Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה השוואתית, תוך שימוש בפעילויות מורכבות מיטוכונדריאליות CI+CIII ו-CII+CIII בנוכחות או בהיעדר Na+, כדי לחקור את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית.
Abstract
בריכות יוביקינון (CoQ) בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי (IMM) מחולקות באופן חלקי לאנזימים מורכבים התלויים ב-I או ב-FAD. ניתן להעריך תת-חלוקה כזו בקלות על ידי בדיקה השוואתית באמצעות NADH או סוקסינט כתורמי אלקטרונים במיטוכונדריה מופשרת קפואה, שבה נמדדת הפחתת ציטוכרום c (cyt c). הבדיקה מסתמכת על ההשפעה של Na+ על ה-IMM, ומפחיתה את הנזילות שלו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות NADH-cyt c oxidoreductase ופעילויות succinate-cyt c oxidoreductase בנוכחות NaCl או KCl. התגובות, המסתמכות על תערובת של ריאגנטים בקובט באופן מדורג, נמדדות באופן ספקטרופוטומטרי במהלך 4 דקות בנוכחות Na+ או K+. אותה תערובת מבוצעת במקביל בנוכחות מעכבי האנזים הספציפיים על מנת להפחית את השינוי הלא ספציפי בספיגה. פעילות NADH-cyt c oxidoreductase אינה פוחתת בנוכחות אף אחד מהקטיונים הללו. עם זאת, פעילות succinate-cyt c oxidoreductase פוחתת בנוכחות NaCl. ניסוי פשוט זה מדגיש: 1) את ההשפעה של Na+ בהפחתת נזילות IMM והעברת CoQ; 2) כי סופר-קומפלקס I+III2 מגן על העברת יוביקינון (CoQ) מפני השפעה על ידי הורדת נזילות IMM; 3) כי העברת CoQ בין CI ל- CIII שונה מבחינה פונקציונלית מהעברת CoQ בין CII ל- CIII. עובדות אלה תומכות בקיומן של בריכות CoQ מובחנות מבחינה פונקציונלית ב- IMM ומראות כי ניתן לווסת אותן על ידי סביבת Na+ המשתנה של המיטוכונדריה.
Introduction
מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) היא המסלול העיקרי המניע סינתזת אדנוזין טריפוספט (ATP), ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) וצריכת מקבילות מפחיתות, כגון ניקוטין אדנין דינוקלאוטיד (NADH) או סוקסינט, על ידי מיטוכונדריה. מערכת OXPHOS מורכבת מחמישה קומפלקסים של חלבונים: קומפלקס I (CI) מחמצן את NADH ומפחית את ה-CoQ ליוביקינול (CoQH2). קומפלקס II (CII) מחמצן את הסוקסינט לפומאראט ומפחית את ה-CoQQ ל-CoQH2. קומפלקס III (CIII) מחמצן את CoQH2 בחזרה ל-CoQ, ומפחית ציטוכרום c (cyt c). לבסוף, IV מורכב (CIV) מחמצן את cyt c ומפחית את החמצן למים. שרשרת אוקסידורדוקציה זו, מה שמכונה שרשרת הובלת האלקטרונים (mETC), מצומדת לשאיבה של H+ לרוחב ה-IMM, מה שיוצר גרדיאנט אלקטרוכימי המשמש את V (CV) המורכב כדי לזרחן אדנוזין דיפוספט (ADP) ל-ATP.
קומפלקסים של mETC יכולים להיות לבדם ב-IMM או להתאסף למבנים רבעוניים הנקראים סופר-קומפלקסים. CIV יכול להרכיב עם CIII, וליצור את III2+IV או Q-respirasome (כפי שהוא מסוגל לנשום בנוכחות CoQH2)1,2,3 או יצירת הומודימרים או הומוליגומרים4. CIII יכול לקיים אינטראקציה עם CI, ויוצר את הסופר-קומפלקס I+III25. לבסוף, CI מסוגל גם לקיים אינטראקציה עם Q-respirasome, ובונה את I+III2+IV או N-respirasome (כפי שהוא יכול לנשום לצרוך NADH)1,6,7,7,8,9,10.
CoQ ו-cyt c הם נושאי אלקטרונים ניידים האחראים על העברת אלקטרונים מ-CI/CII ל-CIII, ומ-CIII ל-CIV, בהתאמה. השאלה אם סוכני-על מטילים מגבלה מקומית פונקציונלית על נשאים אלה הייתה נושא לוויכוח עז בשני העשורים האחרוניםעל 2,7,11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, מספר קבוצות עצמאיות הוכיחו כי ניתן לפלח את CoQ ו- cyt c באופן פונקציונלי לבריכות ב- IMM. לגבי ה-CoQ, ניתן לפלח אותו באופן פונקציונלי למאגר CoQ ספציפי עבור CI (CoQNAD) ומאגר נוסף המוקדש לאנזימים תלויי FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. עם זאת, על מנת להבדיל בין קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית, נדרש ביטוי יתר של האוקסידאז החלופי (AOX) ויצירת מוטנטים ספציפיים של mtDNA, שיכולים להרכיב CI בהיעדר CIII, 1,19,20.
המנגנון של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) במהלך היפוקסיה לא היה ידוע עד לאחרונה. בהיפוקסיה חריפה, CI עובר את המעבר הפעיל/דה-אקטיבי (A/D), הכרוך בירידה בפעילות האוקסידורדוקטאז של NADH-CoQ השואבת את ה-H+ . ירידה כזו בשאיבת H+ מחמצצת את המטריצה המיטוכונדרית וממיסה חלקית את משקעי הסידן-פוספט במטריצה המיטוכונדרית, ומשחררת Ca2+ מסיס. עלייה זו ב-Ca2+ המסיס מפעילה את מחליף Na+/Ca2+ (NCLX), אשר מוציא את Ca2+ בתמורה ל-Na+. הגברת Na+ המיטוכונדרית מתקשרת עם פוספוליפידים בצד הפנימי של ה-IMM, מפחיתה את הנזילות שלה ואת העברת ה-CoQ שלו בין CII ל-CIII, ולבסוף מייצרת אניון סופראוקסיד, אות חמצון-חיזור21. באופן מעניין, העברת CoQ רק פחתה בין CII ל-CIII, אך לא בין CI ל-CIII, מה שמדגיש כי 1) Na+ הצליחה לווסת רק אחת מבריכות ה-CoQ הקיימות במיטוכונדריה; 2) קיימות בריכות CoQ מובחנות מבחינה פונקציונלית ב- IMM. לפיכך, פרוטוקול בשימוש נרחב לחקר פעילויות אנזים מיטוכונדריאלי יכול לשמש כדי להעריך את קיומם של בריכות CoQ שהוזכרו.
הפרוטוקול הנוכחי מבוסס על מדידת הפחתה של ציט c מחומצן, המצע של CIII, על ידי ספיגה בנוכחות סוקסינט (כלומר, מצע CII) או NADH (כלומר, מצע CI). אותה דגימה מחולקת לשניים, שאחד מהם יטופל ב- KCl, והשני עם אותו ריכוז של NaCl. בדרך זו, בהתחשב בכך ש-Na+ מקטין את נזילות ה-IMM, אם CoQ היה קיים במאגר ייחודי ב-IMM, גם CI+CIII וגם CII+CIII היו יורדים בנוכחות Na+. עם זאת, אם CoQ היה קיים במאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית, ההשפעה של Na+ הייתה ניכרת בעיקר (או רק) על פעילות CII+CIII, אך לא על CI+CIII. כפי שפורסם לאחרונה21, Na+ משפיע רק על העברת ה-CoQ בין CII ל-CIII (איור 1C,D), אך לא בין CI ל-CIII (איור 1A,B).
פרוטוקול זה, יחד עם שפע של טכניקות, שימשו כדי לאשר את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית ב-IMM, אחד המוקדש ל-CI (כלומר, CoQNAD), ואחר המוקדש לאנזימים הקשורים ל-FAD (כלומר, CoQFAD)1,3,7; תצפית שלמרות שהיא ממשיכה להתווכח22, אומתה באופן עצמאי על ידי כמה קבוצות 7,19. לפיכך, הרכבת העל של CI לתוך פלקסים סופר-קומפלקסים משפיעה על הניידות המקומית של CoQ, ומקלה על השימוש בו על ידי ה-CIII בתוך הסופר-קומפלקס 1,7,13,14,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בעקבות המדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן ואושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של ה- Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), ספרד, בהתאם לדירקטיבת האיחוד האירופי מיום 22 בספטמבר 2010 (2010/63/UE) ועם הצו המלכותי הספרדי מיום 1 בפברואר 2013 (53/2013). כל המאמצים נעשו כדי למזער את מספר בעלי החיים שבהם נעשה שימוש ואת הסבל שלהם.
הערה: בדיקה השוואתית זו לחקר הפילוח של בריכות CoQ מיטוכונדריאליות מתוארת באופן הבא:
1. כימות חלבונים
- להקפיא ולהפשיר את המיטוכונדריה26 המבודדת מכבד עכברים מסוג פרא שלוש פעמים (כלומר, ממברנות מיטוכונדריאליות) לפני הניסוי כדי להפוך את האברונים לחדירים למצעי התגובה.
- לכמת את כמות החלבון של דגימת המיטוכונדריה המבודדת בשיטות ברדפורד או חומצה ביצ'ינצ'ונינית (BCA). במקרה של ברדפורד, הוסף 2 μL של דגימה לתוך 1 מ"ל של 1x מגיב ברדפורד.
- לפצל את המדגם לארבע תת-דגימות של 20 מיקרוגרם כל אחת (כלומר: A, B, C, D; איור 2א).
2. מדידת פעילות CI+CIII
הערה: חלק זה של הפרוטוקול משתמש בדוגמאות A ו-B כדי למדוד פעילות CI+CIII (איור 2B).
- פיצול דגימות A ו-B לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת (כלומר A1, A2, B1 ו-B2). ערבבו כל אחת מתת-הדגימות ב-cuvette של 1 מ"ל עם 30 μL של ציצי c (10 מ"ג/מ"ל), 10 μL של 100 mM malonate, והוסיפו חיץ C1/C2 שחומם מראש (טבלה 1) ב-37 °C עד 980 μL (979 μL עבור cuvettes A2 ו-B2).
אזהרה: שלב זה כולל שימוש בריאגנטים הרעילים מלונט ואשלגן ציאניד.
הערה: יש להכין ציצי c (10 מ"ג/מ"ל) טרי על ידי ערבוב של 10 מ"ג ציט c ב-1 מ"ל של תמיסת 10 mM K2HPO4 , pH מותאם ל-7.2, ויש לשמור עליו בקרח לאורך כל הניסוי. - הוסף 10 μL של 1 M KCl ב- cuvettes A1 ו- A2, והוסף 10 μL של 1 M NaCl ב- cuvettes B1 ו- B2.
- הוסף 1 μL של 1 mM רוטנון לתוך cuvette המכיל תת-דגימות A2 ו- B2.
אזהרה: שלב זה כרוך בשימוש ברוטנון המגיב הרעיל. - ממש לפני המדידה, הוסף 10 μL של NADH (10 mM) לתוך כל cuvettes.
הערה: עדיף להוסיף את ה-10 μL על המדרגה של ה-cuvette, כך שהתגובה תתחיל בערבוב. - ערבבו את הקובט על ידי היפוך זהיר שלה שלוש פעמים. מקם אותו בקורא הקובטים לספיגה (ספקטרופוטומטר UV/VISJASCO).
- לחץ על מדידת פרמטרים > > כללי והגדר את פרמטרי המדידה באורך גל: 550 ננומטר, וזמן: 4 דקות קריאה; לחץ על הלחצנים קבל והתחל כדי להתחיל בניסוי.
- בסוף המדידה, שמור את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה על ידי לחיצה על קובץ ושמירה בשם. ניתן גם לאסוף את השיפוע באופן ידני.
3. מדידת פעילות CII+CIII
הערה: חלק זה של הפרוטוקול משתמש בדוגמאות C ו-D כדי למדוד פעילות CII+CIII (איור 2C).
- פיצול דגימות C ו-D לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת (כלומר C1, C2, D1 ו-D2). מערבבים כל אחת מתת-הדגימות ב-cuvette של 1 מ"ל עם 30 μL של ציצי c (10 מ"ג/מ"ל), 1 μL של 1 mM רוטנון, ומוסיפים מאגר C1/C2 שחומם מראש ב-37 °C עד 980 μL (970 μL עבור cuvettes C2 ו-D2).
אזהרה: שלב זה כולל שימוש בריאגנטים הרעילים אשלגן ציאניד ורוטנון.
הערה: יש להכין ציצי c (10 מ"ג/מ"ל) טרי על ידי ערבוב של 10 מ"ג ציט c ב-1 מ"ל של תמיסת 10 mM K2HPO4 , pH מותאם ל-7.2, ויש לשמור עליו בקרח לאורך כל הניסוי. - הוסף 10 μL של 1 M KCl ב- cuvettes C1 ו- C2, והוסף 10 μL של 1 M NaCl ב- cuvettes D1 ו- D2.
- הוסף 1 μL של 1 mM אנטימיצין A לתוך cuvette המכיל תת-דגימות C2 ו- D2.
אזהרה: שלב זה כרוך בשימוש באנטימיצין ריאגנט רעיל A. - ממש לפני המדידה, הוסיפו 10 μL של סוקסינט (1 M) לכל הקובטות.
הערה: עדיף להוסיף את ה-10 μL על המדרגה של ה-cuvette, כך שהתגובה תתחיל בערבוב. - מערבבים את הקובט בזהירות, הופכים אותו שלוש פעמים. מקם אותו בקורא קובט הספיגה (ספקטרופוטומטר UV/VIS).
- לחץ על מדידת פרמטרים > > כללי והגדר את פרמטרי המדידה באורך גל: 550 ננומטר, וזמן: 4 דקות של קריאה; לחץ על הלחצנים קבל והתחל כדי להתחיל בניסוי.
- בסוף המדידה, שמור את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה על ידי לחיצה על קובץ ושמירה בשם. ניתן גם לאסוף את השיפוע באופן ידני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות אופייניות מפרוטוקול זה מיוצגות להלן (איור 3). מכיוון שספיגת ציט c מופחתת מתמקמת ב-550 ננומטר, כל תת-הדגימות ללא מעצורים חייבות להראות עלייה בספיגה ב-550 ננומטר. תת-דגימות מעוכבות מראות באופן אידיאלי שיפוע שטוח או מעט עולה (איור 3). יש להחסיר מדרונות מתת-דגימות מעוכבות מתת-דגימות חסרות מעצורים.
לדגימות A ו-B, שתיהן מתוקנות על ידי עיכוב הכתב שלהן והן מייצגות את פעילות NADH:cyt c oxidoreductase, יש שיפוע דומה (איור 3A). עם זאת, תת-דגימות C ו-D, שתיהן מתוקנות על ידי עיכוב הכתב שלהן והן מייצגות פעילות succinate:cyt c oxidoreductase, הן שונות, בכך שהפעילות של תת-דגימה C גבוהה יותר מהפעילות של תת-דגימה D (איור 3B). שימו לב שספיגה בסיסית יכולה להיות שונה במקצת בין דגימות (איור 3A).
תוצאות אלה (כלומר, שיפועים שכבר תוקנו על ידי המעכב שלהם; טבלה 2) ניתן לייצג על ידי חלוקת כמות החלבון המשמשת (0.01 מ"ג) כחלבון a.u./min/mg. מערך זה, ניתן לחשב עוד יותר את שיעור הפחתת cyt c באמצעות חוק למבר-בירה21.
חשוב לציין שתוצאות אלה עשויות להשתנות בהתאם למספר גורמים: (i) מקור הדגימות. בהתחשב בכך שלרקמות וסוגי תאים שונים יש הרכב משתנה של קומפלקסים של OXPHOS וסופר-קומפלקסים, הערכים המוחלטים והשינויים היחסיים עשויים להשתנות בין דגימות. (ii) בהתחשב בכך שלרקמות שונות עשוי להיות הרכב משתנה של קומפלקסים של OXPHOS וסופר-קומפלקסים, הוספת מיטוכונדריה קפואה יותר (כדי לפצות על ערכים מוחלטים נמוכים יותר של רקמה מסוימת) לתערובת התגובה עשויה להיות בעלת השפעה משנית, והיא שהיחס בין Na+ או K+ למ"ג של חלבון/פוספוליפיד בדגימה פוחת. לפיכך, יש לנקוט משנה כאשר משנים את כמות המיטוכונדריה או את ריכוז Na+/K+ שנוספו למדגם. (iii) שונות בין-ניסיונית עשויה לנבוע ממשך וטמפרטורה של מחזורי הפשרה בהקפאה, ריאגנטים באצווה מסחרית, או מאגר אחסון משתנה של מיטוכונדריה מבודדת.
איור 1: Na+ מקטין באופן ספציפי את העברת האלקטרונים בין CII ל-CIII, אך לא בין CI ל-CIII. (A) ייצוג סכמטי של העברת האלקטרונים בין NADH ל-cyt c, המתרחשת דרך ה-CoQNAD בסופר-קומפלקס I+III2. (B) העברת אלקטרונים בין NADH לציט c, המתרחשת דרך ה-CoQNAD בסופר-קומפלקס I+III2, אינה מושפעת מ-Na+תוך-מיטוכונדריאלי. (C) ייצוג סכמטי של העברת האלקטרונים בין סוקסינט לציט c, המתרחשת באמצעות CoQFAD ב-CII. (D) העברת אלקטרונים בין NADH ל-cyt c, המתרחשת דרך ה-CoQFAD בסופר-קומפלקס I+III2, מופחתת על-ידי Na+תוך-מיטוכונדריאלי גבוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מחלוקת המשנה של המדגם המקורי למדידה הקינטית. (A) ייצוג סכמטי של חלוקת תת-הדגימה, המדגיש את אותו מקור של כל תת-הדגימות. (B) סכמת השלבים העוקבים של תוספות המגיבים עבור פעילות CI+CIII בתת-דגימות A1 ו-B1. העיגול האדום מייצג את המיקום שבו יש להוסיף NADH באופן אידיאלי. שים לב שההבדל היחיד עם תת-דגימות A2 ו- B2 הוא התוספת הנוספת של רוטנון באחרונה. (C) סכימה של השלבים העוקבים של תוספות המגיבים עבור פעילות CII+CIII בתת-דגימות C1 ו-D1. העיגול האדום מייצג את המיקום שבו יש להוסיף סוקינט באופן אידיאלי. שים לב שההבדל היחיד עם תת-דגימות C2 ו- D2 הוא התוספת הנוספת של אנטימיצין A באחרונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ההשפעה של Na+ על הפחתת cyt c על ידי ממברנות מיטוכונדריאליות של כבד עכברים על תוספת NADH או סוקסינט. (A) עקבות מייצגים המראים את ההשפעה של Na+ על הפחתת cyt c על ידי ממברנות מיטוכונדריאליות של כבד עכברים המחמצנות את NADH. (B) עקבות מייצגים המראים את ההשפעה של Na+ על הפחתת cyt c על ידי ממברנות מיטוכונדריאליות בכבד עכברים המחמצנות את הסוקסינט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| תרכובת | ריכוז |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 מ"מ |
| KCN | 3 מ"מ |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | 2.5 מ"ג/מ"ל |
טבלה 1: הרכב מאגר C1/C2. הרכב המאגר מוצג בריכוזים טוחנים.
| תעריפים צפויים | +KCl (ממוצע) | +KCl (SD) | +NaCl (ממוצע) | +NaCl (SD) | ערך מאן-וויטני P |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| ערכים בודדים | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| ערכים בודדים | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
טבלה 2: טווחי התעריפים הצפויים. הערכים הצפויים עבור כל פעילות מוצגים ביחידות שרירותיות. מוצג גם המבחן הסטטיסטי המתאים בין +KCl ל-+NaCl. "n" מייצג את מספר המשכפלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שפרוטוקול זה מייצג הליך פשוט מאוד לזיהוי קיומם של מאגרי CoQ המפולחים חלקית, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון. מצעים (כלומר, NADH או succinate) רצוי להוסיף אחרון מאז חמצון אוטומטי של תרכובות אלה עשוי להתרחש. ההיפוך של קובט חייב להיות זהיר על מנת למנוע היווצרות של בועות שעלולות להפריע לקריאה.
בנוסף, הטכניקה הנוכחית מציגה כמה מגבלות שראוי להזכיר. המדידות אינן מבוצעות במיטוכונדריה שלמה. לפיכך, התוכן המלאכותי ושיעורו של המאגר עשויים לגרום להבדלים עם הסביבה הטבעית של המיטוכונדריה.
ריאגנטים מתווספים עודף, והם עשויים שלא לייצג את הזמינות האמיתית של מצעים ברקמות שלמות.
השיטות הנוכחיות מרמזות על ייצור ושימוש במודלים וציוד גנטיים ספציפיים מאוד שאינם זמינים בקלות במעבדות רבות1. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה וקלה לביצוע למדידת קיומם של מאגרי ה- CoQ המובחנים חלקית באמצעות ריאגנטים וכלים זמינים באופן נרחב. לפיכך, ייתכן כי הוא עשוי להיות מיושם במחקרים עתידיים המשווים מודלים גנטיים של מחלה מיטוכונדריאלית.
הניידות של מובילי האלקטרונים הניידים ב-mETC היא עדיין נושא שנוי במחלוקת 25,27, אם כי קיומם של מאגרים מובחנים חלקית הופך להיות מקובל 7,12,18,28,29. לאחרונה, נשימה ברזולוציה גבוהה ואפיון ביוכימי מפורט של מספר מוטציות OXPHOS המבטאות AOX1, יחד עם מחקרי מיקרוסקופיה קריו-אלקטרוניים מעודנים המשמרים את השומנים הטבעיים סביבה7, הביאו אור לדיון. זה מציב טיעונים כבדים לטובת קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית.
בנוסף, גירויים פיזיולוגיים הוכחו כמווסתים על ידי בריכות CoQ השונות; בפרט, התגובה ההיפוקסית החריפה המונעת על ידי Na+intramitochondrial. רמות Na+ גבוהות יותר במיטוכונדריה במהלך היפוקסיה מפחיתות את העברת האלקטרונים בין CII ל-CIII, משחררות את מחזור ה-Q ברמה של CIII ומייצרות אניון סופראוקסיד. לעומת זאת, העברת אלקטרונים בין CI ל-CIII לא ירדהב-21. הפרוטוקול הנוכחי מסביר בהרחבה את ההליך שבו התקבלו תוצאות אלה.
ניתן ליישם בקרות נוספות על הפרוטוקול הנוכחי אם הטיפול הנחקר מבוצע ב- cellule או in vivo, שהן הפעילויות המורכבות המבודדות של CI, CII ו- CIII, שכן הכמויות האינדיבידואליות שלהם או פעילויות בודדות עשויות להשתנות יחד עם הטיפול. בעקבות הליך דומה מאוד כפי שתואר לעיל, לא נצפו הבדלים באף אחת מהפעילויות המבודדות הללו21 בנוכחות או בהיעדר Na+. כדי לציין, תואר כי Na+ יכול להגדיל את המעבר D/A30. עם זאת, הפרוטוקול ששימש בתצפית זו כלל שימוש בחלקיקים גישוכונדריים (SMPs), בעוד שהפרוטוקול שלנו משתמש בממברנות מיטוכונדריאליות, מה שמדגיש את הצורך בפוטנציאל הממברנה על פני ה-IMM עבור האפקט המדווח30.
יש לציין כי מחזורי הפשרה-הקפאה אינם ממיסים את הממברנות כפי שעושים דטרגנטים, ולכן קומפלקסים בודדים וסופר-קומפלקסים עדיין מחוברים לפוספוליפידים דו-שכבתיים. עדות לכך היא העובדה כי ניתן למדוד את צריכת החמצן של המיטוכונדריה המופשרת הקפואה באמצעות CI או CII בנוכחות ציטוכרום c31. בנוסף, אם הייתה השפעה של מחזורי הפשרה בהקפאה על פעילות CII+CIII, היא לא הייתה נראית רק בדגימות "NaCl 10 mM", אלא גם בדגימות "KCl 10 mM". זה יהפוך את המדידה לבלתי אפשרית (מכיוון ש-CII יופרד מ-CIII באמצעות פירוק הממברנה) או נמוך יותר לנקודה שבה לא ייראו הבדלים בין K+ ל-Na+ . עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 2B, זה לא המקרה. התוספת של KCl בפרוטוקול נועדה להשליך השפעות אפשריות של אוסמולריות או חוזק יוני על הפעילויות הנמדדות. האוסמולריות הסופית בשני המקרים, דגימת "10 mM KCl" ומדגם "10 mM NaCl", שווה (116 mEq/L) וההבדל היחיד בין הדגימות הוא נוכחות של 10 mM K+ או 10 mM Na+. עם זאת, אם לקטיונים K+ מהמאגר הייתה השפעה, היא הייתה מתבטאת הן בדגימות "KCl 10 mM" והן בדגימות "NaCl 10 mM", מה שהופך השפעה כזו לבלתי ניתנת להבחנה באף אחת מהדגימות.
ביכולתם של הקטיונים השונים לקשור פוספוליפידים, מה שאכן חיוני הוא הכימיה של הקואורדינציה והרדיוס היוני של כל קטיון (כפי שהודגש בניסוי במאמר המקורי שלנו21, ותיאורטית בבוקמן ואחרים 32). בעוד ש-K+ מציג מספר קואורדינציה ממוצע של שישה, מספר הקואורדינציה הממוצע של Na+ הוא חמש, והתוצאה היא גיאומטריה מרוכבת קואורדינציה שונה, המתורגמת להשפעות שונות מאוד של K+ ו-Na+ על דו-שכבתי פוספוליפידי33.
כמו כן יש לציין כי הרדיוס היוני של K+ ו- Na+ שונה. בעוד של-K+ יש רדיוס יוני של 280 pm, ל-Na+ יש רדיוס יוני של 227 pm. הבדל זה משפיע ישירות על האינטראקציה שלהם עם אניונים (או zwitterions), שכן רדיוס יוני נמוך יותר (כלומר פחות קליפות אלקטרונים) גורם לאינטראקציה חזקה יותר עם מולקולה טעונה שלילית מכיוון שהגרעין היוני החיובי חשוף יותר כאילו היו לו קליפות אלקטרונים נוספות (כלומר רדיוס יוני גבוה יותר). ואכן, כל הקטיונים מסוגלים אולי לתקשר עם פוספוליפידים; עם זאת, רק אלה עם תכונות כימיות-פיזיקליות ספציפיות מסוגלים להשפיע באופן ספציפי על דו-שכבתי של פוספוליפידים, כגון Na+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ר. מרטינז-דה-מנה, מ. מ. מוניוז-הרננדז, א., ד"ר ק. חימנז וא.ר. מרטינז-חימנז על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי MICIN: RTI2018-099357-B-I00 ו- HFSP (RGP0016/2018). ה- CNIC נתמך על ידי המכון דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII), השרים דה סיינסיה, Innovación y Universidades (MCNU) וקרן Pro CNIC והוא מרכז המצוינות של סברו אוצ'ואה (SEV-2015-0505). איור 2 נוצר עם BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A.
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al.
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A.
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A.
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J.
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T.
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
