Summary
본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.
Abstract
평활근 세포 (SMC)는기도와 폐 동맥의 수축을 매개하여 기류 저항과 폐 순환을 각각 수정하므로 폐 시스템의 항상성에 중요한 역할을합니다. SMC 수축성의 규제 완화는 천식 및 폐 고혈압을 포함한 여러 폐 질환에 기여합니다. 그러나, 제한된 조직 접근과 생체내 SMC 표현형을 유지하기 위한 배양 시스템의 부족으로 인해, 이들 질환에서 탈조절된 SMC 수축성의 기초가 되는 분자 메커니즘은 완전히 확인된 채로 남아 있다. 정밀 절단 폐 슬라이스 (PCLS)는 이러한 기술적 어려움을 우회하는 생체 외 모델을 제공합니다. 살아있는 얇은 폐 조직 절편으로서 PCLS는 자연 환경에서 SMC를 유지하고 SMC 수축을 조절하는 SMC 수축 및 세포 내 Ca2+ 신호전달의 현장 추적을 허용합니다. 여기에서, 상세한 마우스 PCLS 준비 프로토콜이 제공되며, 이는 온전한 기도 및 폐동맥을 보존한다. 이 프로토콜은 폐 엽을 슬라이스하기 전에 두 가지 필수 단계를 포함합니다 : 기관을 통해 저융점 아가로오스로기도를 팽창시키고 우심실을 통해 젤라틴으로 폐 혈관을 채우십시오. 이 프로토콜을 사용하여 제조된 PCLS는 기도 및 폐내 동맥 구획 모두에서 SMC의Ca2+ 매개 수축 조절을 평가하기 위한 생물 검정에 사용될 수 있습니다. 호흡기 질환의 마우스 모델에 적용될 때,이 프로토콜은 SMC의 기능적 조사를 가능하게하여 질병에서 SMC 수축성 조절 완화의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
Introduction
평활근 세포 (SMC)는 폐의 주요 구조 세포 유형으로, 주로기도와 폐 혈관의 배지 벽에 상주합니다. SMC는 발광 구경을 변경하여 공기와 혈류를 조절하는 계약을 체결합니다 1,2. 따라서 SMC의 수축 조절은 공기 환기 및 폐 순환의 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 대조적으로, 비정상적인 SMC 수축성은 천식 및 폐 동맥 고혈압과 같은 폐쇄성 기도 또는 폐 혈관 질환을 유발합니다. 그러나, 폐 SMCs의 기능적 평가는 폐 조직, 특히 폐 2,3의 원위 부분에서의 작은 기도 및 미세혈관에 대한 제한된 접근에 의해 도전 받고 있다. 현재의 솔루션은 기도 수축을 반영하기 위해 Flexivent에 의한 기류 저항을 측정하고, 폐 혈관 수축을 평가하기 위해 우심 카테터 삽입에 의한 폐 동맥 혈압을 검사하는 것과 같은 간접 분석에 의존합니다 4,5. 그러나, 이러한 간접 분석은 구조적 요인에 의해 혼동되고, 전체 폐 규모6,7에서 기도 또는 혈관 반응의 공간적 다양성을 포착하지 못하고, 세포 수준에서 수축 조절에 대한 기계론적 연구에 부적합하다는 것과 같은 여러 단점을 갖는다. 따라서, 단리된 일차 세포, 기관지/기관지 근육 스트립(8,9) 또는 큰 혈관 세그먼트(10)를 사용하는 대안적인 접근법이 시험관내 SMC 연구를 위해 적용되었다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법에도 한계가 있습니다. 예를 들어, 배양 조건(11,12)에서 일차 SMCs의 빠른 표현형 적응은 세포 배양으로부터 생체내 설정으로 소견을 추정하는 것을 문제시한다. 또한, 단리된 근위 기도 또는 혈관 세그먼트 내의 SMCs의 수축성 표현형은 원위 폐 6,7에서 SMCs를 나타내지 않을 수 있다. 또한, 조직 수준에서의 근육력 측정은 수축 조절에 대한 기계론적 통찰력에 필수적인 분자 및 세포 사건과 분리되어 있습니다.
살아있는 폐 조직 절편인 정밀 절단 폐 절편(PCLS)은 근적외선 미세환경(즉, 보존된 다세포 구조 및 상호작용)13에서 폐 SMC를 특성화하기 위한 이상적인 생체외 도구를 제공한다. Placke 박사와 Fisher 박사는 1980 년대14,15 년대에 아가로스 팽창 쥐와 햄스터 폐에서 폐 조각의 제조를 처음 도입 한 이래로,이 기술은 PCLS에 생물 의학 연구를위한 더 높은 품질과 더 큰 다양성을 제공하기 위해 지속적으로 발전해 왔습니다. 한 가지 중요한 개선은 기관을 통한 아가로오스로 인한 폐 인플레이션 외에도 젤라틴 주입에 의한 폐 동맥 보존의 향상입니다. 그 결과, 기도 및 폐동맥 둘 모두는 생체외 평가(16)를 위해 PCLS에서 온전하게 유지된다. 또한, PCLS는 문화에서 오랜 시간 동안 실행 가능합니다. 예를 들어, 마우스 PCLSs는 배양에서 최소 12일 동안 세포 생존력 및 대사에 큰 변화가 없었으며, 뿐만 아니라,17일까지 7일 동안 기도 수축성을 유지하였다. 또한 PCLS는 수축 및 이완 분석을 위해 다양한 크기의 기도 또는 혈관을 유지합니다. 더욱이, 세포 수축성의 결정인자인 SMCs의 세포내 Ca2+ 신호전달은 공초점 또는2-광자 현미경(13)에 의해 이미지화된Ca2+ 리포터 염료로 검정될 수 있다.
폐 연구에서 마우스 모델의 광범위한 적용을 고려할 때, 생체외 폐 연구를 위해 무손상 기도 및 폐동맥을 갖는 마우스 PCLS를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 여기에 기술되어 있다. 준비된 PCLS를 사용하여, 우리는 수축성 또는 이완제 자극에 대한기도 및 폐 동맥 반응을 평가하는 방법을 후속 시연했습니다. 또한, PCLS를 Ca2+ 리포터 염료로 로딩한 다음, 수축성 또는 이완제 반응과 관련된 SMCs의Ca2+ 신호전달을 이미징하는 방법이 또한 기재되어 있다.
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Protocol
모든 동물 보호는 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 이루어졌습니다. 8주령의 야생형 C57/B6 수컷 마우스를 본 연구에 사용하였다.
1. 실험 준비
- 작업 솔루션을 준비하십시오.
- 1x 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS, Ca2+ 및Mg2+ ,pH는 20mM HEPES로 균형을 이룬다, 자료표 참조)을 준비한다. HBSS 용액을 사용하여 PCLS를 준비하고 처리하십시오. PCLS를 준비 할 때 HBSS 용액을 얼음 위에 차갑게 유지하십시오.
- 둘베코의 변형 이글 배지와 F-12 (DMEM-F12)를 항생제 - 항균제 (1:100 부피비, 표 참조)로 보충하여 PCLS의 배양액을 준비하십시오.
- 1.5 % 아가로스와 6 % 젤라틴 용액을 준비하십시오.
- 저융점 (LMP) 아가로스 또는 젤라틴 분말 ( 물질 표 참조)을 HBSS 용액과 별도로 15 mL 멸균 원심분리 튜브 (또는 용액 부피 >10 mL인 경우 50 mL 튜브)에 섞어 최종 농도로 혼합하십시오.
참고: 아가로스 용액의 총 부피 = 5 mL/마우스 x 마우스 수; 젤라틴 용액 = 2 mL/마우스 x 마우스 수. - 분말이 완전히 용해 될 때까지 끓는 물에 용액 튜브를 가열하십시오. 아가로스와 젤라틴 용액을 모두 42°C 수조에 보관하십시오.
참고: 해부 테이블의 가열 램프는 작동 환경을 따뜻하게 유지하고 마우스 폐에 주입되기 전에 아가로스 용액이 응고되는 것을 방지하는 데 유용할 수 있습니다.
- 저융점 (LMP) 아가로스 또는 젤라틴 분말 ( 물질 표 참조)을 HBSS 용액과 별도로 15 mL 멸균 원심분리 튜브 (또는 용액 부피 >10 mL인 경우 50 mL 튜브)에 섞어 최종 농도로 혼합하십시오.
- 한 쌍의 해부 가위, 두 쌍의 곡선 마이크로 해부 포셉 및 한 쌍의 지혈 포셉을 포함한 모든 해부 도구를 70 % 에탄올 용액에 적어도 20 분 동안 잠수하십시오.
- 비브라톰을 준비( 재료 표 참조)하여 폐 조직을 얇은 조각으로 절편성하십시오.
- 기도 또는 혈관 수축 반응을 평가하기 위해 CCD 카메라로 반전 위상차 현미경을 유지하고 맞춤형 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (자료 표 참조)을 사용하여 폐 SMC18에서Ca2+ 신호 전달을 평가하십시오.
2. 아가로스와 젤라틴 용액으로 마우스 폐의 팽창
- 마우스를 안락사시킵니다.
- 마우스를 5% 이소플루란이 있는 플라스틱 챔버(약 750cm3)에 넣는다. 마우스가 적어도 1 분 동안 호흡을 멈출 때까지 챔버에 보관하십시오.
참고: 케타민 (240 mg/Kg) 및 자일라진 (32 mg/Kg)19 또는 펜토바르비탈 (0.3 mL)20의 복강내 주사와 같은 다른 일차 안락사 방법은 흡입된 이소플루란의 대안으로 적용될 수 있다. - 마우스 몸체를 수핀 위치의 해부 보드에 놓습니다. 꼬리, 앞발 및 머리를 25G 주사기 바늘로 고정하여 몸을 제자리에 고정시키고 70 % 에탄올 스프레이로 몸을 소독하십시오.
- 외과 용 가위로 마우스의 복부를 엽니 다 (절개, 길이 ~ 2cm x 너비 2cm). 그런 다음 복부 대동맥을 잘라 혈액량을 고갈시킵니다.
- 마우스를 5% 이소플루란이 있는 플라스틱 챔버(약 750cm3)에 넣는다. 마우스가 적어도 1 분 동안 호흡을 멈출 때까지 챔버에 보관하십시오.
- 아래 단계에 따라 폐 엽을 팽창시킵니다.
- 흉골과 횡격막 위의 양측 열등한 흉곽을 따라 흉강을 조심스럽게 열고 흉강이 열릴 때 폐 엽이 붕괴되는 것을 관찰하십시오.
- 양측 복부 흉곽의 일부를 제거하여 심장을 노출시킵니다. 날카로운 가위 끝을 폐 조직에서 멀리 향하게하여 폐 손상을 피하십시오.
- 포셉을 사용하여 마우스 목의 흉선과 연조직을 분리하여 기관을 노출시킵니다.
- 20G Y형 IV 카테터의 팁이 통과할 수 있도록 기관의 상단부에 작은 구멍(직경 1.2mm) 을 절단합니다(재료 표 참조).
- Y자형 카테터의 어댑터 포트 하나를 0.5mL의 공기로 미리 채워진 3mL 주사기로 연결하고, 다른 포트는 2mL의 따뜻한 1.5% 아가로스 용액(42°C)으로 미리 채워진 3mL 주사기로 연결한다.
- 카테터를 채우기 위해 아가로스 용액을 주입한 다음, 미리 절단된 개구부를 통해 카테터를 5-8 mm 길이의 기관 내로 밀어 넣는다.
- 아가로스 용액을 약 1 mL/5 s로 천천히 주입하십시오. 폐는 근위 - 원위 축을 따라 확장됩니다. 각 폐 엽의 가장자리가 팽창 될 때 주사를 중단하십시오.
참고 : 폐가 파열 될 수 있으므로 폐를 과도하게 팽창시키지 마십시오. 젊은 성인 마우스의 전체 폐를 팽창시키는 아가로스 용액의 부피는 약 1.3 ± 0.1 mL이다. - 다른 주사기에서 0.2-0.3 mL의 공기를 주입하여 카테터 및 전도성 기도의 잔류 아가로스를 원위 폐포 공간으로 밀어 넣습니다.
- 한 쌍의 곡선 지혈 포셉으로 기관을 닫습니다 ( 재료 표 참조).
- 폐 혈관 조직을 채우십시오.
- 1 mL 주사기를 따뜻한 6 % 젤라틴으로 채 웁니다. 바늘 두피 정맥 카테터에 연결하고 카테터를 젤라틴 용액으로 채운 다음 바늘로 열등한 벽에 가까운 우심실에 구멍을 뚫습니다.
- 바늘을 2-3mm 길이의 우심실로 밀어 넣고 바늘 끝을 주요 폐동맥으로 향하게하십시오.
- 젤라틴 용액 0.2 mL를 우심실 및 폐동맥 혈관에 천천히 주입하십시오.
참고 : 폐 엽은 적절한 젤라틴 인플레이션으로 약간 더 창백하게 보입니다. - 주사 후 5분 동안 바늘을 제자리에 두고, 심장과 폐에 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 부어 폐엽을 식힌 다음, 해부보드가 있는 몸체를 4°C 냉장고 또는 얼음 위에 총 10분 동안 놓는다.
- 가위로 주변의 결합 조직에서 마우스 폐와 심장을 제거하십시오. 그런 다음 각 폐엽을 분리하고 얼음 위의 HBSS 용액에 보관하십시오.
3. 폐 엽을 얇은 조각으로 절개하기
- 수퍼접착제로 시편 컬럼 상단에 폐엽을 다듬어 부착하고, 절단 방향이 힐라에서 폐 표면까지 대부분의 기도에 수직이 되도록 로브(그림 1A,B)의 방향을 맞춥니다.
- 신선한 얇은 면도날이있는 비브라톰을 사용하여 폐 엽을 150 μm 조각으로 자릅니다. 차가운 HBSS 용액으로 미리 채워진 100mm 멸균 페트리 접시에 조각을 모으십시오.
주: 슬라이싱을 시작하기 전에 적절한 블레이드 이동 속도와 진동 주파수를 설정하십시오. 압축기의 일반적인 설정은 속도 레벨 4 및 진동 레벨 4입니다. - 슬라이스를 DMEM/F-12 배지(20 슬라이스/15 mL 배지/접시)로 채워진 페트리 접시로 옮기고 실험 전에 하룻밤 동안 37°C 배양기에서 유지한다.
참고: 마우스 PCLS는 기도 수축성 반응을 잃지 않고 약 7일 동안 배양물에서 유지될 수 있다(17). 폐동맥의 수명은 철저히 평가되지 않았습니다. 우리의 관찰에서, 그들은 DMEM / F12 배지에서 적어도 3 일 동안 온전한 구조와 혈관 반응을 유지합니다. 장기간 보관을 위해, 마우스 PCLS를 10% DMSO(바이알 당 1mL 배지에 5개 슬라이스)를 함유하는 DMEM/F12 배지로 채워진 냉동 장치에 넣고, -80°C에서 하룻밤 동안 이소프로필 알콜 충전된 용기에 동결시키고, 수주 내지 수개월 동안 액체 질소에서동결보존할 수 있다.
4. 폐내 기도와 동맥의 수축 반응 분석
- PCLS를 HBSS로 채워진 24웰 배양 플레이트에 각 웰에 하나씩 넣습니다. 우물 중앙에서 PCLS를 찾은 다음 피펫으로 HBSS 용액을 제거하십시오.
- 현미경으로 슬라이스에서 대상 기도 및 용기를 찾은 다음, 미리 절단된 중앙 구멍(직경 2-3 mm)이 있는 나일론 메쉬를 사용하여 슬라이스를 커버하여 표적 영역을 노출시킵니다.
- 메쉬 위에 중공 금속 와셔를 내려 놓고 슬라이스를 제자리에 고정시킵니다(그림 2A).
- 600 μL의 HBSS 용액을 첨가하여 PCLS를 잠급니다. 슬라이스를 10분 동안 쉬고 기도나 선박의 기준선 이미지를 기록합니다.
- 피펫으로 빈 HBSS 용액을 조심스럽게 흡입하고 1 μM의 메타콜린 (MCh) 또는 10 nM의 엔도텔린과 같은 작용제와 함께 HBSS 600 μL를 첨가함으로써 기도 또는 혈관 수축을 유도 하였다 (물질의 표 참조).
참고: 도구 세트 표준으로서의 KCl 자극은 메타콜린 또는 엔도텔린 노출 전에 필요하지 않습니다. 마우스 기도에서 100 mM의 KCl 자극은 단지 작고 불규칙한 기도 수축(10%-15%)을 유도한다20. 마찬가지로, 프라이밍 메타콜린 자극은 동일한 작용제, 예를 들어 메타콜린 또는 세로토닌이 첫 번째 및 반복적 인 노출20,22에서 유사한 기도 수축을 유발한다는 것을 확인했기 때문에 의무적이지 않습니다. - 발광 영역 변화가 평형 상태에 도달할 때까지 현미경으로 반응을 관찰한 다음, 분석을 위해 기도 또는 혈관 이미지를 기록한다.
- 피펫으로 MCh 또는 엔도텔린 용액을 제거하고 동일한 작용제 농도 및 이완제를 갖는 새로운 600 μL HBSS 용액을 첨가하고; 기도 또는 혈관 이완을 관찰하고 기록하십시오.
- 아래 단계에 따라 기도 또는 혈관 반응을 정량화한다.
- NIH가 후원하는 무료 소프트웨어 FIJI에 이미지를로드하십시오.
- 도구 모음에서 다각형 선택을 선택하여 각 프레임의 기도 또는 혈관 내강을 윤곽을 그립니다.
- 분석을 선택> 측정값을 영역 > 설정합니다.
- 분석 > 측정을 선택하여 관심 영역을 정량화합니다. 결과는 통계 분석을 위해 별도의 창에 표시됩니다.
5. 기도 또는 혈관 SMC의Ca2+ 신호전달 분석
- Ca2+ 염료 로딩 완충액을 준비한다.
- Ca2+ 염료, 오레곤 그린 488 BAPTA-1-AM (재료 표 참조), 50 μg (1 바이알)을 10 μL의 DMSO와 함께 용해시킨다.
- 0.2 g의 플루로닉 F-12 분말 ( 물자재 표 참조)을 1 mL의 DMSO에 용해시켜 20% 플루로닉 용액을 생성하였다.
- 20% 플루로닉 용액 10μL를Ca2+ 염료-DMSO 용액 10μL와 혼합한다.
- 200 μM의 설포브로모프탈레인과 함께 HBSS 용액 2 mL에 혼합물 20 μL를 첨가하여 Ca2+ 염료 로딩 버퍼를 만든다(표 참조).
- 15마리의 마우스 PCLS를 2 mL의Ca2+ 로딩 완충액에 넣고 30°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 슬라이스를 실온에서 형광 염료 탈에스테르화를 위해 추가로 30분 동안 100 μM의 설포브로모프탈레인과 함께 HBSS 용액 2 mL로 옮긴다.
- SMC의 Ca2+ 신호를 감지합니다.
- Ca2+ 염료가 장착된 슬라이스를 대형 커버 글래스에 놓습니다.
- 3mL 주사기를 고진공 실리콘 그리스로 채웁니다. 18G 무딘 바늘을 통해 그리스를 짜서 슬라이스 위와 아래의 커버 글라스를 가로 질러 두 개의 평행선을 그립니다.
- 두 그리스 라인 사이에 나일론 메쉬를 사용하여 슬라이스를 덮으십시오. 두 번째 커버 유리를 메쉬 위에 놓아 측면에 그리스로 밀봉된 챔버를 생성합니다(그림 3A).
참고: 나일론 메쉬는 슬라이스를 하단 커버슬립에 부착하여 40x 오일과 같은 높은 크기 반전 목표의 작동 거리 내에 유지하는 데 필수적입니다. - HBSS 또는 작용제 용액을 수동으로 또는 관류 시스템을 통해 피펫팅하여 한쪽 끝에서 챔버에 추가하십시오. 연속 유체 관류의 경우 티슈 페이퍼 또는 진공으로 다른 쪽 끝에서 흡입하여 챔버로부터 유체를 제거하십시오.
- PCLS 챔버를 현미경 무대에 놓습니다. SMC 23의 Ca2+ 신호를 15 또는30 이미지 / s의 레이저 스캔 속도로 맞춤형 공진 스캐닝 공초점 현미경으로 감지하십시오.
참고: 대안적으로, 현재 널리 이용가능한 고속 상용 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 PCLS에서 폐 SMCs의Ca2+ 신호전달 검정에 적용될 수 있다.
- SMCs에서Ca2+ 형광을 정량한다.
- 녹화된 이미지 시퀀스를 FIJI로 로드하고 이미지 > 유형 > 8비트 회색조를 선택합니다.
- 도구 모음에서 사각형 선택을 선택하고 평활근 셀에서 5픽셀 x 5픽셀 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
- 분석 >Ca2+ 형광 강도를 나타내는 평균 회색 값> 측정 설정을 선택합니다.
- SMC 수축에 따라 ROI의 위치가 변경되면 분석 > Ca2+ 형광 강도 측정을 프레임별로 선택합니다.
- SMC의 ROI가 이미지 스택에서 유사한 위치에 유지되면 이미지 > 스택을 선택>Ca2+ 형광 강도의 측정 스택을 선택합니다.
참고: 사용자 지정 작성된 매크로를 연결하여 SMC가 이미지 스택에서 수축과 함께 이동할 때 SMC 내의 ROI를 추적하고 프레임별로 ROI의 Ca2+ 강도(회색 값)를 자동으로 측정할 수 있습니다.
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Representative Results
온전한 폐내 기도와 동맥을 보존하는 마우스 PCLS 제제
150 μm 두께의 PCLS를 반전된 위상차 현미경 하에서 관찰하였다. 마우스 폐에서 전도성 기도는 폐동맥을 동반하며, 힐러스에서 말초 폐까지 이어집니다. 마우스 PCLS에서 대표적인 폐기도-동맥 다발이 도 2B에 도시되어 있다. 기도는 루멘의 내부 표면을 감싸는 활성 실리얼 박동을 가진 입방체 상피 세포에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 대조적으로, 근처의 폐동맥은 편평한 내피에 의해 특징지어진다. 말초 폐장에 도달하면, 전도성 기도는 호흡 덕트와 낭으로 분기하여 작은 acinar 세동맥을 둘러 쌉니다 (그림 2C).
마우스 PCLS를 활용하여 폐기도 및 동맥 수축 평가
메타콜린(MCh, 1 μM) 유도 기도 수축은 도 2B에 입증된다. 기도 수축 반응은 MCh 노출 후 발광 면적 감소의 백분율로 정량화됩니다(그림 2D). 대조적으로, 폐동맥은 MCh 자극에 대한 반응을 나타내지 않는다(도 2B). 기도는 1일 또는 5일 배양 후 PCLS에서 MCh에 대한 유사한 용량 의존적 수축 반응을 유지합니다(그림 2D). PCLS가 엔도텔린(10 nM)에 노출되었을 때, 기도와 폐동맥 모두 수축되고(도 2C,E), 이어서 NOC-5(100 μM)가 이완을 유도하였다(도 2E).
마우스 PCLS를 활용하여 기도 및 동맥 SMC의 Ca2+ 신호전달을 평가합니다.
Ca2+ 염료가 로딩된 PCLS를 공초점 형광 현미경으로 관찰한다. 기도 (도 3B) 및 혈관 (도 3C) 내의 Ca2+ 형광 (도 3C) SMCs는 휴지 상태에서 낮고, 세포내Ca2+ 신호전달의 초점 스파크가 주목할 만하다. 작용제에 노출되면,Ca2+ 형광 강도는 SMC에서 상승하며(그림 3B, C), 보통 한 지점에서 그리고 나서 전체 세포로 전파된다. Ca2+ 형광파는 진동 신호와 동일한 셀에서 반복적으로 나타납니다(그림 3D,E). 일반적으로,Ca2+ 진동의 빈도는 작용제 농도가 고원 수준24에 도달할 때까지 상승함에 따라 증가한다. 기도 SMC 이완은Ca2+ 진동(25)의 감소 또는 중단과 관련된다.
그림 1: 비브라톰 슬라이싱을 위한 마우스 폐엽의 방향. 마우스 폐 엽은 절편에 대해 개별적인 것들로 분리된다. (A) 좌측(1), 우측 두개골(2), 및 꼬리 엽(3)은 샘플 컬럼 상에 평평한 절단면을 고집하기 전에 흰색 점선을 따라 힐룸 근처에서 트리밍된다. 좌엽의 배치는 (4)에 도시되어 있다. (B) 오른쪽 중간 엽은 샘플 컬럼에 직접 접착 될 수 있습니다. 올바른 액세서리 로브는 크기가 작기 때문에 일반적으로 사용되지 않았습니다. 다른 엽의 적절한 방향은 대부분의 기도와 폐 혈관이 PCLS에서 횡단 단면을 제시하도록 보장합니다. 배율 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 마우스 PCLS에서 기도 및 폐동맥의 수축성 및 이완제 반응. (A) 수축 분석을 위해 배양 플레이트 웰에 PCLS를 배치하는 것을 보여주는 개략도. (B) HBSS에서 휴지 및 1 μM 메타콜린 (MCh)에 노출 된 후 HBSS에서 근처의 폐동맥 (검은 화살촉)이있는 기도 (검은 화살표)를 보여주는 대표적인 이미지. (c) 휴식 시 및 10 nM 엔도텔린(Endo)에 노출시 HBSS에서 아시나내 세동맥을 보여주는 대표적인 이미지. (d) 1-일(회색 선) 및 5-일(검정 점선) 배양 후 PCLSs에서 MCh에 대한 용량-의존적 기도 수축성 반응. 각 지점은 두 마리의 마우스로부터의 아홉 개의 기도의 평균 ± SEM을 나타낸다. (e) 10 nM 엔도텔린-유도된 기도 및 폐 동맥 수축, 이어서 100 μM NOC-5, 산화질소 공여체, 유도 이완을 보여주는 대표적인 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PCLS에서 기도 및 폐동맥 SMC의Ca2+ 신호전달. (A) SMCs의 Ca2+ 이미징을 위한 초점면에 PCLS를 보유하는 상부 및 하부 커버 글라스, 그리스 씰 및 나일론 메쉬를 갖는 챔버의 셋업을 보여주는 개략도. (B) 1 μM MCh에 노출된 후 휴지 상태에서의 기도 SMCs의Ca2+ 신호전달을 보여주는 대표적인 형광 이미지. Epi, 상피 세포. (c)Ca2+ 휴지 및 10 nM 엔도텔린(Endo)에 노출된 후 폐동맥 SMCs의 형광 이미지. 굵은 흰색 화살표는 폐동맥의 세로 축을 나타내고 끝 화살표가있는 점선은 동맥 벽 주위의 혈관 SMC의 나선형 분포를 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. 진동 상승은Ca2+ 형광 강도 (Ft), 휴지 조건 (F0)에서의 형광 강도에 대한 비로, 기도에서 SMC에서 1 μM MCh (D) 및 폐동맥 SMC에서 10 nM 엔도텔린 자극 (E)에 반응한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PCLS의 준비에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫째, 고르지 않은 아가로스 분포로부터 조직 경화의 변화를 피하기 위해 폐 엽을 균질하게 팽창시키는 것이 필수적이다. 액체 아가로스가 37°C 이하의 온도에서 얇은 카테터 또는 기도에서 빠르게 겔화됨에 따라, 원위 폐 필드의 결과적인 충전 결함은 폐 조직 강성의 불균형을 증가시키고 비브라톰 섹션 동안 조직 찢어짐을 야기할 수 있다. 따라서, 저융점 아가로스 용액을 수조에서 42°C로 유지하고 해부 테이블에서 가열 램프를 사용하여 빠른 아가로오스 겔화를 피하기 위해 실시할 수 있다. 빠른 주사는 더 높은 순응도를 가진 폐 실질에 더 많은 아가로스를 밀어 넣을 수 있으므로 피할 필요가 있습니다. 수동 아가로스 주사는 보통 약 5-7 초가 걸립니다. 둘째, 아가로스 주입의 끝에서 필요한 단계는 소량의 공기(∼0.2 mL)를 밀어 전도성 기도로부터 원위 폐포 공간으로 아가로오스를 플러시하는 것이다. 그렇지 않으면, 아가로스는 젤을 만들고 기도 수축에 저항하기 위해 루멘에 머무를 것입니다. 폐포 내부의 아가로스 겔화는 제자리에 머물러 있으며 인큐베이터에서 37 ° C에서 다시 녹지 않는다는 점도 주목할 가치가 있습니다. 아가로스 겔은 음의 흉부 내 압력에 의해 유지되는 생체 내에서 폐 조직의 3D 구조를 유지하는데 필수적인 역할을 한다. 셋째, 폐동맥을 젤라틴 용액으로 관류하는 것은 PCLS에서 동맥 내강을 열어 두는 데 필수적입니다. 젤라틴 용액은 조직 절편 동안 화학적 및 물리적 자극에 대한 혈관 수축에 저항하는 기계적 차단제로서 실온에서 겔화된다. 젤라틴 인플레이션이 없으면 폐 조각의 폐동맥은 일반적으로 펜톨아민, 에피네프린 및 니페디핀13,16을 포함한 다량의 혼합 혈관 확장제가있는 경우에도 주변 간질 조직에서 붕괴되고 분리됩니다. 아가로스 겔과는 달리, 젤라틴 겔은 37°C에서 녹고, 밤새 인큐베이션 후에 혈관 내강으로 유출되어, 혈관 반응 분석 전에 동맥 내강에 장애물이 없게 된다.
PCLS가 폐 SMC를 현장에서 보존하고 거의 생체 내 조건에서 수축 기능을 유지함에 따라, SMC 수축의 조절, 특히Ca2+ 의존성 메커니즘(26)을 통한 조절을 조사하는 강력한 플랫폼으로서 적용되어 왔다. 특히, 저배율 다중 채널 공초점 또는 이광자 현미경을 이용하여, 기도 SMCs에서의 작용제-유도된Ca2+ 신호전달 및 연관된 발광 수축이 기계론적 연구(13,20)를 위해 동시에 포착될 수 있다. PCLS 방법을 사용하여 측정된 기도 또는 혈관 반응성은 폐에서의 반응의 염증성 환경 및 신경 신경과민과 같은 폐 환경으로부터의 영향이 없는 세포 특성을 반영할 것으로 예상된다(27,28). 따라서 PLCS는 내재적 대 내재적 차이를 구별하는 데 도움이 되는 실험 시스템을 제공합니다. 보조 SMC 수정. 건강 및 질병 모델에서 SMC의 수축 조절을 조사하는 것 외에도, PCLS는 산후 폐 발달 및 환경 모욕에 대한 대응으로기도 SMC의 기능적 적응을 탐구하기 위해 다양한 연령대에서 수집되었습니다27. 또한, PCLS는 말초에서 근위 폐 분야에 이르기까지 다양한 크기의 기도와 혈관을 함유하고 있어 항상성 및 병원성 자극 하에서 폐 SMC의 수축성을 조절하는 지역별 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 더욱이, 마우스 PCLS가 7일 동안 배양 배지에서 기도 수축성을 보유함에 따라(17), 이들은 사이토카인 또는 바이러스 노출(29)과 같은 SMC 조절 완화에 대한 위험 인자를 검사하거나 검증하기 위한 생체외 모델로서 사용되어 왔다. 마지막으로, PCLS는 혈관 확장 또는 기관지 확장 약물을 스크리닝하는 이상적인 플랫폼을 제공합니다. 특히, PCLS 제제를 사용한 생물검정은 한 마리의 성인 마우스가 수백 개의 폐 절편을 생성할 수 있기 때문에 매우 비용 효율적이다. 대조군 및 치료 그룹에서 이웃 PCLSs를 사용하는 것은 또한 그룹간 샘플 변이로부터의 실험적 편향을 상당히 감소시킨다.
설치류와 인간 폐 해부학의 차이를 고려할 때, 인간 PCLS는 번역 연구를위한보다 강력한 도구입니다. 그러나, 인간 폐 조직, 특히 병든 폐 샘플의 제한된 이용가능성은 여전히 도전과제로 남아 있다. 대조적으로, 마우스 폐 조직, 인간 질병의 마우스 모델, 및 트랜스제닉 마우스 모델은 생물 의학 및 약리학 연구에 널리 적용되어, 마우스 PCLS를 접근 가능하고 질병 관련 시스템(13,30)으로 만든다. 또한, 폐동맥 보존은 마우스 PCLS 제제에서만 성공적이었으며, 이는 폐고혈압과 같은 폐혈관 질환에서 혈관 조절 완화를 탐구하는 독특한 도구이다. 따라서, 임의의 질병 모델과 관련된 주의 사항에도 불구하고, 마우스 PCLS 제제를 위한 프로토콜은 건강 및 질병에서 기도 및 폐동맥을 조사하기 위한 생체외 플랫폼을 확립하는데 매우 중요하다. 우리와 다른 사람들은 인간 PCLS 31,32,33,34에 대한 폐 연구를보고했습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 인간 PLCS 제제의 프로토콜은 2 %의 더 높은 아가로스 농도, 더 많은 아가로스 용액 (하나의 폐에 대해 3 L) 및 훨씬 더 큰 크기의 카테터를 아가로스 주사를 위해 주, 로바 또는 분절 기관지를 캐뉼레이트하는 것을 제외하고는 마우스와 유사합니다. 마우스 PLCS 준비에 대한 경험은 인간의 폐 슬라이스 준비에 엄청난 도움이됩니다.
폐 SMC 연구에서 PCLS 제제를 사용하는 수많은 이점에도 불구하고,이 기술의 한계를 인식하는 것이 중요합니다. 첫째, PCLS는 주기적으로 폐 실질과기도를 스트레칭하는 생리적 호흡주기가 부족한 정적 시스템으로 남아 있습니다. 또한 혈관 SMC에 맥박 압력을 발생시키고 내피 세포에 전단력을 발생시키는 혈액 순환을 포함하지 않습니다. PCLS의 이러한 기계적 변화는 SMC의 수축 조절을 수정할 수 있습니다. PCLSs에서 공기 환기 및 혈액 순환의 완전한 확립은 달성 할 수 없지만, 적어도 기도 SMC 연구를 위해, 다양한 장치35,36,37로 조직 섹션을 스트레칭함으로써 "호흡"PCLS를 생성하기위한 지난 십 년 동안 막대한 노력이 이루어졌습니다. 둘째, 폐 SMC는 제한된 기간 동안 만 수축성을 유지합니다. 이 시간 제한은 PLCS가 SMC의 아급성 변화, 예를 들어 기도 SMC를 수정하는 데 6-7 일 이상 걸리는 과정을 모델링하는 것을 방지합니다. 이전의 연구에 따르면 SMC는 수축성 단백질의 감소로 인해 수축성을 상실하므로 추가 저용량의 인슐린으로 배양 배지를 최적화하면17 일 동안 기도 SMC 수축을 유지하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, PCLS의 플라스미드 또는 siRNA 형질감염에 의한 폐 SMCs의 유전자 조작은 여전히 성공적이지 못하다. PCLS에서 SMC를 형질감염시키는 기술적 장벽은 폐 SMC의 기계론적 연구를 위한 형질전환 동물 모델에 대한 대안적인 접근법을 제공하기 때문에 확실히 추가 조사를 보증한다. 더 중요한 것은,이 기술은 번역 연구에서 인간 폐 SMC의 유전 적 조절을 달성하기위한 독점적 인 조치입니다.
이 기사에서는 잘 보존 된 기도 및 폐 동맥을 가진 마우스 PCLS를 준비하고 수축 및Ca2+ 신호 분석에 적용하는 것에 대한 포괄적 인 설명을 제공합니다. PCLS 제제는 살아있는 폐 환경에서 평활근 기능을 지원하면서 기계론적 연구가 현장에서 세포에 접근할 수 있도록 합니다. 이 독특한 기능으로 인해 PCLS 준비는 건강 및 질병에서 폐기도 및 혈관 SMC를 연구하기위한 다목적 도구가되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
- Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
- Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
- Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
- McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
- Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
- Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
- Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
- Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
- Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
- Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
- Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
- Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
- Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Sanderson, M. J., Parker, I.
- Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Sanderson, M. J., et al.
- Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
- Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
- Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
- Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
- Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
- Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
- Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
- Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
- Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
- Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).
