Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Использование прецизионно разрезанного среза легких для изучения сократительной регуляции дыхательных путей и внутрилегочных артериальных гладких мышц

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Настоящий протокол описывает подготовку и использование прецизионных срезов легких мышей для оценки сократимости дыхательных путей и внутрилегочных артерий гладкой мускулатуры в среде почти in vivo .

Abstract

Гладкомышечные клетки (SMC) опосредуют сокращение дыхательных путей и внутрилегочной артерии для изменения сопротивления воздушного потока и легочного кровообращения соответственно, играя, следовательно, играя решающую роль в гомеостазе легочной системы. Дерегуляции сократимости СМЦ способствует развитию ряда легочных заболеваний, включая астму и легочную гипертензию. Однако из-за ограниченного доступа к тканям и отсутствия систем культивирования для поддержания фенотипов SMC in vivo молекулярные механизмы, лежащие в основе дерегулированной сократимости SMC при этих заболеваниях, остаются полностью идентифицированными. Прецизионный срез легких (PCLS) предлагает модель ex vivo , которая обходит эти технические трудности. Как живой, тонкий участок легочной ткани, PCLS сохраняет SMC в естественной среде и позволяет in situ отслеживать сокращение SMC и внутриклеточную передачу сигналов Ca2 + , которая регулирует сократимость SMC. Здесь представлен подробный протокол подготовки PCLS для мыши, который сохраняет интактные дыхательные пути и внутрилегочные артерии. Этот протокол включает в себя два основных шага перед тем, как подвергнуть долю легкого нарезке: надувание дыхательных путей агарозой с низкой температурой плавления через трахею и заполнение легочных сосудов желатином через правый желудочек. PCLS, приготовленный с использованием этого протокола, может быть использован для биоанализов для оценки Ca2+ -опосредованной сократительной регуляции SMC как в дыхательных путях, так и во внутрилегочных артериальных компартментах. При применении к мышиным моделям респираторных заболеваний этот протокол позволяет проводить функциональное исследование SMC, тем самым давая представление о базовом механизме дерегуляции сократимости SMC при заболеваниях.

Introduction

Гладкомышечные клетки (SMC) являются основным типом структурных клеток в легких, в основном находящихся в медиа-стенке дыхательных путей и легочных сосудов. SMC сокращаются, чтобы изменить просветный калибр, тем самым регулируя воздух и кровоток 1,2. Поэтому сократительная регуляция SMC имеет важное значение для поддержания гомеостаза вентиляции воздуха и легочного кровообращения. Напротив, аберрантная сократимость SMC провоцирует обструктивные заболевания дыхательных путей или легочных сосудов, такие как астма и легочная артериальная гипертензия. Однако функциональная оценка легких SMC была затруднена ограниченным доступом к легочной ткани, особенно к тем небольшим дыхательным путям и микрососудам в дистальной части легкого 2,3. Современные решения прибегают к косвенным анализам, таким как измерение сопротивления воздушного потока Flexivent для отражения сужения дыхательных путей и проверка легочного артериального артериального давления путем катетеризации правого сердца для оценки легочной вазоконтракции 4,5. Тем не менее, эти косвенные анализы имеют множество недостатков, таких как смешение структурных факторов, неспособность охватить пространственное разнообразие дыхательных путей или сосудистых реакций во всей шкале легких 6,7 и непригодность для механистического изучения сократительной регуляции на клеточном уровне. Поэтому для исследования SMC in vitro были применены альтернативные подходы с использованием изолированных первичных клеток, полосок мышц трахеи/бронхов 8,9 или крупных сосудистых сегментов10. Тем не менее, эти методы также имеют ограничения. Например, быстрая фенотипическая адаптация первичных SMC в условиях культуры 11,12 делает проблематичным экстраполяцию результатов из клеточной культуры в условия in vivo. Кроме того, сократительный фенотип SMC в изолированных проксимальных дыхательных путях или сосудистых сегментах может не представлять собой SMC в дистальном легком 6,7. Более того, измерение мышечной силы на тканевом уровне остается диссоциированным от молекулярных и клеточных событий, которые необходимы для механистического понимания сократительной регуляции.

Прецизионно разрезанный срез легкого (PCLS), живой участок легочной ткани, обеспечивает идеальный инструмент ex vivo для характеристики легочных SMC в микросреде, близкой к in vivo (т.е. сохраненной многоклеточной архитектуре и взаимодействии)13. С тех пор, как доктора Плаке и Фишер впервые представили приготовление легких срезов из надутых агарозой легких крыс и хомяков в 1980-х годах 14,15, этот метод постоянно развивался, чтобы обеспечить PSS более высоким качеством и большей универсальностью для биомедицинских исследований. Одним из значительных улучшений является усиление сохранения легочных артерий путем инфузии желатина в дополнение к надуванию легких агарозой через трахею. В результате как дыхательные пути, так и легочные артерии остаются нетронутыми в PCLS для оценки ex vivo 16. Кроме того, PCLS жизнеспособна в течение длительного времени в культуре. Например, у мышиных PSS не было значительных изменений жизнеспособности клеток и метаболизма в течение как минимум 12 дней в культуре, а также они сохраняли сократимость дыхательных путей до 7 дней17. Кроме того, PCLS сохраняет дыхательные пути или сосуды разного размера для анализа сокращения и релаксации. Кроме того, внутриклеточные сигналы Ca2+ SMC, детерминантный фактор сократимости клеток, могут быть проанализированы с помощью репортерных красителей Ca2+, визуализированных конфокальным или 2-фотонным микроскопом13.

Учитывая широкое применение мышиной модели в исследованиях легких, здесь описан подробный протокол подготовки ПКЛС мыши с интактными дыхательными путями и внутрилегочными артериями для исследования легких ex vivo . Используя подготовленные PSCL, мы впоследствии продемонстрировали, как оценивать реакции дыхательных путей и легочных артерий на констриктивные или релаксантные стимулы. Кроме того, описан способ загрузки PCLS репортерным красителем Ca2+ и последующей визуализации сигналов Ca2+ SMC, связанных со сократительными или релаксантными реакциями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Весь уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Массачусетской больницы общего профиля. Для настоящего исследования использовались самцы мышей дикого типа C57/B6 в возрасте 8 недель.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Подготовьте рабочий раствор.
    1. Приготовьте 1x сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS, с Ca2+ и Mg2+, и pH сбалансирован с 20 мМ HEPES, см. Таблицу материалов). Используйте решение HBSS для подготовки и обработки PCLS. Держите раствор HBSS холодным на льду при приготовлении PCLS.
  2. Готовят культуральную среду PCLS, дополняя модифицированную орлиную среду Dulbecco и F-12 (DMEM-F12) антибиотиком-антимикотическим средством (объемное соотношение 1:100, см. Таблицу материалов).
  3. Готовят 1,5% агарозу и 6% раствор желатина.
    1. Смешайте агарозу с низкой температурой плавления (LMP) или желатиновый порошок (см. Таблицу материалов) с раствором HBSS отдельно в стерильных центрифужных трубках по 15 мл (или в пробирках по 50 мл, если объем раствора >10 мл) до конечных концентраций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем раствора агарозы = 5 мл/мышь x количество мышей; раствор желатина = 2 мл/мышь x количество мышей.
    2. Нагревайте трубки раствора в кипящей воде до полного растворения порошка. Храните растворы агарозы и желатина на водяной бане с температурой 42 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревательная лампа на столе для рассечения может быть полезна для поддержания теплой рабочей среды и предотвращения затвердевания раствора агарозы перед инъекцией в легкое мыши.
  4. Погрузите все инструменты для рассечения, включая пару рассекающих ножниц, две пары изогнутых микродиссекции щипцов и пару гемостатических щипцов в 70% раствор этанола в течение не менее 20 минут для стерилизации.
  5. Держите вибратом наготове (см. Таблицу материалов), чтобы разделить легочную ткань на тонкие ломтики.
  6. Имейте перевернутый фазоконтрастный микроскоп с ПЗС-камерой для оценки дыхательных путей или сосудистых сократительных реакций и специально разработанным лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (см. Таблицу материалов) для оценки сигналов Ca2+ в легочных SMC18.

2. Раздувание легких мыши раствором агарозы и желатина

  1. Усыплите мышь.
    1. Поместите мышь в пластиковую камеру (около 750см3) с 5% изофлурана. Держите мышь в камере до тех пор, пока она не перестанет дышать не менее чем на 1 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы первичной эвтаназии, такие как внутрибрюшинная инъекция кетамина (240 мг/кг) и ксилазина (32 мг/кг)19 или пентобарбитала (0,3 мл)20, могут применяться в качестве альтернативы ингаляционному изофлурану.
    2. Поместите тело мыши на рассеченную доску в положении лежа на спине. Зафиксируйте тело в нужном положении, прижав хвост, передние лапы и голову шприцевыми иглами 25 Г, и продезинфицируйте тело с помощью 70% этанолового спрея.
    3. Разрезайте живот мыши хирургическими ножницами (разрез, ~2 см длиной х 2 см шириной). Затем отрежьте брюшную аорту, чтобы истощить объем крови.
  2. Надувайте доли легких, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Осторожно откройте грудную полость вдоль грудины и двусторонней нижней грудной клетки над диафрагмой и наблюдайте, как мочки легких разрушаются при открытии грудной полости.
    2. Удалите часть двусторонних вентральных грудных клеток, чтобы обнажить сердце. Избегайте повреждения легких, направляя острый кончик ножниц в сторону от легочной ткани.
    3. Используйте щипцы, чтобы отделить тимус и мягкие ткани в шее мыши, чтобы обнажить трахею.
    4. Вырежьте небольшое отверстие (диаметром 1,2 мм) в верхнем конце трахеи, позволяющее пройти кончику 20 G Y-образного IV катетера (см. Таблицу материалов).
    5. Соедините один порт адаптера Y-образного катетера со шприцем объемом 3 мл, предварительно заполненным 0,5 мл воздуха, а другой порт шприцем 3 мл, предварительно заполненным 2 мл теплого 1,5% раствора агарозы (42 °C).
    6. Ввести раствор агарозы для заполнения катетера, а затем протолкнуть катетер через предварительно разрезанное отверстие в трахею на 5-8 мм в длину.
    7. Медленно вводят раствор агарозы со скоростью около 1 мл/5 с. Легкое будет расширяться вдоль проксимально-дистальной оси. Прекратите инъекцию, когда край каждой доли легкого раздут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перегружайте легкое, так как это может разорвать его. Объем раствора агарозы для раздувания всего легкого молодой взрослой мыши составляет около 1,3 ± 0,1 мл.
    8. Введите 0,2-0,3 мл воздуха из другого шприца, чтобы протолкнуть остаточную агарозу в катетере и проводящих дыхательных путях в дистальное пространство альвеол.
    9. Зажмите замыкание трахеи парой изогнутых гемостатических щипцов (см. Таблицу материалов).
  3. Заполняют легочную сосудистую систему.
    1. Наполните шприц объемом 1 мл теплым 6% желатином. Подключите к игле катетер вены кожи головы, наполните катетер раствором желатина, а затем проколите иглой правый желудочек близко к нижней стенке.
    2. Протолкните иглу в правый желудочек на 2-3 мм в длину и направьте кончик иглы на главную легочную артерию.
    3. Медленно вводят 0,2 мл раствора желатина в правый желудочек и легочные артериальные сосуды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доли легких кажутся немного бледнее при соответствующей инфляции желатина.
    4. Держите иглу на месте в течение 5 минут после инъекции, охладите доли легких, вылив холодный раствор HBSS на сердце и легкое, затем поместите тело с рассеченной доской в холодильник с температурой 4 °C или на лед в общей сложности 10 минут.
    5. Удалите легкие и сердце мыши из окружающих соединительных тканей ножницами. Затем отделите каждую долю легкого и держите их в растворе HBSS на льду.

3. Сечение долей легких на тонкие ломтики

  1. Обрежьте и прикрепите легочную долю в верхней части колонки образца с помощью суперклея и сориентируйте долю (рисунок 1A, B), чтобы направление разреза было перпендикулярно большинству дыхательных путей от хилы до поверхности легкого.
  2. Используйте вибратом со свежим тонким лезвием бритвы, чтобы разрезать долю легкого на 150 мкм срезов. Соберите ломтики в 100 мм стерильных чашек Петри, предварительно заполненных холодным раствором HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите соответствующую скорость движения лезвия и частоту колебаний перед началом нарезки. Типичной настройкой для Compresstom является уровень скорости 4 и уровень колебаний 4.
  3. Переложите ломтики в чашки Петри, наполненные питательной средой DMEM/F-12 (20 ломтиков/15 мл среды/тарелки), и выдержите их в инкубаторе с температурой 37 °C в течение ночи перед экспериментами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные PCLS могут поддерживаться в культуре в течение примерно 7 дней без потери сократительных реакций дыхательных путей17. Продолжительность жизни легочных артерий не была тщательно оценена. По нашим наблюдениям, они сохраняют неповрежденную структуру и вазореакцию в течение не менее 3 дней в среде DMEM/F12. Для длительного хранения мышиные ПКС могут быть помещены в криовиалы, заполненные средой DMEM/F12, содержащей 10% DMSO (5 ломтиков в среде 1 мл на флакон), замороженными в контейнере, наполненном изопропиловым спиртом, при -80 °C на ночь, и криоконсервированы в жидком азоте в течение недель домесяцев 21.

4. Анализ сократительных реакций внутрилегочных дыхательных путей и артерий

  1. Поместите PCLS в заполненную HBSS 24-луночную культуральную пластину, по одной в каждой скважине. Расположите PCLS в середине скважины, затем удалите раствор HBSS пипеткой.
  2. Найдите целевые дыхательные пути и сосуд в срезе под микроскопом, затем накройте срез с помощью нейлоновой сетки с предварительно вырезанным центральным отверстием (диаметром 2-3 мм), чтобы обнажить целевую область.
  3. Положите полую металлическую шайбу поверх сетки, чтобы удерживать срезы на месте (рисунок 2А).
  4. Добавьте 600 мкл раствора HBSS для погружения PCLS. Отложите срез в течение 10 минут, затем запишите базовые изображения дыхательных путей или сосудов.
  5. Индуцировать сокращение дыхательных путей или сосудов путем осторожного отсасывания пустого раствора HBSS пипеткой и добавления 600 мкл HBSS с агонистом, таким как 1 мкМ метахолина (MCh) или 10 нМ эндотелина (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стимуляция KCl в качестве стандарта набора инструментов не требуется до воздействия метахолина или эндотелина. 100 мМ стимуляции KCl в дыхательных путях мышей вызывает только небольшое и нерегулярное сокращение дыхательных путей (10%-15%)20. Аналогичным образом, стимуляция прайминга метахолином не является обязательной, поскольку мы подтвердили, что один и тот же агонист, например, метахолин или серотонин, вызывает аналогичное сокращение дыхательных путей при первом и повторяющемся воздействии20,22.
  6. Наблюдайте за реакцией под микроскопом до тех пор, пока изменение просветной области не достигнет равновесного состояния, а затем записывайте изображения дыхательных путей или сосудов для анализа.
  7. Удалить раствор MCh или эндотелина пипеткой и добавить новый раствор HBSS 600 мкл с той же концентрацией агониста и релаксантом; наблюдать и регистрировать расслабление дыхательных путей или сосудов.
  8. Количественно оцените дыхательные пути или сосудистую реакцию, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Загрузите изображения в свободное программное обеспечение FIJI, спонсируемое NIH.
    2. Выберите Polygon Selection на панели инструментов, чтобы очертить дыхательные пути или сосудистый просвет на каждом кадре.
    3. Выберите «Анализировать > устанавливать измерения > области».
    4. Выберите «Анализировать > меру», чтобы количественно оценить интересующую область. Результаты отображаются в отдельном окне для статистического анализа.

5. Анализ сигналов Ca2+ дыхательных путей или сосудистых SMC

  1. Подготовьте буфер загрузки красителя Ca2+ .
    1. Растворяют краситель Ca2+ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (см. Таблицу материалов), 50 мкг (один флакон) с 10 мкл ДМСО.
    2. Растворить 0,2 г порошка Pluronic F-12 (см. Таблицу материалов) в 1 мл DMSO для получения 20% раствора Pluronic.
    3. Смешайте 10 мкл 20% раствора Плуронов с 10 мкл раствора красителяCa2+ DMSO.
    4. Сделать буфер загрузки красителя Ca2+ , добавив 20 мкл смеси в 2 мл раствора HBSS с 200 мкМ сульфобромофталеина (см. Таблицу материалов).
  2. Поместите 15 мышиных PSS в 2 мл буфера загрузки Ca2+ и инкубируйте при 30 °C в течение 1 ч. Затем переместите срезы до 2 мл раствора HBSS со 100 мкМ сульфобромофталеина в течение дополнительных 30 мин для деэтерификации флуоресцентного красителя при комнатной температуре.
  3. Обнаружение сигналов Ca2+ для SMC.
    1. Поместите ломтики, загруженные красителем Ca2+ , на большой покровный стакан.
    2. Наполните шприц объемом 3 мл силиконовой смазкой с высоким вакуумом. Сожмите смазку через затупленную иглу весом 18 г, чтобы провести две параллельные линии через покровное стекло над и под срезом.
    3. Накройте срез нейлоновой сеткой между двумя линиями смазки. Поместите второе покровное стекло поверх сетки, чтобы создать камеру, герметизированную смазкой по бокам (рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейлоновая сетка необходима для удержания среза прикрепленным к нижнему крышке и, таким образом, оставаться в пределах рабочего расстояния перевернутого объектива высокой величины, такого как 40-кратное масло.
    4. Добавьте раствор HBSS или агониста в камеру с одного конца путем пипетки вручную или с помощью перфузионной системы. Удалите жидкость из камеры путем всасывания с другого конца папиросной бумагой или вакуумом в случае непрерывной перфузии жидкости.
    5. Поместите камеру PCLS на ступень микроскопа. Обнаружение сигналов Ca2+ SMC23 с помощью специально построенного резонансного сканирующего конфокального микроскопа со скоростью лазерного сканирования 15 или 30 изображений / с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, высокоскоростной коммерческий лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, широко доступный в настоящее время, может быть применен в сигнальном анализе Ca2+ легочных SMC в PCLS.
  4. Количественная оценка флуоресценции Ca2+ в SMC.
    1. Загрузите записанную последовательность изображений в FIJI и выберите Image > Type > 8-битных оттенках серого.
    2. Выберите «Выделение прямоугольника» на панели инструментов и определите интересующую область (ROI) размером 5 x 5 пикселей в гладкомышечной ячейке.
    3. Выберите «Анализировать > набор измерений > «Среднее значение серого цвета », представляющее интенсивность флуоресценции Ca2+ .
    4. Если положение ROI изменяется с сокращением SMC, выберите «Анализировать > измерять интенсивность флуоресценции Ca2+ кадр за кадром.
    5. Если рентабельность инвестиций SMC остается в аналогичном положении в стеке изображений, выберите «Стеки изображений > > измерить стек флуоресцентной интенсивности Ca2+ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательский макрос может быть подключен для отслеживания ROI в SMC, когда он перемещается с сокращением в стеке изображений, и автоматически измеряет интенсивность Ca2+ (серое значение) ROI кадр за кадром.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мышиный препарат PCLS, сохраняющий интактные внутрилегочные дыхательные пути и артерии
PCLS толщиной 150 мкм наблюдался под перевернутым фазоконтрастным микроскопом. В легких мышей проводящие дыхательные пути сопровождаются внутрилегочными артериями, идущими от хилуса к периферическому легкому. Репрезентативный пучок легочных дыхательных путей и артерий в мышином PCLS показан на рисунке 2B. Дыхательные пути могут быть легко идентифицированы по кубоидальным эпителиальным клеткам с активным цилиальным биением, выстилающим внутреннюю поверхность просвета. Напротив, близлежащая легочная артерия характеризуется плоским эндотелием. При достижении периферического поля легких проводящие дыхательные пути разветвляются в дыхательные протоки и мешочки, окружающие небольшие внутриацинарные артериолы (рисунок 2C).

Использование PCLS мыши для оценки легочных дыхательных путей и артериального сокращения
Метахолин (MCh, 1 мкМ), индуцированное сокращением дыхательных путей, показано на рисунке 2B. Сократительные реакции дыхательных путей количественно определяются процентом уменьшения площади просвета после воздействия MCh (рисунок 2D). Напротив, легочная артерия не представляет никакого ответа на стимулы MCh (рисунок 2B). Дыхательные пути поддерживают аналогичные дозозависимые сократительные реакции на MCh в PCLS после 1-дневной или 5-дневной культуры (рисунок 2D). Когда PCLS подвергается воздействию эндотелина (10 нМ), сужаются как дыхательные пути, так и легочные артерии (рисунок 2C, E), за которым следует NOC-5 (100 мкМ), индуцированная релаксацией (рисунок 2E).

Использование мышиного PCLS для оценки сигналов Ca 2+ дыхательных путей и артерий SMC
PCLS, нагруженный красителем Ca2+, наблюдается под конфокальным флуоресцентным микроскопом. Флуоресценция Ca2+ в дыхательных путях (Рисунок 3B) и сосудистых (Рисунок 3C) SMC низкая в состоянии покоя, при этом не заметно фокальная искра внутриклеточной передачи сигналов Ca2+. При воздействии агонистов интенсивность флуоресценции Ca2+ повышается в SMC (рисунок 3B, C), обычно из одного места, а затем распространяется на всю клетку. Флуоресцентные волны Ca2+ многократно появляются в одной ячейке с колебательными сигналами (рисунок 3D,E). В целом, частота колебаний Ca2+ увеличивается по мере повышения концентрации агонистов до достижения уровня плато24. Расслабление SMC дыхательных путей связано с уменьшением или прекращением колебаний Ca2+ 25.

Figure 1
Рисунок 1: Ориентация долей легких мыши для нарезки вибратома. Доли легких мышей разделены на отдельные по отделам. (A) Левая (1), правая черепная (2) и каудальная доли (3) обрезаются вблизи хилума вдоль белых пунктирных линий перед наклеиванием плоской режущей поверхности на колонку образца. Расположение левой доли показано в пункте (4). (B) Правая средняя доля может быть непосредственно приклеена к колонке образца. Правильная дополнительная доля обычно не использовалась из-за ее небольших размеров. Соответствующая ориентация различных долей гарантирует, что большинство дыхательных путей и легочных сосудов имеют поперечные отделы в PCLS. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сократительные и релаксантные реакции дыхательных путей и легочных артерий у мышей PCLS. (A) Схема, показывающая размещение PCLS в культуральной пластине для анализа сокращения. (B) Репрезентативные изображения, показывающие дыхательные пути (черные стрелки) с близлежащей легочной артерией (черные наконечники стрел) в HBSS в состоянии покоя и после воздействия 1 мкМ метахолина (MCh). (C) Репрезентативные изображения, показывающие интраацинарную артериолу в HBSS в состоянии покоя и при воздействии 10 нМ эндотелина (эндо). (D) Дозозависимые сократительные реакции дыхательных путей на MCh в PCLS после 1-дневной (серая линия) и 5-дневной (черная пунктирная линия) культуры. Каждая точка представляет собой среднюю ± SEM девяти дыхательных путей от двух мышей. (E) Репрезентативные изображения, показывающие 10 нМ эндотелин-индуцированную дыхательные пути и сокращение легочной артерии, за которым следует 100 мкМ NOC-5, донор оксида азота, индуцированное расслаблением. Шкала шкалы = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Ca2+ сигнализация дыхательных путей и легочных артерий SMC в PCLS. (A) Схема, показывающая установку камеры с верхним и нижним покровным стеклом, смазочным уплотнением и нейлоновой сеткой для удержания PCLS в фокальной плоскости для визуализации SMC Ca2+ . (B) Репрезентативные флуоресцентные изображения, показывающие сигналы Ca2+ SMC дыхательных путей в состоянии покоя и после воздействия 1 мкМ MCh. Epi, эпителиальная клетка. (C) Ca2+ флуоресцентные изображения SMC легочной артерии в состоянии покоя и после воздействия эндотелина 10 нМ (Endo). Жирные белые стрелки указывают на продольную ось легочной артерии, а пунктирные линии с концевыми стрелками указывают на спиральное распределение сосудистых SMC вокруг артериальной стенки. Шкала бар = 20 мкм. Колебательное повышение интенсивности флуоресценции Ca2+ (Ft) в соотношении к интенсивности флуоресценции в состоянии покоя (F0), в дыхательных путях SMC до 1 мкМ MCh (D) и в легочной артерии SMC в ответ на стимуляцию эндотелина 10 нМ (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подготовка PCLS включает в себя несколько критических этапов. Во-первых, важно равномерно надувать долю легкого, чтобы избежать изменения жесткости тканей от неравномерного распределения агарозы. Поскольку жидкая агароза быстро гелится в тонких катетерах или дыхательных путях при температуре ниже 37 ° C, результирующий дефект заполнения в дистальном легочном поле может увеличить несоответствие жесткости легочной ткани и вызвать разрыв ткани во время вибратомного сечения. Поэтому можно практиковать хранение низкоплавкого раствора агарозы при 42 °C на водяной бане и использование нагревательной лампы за столом для рассечения, чтобы избежать быстрого гелеобразования агарозы. Быстрая инъекция может подтолкнуть больше агарозы к паренхиме легких с более высоким соответствием, поэтому ее следует избегать. Ручная инъекция агарозы обычно занимает около 5-7 с. Во-вторых, необходимым шагом в конце заполнения агарозы является выталкивание небольшого количества воздуха (~ 0,2 мл), чтобы смыть агарозу из проводящих дыхательных путей в дистальное пространство альвеол. В противном случае агароза будет гель и оставаться в просвете, чтобы противостоять сокращению дыхательных путей. Также стоит отметить, что гелеобразующая агароза внутри альвеол остается на месте и никогда больше не плавится при 37 °C в инкубаторе. Агарозный гель играет важную роль в удержании 3D-структуры легочной ткани, поддерживаемой отрицательным внутригрудным давлением. В-третьих, перфузия легочных артерий раствором желатина необходима для поддержания артериального просвета открытым в PCLS. Желатиновый раствор гели при комнатной температуре в качестве механического блокатора, чтобы противостоять сужению сосудов при химических и физических раздражителях во время среза ткани. Без инфляции желатина легочные артерии в срезах легких обычно разрушаются и отделяются от окружающей интерстициальной ткани, даже в присутствии высоких доз смешанных сосудорасширяющих агентов, включая фентоламин, адреналин и нифедипин13,16. В отличие от агарозного геля, желатиновый гель плавится при 37 °C, вытекая из сосудистого просвета после ночной инкубации, оставляя артериальный просвет свободным от обструкции до анализа сосудистой реакции.

Поскольку PCLS сохраняет легочные SMC in situ и сохраняет свою сократительную функцию в состоянии почти in vivo, он был применен в качестве мощной платформы для исследования регулирования сокращения SMC, особенно регулирования через зависимые от Ca2 + механизмы26. В частности, с помощью многоканального конфокального или двухфотонного микроскопа с низким увеличением можно одновременно захватывать агонист-индуцированную передачу сигналов Ca2+ в СМС дыхательных путей и связанное с этим просветное сужение для механистического исследования13,20. Ожидается, что реакция дыхательных путей или сосудов, измеренная с использованием метода PCLS, будет отражать клеточные свойства, свободные от влияний со стороны легочной среды, таких как воспалительная среда и нейронная иннервация ответа в легких27,28. Таким образом, PLCS предоставляет экспериментальную систему, помогающую различать внутренние и. вторичная модификация SMC. В дополнение к исследованию сократительной регуляции SMC в моделях здоровья и заболеваний, LCCL были собраны из разных возрастных групп для изучения функциональной адаптации SMC дыхательных путей во время постнатального развития легких и в ответ на экологические оскорбления27. Кроме того, PSCL содержат дыхательные пути и кровеносные сосуды различного размера от периферического до проксимального поля легких, что позволяет исследовать специфический для региона механизм регулирования сократимости легочных SMC при гомеостазе и под патогенными стимулами. Кроме того, поскольку мышиные LCS сохраняют сократимость дыхательных путей в культуральной среде в течение 7 дней17, они использовались в качестве модели ex vivo для изучения или проверки факторов риска дерегуляции SMC, таких как воздействие цитокинов или вирусов29. Наконец, PCLS обеспечивает идеальную платформу для скрининга сосудорасширяющих или бронходилататорных препаратов. В частности, биоанализы с использованием препарата PCLS очень экономичны, так как одна взрослая мышь может генерировать сотни ломтиков легких. Использование соседних PCLS в контрольной и лечебной группах также значительно снижает экспериментальное смещение от вариации межгрупповой выборки.

Учитывая разницу между анатомией грызунов и легких человека, ПКЛС человека является более мощным инструментом для трансляционных исследований. Тем не менее, ограниченная доступность легочной ткани человека, особенно больных образцов легких, остается проблемой. Напротив, легочная ткань мыши, мышиные модели заболеваний человека и трансгенные мышиные модели широко применяются в биомедицинских и фармакологических исследованиях, что делает PCLS мыши доступной и соответствующей заболеваниям системой13,30. Кроме того, сохранение внутрилегочных артерий было успешным только при препарате ПКЛС мышей, что делает его уникальным инструментом для исследования дерегуляции сосудов при легочных сосудистых заболеваниях, таких как легочная гипертензия. Поэтому, несмотря на предостережения, связанные с любыми моделями заболеваний, протокол подготовки PCLS для мышей неоценим для создания платформы ex vivo для исследования дыхательных путей и легочных артерий в здоровье и болезни. Мы и другие сообщили об исследованиях легких с человеческимиPCLS 31,32,33,34. По нашему опыту, протокол приготовления ПЛКС человека аналогичен мышиному, за исключением применения более высокой концентрации агарозы 2%, большего количества раствора агарозы (3 л на одно легкое) и гораздо большего размера катетеров для каннуляции основного, долевого или сегментарного бронха для инъекции агарозы. Опыт в приготовлении PLCS для мышей чрезвычайно помогает в приготовлении среза легких человека.

Несмотря на многочисленные преимущества использования препарата PCLS в исследованиях SMC легких, важно знать об ограничениях этого метода. Во-первых, PCLS остается статичной системой, лишенной физиологических дыхательных циклов, которые периодически растягивают паренхиматозные и дыхательные пути легких. Он также не содержит кровообращения, которое создает пульсирующее давление на сосудистые SMC и сдвиговые силы на эндотелиальные клетки. Эти механические изменения в PCLS могут изменить сократительное регулирование SMC. Несмотря на то, что полное установление вентиляции воздуха и кровообращения в LCS недостижимо, по крайней мере, для исследования SMC дыхательных путей, в последнее десятилетие были предприняты капризные усилия по созданию «дышащего» PCLS путем растяжения участка ткани с помощью различных устройств 35,36,37. Во-вторых, легочные SMC сохраняют свою сократимость только в течение ограниченного периода. Это ограничение по времени не позволяет PLCS моделировать подострые изменения SMC, например, процесс, занимающий более 6-7 дней для модификации SMC дыхательных путей. Поскольку предыдущие исследования показывают, что SMC теряют сократимость из-за уменьшения сократительных белков, было показано, что оптимизация культуральной среды с дополнительной низкой дозой инсулина поддерживает сокращение SMC дыхательных путей до 12 дней17. Наконец, генетическое манипулирование легочными SMC путем плазмидной или siRNA-трансфекции PCLS остается безуспешным. Технический барьер для трансфектирования SMC в PCLS, безусловно, требует дальнейшего изучения, поскольку этот метод обеспечивает альтернативный подход к трансгенной модели животных для механистического изучения легочных SMC. Что еще более важно, этот метод является исключительной мерой для достижения генетической модуляции легочных SMC человека в трансляционных исследованиях.

В данной статье приводится подробное описание подготовки мышиных PCLS с хорошо сохранившимися дыхательными путями и легочными артериями и их применения в анализах сокращения и передачи сигналов Ca2+ . Препарат PCLS поддерживает функционирование гладкой мускулатуры в живой среде легких, обеспечивая при этом механистический доступ к клеткам in situ. Эта уникальная особенность сделала препарат PCLS универсальным средством для изучения легочных дыхательных путей и сосудистых СМС в здоровье и заболеваниях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается грантами NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

Биология выпуск 183
Использование прецизионно разрезанного среза легких для изучения сократительной регуляции дыхательных путей и внутрилегочных артериальных гладких мышц
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter