение | Концентрация |
| К2ХПО4 | 25 мМ |
| МгКл2 | 5 мМ |
| КЧН | 3 мМ |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | 2,5 мг/мл |
Таблица 1: Состав буфера C1/C2. Буферный состав представлен в молярных концентрациях.
| Ожидаемые тарифы | +KCl (среднее) | +ККл (СД) | +NaCl (Среднее) | +НаКл (СД) | Значение P Манна-Уитни |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Индивидуальные ценности | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Индивидуальные ценности | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Таблица 2: Диапазоны ожидаемых ставок. Ожидаемые значения для каждого вида деятельности представлены в произвольных единицах. Также представлен соответствующий статистический тест между +KCl и +NaCl. "n" представляет собой число реплик.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя этот протокол представляет собой очень простую процедуру для идентификации существования частично сегментированных пулов CoQ, есть несколько критических шагов, которые необходимо учитывать. Субстраты (т.е. NADH или сукцинат) предпочтительно добавляют последними, поскольку может происходить автоокисление этих соединений. Переворачивание кюветы должно быть осторожным, чтобы избежать образования пузырьков, которые могут помешать чтению.
Кроме того, настоящая методика представляет собой несколько ограничений, о которых стоит упомянуть. Измерения не проводятся в интактных митохондриях. Таким образом, искусственное содержание и пропорция буфера могут привести к различиям с нативной средой митохондрий.
Реагенты добавляются в избытке, и они могут не представлять истинную доступность субстратов в интактных тканях.
Современные методы предполагают создание и использование весьма специфических генетических моделей и оборудования, которые недоступны во многихлабораториях1. Этот протокол обеспечивает надежный и простой в использовании метод измерения существования частично дифференцированных пулов CoQ с использованием широко доступных реагентов и инструментов. Таким образом, возможно, что он может быть применен в будущих исследованиях, сравнивающих генетические модели митохондриальных заболеваний.
Мобильность мобильных носителей электронов в mETC по-прежнему является весьма обсуждаемой темой 25,27, хотя существование частично дифференцированных пулов становится приемлемым 7,12,18,28,29. Недавно респирометрия высокого разрешения и детальная биохимическая характеристика нескольких мутантов OXPHOS, экспрессирующих AOX1, вместе с исследованиями уточненной криоэлектронной микроскопии, сохраняющими естественную липидную среду7, пролили свет на дискуссию. Это выдвигает весомые аргументы в пользу существования частично сегментированных функциональных пулов CoQ.
Кроме того, было показано, что физиологические стимулы регулируются различными пулами CoQ; в частности, острый гипоксический ответ, обусловленный интрамитохондриальным Na+. Более высокие уровни Na+ в митохондриях во время гипоксии уменьшают перенос электронов между CII и CIII, разъединяя цикл Q на уровне CIII и производя супероксидный анион. Напротив, перенос электронов между CI и CIII не уменьшался21. В действующем протоколе подробно разъясняется процедура, с помощью которой были получены эти результаты.
Дополнительные контрольные меры могут быть применены к текущему протоколу, если исследуемое лечение проводится в клетках или in vivo, которые являются изолированными комплексными активностями CI, CII и CIII, поскольку их отдельные количества или отдельные виды деятельности могут варьироваться вместе с лечением. После очень похожей процедуры, описанной выше, различия не были замечены ни в одном из этих изолированных видов деятельности21 в присутствии или отсутствии Na+. Следует отметить, что Na+ может увеличить переход D/A30. Однако протокол, использованный в этом наблюдении, включал использование постохондриальных частиц (SMP), тогда как наш протокол использует митохондриальные мембраны, подчеркивая необходимость мембранного потенциала через IMM для учитываемого эффекта30.
Следует отметить, что циклы замораживания-оттаивания не растворяют мембраны, как это делают моющие средства, поэтому отдельные комплексы и суперкомплексы все еще прикреплены к фосфолипидным бислоям. Об этом свидетельствует тот факт, что потребление кислорода замороженными-размороженными митохондриями через CI или CII может быть измерено в присутствии цитохрома c31. Кроме того, если циклы замораживания-оттаивания влияют на активность CII+CIII, то это будет наблюдаться не только в образцах "NaCl 10 мМ", но и в образцах "KCl 10 мМ". Это сделало бы измерение либо невозможным (поскольку CII был бы отделен от CIII путем мембранного разложения), либо опустилось бы до такой степени, что различия между K+ и Na+ не были бы замечены. Однако, как показано на рисунке 2B, это не так. Добавление KCl в протокол предназначено для отбрасывания возможных эффектов либо осмолярности, либо ионной силы на измеряемую активность. Конечная осмолярность в обоих случаях, образце "10 мМ KCl" и образце "10 мМ NaCl", равна (116 мЭкв/л), и единственное различие между образцами заключается в наличии 10 мМ K+ или 10 мМ Na+. Тем не менее, если бы катионы K+ из буфера имели эффект, он проявлялся бы как в образцах "KCl 10 мМ", так и в образцах "NaCl 10 мМ", что делало бы такой эффект неразличимым ни в одном образце.
В способности различных катионов связывать фосфолипиды действительно важна координационная химия и ионный радиус каждого катиона (как экспериментально подчеркивается в нашей оригинальной статье21 и теоретически в Böckmann et al.32). В то время как K+ отображает среднее координационное число шесть, среднее координационное число Na+ равно пяти, что приводит к другой координационной сложной геометрии, что приводит к очень разным эффектам K+ и Na+ на фосфолипидный бислой33.
Следует также отметить, что ионный радиус K+ и Na+ различны. В то время как K+ имеет ионный радиус 280 пм, Na+ имеет ионный радиус 227 пм. Это различие напрямую влияет на их взаимодействие с анионами (или цвиттерионами), поскольку более низкий радиус иона (т.е. меньшее количество электронных оболочек) приводит к более сильному взаимодействию с отрицательно заряженной молекулой, поскольку положительное ионное ядро подвергается большему воздействию, как если бы оно имело дополнительные электронные оболочки (т.е. более высокий ионный радиус). Действительно, все катионы, возможно, способны взаимодействовать с фосфолипидами; однако только те, которые обладают специфическими химико-физическими свойствами, способны оказывать специфическое воздействие на фосфолипидный бислой, такой как Na+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Р. Мартинеса-де-Мену, М.М. Муньоса-Эрнандеса А., д-ра К. Хименеса и Э.Р. Мартинеса-Хименеса за техническую помощь. Это исследование было поддержано MICIN: RTI2018-099357-B-I00 и HFSP (RGP0016/2018). CNIC поддерживается Институтом спасения Карлоса III (ISCIII), Министром науки, Инноваций и Университетов (MCNU) и Фондом Pro CNIC и является Центром передового опыта Северо Очоа (SEV-2015-0505). Рисунок 2 создан с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A.
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al.
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A.
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A.
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J.
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T.
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
