Summary
Aquí, se describe un método para determinar la afinidad de unión (KD) de los anticuerpos radiomarcados a los antígenos inmovilizados. KD es la constante de disociación de equilibrio que se puede determinar a partir de un experimento de unión a la saturación midiendo la unión total, específica e inespecífica de un anticuerpo radiomarcado a varias concentraciones de su antígeno.
Abstract
La determinación de la afinidad de unión (KD) es un aspecto importante de la caracterización de los anticuerpos radiomarcados (rAb). Típicamente, la afinidad de unión está representada por la constante de disociación de equilibrio, KD, y se puede calcular como la concentración de anticuerpos a la que la mitad de los sitios de unión de anticuerpos están ocupados en equilibrio. Este método se puede generalizar a cualquier anticuerpo radiomarcado u otros andamios de proteínas y péptidos. A diferencia de los métodos basados en células, la elección de antígenos inmovilizados es particularmente útil para validar las afinidades de unión después del almacenamiento a largo plazo de anticuerpos, distinguir las afinidades de unión de fragmentos de brazos de región de unión a antígenos (Fab) en construcciones de anticuerpos biespecíficos y determinar si hay variabilidad en la expresión de antígenos entre diferentes líneas celulares. Este método consiste en inmovilizar una cantidad fija de antígeno en pozos específicos en una placa rompible de 96 pocillos. Luego, se bloqueó la unión inespecífica en todos los pocillos con albúmina sérica bovina (BSA). Posteriormente, el rAb se agregó en un gradiente de concentración a todos los pozos. Se eligió un rango de concentraciones para permitir que el rAb alcance la saturación, es decir, una concentración de anticuerpos en la que todos los antígenos están unidos continuamente por el rAb. En pozos designados sin antígeno inmovilizado, se puede determinar la unión inespecífica del rAb. Al restar la unión inespecífica de la unión total en los pocillos con antígeno inmovilizado, se puede determinar la unión específica del rAb al antígeno. La KD del rAb se calculó a partir de la curva de unión de saturación resultante. Como ejemplo, la afinidad de unión se determinó utilizando amivantamab radiomarcado, un anticuerpo biespecífico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las proteínas de transición mesenquimal-epitelial citoplasmática (cMET).
Introduction
Los anticuerpos radiomarcados (rAb) tienen una variedad de usos en medicina. Si bien la mayoría se utilizan en oncología como agentes terapéuticos y de imágenes, existen aplicaciones de imágenes para la inflamación relacionada con la reumatología, la cardiología y la neurología1. Imaging rAbs tiene una alta sensibilidad para detectar lesiones y tiene el potencial de ayudar en la selección del paciente para el tratamiento 2,3,4,5. También se utilizan para la terapia debido a su especificidad para sus respectivos antígenos. En una estrategia conocida como teranóstica, se utiliza el mismo rAb tanto para la imagen como para el tratamiento6.
Idealmente, el anticuerpo elegido para el radiomarcado es uno que ya ha demostrado tener una alta afinidad y especificidad de unión utilizando métodos no radiomarcados. El radiomarcado de anticuerpos se puede lograr a través de la modificación química directa de anticuerpos con un radionúclido que forma enlaces covalentes estables (por ejemplo, yodo radioactivo), o indirectamente a través de la conjugación con quelantes que posteriormente se coordinan con radiometales 7,8. El radiomarcado directo, como con yodo radioactivo, modifica específicamente los residuos de tirosina e histidina en el anticuerpo. Si estos residuos son importantes para la unión de antígenos, entonces esta radioconjugación alteraría la afinidad de unión. Por el contrario, existen múltiples protocolos establecidos para la conjugación y el radiomarcado indirecto de anticuerpos. Por ejemplo, un quelante común utilizado para unir zirconio-89 (89Zr) para la obtención de imágenes PET de anticuerpos es el p-isotiocianatobencil-deferoxamina (DFO), que se conjuga aleatoriamente con residuos de lisina del anticuerpo 9,10. Si hay residuos de lisina en la región de unión al antígeno, la conjugación en estos sitios podría dificultar estéricamente la unión al antígeno y, por lo tanto, comprometer la unión anticuerpo-antígeno. Así, los diferentes métodos de radioconjugación utilizados para el radiomarcado indirecto o directo de anticuerpos pueden afectar potencialmente a la inmunorreactividad, definida como la capacidad del anticuerpo radioconjugado para unirse a su antígeno 7,11. Los métodos de conjugación específicos del sitio pueden eludir esta limitación, pero estas técnicas requieren ingeniería de anticuerpos para incorporar residuos adicionales de cisteína o experiencia en reacciones enzimáticas en residuos de carbohidratos 12,13,14,15,16. Una vez que un anticuerpo está radiomarcado, es importante probar si la inmunorreactividad se retiene como parte de la caracterización del rAb. Una forma de medir la inmunorreactividad es determinar la afinidad de unión del rAb.
El propósito de este protocolo es describir un proceso para determinar la afinidad de unión para rAbs utilizando un ensayo de saturación de radioligando establecido para cuantificar la unión a rAb-antígeno. La tendencia de enlace se describe en la Figura 1. La cantidad de antígeno unido aumentará a medida que se agregue más rAb a una cantidad fija de antígeno inmovilizado. Una vez que todos los sitios de unión a antígenos estén saturados, se alcanzará una meseta, y agregar más rAbs no tendrá ningún efecto sobre la cantidad de antígeno unido. En este modelo, la constante de disociación de equilibrio (KD) es la concentración de anticuerpo que ocupa la mitad de los receptores de antígeno17. El KD representa qué tan bien se une un anticuerpo a su objetivo con un KD más bajo que corresponde a una afinidad de unión más alta. Anteriormente se informó que un rAb ideal debería tener un KD de 1 nanomolar o menos18. Sin embargo, los rAbs más recientes se han desarrollado con KD en el rango nanomolar bajo, y se consideran adecuados para aplicaciones de imágenes no invasivas 19,20,21,22. Otro parámetro que se puede determinar en el ensayo de saturación de radioligandos de rAbs es Bmax, que corresponde a la cantidad máxima de unión a antígenos. Bmax se puede utilizar para calcular el número de moléculas de antígeno si es necesario.
Figura 1: Curva de unión de saturación representativa. El porcentaje de antígeno unido se traza contra el aumento de las concentraciones de anticuerpos agregados a una cantidad fija de antígeno. Las ventanas emergentes muestran la vinculación en varios puntos. Se muestran la concentración y la unión correspondientes a KD y Bmáx., respectivamente. Esta figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este ensayo es particularmente importante para las construcciones de anticuerpos biespecíficos radiomarcados para determinar la KD para cada fragmento de región de unión al antígeno (Fab) del brazo de anticuerpos biespecíficos radiomarcados con sus respectivos antígenos. Este protocolo se puede utilizar para determinar la KD de cada brazo Fab por separado en antígenos inmovilizados para caracterizar de forma independiente si la afinidad de unión de cada brazo Fab por su respectivo antígeno se vio afectada después de la radioconjugación. Este protocolo se demuestra mediante el uso de amivantamab radiomarcado, un anticuerpo biespecífico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las proteínas de transición mesenquimal-epitelial citoplasmática (cMET)19. Los anticuerpos radiomarcados de un solo brazo, donde un brazo Fab se une a EGFR (α-EGFR) o a cMET (α-cMET) y el otro brazo Fab es un control de isotipo, también se utilizaron como ejemplos19. Este protocolo también es apropiado para cualquier anticuerpo radiomarcado con un antígeno conocido que pueda ser inmovilizado. En este protocolo, se agrega una serie de dilución del rAb a una cantidad fija de antígeno inmovilizado en pozos designados específicos para cada brazo Fab del rAb. El rAb también se agrega a los pocillos que solo han sido bloqueados con albúmina sérica bovina (BSA), sin antígeno, para determinar la unión inespecífica. Para determinar la unión específica, la unión inespecífica al antígeno inmovilizado se resta de la unión total de rAb. La curva de unión de saturación resultante se utiliza para determinar KD, como se describió anteriormente.
Una ventaja de este método es una mayor reproducibilidad cuando se utilizan antígenos purificados en comparación con el uso de líneas celulares como fuente de antígenos, dado que los niveles de expresión de antígenos podrían verse afectados durante el cultivo celular y que las diferentes líneas celulares tienen niveles variables de expresión de antígenos. En el caso de los anticuerpos biespecíficos radiomarcados, las líneas celulares que solo expresan uno de los antígenos sin el otro pueden no estar disponibles, lo que haría que la caracterización de la afinidad de unión de los brazos Fab individuales sea muy difícil. En particular, la ventaja clave del método de ensayo de saturación de radioligando sobre los métodos no radiomarcados es la caracterización específica de la afinidad de unión del rAb sin la contribución de la fracción no conjugada del rAb. Según el mejor conocimiento de los autores, actualmente no existen técnicas de purificación para separar el rAb de su anticuerpo no conjugado padre. Dado el tamaño relativamente pequeño del quelante y el radionúclido, su contribución al peso molecular total del rAb es insignificante en cromatografía de exclusión de tamaño. Por lo tanto, el producto generado a partir de cualquier técnica de radiomarcado es casi siempre una mezcla del rAb y su anticuerpo no conjugado padre. La caracterización de la afinidad de unión mediante el ensayo de saturación radiomarcado garantiza que el producto que se está probando sea únicamente el rAb.
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Protocol
NOTA: Consulte la Figura 2 para obtener una representación gráfica del protocolo.
Figura 2: Esquema del protocolo. Las etiquetas de fila y columna se indican como una guía para configurar la placa rompible de 96 pocillos. La unión anticipada se muestra en un pozo de ejemplo para el antígeno y el BSA. La flecha curva designa el rAb que se espera que sea lavado de los pozos con BSA solamente. Esta figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Preparación del búfer
- Preparar 50 mL de tampón de inmovilización (solución acuosa de 50 mM Na2CO3; pH = 9.0).
- Pesar 191 mg de NaHCO3 y 23,9 mg de Na2CO3 sobre papel de pesaje y transferir a un tubo cónico de 50 ml. Agregue 40 ml de agua de 18 MΩ y vórtice para disolver. Ajuste el pH a 9.0 si es necesario antes de llevar el volumen total a 50 ml con 18 MΩ de agua.
- Prepare aproximadamente 200 ml de tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0.05% Tween-20) agregando 200 ml de PBS y luego 100 μL de Tween-20 a una botella de 250 ml.
- Preparar 50 ml de tampón de unión (PBS que contiene 0,05% tween-20 y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA)).
- Pesar 50 mg de BSA sobre papel de pesaje y transferir a un tubo cónico de 50 ml. Agregue 50 ml de PBS y luego 25 μL de Tween-20 al tubo. Vórtice suavemente para mezclar.
- Preparar 50 ml de tampón de bloqueo (3% BSA en PBS).
- Pesar 1,5 g de BSA sobre papel de pesaje y transferir a un tubo cónico de 50 ml. Agregue 50 ml de PBS y vórtice suavemente para mezclar.
NOTA: Se recomienda que todos los búferes se almacenen durante un máximo de 1 semana a 4 °C para obtener los mejores resultados.
- Pesar 1,5 g de BSA sobre papel de pesaje y transferir a un tubo cónico de 50 ml. Agregue 50 ml de PBS y vórtice suavemente para mezclar.
2. Inmovilización de antígenos
- Diluir el antígeno en tampón de inmovilización para alcanzar una concentración de 5 μg/ml.
- Agregue 100 μL por pocillo de antígeno al fondo de 24 pocillos de una placa rompible de fondo plano de 96 pocillos en una matriz de 8 x 3 (columnas 1-3 para las filas A-H). Cubra la placa con cinta de sellado.
NOTA: Asegúrese de que la superficie de la placa del pozo haya sido tratada para maximizar la adsorción de dominios hidrófobos e hidrófilos mixtos. Estas placas pretratadas están disponibles comercialmente. - Incubar a 4 °C durante la noche.
- Al día siguiente, lave el plato 3x con tampón de lavado.
- Invierta la placa rápidamente en el fregadero para desechar el líquido y golpee la placa con una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de líquido.
- Usando una pipeta multicanal, agregue 300 μL por pocillo de tampón de lavado a los pozos que contienen el antígeno. Retire el líquido como se describe en 2.4.1. Repita el paso de lavado un total de tres veces.
3. Bloqueo de sitios no específicos con BSA
- Usando una pipeta multicanal, agregue 300 μL por pozo de tampón de bloqueo a los 24 pozos recubiertos de antígenos y 24 pozos vacíos de la placa de 96 pocillos (columnas 1-6 para las filas A-H).
- Incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la placa con 300 μL por pocillo de tampón de lavado un total de tres veces. Consulte el paso 2.4 para obtener una descripción detallada del lavado de la placa.
4. Diluciones en serie y adición de la solución rAb
PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican radiactividad. Los pasos solo deben ser realizados por personas con capacitación en seguridad radiológica. Los investigadores deben doble guante y realizar pasos con el blindaje adecuado.
- Sintetizar el rAb bajo investigación utilizando el método de elección. Los rAbs utilizados como ejemplo fueron sintetizados como se describió anteriormente19.
NOTA: Este protocolo se centra en la caracterización de un rAb una vez radiomarcado. - Haga diluciones en serie de 8 x 3 veces (designadas para filas A-H en la placa) del rAb en el tampón de unión.
NOTA: Las concentraciones de las diluciones en serie variarán para cada rAb. Los detalles se discuten en la sección Discusión. Si el factor de dilución cambia, el volumen necesario para cada dilución debe recalcularse para asegurar un volumen suficiente para 1) la unión del rAb en cada pozo, 2) la siembra de la siguiente dilución y 3) la alícuota de una solución estándar de rAb para el conteo gamma para medir la radiactividad del rAb total agregado a cada pozo.- Calcular el volumen de stock de rAb necesario para hacer una solución de 1,2 ml de la primera concentración (etiqueta como A).
- Añadir 800 μL de tampón de unión a los tubos de microcentrífuga etiquetados como B, C, D, ... a H. Añadir 1,2 ml menos el volumen calculado en el paso 4.2.1 del tampón de unión a un tubo de microcentrífuga etiquetado como A.
- Añadir el volumen de rAb de stock calculado en 4.2.1 al tubo A. Vórtice suavemente para mezclar y luego girar hacia abajo usando una mini microcentrífuga para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo.
- Añadir 400 μL del tubo A al tubo B. Vórtice para mezclar y luego girar hacia abajo usando una mini microcentrífuga. Repita la adición de B a C, C a D, ..., G a H.
- Agregue 100 μL por pocillo de cada dilución a tres pocillos inmovilizados con antígeno y tres pocillos bloqueados solo con BSA. Por ejemplo, agregue dilución A a los pocillos A1-A3 (antígeno) y A4-A6 (BSA).
- Añadir 100 μL de cada dilución a los tubos de microcentrífuga etiquetados como A std - H std. Guarde estos tubos como estándares de rAb para ser ensayados en el contador gamma.
- Incubar la placa durante 1 h a 37 °C con balanceo suave.
5. Lavar las placas y probar la radiactividad
- Etiquete los tubos de microcentrífuga para cada pozo (A1 a A6, B1 a B6 ... a través de H1-H6). Use dos marcadores de colores diferentes para codificar muestras de colores si lo desea: uno para pozos recubiertos con antígeno y otro para pozos con BSA solamente.
- Aspire el rAb de cada pozo usando un aspirador de vacío.
- Usando una pipeta multicanal, agregue 300 μL de tampón de lavado a cada pozo. Aspira el tampón de lavado. Repita el lavado un total de cinco veces.
- Rompa los pozos en los tubos de microcentrífuga apropiados.
- Cuente la radiactividad en los tubos usando un contador gamma. Cuente primero los tubos con el antígeno (H1, H2, H3 a A1, A2, A3), y luego aquellos con BSA solamente (H4, H5, H6 a A4, A5, A6). Para minimizar la interferencia, cuente por separado los estándares para cada dilución (H std a A std) en un momento diferente.
6. Análisis de datos
NOTA: Los archivos complementarios contienen las correspondientes plantillas de hoja de cálculo y análisis estadístico para analizar y trazar los datos.
- En una hoja de cálculo, calcule el enlace total, específico e inespecífico para cada muestra (consulte la plantilla de hoja de cálculo adjunta como archivo complementario).
- Calcule "Actividad enlazada" como los recuentos por minuto (CPM) de la muestra (obtenidos del contador gamma) divididos por el CPM del estándar apropiado. Calcule "% bound" como actividad enlazada multiplicada por 100.
- Calcule "Total Bound, mol/L" multiplicando "% Bound" con la concentración (mol/L) del rAb añadido. Calcule "Total Bound, mol" multiplicando "Total Bound, mol/L" con el volumen de rAb añadido en litros (0.0001 L).
- Calcule "Specific Binding, mol" restando "Total Bound, mol" de las diluciones de BSA de las diluciones de antígenos de tal manera que A1 se empareje con A4, A2 con A5, A3 con A6, B1 con B4, etc.
- Calcule "Unión inespecífica, mol" restando "Unión específica, mol" de "Unión total, mol" para cada pozo.
- En el software de trazado de análisis estadístico, grafique la concentración de rAb añadido (nmol/L) en el eje x frente a la unión (mol) en el eje y. Cree grupos separados para trazar por triplicar el enlace total, el enlace específico y el enlace no específico. Realice un análisis de ajuste no lineal seleccionando los siguientes parámetros en el software utilizado (Tabla de materiales; consulte la plantilla de análisis estadístico adjunta como archivo complementario).
- Seleccione Nuevo análisis. En Análisis XY, seleccione Regresión no lineal (ajuste de curva).. Asegúrese de que todos los datos estén seleccionados en ¿Analizar qué conjuntos de datos? y, a continuación, seleccione Aceptar.
- En la ficha Modelo , en Enlace - Saturación, seleccione Un sitio - Enlace específico. En la pestaña Confianza , seleccione Identificar ajustes 'ambiguos'. Deje todos los demás parámetros como predeterminados y seleccione Aceptar.
NOTA: Esto calculará KD y Bmax para el enlace total, específico y no específico. La KD de la unión específica es la KD en nmol/L del rAb unido al antígeno.
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Representative Results
Este método calcula la afinidad de unión (KD) para un rAb basado en el ensayo de unión a la saturación donde se agregaron diferentes concentraciones de rAb a una cantidad fija de antígeno inmovilizado. La curva de unión debe seguir el crecimiento logarítmico donde inicialmente es empinado y luego se estanca a medida que el antígeno está saturado. Para garantizar que el KD determinado sea preciso, las concentraciones de rAb deben ser lo suficientemente altas como para alcanzar la saturación. Para este ensayo, los anticuerpos radiomarcados se conjugaron a DFO y se radiomarcaron con 89Zr, como se describió anteriormente19. La Figura 3 muestra gráficos de unión de saturación representativos. El amivantamab radiomarcado, un anticuerpo biespecífico para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la proteína de transición mesenquimal-epitelial citoplasmática (cMET), se unió a las proteínas EGFR (Figura 3A) y cMET (Figura 3B)19. También se muestran gráficos de unión a la saturación para las Fabs radiomarcadas de un solo brazo unidas a las proteínas EGFR (Figura 3C) y cMET (Figura 3D)19. En todas las subfiguras, las curvas de regresión no lineal fueron representativas de la serie de dilución con valores atípicos mínimos de las curvas. La unión específica correspondía a la mayor parte de la vinculación total. Si bien la unión inespecífica fue baja en general, las concentraciones más altas de rAb mostraron una mayor unión inespecífica, lo que indica un posible umbral para la unión inespecífica en este ensayo. Las afinidades de unión de los rAbs estaban en el rango nanomolar esperado. Los valores de KD de 8,4 ± 1,7 nM y 4,2 ± 1,5 nM para el α-EGFR de un solo brazo y el α-cMET, respectivamente, demuestran una afinidad similar por el antígeno objetivo que el rAb biespecífico con valores de KD de 9,9 ± 2,1 nM y 16,9 ± 5,9 nM para EGFR y cMET, respectivamente.
En la Figura 4 se muestran experimentos subóptimos para la unión de α-cMET radiomarcados a proteínas cMET inmovilizadas para demostrar los resultados de parámetros que requieren optimización. En la Figura 4A, el rango de concentración de rAb agregado fue demasiado bajo y no se alcanzó la saturación, como lo indica la curva de unión que no alcanzó una meseta. Estas condiciones dieron como resultado una gráfica lineal de la concentración de rAb añadido frente a rAb unido. Dado que los datos no se ajustan al modelo de regresión no lineal, se determinó que el valor de KD era "ambiguo" en el análisis estadístico. En la Figura 4B, se utilizaron concentraciones demasiado altas para el α-cMET radiomarcado. La saturación se alcanzó como lo indica la meseta horizontal de la curva de unión. Sin embargo, la unión inespecífica contribuye notablemente a la unión total. Estas condiciones dan lugar a una gran cantidad de incertidumbre indicada por un valor de KD de 14,9 nM con un gran intervalo de confianza del 95% de 4,8 - 44,2 nM. Por lo tanto, la optimización del rango de concentración de rAb agregado, como se muestra en la Figura 3D, proporcionaría valores KD más precisos . La curva de unión de saturación se basa en la ecuación de Michaelis-Menten para la cinética de reacción. Una curva es un buen ajuste cuando los puntos se distribuyen aleatoriamente alrededor de la línea de regresión17. Un intervalo de confianza estrecho indica que el valor KD es preciso.
Figura 3: Gráficos de unión de saturación para determinar KD. Curvas de unión de [89Zr]Zr-DFO-amivantamab a (A) proteínas EGFR y (B) cMET, (C) [89Zr]Zr-DFO-α-EGFR a proteína EGFR, y (D) [89Zr]Zr-DFO-α-cMET a proteínas cMET para calcular la afinidad de unión. Las barras de error representan la desviación estándar del anticuerpo unido marcado con 89Zr para cada concentración. La media ± SD de KD y Bmax se muestran a partir de tres experimentos independientes para cada condición. Esta cifra se reutiliza con permiso de Cavaliere et al19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Gráficos de unión de saturación donde KD no se puede determinar con precisión. Unión de [89Zr]Zr-DFO-α-cMET a proteínas cMET. Las barras de error representan la desviación estándar del [89Zr]Zr-DFO-α-cMET enlazado. (A) Las concentraciones de [89Zr]Zr-DFO-α-cMET son demasiado bajas y no se alcanza la saturación. KD no se puede calcular ya que la curva es lineal y no se ajusta al modelo de regresión no lineal. (B) La alta incertidumbre para la unión específica se indica por el amplio intervalo de confianza (IC) del 95% para KD (4,8-44,2 nM). También hay una alta unión inespecífica debido a las altas concentraciones de rAb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivos complementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Como parte del desarrollo de rAbs, es importante asegurarse de que un rAb se una específicamente a su objetivo con alta afinidad de unión. La determinación de la afinidad de unión puede informar si la inmunorreactividad del rAb se ve afectada por la radioconjugación a través del ensayo de saturación de radioligando utilizando antígeno inmovilizado. La determinación de la unión de rAb a BSA se puede utilizar para cuantificar la unión inespecífica para medir la unión específica al antígeno inmovilizado con mayor precisión. Este método prueba la unión de diferentes concentraciones de rAb para generar una curva de unión de saturación para calcular la KD y determinar la afinidad de unión.
Para realizar este ensayo, se debe tener el antígeno para el rAb bajo investigación. El antígeno necesita tener el epítopo al que se une el anticuerpo. En situaciones en las que los nuevos anticuerpos tienen epítopos de unión desconocidos, los métodos no radiomarcados para determinar la afinidad de unión pueden ser más apropiados. Antes de comenzar el experimento, se recomienda una búsqueda bibliográfica. Es probable que los antígenos de interés que se han utilizado previamente en ensayos basados en ELISA sean efectivos para este ensayo.
Dependiendo de la vida media del radionúclido y la sensibilidad del contador gamma, los estándares pueden tardar tiempo en descomponerse a un nivel de radiactividad que esté dentro de los límites cuantitativos del contador gamma. Si se prevé que el nivel de radiactividad es demasiado alto para el contador gamma, diluya las muestras estándar y luego multiplique por el factor de dilución en el análisis de datos. Este paso debe realizarse el día del experimento para evitar la posibilidad de agregación o degradación de anticuerpos que podría resultar en soluciones estándar no homogéneas y lecturas inexactas.
La generación de una curva de saturación con la forma adecuada se basa en la serie de dilución elegida. Este proceso requerirá prueba y error. La incapacidad de generalizar las concentraciones de rAbs es una limitación del protocolo, ya que se espera que todos los rAbs tengan diferentes afinidades de unión para sus antígenos. Este protocolo debe optimizarse para cada rAb. Una vez optimizado, el protocolo debe ser reproducible para el rAb específico. Es posible que sea necesario ajustar tanto el rango de concentración como el factor de dilución en función de la forma de la curva. Dado el rango nanomolar esperado para la unión de anticuerpos, comenzar con la representación más amplia posible de este rango permitirá acercarse a un rango de concentración más estrecho de interés para futuros ensayos. En lugar de ocho diluciones en serie, dieciséis proporcionarían más puntos de datos para comprender el rango de unión. Si se conoce la KD del anticuerpo no conjugado, se recomienda utilizar ese valor como concentración media del rango al diseñar el estudio por primera vez. Dependiendo de la disponibilidad de materiales, tener múltiples ensayos en curso con diferentes rangos de concentración y factores de dilución puede optimizar el protocolo relativamente más rápido. El tiempo de incubación puede ajustarse para garantizar que se alcance la saturación. Además, si la unión es baja incluso en saturación, es posible que no haya suficiente rango de señal para calcular con precisión el KD. Puede ser necesario optimizar la concentración de antígeno inmovilizado. Se puede realizar un estudio preliminar con diferentes concentraciones de antígeno inmovilizado y la concentración de stock de rAb para determinar la señal máxima de unión.
El ensayo de saturación de radioligando es un método establecido y tiene muchos beneficios, en comparación con otros métodos no radiomarcados, como la citometría de flujo o la resonancia de plasmón de superficie (SPR), para determinar la afinidad de unión de rAbs. Los métodos que emplean la detección de anticuerpos no radiomarcados determinan la afinidad de unión de una muestra mixta compuesta por anticuerpos conjugados y no conjugados. En el ensayo de saturación de radioligandos, la única señal registrada es la del conjugado de anticuerpos radiomarcados, que proporciona una KD más precisa para las especies radiomarcadas que afectarían la aplicación biomédica. Esta consideración hace que los resultados del ensayo de saturación de radioligandos y los de las técnicas no radiomarcadas sean prácticamente incomparables, ya que miden diferentes muestras: rAb vs. rAb más anticuerpo parental. Un estudio comparó la afinidad de unión del conjugado anticuerpo-quelante no radiomarcado y el anticuerpo biespecífico parental utilizando SPR en proteínas inmovilizadas. Hubo una diferencia de cinco veces entre los valores de KD del conjugado anticuerpo-quelante y el anticuerpo parental. La diferencia en los valores de KD encontrada entre SPR y un ensayo de saturación en múltiples líneas celulares varió de 10 a 1.000 veces23. El quelante de anticuerpos no radiomarcado es una mezcla de anticuerpos conjugados y no conjugados, mientras que los valores de KD determinados por el ensayo de saturación son solo del anticuerpo conjugado radiomarcado. También hay variación en la expresión de antígenos entre las líneas celulares utilizadas. Por lo tanto, las técnicas no radiomarcadas no se pueden utilizar para validar el ensayo de saturación de radioligando. Sin embargo, una vez determinada la KD del rAb, se puede realizar un ensayo de unión competitiva para determinar las diferencias de unión entre las variantes parental y conjugada del anticuerpo17,21.
El ensayo de saturación de radioligando se puede extender para determinar la unión de saturación del rAb a las células en lugar del antígeno inmovilizado. Usando los mismos conceptos, se pueden agregar diferentes concentraciones de rAb a un número fijo de celdas. El análisis de datos descrito en el protocolo se puede utilizar para determinar la afinidad de unión del rAb a las células, lo que también determinaría Bmax para calcular el número de moléculas de antígeno presentes en la línea celular de interés. Este método también se puede generalizar a otros andamios de proteínas y péptidos radiomarcados para determinar su unión específica a sus objetivos. En conclusión, este protocolo describe el proceso de determinación de la afinidad de unión de los rAbs a los antígenos proteicos inmovilizados. El proceso utiliza técnicas básicas de laboratorio para hacer diluciones en serie del rAb para agregar al antígeno inmovilizado. El aspecto más desafiante es determinar las concentraciones del rAb para generar una curva de unión de saturación con la forma adecuada. Este proceso requiere prueba y error en el desarrollo del ensayo para rAbs individuales, pero luego sería reproducible una vez establecido. La KD calculada se puede utilizar como una métrica de inmunorreactividad como criterio para avanzar con aplicaciones de imagen o terapia, o para refinar la reacción de conjugación anticuerpo-quelato.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a 3D Imaging por la producción de [89Zr]Zr-oxalato y a la Dra. Sheri Moores de Janssen Pharmaceuticals por proporcionar anticuerpos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Gamma Counter | Hidex | Hidex Automatic Gamma Counter | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad | version 9.2; used for statistical analyses in this study | |
| Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates | Thermo Scientific | 473768 | |
| Microplate Sealing Tape | Corning | 4612 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Sodium Bicarbonate | JT Baker | 3506-01 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 |
References
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