Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Använda den precisionsskurna lungskivan för att studera kontraktil reglering av luftvägar och intrapulmonell arteriell glattmuskel

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Det nuvarande protokollet beskriver beredning och användning av musprecisionsskurna lungskivor för att bedöma luftvägarna och intrapulmonell arteriell glattmuskelkontraktilitet i en nästan in vivo-miljö .

Abstract

Glattmuskelceller (SMC) förmedlar sammandragningen av luftvägarna och den intrapulmonella artären för att modifiera luftflödesmotståndet respektive lungcirkulationen och spelar därmed en kritisk roll i lungsystemets homeostas. Avreglering av SMC-kontraktilitet bidrar till flera lungsjukdomar, inklusive astma och pulmonell hypertension. På grund av begränsad vävnadstillgång och brist på odlingssystem för att upprätthålla in vivo SMC-fenotyper förblir molekylära mekanismer som ligger till grund för den avreglerade SMC-kontraktiliteten vid dessa sjukdomar fortfarande fullständigt identifierade. Den precisionsskurna lungskivan (PCLS) erbjuder en ex vivo-modell som kringgår dessa tekniska svårigheter. Som en levande, tunn lungvävnadssektion behåller PCLS SMC i naturliga omgivningar och möjliggör in situ-spårning av SMC-sammandragning och intracellulär Ca2+ -signalering som reglerar SMC-kontraktilitet. Här tillhandahålls ett detaljerat PCLS-beredningsprotokoll för mus som bevarar intakta luftvägar och intrapulmonala artärer. Detta protokoll innefattar två viktiga steg innan lungloben utsätts för skivning: blåsa upp luftvägarna med lågsmältpunktsagaros genom luftstrupen och fylla lungkärlen med gelatin genom höger kammare. PCLS framställd med hjälp av detta protokoll kan användas för bioassays för att utvärdera Ca2+-medierad kontraktil reglering av SMC i både luftvägarna och de intrapulmonella artärfacken. När det tillämpas på musmodeller av luftvägssjukdomar möjliggör detta protokoll funktionell undersökning av SMC, vilket ger insikt i den underliggande mekanismen för SMC-kontraktilitetsavreglering vid sjukdomar.

Introduction

Glattmuskelcell (SMC) är en viktig strukturell celltyp i lungan, som främst bor i medieväggen i luftvägar och lungkärl. SMC kontrakterar för att ändra den luminala kalibern och därmed reglera luft- och blodflödet 1,2. Därför är kontraktil reglering av SMC viktigt för att upprätthålla homeostasen för luftventilation och lungcirkulation. Däremot framkallar avvikande SMC-kontraktilitet obstruktiv luftväg eller lungkärlssjukdomar som astma och pulmonell arteriell hypertension. Den funktionella bedömningen av lung-SMC har dock utmanats av begränsad tillgång till lungvävnaden, särskilt de små luftvägarna och mikrovågorna i den distala delen av lungan 2,3. Nuvarande lösningar använder indirekta analyser, såsom mätning av luftflödesmotstånd av Flexivent för att återspegla luftvägsförträngning och kontroll av lungartäriellt blodtryck genom höger hjärtkateterisering för att bedöma lungvasokontraktion 4,5. Dessa indirekta analyser har emellertid flera nackdelar, såsom att de är förvirrade av strukturella faktorer, misslyckas med att fånga den rumsliga mångfalden av luftvägs- eller vaskulära svar i hela lungskalan 6,7 och olämpliga för den mekanistiska studien av kontraktil reglering på cellulär nivå. Därför har alternativa metoder med isolerade primära celler, luftstrupen/bronkimuskelremsor 8,9 eller stora vaskulära segment10 tillämpats för SMC-studien in vitro. Ändå har dessa metoder också begränsningar. Till exempel gör en snabb fenotypisk anpassning av primära SMC i odlingstillståndet11,12 det problematiskt att extrapolera fynd från cellodling till in vivo-inställningar. Dessutom kan kontraktilfenotypen av SMC i de isolerade proximala luftvägarna eller vaskulära segmenten inte representera SMC i den distala lungan 6,7. Dessutom förblir muskelkraftmätningen på vävnadsnivå dissocierad från molekylära och cellulära händelser som är väsentliga för mekanistisk insikt i kontraktil reglering.

Precisionsskuren lungskiva (PCLS), en levande lungvävnadssektion, ger ett idealiskt ex vivo-verktyg för att karakterisera pulmonella SMC i en nära in vivo mikromiljö (dvs. bevarad flercellig arkitektur och interaktion)13. Sedan Drs. Placke och Fisher först introducerade beredningen av lungskivor från agarosuppblåsta rått- och hamsterlungor på 1980-talet 14,15, har denna teknik utvecklats kontinuerligt för att ge PCLS med högre kvalitet och större mångsidighet för biomedicinsk forskning. En signifikant förbättring är förbättringen av lungartärbevarandet genom gelatininfusion utöver lunginflation med agaros via luftstrupen. Som ett resultat hålls både luftvägarna och lungartärerna intakta i PCLS för ex vivo-bedömning 16. Dessutom, PCLS är livskraftig under en längre tid i kulturen. Till exempel hade MUS-PCLS ingen signifikant förändring i cellviabilitet och metabolism under minst 12 dagar i odling, liksom de behöll luftvägskontraktilitet i upp till 7 dagar17. Dessutom håller PCLS luftvägar eller fartyg i olika storlekar för sammandragnings- och avslappningsanalyser. Dessutom kan intracellulär Ca2+ signalering av SMC, den avgörande faktorn för cellkontraktilitet, analyseras med Ca2+ reporterfärger avbildade av ett konfokalt eller 2-fotonmikroskop13.

Med tanke på den omfattande tillämpningen av musmodellen i lungforskning beskrivs här ett detaljerat protokoll för att förbereda mus-PCLS med intakta luftvägar och intrapulmonala artärer för ex vivo lungforskning. Med hjälp av de beredda PCLS:erna demonstrerade vi därefter hur man utvärderar luftvägs- och lungartärsvaren på sammandragande eller avslappnande stimuli. Dessutom beskrivs metoden för att ladda PCLS med Ca2+ reporterfärgämne och sedan avbilda Ca2+ signalering av SMC associerade med kontraktila eller avslappnande svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All djurvård var i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts General Hospital. Vildtyp C57/B6 hanmöss, 8 veckors ålder, användes för den aktuella studien.

1. Experimentell förberedelse

  1. Förbered arbetslösningen.
    1. Förbered 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS, med Ca2+ och Mg2+, och pH balanserad med 20 mM HEPES, se materialtabell). Använd HBSS-lösningen för att förbereda och bearbeta PCLS. Förvara HBSS-lösningen kall på is när du förbereder PCLS.
  2. Förbered odlingsmediet för PCLS genom att komplettera Dulbeccos Modified Eagle Medium och F-12 (DMEM-F12) med ett antibiotikum-antimykotiskt medel (volymförhållande 1:100, se materialtabell).
  3. Förbered 1,5% agaros och 6% gelatinlösning.
    1. Blanda Agaros eller gelatinpulver med låg smältpunkt (LMP) (se materialtabell) med HBSS-lösning separat i 15 ml sterila centrifugrör (eller 50 ml rör om lösningsvolymen >10 ml) till slutliga koncentrationer.
      OBS: Total volym agaroslösning = 5 ml / mus x antal möss; gelatinlösning = 2 ml/mus x antal möss.
    2. Värm lösningsrören i kokande vatten tills pulvret löser sig helt. Förvara både agaros- och gelatinlösningar i ett 42 °C vattenbad.
      OBS: En värmelampa vid dissektionsbordet kan vara användbar för att hålla driftsmiljön varm och förhindra att agaroslösningen stelnar innan den injiceras i muslungan.
  4. Sänk ner alla dissektionsverktyg, inklusive ett par dissekerande saxar, två par böjda mikrodissekerande pincett och ett par hemostatiska pincett i 70% etanollösning i minst 20 minuter för sterilisering.
  5. Håll ett vibratom klart (se materialtabell) för att dela lungvävnaden i tunna skivor.
  6. Håll ett inverterat faskontrastmikroskop med en CCD-kamera för att utvärdera luftvägs- eller vaskulära kontraktila svar och ett specialbyggt laserscanningskonfokalmikroskop (se materialtabell) för att bedöma Ca2+ -signaleringen i lung-SMCs18.

2. Inflation av muslungor med agaros och gelatinlösning

  1. Avliva musen.
    1. Placera musen i en plastkammare (ca 750 cm3) med 5% isofluran. Håll musen i kammaren tills den slutar andas i minst 1 min.
      OBS: Andra primära eutanasimetoder, såsom intraperitoneal injektion av ketamin (240 mg/kg) och xylazin (32 mg/kg)19 eller pentobarbital (0,3 ml)20, kan användas som alternativ till inhalerad isofluran.
    2. Placera muskroppen på ett dissektionskort i ryggläge. Fixa kroppen på plats genom att fästa ner svansen, framtassarna och huvudet med 25 G sprutnålar och sanera kroppen med 70% etanolspray.
    3. Skär upp musens buk med kirurgisk sax (snitt, ~2 cm lång x 2 cm bred). Skär sedan av bukaorta för att tömma blodvolymen.
  2. Blås upp lunglober enligt stegen nedan.
    1. Öppna bröstkaviteten försiktigt längs bröstbenet och bilateral underlägsen bröstkorg ovanför membranet och observera lungloberna kollapsa när bröstkaviteten öppnas.
    2. Ta bort en del av bilaterala ventrala bröstkorg för att exponera hjärtat. Undvik lungskador genom att rikta den vassa saxspetsen bort från lungvävnaden.
    3. Använd pincett för att separera tymus och mjukvävnad i mushalsen för att exponera luftstrupen.
    4. Skär ett litet hål (1,2 mm i diameter) i luftrörets övre ände så att spetsen på en 20 G Y-formad IV-kateter kan passera (se materialtabell).
    5. Anslut en adapterport på den Y-formade katetern med en 3 ml spruta förfylld med 0,5 ml luft och den andra porten med en 3 ml spruta förfylld med 2 ml varm 1,5% agaroslösning (42 °C).
    6. Injicera agaroslösning för att fylla katetern och tryck sedan katetern genom den förskurna öppningen i luftstrupen för 5-8 mm i längd.
    7. Injicera långsamt agaroslösningen vid cirka 1 ml/5 s. Lungan kommer att expandera längs den proximala till distala axeln. Stoppa injektionen när kanten på varje lunglob är uppblåst.
      OBS: Överblåsa inte lungan, eftersom det kan brista den. Volymen av agaroslösning för att blåsa upp hela lungan hos en ung vuxen mus är cirka 1,3 ± 0,1 ml.
    8. Injicera 0,2-0,3 ml luft från den andra sprutan för att trycka den kvarvarande agarosen i katetern och ledande luftvägar till det distala alveolutrymmet.
    9. Kläm fast luftstrupen med ett par böjda hemostatiska pincett (se materialtabell).
  3. Fyll i lungkärlen.
    1. Fyll en 1 ml spruta med varmt 6% gelatin. Anslut till en nål hårbotten ven kateter, fyll katetern med gelatinlösning och punktera sedan höger kammare nära den underlägsna väggen med nålen.
    2. Tryck nålen i höger kammare i 2-3 mm i längd och rikta nålspetsen mot lungartären.
    3. Injicera 0,2 ml gelatinlösning långsamt i höger kammare och lungartärkärl.
      OBS: Lungloberna verkar något blekare med lämplig gelatininflation.
    4. Håll nålen på plats i 5 minuter efter injektion, kyl lungloberna genom att hälla iskall HBSS-lösning på hjärtat och lungan och placera sedan kroppen med dissektionskortet i ett kylskåp på 4 °C eller på is i totalt 10 minuter.
    5. Ta bort muslungan och hjärtat från omgivande bindväv med sax. Separera sedan varje lunglob och förvara dem i HBSS-lösning på is.

3. Sektionering av lunglober till tunna skivor

  1. Trimma och fäst lungloben på toppen av provkolonnen med superlim och orientera loben (figur 1A,B) så att skärriktningen kan vara vinkelrät mot de flesta luftvägar från hila till lungytan.
  2. Använd ett vibratom med ett nytt tunt rakblad för att skära lungloben i 150 μm skivor. Samla skivorna i 100 mm sterila petriskålar förfyllda med kall HBSS-lösning.
    OBS: Ställ in lämplig bladrörelsehastighet och svängningsfrekvens innan du börjar skiva. En typisk inställning för en Compresstom är Hastighetsnivå 4 och Oscillationsnivå 4.
  3. Överför skivor till petriskålar fyllda med DMEM / F-12 odlingsmedium (20 skivor / 15 ml medium / skål) och förvara dem i en 37 ° C inkubator över natten före experiment.
    OBS: Mus-PCLS kan bibehållas i kultur i cirka 7 dagar utan att förlora luftvägskontraktila svar17. Lungartärernas livslängd har inte utvärderats grundligt. I vår observation behåller de intakt struktur och vasoreaction i minst 3 dagar i DMEM / F12-medium. För långvarig lagring kan MUS-PCS placeras i kryomedialer fyllda med DMEM / F12-medium som innehåller 10% DMSO (5 skivor i 1 ml medium per injektionsflaska), frysas i en isopropylalkoholfylld behållare vid -80 ° C över natten och kryokonserveras i flytande kväve i veckor till månader21.

4. Analysera kontraktila svar i intrapulmonala luftvägar och artärer

  1. Placera PCLS i en HBSS-fylld odlingsplatta med 24 brunnar, en i varje brunn. Leta reda på PCLS i mitten av brunnen och ta sedan bort HBSS-lösningen med en pipett.
  2. Hitta målluftvägen och kärlet i skivan under mikroskopet och täck sedan skivan med ett nylonnät med ett förskuret centralt hål (2-3 mm i diameter) för att exponera målområdet.
  3. Lägg ner en ihålig metallbricka ovanpå nätet för att hålla skivorna på plats (figur 2A).
  4. Tillsätt 600 μL HBSS-lösning för att sänka ner PCLS. Vila segmentet i 10 minuter och registrera sedan baslinjebilderna av luftvägar eller fartyg.
  5. Inducera luftvägs- eller kärlkontraktionen genom att försiktigt suga ut den tomma HBSS-lösningen med en pipett och tillsätta 600 μL HBSS med en agonist, såsom 1 μM metakolin (MCh) eller 10 nM endotelin (se materialtabell).
    OBS: KCl-stimulering som verktygsuppsättningsstandard krävs inte före metakolin- eller endotelinexponering. 100 mM KCl-stimulering i musluftvägar inducerar endast en liten och oregelbunden luftvägskontraktion (10% -15%) 20. På samma sätt är en priming metakolinstimulering inte skyldig eftersom vi har bekräftat att samma agonist, till exempel metakolin eller serotonin, utlöser liknande luftvägskontraktion vid den första och repetitiva exponeringen20,22.
  6. Observera reaktionen under mikroskopet tills luminalområdesförändringen når en jämviktsstatus och registrera sedan luftvägarna eller kärlbilderna för analys.
  7. Avlägsna MCh eller endotelinlösning med en pipett och tillsätt en ny 600 μL HBSS-lösning med samma agonistkoncentration och ett avslappnande medel; observera och registrera luftvägarna eller vaskulär avkoppling.
  8. Kvantifiera luftvägs- eller kärlreaktionen enligt stegen nedan.
    1. Ladda bilderna till NIH-sponsrad fri programvara FIJI.
    2. Markera Polygonmarkeringen i verktygsfältet om du vill rita över luftvägarna eller kärllumen på varje bildruta.
    3. Välj Analysera > Ställ in mått > område.
    4. Välj Analysera > mått för att kvantifiera intresseområdet. Resultaten visas i ett separat fönster för statistisk analys.

5. Analysera Ca2+ signalering av luftvägs- eller vaskulära SMC

  1. Förbered Ca2+ färgämnesbelastningsbufferten.
    1. Lös upp Ca2+ färgämne, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (se materialtabell), 50 μg (en injektionsflaska) med 10 μL DMSO.
    2. Lös upp 0,2 g Pluronic F-12 pulver (se materialtabell) i 1 ml DMSO för att generera en 20% Pluronic lösning.
    3. Blanda 10 μl 20% Pluronic-lösning med 10 μL Ca2+ färgämne-DMSO-lösning.
    4. Gör Ca2+ färgämnesbelastningsbuffert genom att tillsätta 20 μL av blandningen till 2 ml HBSS-lösning med 200 μM sulfobromfalostein (se materialtabell).
  2. Placera 15 MUS-PCS i 2 ml Ca2+ laddningsbuffert och inkubera vid 30 °C i 1 timme. Flytta sedan skivorna till 2 ml HBSS-lösning med 100 μM sulfobromoftalein i ytterligare 30 minuter för fluorescerande färgämnesförestring vid rumstemperatur.
  3. Upptäck Ca2+ signalering av SMC.
    1. Lägg Ca2+ färgladdade skivor på ett stort täckglas.
    2. Fyll en 3 ml spruta med högvakuum silikonfett. Pressa fettet genom en 18 G trubbig nål för att dra två parallella linjer över täckglaset ovanför och under skivan.
    3. Täck skivan med ett nylonnät mellan två fettledningar. Placera det andra täckglaset ovanpå nätet för att generera en kammare förseglad med fett på sidorna (figur 3A).
      OBS: Nylonnätet är viktigt för att hålla skivan fäst vid bottenöverdragsglaset och därmed hålla sig inom arbetsavståndet för ett inverterat mål med hög storlek, såsom 40x olja.
    4. Tillsätt HBSS eller agonistlösning i kammaren från ena änden genom pipettering manuellt eller via ett perfusionssystem. Ta bort vätskan från kammaren genom att suga från den andra änden med silkespapper eller vakuum vid kontinuerlig vätskeperfusion.
    5. Sätt PCLS-kammaren på mikroskopsteget. Upptäck Ca2+ signalering av SMC23 med ett specialbyggt resonansskanningskonfokalmikroskop med en laserskanningshastighet på 15 eller 30 bilder / s.
      OBS: Alternativt kan ett höghastighets kommersiellt laserscanningskonfokalmikroskop, allmänt tillgängligt för närvarande, tillämpas i Ca2+ signalanalysen av lung-SMC i PCLS.
  4. Kvantifiera Ca2+ fluorescensen i SMC.
    1. Ladda den inspelade bildsekvensen till FIJI och välj Bild > typ > 8-bitars gråskala.
    2. Markera rektangelmarkeringen i verktygsfältet och definiera ett intresseområde på 5 pixlar x 5 pixlar (ROI) i en glattmuskelcell.
    3. Välj Analysera > Ställ in mått > gråvärde , som representerar ca2+ fluorescensintensiteten.
    4. Om positionen för en ROI ändras med SMC-sammandragning väljer du Analysera > Mät ca2+ fluorescerande intensitet bild för bildruta.
    5. Om avkastningen på SMC förblir i en liknande position i en stapel med bilder väljer du Bild > staplar > mäta stack med lysrörsintensiteten Ca2 +.
      Ett specialskrivet makro kan anslutas för att spåra avkastningen i SMC när den rör sig med sammandragning i en bildstack och automatiskt mäter Ca2+ intensitet (grått värde) för ROI ram för ram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus PCLS-preparat som bevarar intakta intrapulmonala luftvägar och artärer
En 150 μm tjock PCLS observerades under det inverterade faskontrastmikroskopet. I muslungor åtföljs ledande luftvägar av intrapulmonala artärer, som löper från hilus till perifer lunga. En representativ lungluftvägsartärbunt i en MUS-PCLS visas i figur 2B. Luftvägarna kan lätt identifieras av kuboidala epitelceller med aktiv cilial slående som foder den inre ytan av lumen. Däremot presenteras den närliggande lungartären av platt endotel. När de når det perifera lungfältet förgrenar sig de ledande luftvägarna i andningskanaler och säckar, som omger de små intra-acinära arteriolerna (figur 2C).

Använda mus-PCLS för att bedöma lungluftvägar och arteriell sammandragning
Metakolin (MCh, 1 μM) inducerad luftvägskontraktion visas i figur 2B. Luftvägskontraktilsvaren kvantifieras med procentandelen luminal areareduktion efter MCh-exponering (figur 2D). Däremot presenterar lungartären inget svar på MCh-stimuli (figur 2B). Luftvägarna upprätthåller liknande dosberoende kontraktila svar på MCh i PCLS efter 1-dagars eller 5-dagars kultur (figur 2D). När PCLS utsätts för endotelin (10 nM) drar både luftvägar och lungartärer ihop sig (figur 2C,E), följt av NOC-5 (100 μM) inducerad avslappning (figur 2E).

Använda mus-PCLS för att bedöma Ca2+ signalering av luftvägarna och arteriell SMC
Ca2+ färgladdad PCLS observeras under ett konfokalt fluorescerande mikroskop. Ca2+ fluorescensen i luftvägarna (figur 3B) och vaskulära (figur 3C) SMC är låg vid vilostatus, utan någon fokal gnista av intracellulär Ca2+ signalering anmärkningsvärd. Vid exponering för agonister höjs Ca2+ fluorescensintensiteten i SMC (figur 3B, C), vanligtvis från en plats och sedan föröka sig till hela cellen. Ca2+ fluorescerande vågor visas upprepade gånger i samma cell som oscillerande signaler (figur 3D, E). I allmänhet ökar frekvensen av Ca2+ svängning när agonistkoncentrationen stiger tills den når en platånivå24. Luftvägs SMC-avslappning är förknippad med minskning eller upphörande av Ca2+ svängningar25.

Figure 1
Figur 1: Orientering av musens lunglober för vibratomskivning. Musens lunglober är separerade i enskilda för sektioner. (A) De vänstra (1), högra kranialerna (2) och kaudala loberna (3) trimmas nära hilum längs de vita prickade linjerna innan den plana skärytan fastnar på provkolonnen. Placeringen av den vänstra loben visas i (4). (B) Den högra mittloben kan limmas direkt på provkolonnen. Den högra tillbehörsloben användes inte vanligtvis på grund av sin lilla storlek. Lämplig orientering av olika lober säkerställer att de flesta luftvägar och lungkärl uppvisar tvärgående sektioner i PCLS. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Kontraktila och avslappnande svar i luftvägar och lungartärer i MUS PCLS. (A) Schematisk som visar placeringen av en PCLS i en odlingsplatta väl för sammandragningsanalys. (B) Representativa bilder som visar en luftväg (svarta pilar) med en närliggande lungartär (svarta pilspetsar) i HBSS i vila och efter exponering för 1 μM metakolin (MCh). (C) Representativa bilder som visar en intra-acinär arteriole i HBSS i vila och vid exponering för 10 nM endotelin (Endo). (D) Dosberoende luftvägskontraktila svar på MCh i PCLS efter 1-dagars (grå linje) och 5-dagars (svart prickad linje) kultur. Varje punkt representerar den genomsnittliga ± SEM för nio luftvägar från två möss. (E) Representativa bilder som visar 10 nM endotelininducerad luftvägs- och lungartärkontraktion, följt av 100 μM NOC-5, en kväveoxiddonator, inducerad avslappning. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Ca2+ signalering av luftvägs- och lungartär-SMC i PCLS. (A) Schematisk som visar installationen av en kammare med ett övre och ett bottenglas, fetttätning och ett nylonnät för att hålla en PCLS i fokalplanet för Ca2+ avbildning av SMC. (B) Representativa fluorescerande bilder som visar Ca2+ signalering av luftvägs-SMC i vila och efter exponering för 1 μM MCh. Epi, epitelcell. (C) Ca2+ fluorescerande bilder av lungartäriska SMC i vila och efter exponering för 10 nM endotelin (Endo). De djärva vita pilarna indikerar lungartärens längdaxel, och de prickade linjerna med ändpilar indikerar den spiralformade fördelningen av vaskulära SMC runt artärväggen. Skalstreck = 20 μm. Oscillerande höjning av Ca2+ fluorescensintensitet (Ft), i förhållande till fluorescensintensiteten vid vilotillstånd (F0), i en luftvägs-SMC till 1 μM MCh (D) och i en lungartär SMC som svar på 10 nM endotelinstimulering (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förberedelsen av PCLS innebär flera kritiska steg. För det första är det viktigt att blåsa upp lungloben homogent för att undvika variation av vävnadsstyvhet från ojämn agarosfördelning. Eftersom den flytande agarosen snabbt gelerar i tunna katetrar eller luftvägar vid en temperatur under 37 °C, kan den resulterande fyllningsdefekten i det distala lungfältet öka skillnaden i lungvävnadsstyvhet och orsaka vävnadsrivning under vibratomsektionen. Därför kan man öva på att hålla den lågsmältande agaroslösningen vid 42 °C i ett vattenbad och använda en värmelampa vid dissektionsbordet för att undvika snabb agarosgelering. En snabb injektion kan trycka mer agaros till lungparenkymen med högre efterlevnad, och måste därför undvikas. Den manuella agarosinjektionen tar vanligtvis cirka 5-7 s. För det andra är ett nödvändigt steg i slutet av agarosfyllningen att trycka på en liten mängd luft (~ 0,2 ml) för att spola agarosen från den ledande luftvägen till det distala alveolen. Annars skulle agarosen gela och stanna i lumen för att motstå luftvägskontraktionen. Det är också värt att notera att agarosgelen inuti alveolerna förblir på plats och smälter aldrig igen vid 37 °C i inkubatorn. Agarosgelen spelar en viktig roll för att hålla lungvävnadens 3D-struktur som in vivo upprätthålls av det negativa intratorakiska trycket. För det tredje är perfusing lungartärer med gelatinlösning viktigt för att hålla arteriell lumen öppen i PCLS. Gelatinlösningen gelerar vid rumstemperatur som en mekanisk blockerare för att motstå vasokonstriktion vid kemiska och fysiska stimuli under vävnadssektionen. Utan gelatininflation kollapsar lungartärerna i lungskivor vanligtvis och lossnar från den omgivande interstitiella vävnaden, även i närvaro av höga doser av blandade vasodilaterande medel, inklusive fentolamin, adrenalin och nifedipin13,16. Till skillnad från en agarosgel smälter gelatingelen vid 37 °C och strömmar ut ur kärllumen efter inkubation över natten, vilket gör att artärlumenet är fritt från obstruktion före vaskulär reaktionsanalys.

Eftersom PCLS bevarar pulmonella SMC in situ och behåller sin kontraktila funktion i ett nästan in vivo-tillstånd, har den tillämpats som en kraftfull plattform för att undersöka regleringen av SMC-sammandragning, särskilt regleringen via Ca2+ beroende mekanismer26. I synnerhet med ett flerkanaligt konfokal- eller tvåfotonmikroskop med låg förstoring kan agonistinducerad Ca2+ -signalering i luftvägs-SMC och tillhörande luminal förträngning fångas samtidigt för mekanistisk studie13,20. Luftvägs- eller vaskulär respons mätt med PCLS-metoden förväntas återspegla cellulära egenskaper fria från påverkan från lungmiljön, såsom inflammatorisk miljö, och neural innervering av svaret i lungan27,28. Som sådan tillhandahåller PLCS ett experimentellt system för att skilja inneboende kontra. sekundär SMC-modifiering. Förutom att undersöka kontraktil reglering av SMC i hälso- och sjukdomsmodeller har PCLS samlats in från olika åldersgrupper för att utforska den funktionella anpassningen av luftvägs SMC under postnatal lungutveckling och som svar på miljöförolämpningar27. Dessutom innehåller PCLS i olika storlekar av luftvägar och blodkärl från perifera till proximala lungfält, vilket möjliggör undersökning av en regionspecifik mekanism för att reglera lung-SMCs kontraktilitet i homeostas och under patogena stimuli. Eftersom PCLS-mus behåller luftvägskontraktilitet i odlingsmediet i 7 dagar17, har de dessutom använts som en ex vivo-modell för att undersöka eller validera riskfaktorer för SMC-avreglering, såsom cytokin- eller virusexponering29. Slutligen, PCLS ger en idealisk plattform för att screena vasodilaterande eller bronkodilatoriska läkemedel. I synnerhet är bioassays som använder PCLS-preparat mycket kostnadseffektiva, eftersom en vuxen mus kan generera hundratals lungskivor. Att använda närliggande PCLS i kontroll- och behandlingsgrupperna minskar också signifikant den experimentella biasen från intergruppsprovvariation.

Med tanke på skillnaden mellan gnagare och mänsklig lunganatomi är den mänskliga PCLS ett kraftfullare verktyg för translationell forskning. Den begränsade tillgången på mänsklig lungvävnad, särskilt sjuka lungprover, är dock fortfarande en utmaning. Däremot används muslungvävnad, musmodeller av mänskliga sjukdomar och transgena musmodeller i stor utsträckning inom biomedicinsk och farmakologisk forskning, vilket gör mus-PCLS till ett tillgängligt och sjukdomsrelevant system13,30. Dessutom har bevarandet av intrapulmonella artärer endast varit framgångsrikt i MUS PCLS-preparat, vilket gör det till ett unikt verktyg för att utforska vaskulär avreglering vid lungkärlsjukdomar som lunghypertension. Därför, trots försiktighetsåtgärder i samband med alla sjukdomsmodeller, är ett protokoll för PCLS-preparat för mus ovärderligt för att etablera en ex vivo-plattform för att undersöka luftvägar och lungartärer i hälsa och sjukdom. Vi och andra har rapporterat lungforskning med mänskliga PCLS 31,32,33,34. Enligt vår erfarenhet liknar protokollet för human PLCS-beredning musen, förutom att applicera en högre agaroskoncentration på 2%, mer agaroslösning (3 L för en lunga) och mycket större katetrar för att kannulera huvud-, lobar- eller segmentbronkier för agarosinjektion. Erfarenhet av mus PLCS-beredning hjälper enormt med beredning av mänskliga lungskivor.

Trots många fördelar med att använda PCLS-preparat i lung-SMC-forskning är det viktigt att vara medveten om begränsningarna med denna teknik. För det första förblir PCLS ett statiskt system som saknar fysiologiska andningscykler som regelbundet sträcker lungparenkymala och luftvägar. Inte heller innehåller den blodcirkulation, vilket genererar pulserande tryck på de vaskulära SMC: erna och skjuvkrafterna på endotelceller. Dessa mekaniska variationer i PCLS kan ändra kontraktsregleringen av SMC. Även om en fullständig etablering av luftventilationen och blodcirkulationen i PCLS är ouppnåelig, åtminstone för SMC-studien i luftvägarna, har vagarious ansträngningar gjorts under det senaste decenniet för att generera en "andning" PCLS genom att sträcka vävnadssektionen med en mängd olika enheter 35,36,37. För det andra behåller lung-SMC sin kontraktilitet endast under en begränsad period. Denna tidsgräns hindrar PLCS från att modellera de subakuta förändringarna av SMC: er, till exempel en process som tar mer än 6-7 dagar att ändra luftvägs-SMC. Eftersom tidigare forskning avslöjar att SMC förlorar kontraktilitet på grund av en minskning av kontraktila proteiner, har optimering av odlingsmediet med en ytterligare låg dos insulin visat sig upprätthålla SMC-sammandragningen i luftvägarna i upp till 12 dagar17. Slutligen är den genetiska manipulationen av lung-SMC genom plasmid- eller siRNA-transfektion av PCLS fortfarande misslyckad. Den tekniska barriären för transfekta SMC i PCLS motiverar verkligen ytterligare undersökning, eftersom denna metod ger ett alternativt tillvägagångssätt för den transgena djurmodellen för den mekanistiska studien av lung-SMC. Ännu viktigare är att denna teknik är den exklusiva åtgärden för att uppnå genetisk modulering av mänskliga lung-SMC i translationell forskning.

Denna artikel ger en omfattande beskrivning av att förbereda mus-PCLS med välbevarade luftvägar och lungartärer och applicera dem i sammandragningen och Ca2+ signalanalyser. PCLS-preparat stöder glattmuskelns funktion i en levande lungmiljö samtidigt som mekanistisk studieåtkomst till celler in situ. Denna unika egenskap har gjort PCLS-preparatet till ett mångsidigt verktyg för att studera lungluftvägar och vaskulära SMC vid hälsa och sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH-bidrag, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

Biologi utgåva 183
Använda den precisionsskurna lungskivan för att studera kontraktil reglering av luftvägar och intrapulmonell arteriell glattmuskel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter