Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Abstract

Düz kas hücreleri (SMC), sırasıyla hava akımı direncini ve pulmoner dolaşımı değiştirmek için hava yolunun ve intrapulmoner arterin kasılmasına aracılık eder, bu nedenle pulmoner sistemin homeostazında kritik bir rol oynar. SMC kontraktilitesinin deregülasyonu, astım ve pulmoner hipertansiyon dahil olmak üzere çeşitli akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Bununla birlikte, sınırlı doku erişimi ve in vivo SMC fenotiplerini korumak için kültür sistemlerinin eksikliği nedeniyle, bu hastalıklarda deregüle SMC kontraktilitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak tanımlanmaya devam etmektedir. Hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), bu teknik zorlukları ortadan kaldıran bir ex vivo model sunar. Canlı, ince bir akciğer dokusu kesiti olarak PCLS, SMC'yi doğal ortamda tutar ve SMC kontraktilitesini düzenleyen SMC kontraksiyonunun ve hücre içi Ca2+ sinyallemesinin yerinde izlenmesini sağlar. Burada, sağlam hava yollarını ve intrapulmoner arterleri koruyan ayrıntılı bir fare PCLS hazırlama protokolü sağlanmaktadır. Bu protokol, akciğer lobunu dilimlemeye maruz bırakmadan önce iki temel adımı içerir: trakeadan düşük erime noktalı agaroz ile hava yolunu şişirmek ve pulmoner damarları sağ ventrikülden jelatin ile doldurmak. Bu protokol kullanılarak hazırlanan PCLS, hem hava yolu hem de intrapulmoner arteriyel kompartmanlarda SMC'nin Ca2 + aracılı kontraktil regülasyonunu değerlendirmek için biyotahliller için kullanılabilir. Solunum yolu hastalıklarının fare modellerine uygulandığında, bu protokol SMC'nin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlar, böylece hastalıklarda SMC kontraktilitesi deregülasyonunun altında yatan mekanizma hakkında fikir verir.

Introduction

Düz kas hücresi (SMC), öncelikle hava yollarının ve pulmoner damarların medya duvarında bulunan, akciğerde önemli bir yapısal hücre tipidir. SMC'ler luminal kalibreyi değiştirmek için büzülür, böylece hava ve kan akışını düzenler 1,2. Bu nedenle, SMC'lerin kontraktil regülasyonu, hava ventilasyonu ve pulmoner dolaşımın homeostazını korumak için esastır. Buna karşılık, anormal SMC kontraktilitesi obstrüktif hava yolunu veya astım ve pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıkları tetikler. Bununla birlikte, akciğer SMC'lerinin fonksiyonel değerlendirmesi, akciğer dokusuna, özellikle de akciğerin distal kısmındaki küçük hava yollarına ve mikrodamarlara sınırlı erişim nedeniyle zorlanmıştır 2,3. Mevcut çözümler, hava yolu daralmasını yansıtmak için Flexivent ile hava akımı direncini ölçmek ve pulmoner vazokontraksiyonu değerlendirmek için sağ kalp kateterizasyonu ile pulmoner arteriyel kan basıncını kontrol etmek gibi dolaylı testlere başvurmaktadır 4,5. Bununla birlikte, bu dolaylı tahlillerin, yapısal faktörler tarafından karıştırılması, tüm akciğer skalası 6,7'deki hava yolunun veya vasküler yanıtların mekansal çeşitliliğini yakalayamaması ve hücresel düzeyde kontraktil regülasyonun mekanik çalışması için uygun olmaması gibi birçok dezavantajı vardır. Bu nedenle, SMC çalışması için in vitro olarak izole primer hücreler, trakea/bronş kas şeritleri 8,9 veya büyük vaskülersegmentler 10 kullanılarak alternatif yaklaşımlar uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin de sınırlamaları vardır. Örneğin,11,12 kültür koşulundaki primer SMC'lerin hızlı bir fenotipik adaptasyonu, bulguları hücre kültüründen in vivo ortamlara tahmin etmeyi sorunlu hale getirmektedir. Ek olarak, izole proksimal hava yolu veya vasküler segmentlerdeki SMC'lerin kontraktil fenotipi, distal akciğer 6,7'deki SMC'leri temsil etmeyebilir. Dahası, doku seviyesindeki kas kuvveti ölçümü, kasılma regülasyonuna mekanik bakış açısı için gerekli olan moleküler ve hücresel olaylardan ayrışmış olarak kalır.

Canlı bir akciğer dokusu kesiti olan hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), pulmoner SMC'leri yakın in vivo mikro ortamda (yani, korunmuş çok hücreli mimari ve etkileşim) karakterize etmek için ideal bir ex vivo araç sağlar13. Dr. Placke ve Fisher, 1980'lerde agarozla şişirilmiş sıçan ve hamster akciğerlerinden akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ilk kez14,15'te tanıttığından beri, bu teknik, PCLS'lere biyomedikal araştırmalar için daha yüksek kalite ve çok yönlülük sağlamak için sürekli olarak geliştirilmiştir. Önemli bir gelişme, trakea yoluyla agarozlu akciğer enflasyonuna ek olarak, jelatin infüzyonu ile pulmoner arteriyel korumanın arttırılmasıdır. Sonuç olarak, ex vivo değerlendirme16 için PCLS'de hem hava yolu hem de pulmoner arterler sağlam tutulur. Ayrıca, PCLS kültürde uzun süre uygulanabilir. Örneğin, fare PCLS'lerinin kültürde en az 12 gün boyunca hücre canlılığı ve metabolizmasında önemli bir değişiklik olmadı ve ayrıca 7 güne kadar hava yolu kontraktilitesini korudular17. Ek olarak, PCLS kasılma ve gevşeme tahlilleri için farklı boyutlarda hava yolları veya damarlar tutar. Ayrıca, hücre kontraktilitesinin belirleyici faktörü olan SMC'lerin hücre içi Ca2+ sinyalizasyonu, bir konfokal veya 2-foton mikroskobu13 tarafından görüntülenen Ca 2+ muhabir boyaları ile test edilebilir.

Fare modelinin akciğer araştırmalarında kapsamlı bir şekilde uygulanması göz önüne alındığında, burada ex vivo akciğer araştırması için sağlam hava yolları ve intrapulmoner arterlere sahip fare PCL'lerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Hazırlanan PCLS'leri kullanarak, konstrüktif veya gevşetici uyaranlara karşı hava yolu ve pulmoner arteriyel yanıtların nasıl değerlendirileceğini gösterdik. Ek olarak, PCLS'yi Ca 2+ muhabir boyası ile yükleme ve daha sonra kasılma veya gevşetici yanıtlarla ilişkili SMC'lerin Ca2+ sinyallemesini görüntüleme yöntemi de tanımlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan bakımı, Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygundu. Bu çalışmada 8 haftalık vahşi tip C57/B6 erkek fareler kullanılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

  1. Çalışma çözümünü hazırlayın.
    1. 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini hazırlayın (HBSS, Ca 2+ ve Mg 2+ ile ve pH20 mM HEPES ile dengelenmiştir, Malzeme Tablosuna bakınız). PCLS'yi hazırlamak ve işlemek için HBSS çözümünü kullanın. PCLS'leri hazırlarken HBSS solüsyonunu buz üzerinde soğuk tutun.
  2. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ve F-12'yi (DMEM-F12) bir antibiyotik-antimikotik ajanla destekleyerek PCLS'nin kültür ortamını hazırlayın (1:100 hacim oranı, bakınız Malzeme Tablosu).
  3. % 1.5 agaroz ve% 6 jelatin çözeltisi hazırlayın.
    1. Düşük erime noktalı (LMP) agaroz veya jelatin tozunu (bakınız Malzeme Tablosu) HBSS çözeltisi ile ayrı ayrı 15 mL steril santrifüj tüplerinde (veya çözelti hacmi >10 mL) 50 mL tüplerde) nihai konsantrasyonlara karıştırın.
      NOT: Agaloz çözeltisinin toplam hacmi = 5 mL/fare x fare sayısı; jelatin çözeltisi = 2 mL / fare x fare sayısı.
    2. Çözelti tüplerini, toz tamamen çözünene kadar kaynar suda ısıtın. Hem agaroz hem de jelatin çözeltilerini 42 °C su banyosunda tutun.
      NOT: Diseksiyon masasındaki bir ısıtma lambası, çalışma ortamını sıcak tutmak ve agaroz çözeltisinin fare akciğerine enjekte edilmeden önce katılaşmasını önlemek için yararlı olabilir.
  4. Bir çift diseksiyon makas, iki çift kavisli mikro diseksiyon forseps ve bir çift hemostatik forseps dahil olmak üzere tüm diseksiyon aletlerini, sterilizasyon için en az 20 dakika boyunca% 70 etanol çözeltisine batırın.
  5. Akciğer dokusunu ince dilimler halinde bölmek için bir vibratomu hazır tutun (bkz.
  6. Hava yolu veya vasküler kontraktil yanıtları değerlendirmek için CCD kameralı ters faz kontrastlı bir mikroskop ve pulmoner SMC'lerde Ca 2+ sinyallemesini değerlendirmek için özel yapım bir lazer taramalı konfokal mikroskop (bakınız Malzeme Tablosu) bulundurun18.

2. Fare akciğerlerinin agaroz ve jelatin çözeltisi ile şişirilmesi

  1. Fareyi ötenazileştirin.
    1. Fareyi% 5 izofluran içeren plastik bir odaya (yaklaşık 750cm3) yerleştirin. Fareyi en az 1 dakika boyunca nefes almayı bırakana kadar odada tutun.
      NOT: İntraperitoneal ketamin (240 mg/Kg) ve ksilazin (32 mg/Kg)19 veya pentobarbital (0.3 mL)20 enjeksiyonu gibi diğer primer ötenazi yöntemleri, inhale izoflurana alternatif olarak uygulanabilir.
    2. Fare gövdesini sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Kuyruğu, ön pençeleri ve kafayı 25 G şırınga iğneleriyle sabitleyerek vücudu yerinde sabitleyin ve% 70 etanol spreyi ile vücudu sterilize edin.
    3. Farenin karnını cerrahi makasla kesin (kesi, ~2 cm uzunluğunda x 2 cm genişliğinde). Ardından, kan hacmini tüketmek için abdominal aortu kesin.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek akciğer loblarını şişirin.
    1. Göğüs boşluğunu diyaframın üzerindeki sternum ve bilateral inferior göğüs kafesi boyunca dikkatlice açın ve göğüs boşluğu açıldığında akciğer loblarının çöktüğünü gözlemleyin.
    2. Kalbi açığa çıkarmak için bilateral ventral göğüs kafeslerinin bir kısmını çıkarın. Keskin makas ucunu akciğer dokusundan uzağa işaret ederek akciğer hasarından kaçının.
    3. Trakeayı açığa çıkarmak için fare boynundaki timus ve yumuşak dokuyu ayırmak için forseps kullanın.
    4. Trakeanın üst ucunda, 20 G Y şeklinde bir IV kateterin ucunun geçişine izin veren küçük bir delik (1,2 mm çapında) kesin (bkz.
    5. Y şeklindeki kateterin bir adaptör portunu 0,5 mL hava ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya ve diğer portu 2 mL sıcak% 1,5 agaroz çözeltisi (42 ° C) ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
    6. Kateteri doldurmak için agaroz çözeltisi enjekte edin ve ardından kateteri önceden kesilmiş açıklıktan 5-8 mm uzunluğunda trakeaya itin.
    7. Agaroz çözeltisini yavaşça yaklaşık 1 mL / 5 s'de enjekte edin. Akciğer, proksimal-distal eksen boyunca genişleyecektir. Her akciğer lobunun kenarı şişirildiğinde enjeksiyonu durdurun.
      NOT: Akciğeri aşırı şişirmeyin, çünkü bu onu yırtabilir. Genç yetişkin bir farenin tüm akciğerini şişirmek için agaroz çözeltisinin hacmi yaklaşık 1.3 ± 0.1 mL'dir.
    8. Kateterdeki ve iletken hava yollarındaki artık agarozu distal alveol boşluğuna itmek için diğer şırıngadan 0.2-0.3 mL hava enjekte edin.
    9. Klipsle trakeayı bir çift kavisli hemostatik forseps ile kapatın (bkz.
  3. Pulmoner vaskülatürü doldurun.
    1. 1 mL'lik bir şırıngayı ılık% 6 jelatin ile doldurun. Bir iğne derisi damar kateterine bağlayın, kateteri jelatin çözeltisi ile doldurun ve ardından sağ ventrikülü iğne ile inferior duvara yakın delin.
    2. İğneyi 2-3 mm uzunluğunda sağ ventriküle itin ve iğne ucunu ana pulmoner artere doğrultun.
    3. 0.2 mL jelatin çözeltisini yavaşça sağ ventrikül ve pulmoner arteriyel damarlara enjekte edin.
      NOT: Akciğer lobları uygun jelatin şişirmesi ile biraz daha solgun görünür.
    4. İğneyi enjeksiyondan sonra 5 dakika yerinde tutun, kalp ve akciğere buz gibi soğuk HBSS çözeltisi dökerek akciğer loblarını soğutun, ardından vücudu diseksiyon tahtası ile 4 ° C'lik bir buzdolabına veya toplam 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
    5. Fare akciğerini ve kalbini çevredeki bağ dokularından makasla çıkarın. Daha sonra, her akciğer lobunu ayırın ve buz üzerinde HBSS çözeltisinde saklayın.

3. Akciğer loblarının ince dilimlere ayrılması

  1. Numune kolonunun üstündeki akciğer lobunu süper yapıştırıcı ile kesin ve takın ve kesme yönünün hiladan akciğer yüzeyine kadar çoğu hava yoluna dik olmasını sağlamak için lobu (Şekil 1A, B) yönlendirin.
  2. Akciğer lobunu 150 μm dilimler halinde kesmek için taze ince bir tıraş bıçağı ile bir vibratom kullanın. Dilimleri soğuk HBSS çözeltisi ile önceden doldurulmuş 100 mm steril Petri kaplarında toplayın.
    NOT: Dilimlemeye başlamadan önce uygun bıçak hareket hızını ve salınım frekansını ayarlayın. Bir Compresstom için tipik bir ayar Hız seviyesi 4 ve Salınım seviyesi 4'tür.
  3. Dilimleri DMEM/F-12 kültür ortamı (20 dilim/15 mL orta/çanak) ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın ve deneylerden önce gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde saklayın.
    NOT: Fare PCLS'leri hava yolu kontraktil yanıtlarını kaybetmeden yaklaşık 7 gün boyunca kültürde tutulabilir17. Pulmoner arterlerin ömrü tam olarak değerlendirilmemiştir. Gözlemlerimizde, DMEM / F12 ortamında en az 3 gün boyunca sağlam yapı ve vazoreaksiyonu korurlar. Uzun süreli depolama için, fare PCLS'leri% 10 DMSO (şişe başına 1 mL ortamda 5 dilim) içeren DMEM / F12 ortamı ile doldurulmuş kriyovyallere yerleştirilebilir, gece boyunca -80 ° C'de izopropil alkol dolu bir kapta dondurulabilir ve haftalarcaila 21. aylar boyunca sıvı azotta kriyo-korunabilir.

4. İntrapulmoner hava yolları ve arterlerin kontraktil yanıtlarının analizi

  1. PCLS'leri HBSS dolgulu 24 delikli bir kültür plakasına, her bir kuyucuğa bir tane yerleştirin. PCLS'yi kuyunun ortasına yerleştirin, ardından HBSS solüsyonunu bir pipetle çıkarın.
  2. Mikroskop altındaki dilimde hedef hava yolunu ve kabı bulun, ardından hedef alanı ortaya çıkarmak için önceden kesilmiş merkezi bir deliğe (2-3 mm çapında) sahip naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün.
  3. Dilimleri yerinde tutmak için ağın üzerine içi boş bir metal yıkayıcı yerleştirin (Şekil 2A).
  4. PCLS'yi suya batırmak için 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin. Dilimi 10 dakika dinlendirin, ardından hava yollarının veya gemilerin temel görüntülerini kaydedin.
  5. Boş HBSS solüsyonunu bir pipetle dikkatli bir şekilde emerek ve 1 μM metakolin (MCh) veya 10 nM endotelin gibi bir agonistle 600 μL HBSS ekleyerek hava yolunu veya vasküler kontraksiyonu indükleyin (bkz.
    NOT: Alet seti standardı olarak KCl stimülasyonu, metakolin veya endotel maruziyetinden önce gerekli değildir. Fare hava yollarında 100 mM KCl stimülasyonu sadece küçük ve düzensiz bir hava yolu kasılmasına neden olur (%10-%15)20. Benzer şekilde, aynı agonistin, örneğin metakolin veya serotoninin, ilk ve tekrarlayan maruziyetlerde benzer hava yolu kasılmasını tetiklediğini doğruladığımız için bir astarlama metakolin stimülasyonu zorunlu değildir20,22.
  6. Luminal alan değişimi dengeleyici bir duruma ulaşana kadar mikroskop altında reaksiyonu gözlemleyin ve ardından analiz için hava yolunu veya vasküler görüntüleri kaydedin.
  7. MCh veya endotelin solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve aynı agonist konsantrasyonuna ve gevşeticiye sahip yeni bir 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin; hava yolunu veya vasküler gevşemeyi gözlemleyin ve kaydedin.
  8. Aşağıdaki adımları izleyerek hava yolunu veya vasküler reaksiyonu ölçün.
    1. Görüntüleri NIH sponsorluğundaki özgür yazılım FIJI'ye yükleyin.
    2. Her çerçevedeki hava yolunu veya vasküler lümeni ana hatlarıyla belirtmek için araç çubuğunda Poligon Seçimi'ni seçin.
    3. Analiz Et > Ölçümleri > Ayarla'yı seçin.
    4. İlgi alanını ölçmek için Analiz > Ölçü'yü seçin. Sonuçlar istatistiksel analiz için ayrı bir pencerede gösterilir.

5. Hava yolu veya vasküler SMC'lerin Ca2+ sinyalizasyonunun analizi

  1. Ca2+ boya yükleme tamponunu hazırlayın.
    1. Ca2+ boya, Oregon Green 488 BAPTA-1-( Malzeme Tablosuna bakınız), 50 μg (bir şişe) 10 μL DMSO ile çözün.
    2. % 20'lik bir Pluronik çözelti oluşturmak için 0.2 g Pluronik F-12 tozunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL DMSO'da çözün.
    3. 10 μL% 20 Pluronik çözeltiyi, 10 μL Ca2+ boya-DMSO çözeltisi ile karıştırın.
    4. 200 μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine 20 μL karışım ekleyerek Ca 2+ boya yükleme tamponu yapın (bkz.
  2. 2 mL Ca 2+ yükleme tamponuna 15 fare PCL'si yerleştirin ve 1 saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Daha sonra dilimleri, oda sıcaklığında floresan boya deesterifikasyonu için 30 dakika daha 100 μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine taşıyın.
  3. SMC'lerin Ca2+ sinyalizasyonunu tespit edin.
    1. Ca2+ boya yüklü dilimleri büyük bir kapak camına yerleştirin.
    2. 3 mL'lik bir şırıngayı yüksek vakumlu silikon gres ile doldurun. Gresi 18 G körelmiş bir iğneden sıkarak dilimin üstündeki ve altındaki kapak camı boyunca iki paralel çizgi çizin.
    3. İki gres hattı arasında naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün. Yanlarda gresle kapatılmış bir oda oluşturmak için ikinci kapak camını ağın üzerine yerleştirin (Şekil 3A).
      NOT: Naylon ağ, dilimi alt kapak kaymasına bağlı tutmak ve böylece 40x yağ gibi yüksek büyüklükte ters çevrilmiş bir hedefin çalışma mesafesinde kalmak için gereklidir.
    4. HBSS veya agonist solüsyonunu manuel olarak veya bir perfüzyon sistemi aracılığıyla pipetleme yaparak bir ucundan hazneye ekleyin. Sürekli sıvı perfüzyonu durumunda diğer ucundan kağıt mendil veya vakum ile emerek sıvıyı odadan çıkarın.
    5. PCLS odasını mikroskop aşamasına yerleştirin. SMC23'ün Ca2+ sinyalini, 15 veya 30 görüntü/sn lazer tarama hızına sahip özel yapım rezonans taramalı konfokal mikroskopla algılayın.
      NOT: Alternatif olarak, şu anda yaygın olarak bulunan yüksek hızlı bir ticari lazer taramalı konfokal mikroskop, PCLS'deki pulmoner SMC'lerin Ca2+ sinyal tahlilinde uygulanabilir.
  4. SMC'lerde Ca2+ floresansını ölçün.
    1. Kaydedilen görüntü dizisini FIJI'ye yükleyin ve 8 bit gri tonlamalı Görüntü > Türü>nü seçin.
    2. Araç çubuğunda Dikdörtgen Seçimi'ni seçin ve düz bir kas hücresinde 5 piksel x 5 piksellik bir ilgi alanı (YG) tanımlayın.
    3. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla > Ca 2+ floresan yoğunluğunu temsil eden Ortalama gri değer'i seçin.
    4. Bir yatırım getirisinin konumu SMC daralmasıyla birlikte değişirse, Ca2+ floresan yoğunluğunu kare kare ölç > Analiz Et'i seçin.
    5. SMC'nin yatırım getirisi bir görüntü yığınında benzer bir konumda kalırsa, Görüntü > Yığınları > Ca 2+ floresan yoğunluğunun yığınını ölç'ü seçin.
      NOT: Özel olarak yazılmış bir makro, bir görüntü yığınında daralma ile hareket ettiğinde SMC içindeki YG'yi izlemek için takılabilir ve YG'nin Ca2+ yoğunluğunu (gri değer) kare kare otomatik olarak ölçer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bozulmamış intrapulmoner hava yollarını ve arterleri koruyan fare PCLS preparatı
Ters faz kontrast mikroskobu altında 150 μm kalınlığında bir PCLS gözlendi. Fare akciğerlerinde, iletken hava yollarına, hilustan periferik akciğere uzanan intrapulmoner arterler eşlik eder. Bir fare PCLS'sinde temsili bir pulmoner hava yolu-arter demeti Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hava yolu, lümenin iç yüzeyini kaplayan aktif siliyal atımlı küboidal epitel hücreleri ile kolayca tanımlanabilir. Buna karşılık, yakındaki pulmoner arter düz endotel tarafından öne çıkar. Periferik akciğer alanına ulaştığında, iletken hava yolları, küçük intraasiner arteriolleri çevreleyen solunum kanallarına ve keselere dallanır (Şekil 2C).

Pulmoner hava yolunu ve arteriyel kontraksiyonu değerlendirmek için fare PCL'lerinin kullanılması
Metakolin (MCh, 1 μM) kaynaklı hava yolu kontraksiyonu Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hava yolu kontraktil yanıtları, MCh maruziyetini takiben luminal alan azalması yüzdesi ile ölçülür (Şekil 2D). Buna karşılık, pulmoner arter MCh uyaranlarına yanıt vermez (Şekil 2B). Hava yolları, 1 günlük veya 5 günlük kültürü takiben PCLS'de MCh'ye benzer doza bağımlı kontraktil yanıtları sürdürür (Şekil 2D). PCLS endotele (10 nM) maruz kaldığında, hem hava yolları hem de pulmoner arterler daralır (Şekil 2C, E), ardından NOC-5 (100 μM) kaynaklı gevşeme (Şekil 2E).

Hava yolu ve arteriyel SMC'nin Ca 2+ sinyalini değerlendirmek için fare PCL'lerini kullanma
Ca2+ boya yüklü PCLS, konfokal floresan mikroskop altında gözlenir. Hava yolundaki Ca 2 + floresan (Şekil 3B) ve vasküler (Şekil 3C) SMC'ler dinlenme durumunda düşüktür, hücre içi Ca2 + sinyalinin fokal kıvılcımı dikkate değer değildir. Agonistlere maruz kaldıktan sonra, Ca2 + floresan yoğunluğu SMC'de yükselir (Şekil 3B, C), genellikle bir noktadan ve daha sonra tüm hücreye yayılır. Ca2+ floresan dalgaları, salınımlı sinyallerle aynı hücrede tekrar tekrar ortaya çıkar (Şekil 3D, E). Genel olarak, Ca 2+ salınım sıklığı, agonist konsantrasyonu plato seviyesi24'e ulaşana kadar yükseldikçe artar. Hava yolu SMC gevşemesi, Ca 2+ salınımlarınınazalması veya durması ile ilişkilidir25.

Figure 1
Resim 1: Vibratom dilimleme için fare akciğer loblarının oryantasyonu. Fare akciğer lobları bölümler için ayrı ayrı loblara ayrılır. (A) Sol (1), sağ kraniyal (2) ve kaudal loblar (3), düz kesme yüzeyini numune sütununa yapıştırmadan önce beyaz noktalı çizgiler boyunca hilumun yakınında kesilir. Sol lobun yerleşimi (4)'te gösterilmiştir. (B) Sağ orta lob doğrudan numune kolonuna yapıştırılabilir. Doğru aksesuar lobu, küçük boyutu nedeniyle yaygın olarak kullanılmamıştır. Farklı lobların uygun oryantasyonu, çoğu hava yolunun ve pulmoner damarın PCLS'de enine kesitler göstermesini sağlar. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Fare PCLS'lerinde hava yollarının ve pulmoner arterlerin kontraktil ve gevşetici yanıtları. (A) Bir PCLS'nin kasılma testi için bir kültür plakasına iyi yerleştirilmesini gösteren şema. (B) İstirahatte ve 1 μM metakoline (MCh) maruz kaldıktan sonra HBSS'de yakındaki bir pulmoner artere (siyah ok uçları) sahip bir hava yolunu (siyah oklar) gösteren temsili görüntüler. (C) İstirahatte ve 10 nM endotele (Endo) maruz kalındığında HBSS'de intraasinar arteriol gösteren temsili görüntüler. (D) 1 günlük (gri çizgi) ve 5 günlük (siyah noktalı çizgi) kültürü takiben PCLS'lerde MCh'ye doza bağımlı hava yolu kontraktil yanıtları. Her nokta, iki fareden dokuz hava yolunun ortalama ± SEM'ini temsil eder. (E) 10 nM endotelin indüklediği hava yolunu ve pulmoner arteriyel kontraksiyonu, ardından nitrik oksit donörü olan 100 μM NOC-5'i gösteren temsili görüntüler, indüklenmiş gevşeme. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: PCLS'de hava yolu ve pulmoner arteriyel SMC'lerin Ca2+ sinyalizasyonu. (A) SMC'lerin Ca 2+ görüntülemesi için odak düzleminde bir PCLS'yi tutmak için üst ve alt kapak camı, gres contası ve naylon bir ağ içeren bir odanın kurulumunu gösteren şema. (B) İstirahatte ve 1 μM MCh'ye maruz kaldıktan sonra hava yolu SMC'lerinin Ca2+ sinyalini gösteren temsili floresan görüntüler. Epi, epitel hücresi. (C) İstirahatte ve 10 nM endotele (Endo) maruz kaldıktan sonra pulmoner arteriyel SMC'lerin Ca2+ floresan görüntüleri. Koyu beyaz oklar pulmoner arterin uzunlamasına eksenini gösterir ve uç oklu noktalı çizgiler arteriyel duvar etrafındaki vasküler SMC'lerin sarmal dağılımını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Ca2+ floresan yoğunluğunun (Ft) salınımlı yükselmesi, dinlenme durumundaki floresan yoğunluğuna (F0) oranla, bir hava yolu SMC'sinde 1 μM MCh'ye (D) ve pulmoner arteriyel SMC'de 10 nM endotelin stimülasyonuna (E) yanıt olarak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PCLS'nin hazırlanması birkaç kritik adımı içerir. İlk olarak, doku sertliğinin düzensiz agaroz dağılımından değişmesini önlemek için akciğer lobunu homojen olarak şişirmek esastır. Sıvı agaroz, 37 ° C'nin altındaki bir sıcaklıkta ince kateterlerde veya hava yollarında hızla jelleştikçe, distal akciğer alanında ortaya çıkan dolgu defekti, akciğer dokusu sertliğinin eşitsizliğini artırabilir ve vibratom kesiti sırasında doku yırtılmasına neden olabilir. Bu nedenle, düşük erime noktalı agaroz çözeltisini bir su banyosunda 42 ° C'de tutmak ve diseksiyon masasında bir ısıtma lambası kullanmak, hızlı agaroz jelleşmesini önlemek için uygulanabilir. Hızlı bir enjeksiyon, akciğer parankimine daha yüksek uyumla daha fazla agaroz itebilir, bu nedenle kaçınılması gerekir. Manuel agaroz enjeksiyonu genellikle yaklaşık 5-7 s sürer. İkincisi, agaroz dolgusunun sonunda gerekli bir adım, agarozu iletken hava yolundan distal alveol boşluğuna yıkamak için az miktarda havayı (~ 0.2 mL) itmektir. Aksi takdirde, agaroz jelleşir ve hava yolu kasılmasına direnmek için lümende kalır. Ayrıca, alveollerin içindeki agaroz jelleşmesinin yerinde kaldığını ve inkübatörde 37 ° C'de bir daha asla erimediğini belirtmek gerekir. Agaroz jeli, negatif intratorasik basınç tarafından tutulan in vivo olarak akciğer dokusunun 3D yapısını tutmada önemli bir rol oynar. Üçüncüsü, pulmoner arterlerin jelatin çözeltisi ile perfüzyonu, arteriyel lümeni PCLS'de açık tutmak için esastır. Jelatin çözeltisi, doku kesiti sırasında kimyasal ve fiziksel uyaranlar üzerinde vazokonstriksiyona direnmek için mekanik bir bloker olarak oda sıcaklığında jelleşir. Jelatin inüflemesi olmadan, akciğer dilimlerindeki pulmoner arterler, fentolamin, epinefrin ve nifedipin13,16 dahil olmak üzere yüksek dozda karışık vazodilatatör ajanların varlığında bile, genellikle çevredeki interstisyel dokudan çöker ve ayrılır. Bir agaroz jelinin aksine, jelatin jel 37 ° C'de erir, gece boyunca inkübasyondan sonra vasküler lümenden dışarı akar ve vasküler reaksiyon tahlilinden önce arteriyel lümeni tıkanıklıktan arındırır.

PCLS, pulmoner SMC'leri in situ olarak koruduğundan ve kontraktil fonksiyonlarını neredeyse in vivo bir durumda koruduğundan, SMC kontraksiyonunun düzenlenmesini, özellikle de Ca2 + bağımlı mekanizmalar26 ile düzenlemeyi araştırmak için güçlü bir platform olarak uygulanmıştır. Özellikle, düşük büyütmeli çok kanallı bir konfokal veya iki foton mikroskobu ile, hava yolu SMC'lerinde agonist kaynaklı Ca2 + sinyallemesi ve ilişkili luminal daralma, mekanik çalışma13,20 için aynı anda yakalanabilir. PCLS yöntemi kullanılarak ölçülen hava yolu veya vasküler yanıtın, enflamatuar ortam ve akciğerdeki yanıtın nöral innervasyonu gibi akciğer ortamından etkilenmemiş hücresel özellikleri yansıtması beklenmektedir27,28. Bu nedenle, PLCS, içsel ve içsel olanı ayırt etmeye yardımcı olmak için deneysel bir sistem sağlar. ikincil SMC'lerin modifikasyonu. Sağlık ve hastalık modellerinde SMC'lerin kontraktil regülasyonunu araştırmaya ek olarak, doğum sonrası akciğer gelişimi sırasında ve çevresel hakaretlere yanıt olarak hava yolu SMC'sinin fonksiyonel adaptasyonunu araştırmak için farklı yaş gruplarından PCLS'ler toplanmıştır27. Ayrıca, PCLS'ler periferikten proksimal akciğer alanına kadar farklı büyüklükte hava yolları ve kan damarları içerir ve homeostazda ve patojenik uyaranlar altında pulmoner SMC'lerin kontraktilitesini düzenlemek için bölgeye özgü bir mekanizmanın araştırılmasını sağlar. Ayrıca, fare PCLS'leri 7 gün boyunca kültür ortamında hava yolu kontraktilitesini koruduğundan17, sitokin veya virüs maruziyeti29 gibi SMC deregülasyon için risk faktörlerini incelemek veya doğrulamak için ex vivo bir model olarak kullanılmıştır. Son olarak, PCLS vazodilatatör veya bronkodilatör ilaçları taramak için ideal bir platform sağlar. Özellikle, PCLS preparatını kullanan biyotahliller oldukça uygun maliyetlidir, çünkü bir yetişkin fare yüzlerce akciğer dilimi üretebilir. Kontrol ve tedavi gruplarında komşu PCLS'lerin kullanılması da gruplar arası örneklem varyasyonundan kaynaklanan deneysel önyargıyı önemli ölçüde azaltır.

Kemirgen ve insan akciğer anatomisi arasındaki fark göz önüne alındığında, insan PCLS, translasyonel araştırmalar için daha güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, insan akciğer dokusunun, özellikle de hastalıklı akciğer örneklerinin sınırlı mevcudiyeti bir zorluk olmaya devam etmektedir. Buna karşılık, fare akciğer dokusu, insan hastalıklarının fare modelleri ve transgenik fare modelleri, biyomedikal ve farmakolojik araştırmalarda yaygın olarak uygulanmakta ve fare PCLS'yi erişilebilir ve hastalıkla ilgili bir sistem haline getirmektedir13,30. Ek olarak, intrapulmoner arterlerin korunması sadece fare PCLS preparatında başarılı olmuştur, bu da pulmoner hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıklarda vasküler deregülasyonun araştırılması için eşsiz bir araç haline getirmektedir. Bu nedenle, herhangi bir hastalık modeliyle ilişkili uyarılara rağmen, fare PCLS hazırlığı için bir protokol, sağlık ve hastalıkta hava yolu ve pulmoner arterleri araştırmak için bir ex vivo platform oluşturmak için paha biçilmezdir. Biz ve diğerleri, insan PCLS'leri31,32,33,34 ile akciğer araştırmalarını bildirdik. Deneyimlerimize göre, insan PLC preparatının protokolü,% 2'lik daha yüksek bir agaroz konsantrasyonu, daha fazla agaroz çözeltisi (bir akciğer için 3 L) ve agaroz enjeksiyonu için ana, lober veya segmental bronşları kanüle etmek için çok daha büyük boyutlu kateterler uygulamak dışında, fareye benzer. Fare PLC hazırlamadaki deneyim, insan akciğer dilimi hazırlığında muazzam bir şekilde yardımcı olur.

Pulmoner SMC araştırmalarında PCLS preparatının kullanılmasının sayısız avantajına rağmen, bu tekniğin sınırlamalarının farkında olmak çok önemlidir. İlk olarak, PCLS, akciğer parankimal ve hava yollarını periyodik olarak geren fizyolojik solunum döngülerinden yoksun statik bir sistem olarak kalır. Vasküler SMC'ler üzerinde pulsif basınç ve endotel hücreleri üzerinde kesme kuvvetleri oluşturan kan dolaşımını da içermez. PCLS'deki bu mekanik değişiklikler, SMC'lerin kontraktil düzenlemesini değiştirebilir. PCLS'lerde hava ventilasyonunun ve kan dolaşımının tam olarak kurulması mümkün olmasa da, en azından hava yolu SMC çalışması için, son on yılda, doku bölümünü çeşitli cihazlarla gererek "nefes alan" bir PCLS üretmek için belirsiz çabalar sarf edilmiştir35,36,37. İkincisi, pulmoner SMC'ler kontraktilitelerini sadece sınırlı bir süre için korurlar. Bu süre sınırı, PLCS'nin SMC'lerin subakut değişikliklerini modellemesini önler, örneğin, hava yolu SMC'lerini değiştirmek için 6-7 günden fazla süren bir süreç. Önceki araştırmalar, SMC'lerin kontraktil proteinlerin azalması nedeniyle kontraktiliteyi kaybettiğini ortaya koyduğundan, kültür ortamının ek bir düşük doz insülin ile optimize edilmesinin, hava yolu SMC kasılmasını 12 güne kadar sürdürdüğü gösterilmiştir17. Son olarak, pulmoner SMC'lerin plazmid veya PCLS'nin siRNA transfeksiyonu ile genetik manipülasyonu başarısız olmaya devam etmektedir. PCLS'deki transfektif SMC'lerin önündeki teknik bariyer kesinlikle daha fazla araştırmayı garanti eder, çünkü bu yöntem pulmoner SMC'lerin mekanik çalışması için transgenik hayvan modeline alternatif bir yaklaşım sağlar. Daha da önemlisi, bu teknik, translasyonel araştırmalarda insan pulmoner SMC'lerinin genetik modülasyonunu sağlamak için özel bir önlemdir.

Bu makalede, iyi korunmuş hava yolları ve pulmoner arterlere sahip fare PCLS'lerinin hazırlanması ve bunların kasılma ve Ca2+ sinyal tahlillerinde uygulanması hakkında kapsamlı bir açıklama sunulmaktadır. PCLS preparatı, canlı bir akciğer ortamında çalışan düz kası desteklerken, mekanik çalışmanın in situ hücrelere erişmesine izin verir. Bu eşsiz özellik, PCLS preparatını sağlık ve hastalıklarda pulmoner hava yolu ve vasküler SMC'leri incelemek için çok yönlü bir araç haline getirmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibeleri, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

Biyoloji Sayı 183
Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter