Summary
Le présent protocole décrit la préparation et l’utilisation de tranches pulmonaires coupées avec précision par des souris pour évaluer la contractilité des voies respiratoires et des muscles lisses artériels intrapulmonaires dans un milieu presque in vivo .
Abstract
Les cellules musculaires lisses (SMC) médient la contraction des voies respiratoires et de l’artère intrapulmonaire pour modifier la résistance au flux d’air et la circulation pulmonaire, respectivement, jouant ainsi un rôle essentiel dans l’homéostasie du système pulmonaire. La dérégulation de la contractilité SMC contribue à plusieurs maladies pulmonaires, y compris l’asthme et l’hypertension pulmonaire. Cependant, en raison de l’accès limité aux tissus et d’un manque de systèmes de culture pour maintenir les phénotypes SMC in vivo , les mécanismes moléculaires sous-jacents à la contractilité DÉRÉGULée du SMC dans ces maladies restent pleinement identifiés. La tranche de poumon découpée avec précision (PCLS) offre un modèle ex vivo qui contourne ces difficultés techniques. En tant que section de tissu pulmonaire mince et vivant, le PCLS retient le SMC dans un environnement naturel et permet un suivi in situ de la contraction du SMC et de la signalisation intracellulaire Ca2+ qui régule la contractilité du SMC. Ici, un protocole détaillé de préparation PCLS de souris est fourni, qui préserve les voies respiratoires intactes et les artères intrapulmonaires. Ce protocole implique deux étapes essentielles avant de soumettre le lobe pulmonaire au tranchage: gonfler les voies respiratoires avec de l’agarose à faible point de fusion à travers la trachée et remplir les vaisseaux pulmonaires de gélatine à travers le ventricule droit. Le PCLS préparé à l’aide de ce protocole peut être utilisé pour des essais biologiques afin d’évaluer la régulation contractile médiée par ca2+ de la SMC dans les voies respiratoires et les compartiments artériels intrapulmonaires. Lorsqu’il est appliqué à des modèles murins de maladies respiratoires, ce protocole permet l’étude fonctionnelle de la SMC, fournissant ainsi un aperçu du mécanisme sous-jacent de la dérégulation de la contractilité SMC dans les maladies.
Introduction
La cellule musculaire lisse (SMC) est un type de cellule structurelle majeur dans le poumon, résidant principalement dans la paroi médiale des voies respiratoires et des vaisseaux pulmonaires. Les SMC se contractent pour modifier le calibre luminal, régulant ainsi le flux d’air et de sang 1,2. Par conséquent, la régulation contractile des SMC est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la ventilation de l’air et de la circulation pulmonaire. En revanche, la contractilité aberrante du SMC provoque des maladies vasculaires obstructives ou pulmonaires comme l’asthme et l’hypertension artérielle pulmonaire. Cependant, l’évaluation fonctionnelle des SMC pulmonaires a été remise en question par un accès limité au tissu pulmonaire, en particulier aux petites voies respiratoires et aux microvaisseaux dans la partie distale du poumon 2,3. Les solutions actuelles ont recours à des tests indirects, tels que la mesure de la résistance au flux d’air par Flexivent pour refléter la constriction des voies respiratoires et la vérification de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit pour évaluer la vasocontraction pulmonaire 4,5. Cependant, ces essais indirects présentent de multiples inconvénients, tels que le fait d’être confondus par des facteurs structurels, de ne pas capturer la diversité spatiale des réponses vasculaires ou vasculaires dans l’ensemble de l’échelle pulmonaire 6,7 et de ne pas convenir à l’étude mécaniste de la régulation contractile au niveau cellulaire. Par conséquent, des approches alternatives utilisant des cellules primaires isolées,des bandes musculaires trachées/ bronchiques 8,9 ou de grands segments vasculaires10 ont été appliquées pour l’étude SMC in vitro. Néanmoins, ces méthodes ont également des limites. Par exemple, une adaptation phénotypique rapide des SMC primaires dans la condition de culture11,12 rend problématique l’extrapolation des résultats de la culture cellulaire aux contextes in vivo. De plus, le phénotype contractile des SMC dans les voies respiratoires proximales isolées ou les segments vasculaires peut ne pas représenter les SMC dans le poumon distal 6,7. De plus, la mesure de la force musculaire au niveau tissulaire reste dissociée des événements moléculaires et cellulaires qui sont essentiels pour la compréhension mécaniste de la régulation contractile.
La tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS), une section de tissu pulmonaire vivant, fournit un outil ex vivo idéal pour caractériser les SMC pulmonaires dans un microenvironnement quasi in vivo (c.-à-d. architecture et interaction multicellulaires préservées)13. Depuis que les Drs Placke et Fisher ont introduit pour la première fois la préparation de tranches pulmonaires à partir de poumons de rat et de hamster gonflés à l’agarose dans les années 1980 14,15, cette technique a été continuellement avancée pour fournir aux PCLS une qualité supérieure et une plus grande polyvalence pour la recherche biomédicale. Une amélioration significative est l’amélioration de la préservation artérielle pulmonaire par perfusion de gélatine en plus de l’inflation pulmonaire avec l’agarose via la trachée. En conséquence, les artères respiratoires et pulmonaires sont maintenues intactes dans le PCLS pour l’évaluation ex vivo 16. De plus, le PCLS est viable pendant une période prolongée en culture. Par exemple, les PCLS de souris n’ont eu aucun changement significatif dans la viabilité cellulaire et le métabolisme pendant au moins 12 jours en culture, ainsi que, ils ont conservé la contractilité des voies respiratoires jusqu’à 7 jours17. En outre, PCLS conserve des voies respiratoires ou des vaisseaux de différentes tailles pour les tests de contraction et de relaxation. De plus, la signalisation intracellulaire Ca2+ des SMC, le facteur déterminant de la contractilité cellulaire, peut être dosée avec des colorants rapporteurs Ca2+ imagés par un microscope confocal ou à 2 photons13.
Compte tenu de l’application étendue du modèle murin dans la recherche pulmonaire, un protocole détaillé est décrit ici pour préparer le PCLS de souris avec des voies respiratoires et des artères intrapulmonaires intactes pour la recherche pulmonaire ex vivo . À l’aide des LPC préparés, nous avons ensuite démontré comment évaluer les réponses artérielles et pulmonaires aux stimuli constrictifs ou relaxants. En outre, la méthode de chargement du PCLS avec un colorant rapporteur Ca2+ , puis l’imagerie de la signalisation Ca2+ des SMC associés à des réponses contractiles ou relaxantes sont également décrites.
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Protocol
Tous les soins aux animaux étaient conformes aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee du Massachusetts General Hospital. Des souris mâles de type sauvage C57/B6, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude.
1. Préparation expérimentale
- Préparez la solution de travail.
- Préparez 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS, avec Ca2+ et Mg2+, et pH équilibré avec 20 mM HEPES, voir Tableau des matériaux). Utilisez la solution HBSS pour préparer et traiter le PCLS. Gardez la solution HBSS froide sur la glace lors de la préparation des PCLS.
- Préparer le milieu de culture du PCLS en complétant le milieu Eagle modifié de Dulbecco et le F-12 (DMEM-F12) avec un agent antibiotique-antimycotique (rapport volumique 1:100, voir tableau des matériaux).
- Préparer une solution d’agarose à 1,5 % et une solution de gélatine à 6 %.
- Mélanger séparément l’agarose ou la poudre de gélatine à faible point de fusion (LMP) avec la solution HBSS séparément dans des tubes centrifuges stériles de 15 mL (ou des tubes de 50 mL si le volume de la solution >10 mL) jusqu’aux concentrations finales.
REMARQUE: Volume total de la solution d’agarose = 5 mL/souris x nombre de souris; solution de gélatine = 2 mL/souris x nombre de souris. - Chauffer les tubes de solution dans de l’eau bouillante jusqu’à ce que la poudre se dissout complètement. Conservez les solutions d’agarose et de gélatine dans un bain-marie à 42 °C.
REMARQUE: Une lampe chauffante à la table de dissection peut être utile pour garder l’environnement d’exploitation au chaud et empêcher la solution d’agarose de se solidifier avant d’être injectée dans le poumon de la souris.
- Mélanger séparément l’agarose ou la poudre de gélatine à faible point de fusion (LMP) avec la solution HBSS séparément dans des tubes centrifuges stériles de 15 mL (ou des tubes de 50 mL si le volume de la solution >10 mL) jusqu’aux concentrations finales.
- Immergez tous les outils de dissection, y compris une paire de ciseaux à dissection, deux paires de pinces à micro-dissection incurvées et une paire de pinces hémostatiques dans une solution d’éthanol à 70% pendant au moins 20 min pour la stérilisation.
- Gardez un vibratome prêt (voir tableau des matériaux) pour sectionner le tissu pulmonaire en fines tranches.
- Conservez un microscope à contraste de phase inversé avec une caméra CCD pour évaluer les réponses contractiles des voies respiratoires ou vasculaires et un microscope confocal à balayage laser construit sur mesure (voir tableau des matériaux) pour évaluer la signalisation Ca2+ dans les SMC pulmonaires18.
2. Gonflage des poumons de souris avec une solution d’agarose et de gélatine
- Euthanasier la souris.
- Placez la souris dans une chambre en plastique (environ 750 cm3) avec 5% d’isoflurane. Gardez la souris dans la chambre jusqu’à ce qu’elle cesse de respirer pendant au moins 1 min.
REMARQUE: D’autres méthodes d’euthanasie primaires, telles que l’injection intrapéritonéale de kétamine (240 mg / Kg) et de xylazine (32 mg / Kg) 19 ou de pentobarbital (0,3 mL) 20, peuvent être appliquées comme alternatives à l’isoflurane inhalé. - Placez le corps de la souris sur une planche de dissection en position couchée. Fixez le corps en position en épinglant la queue, les pattes avant et la tête avec des aiguilles de seringue de 25 G, et désinfectez le corps avec un spray à éthanol à 70%.
- Coupez l’abdomen de la souris avec des ciseaux chirurgicaux (incision, ~ 2 cm de long x 2 cm de large). Ensuite, coupez l’aorte abdominale pour épuiser le volume sanguin.
- Placez la souris dans une chambre en plastique (environ 750 cm3) avec 5% d’isoflurane. Gardez la souris dans la chambre jusqu’à ce qu’elle cesse de respirer pendant au moins 1 min.
- Gonflez les lobes pulmonaires en suivant les étapes ci-dessous.
- Ouvrez soigneusement la cavité thoracique le long du sternum et de la cage thoracique inférieure bilatérale au-dessus du diaphragme, et observez les lobes pulmonaires s’effondrer lorsque la cavité thoracique s’ouvre.
- Retirez une partie des cages thoraciques ventrales bilatérales pour exposer le cœur. Évitez les lésions pulmonaires en pointant la pointe de ciseaux pointue loin du tissu pulmonaire.
- Utilisez une pince pour séparer le thymus et les tissus mous dans le cou de la souris afin d’exposer la trachée.
- Couper un petit trou (1,2 mm de diamètre) dans l’extrémité supérieure de la trachée permettant le passage de l’extrémité d’un cathéter IV en forme de Y de 20 G (voir Tableau des matériaux).
- Connectez un orifice adaptateur du cathéter en forme de Y avec une seringue de 3 mL préremplie avec 0,5 mL d’air, et l’autre orifice avec une seringue de 3 mL préremplie avec 2 mL de solution chaude d’agarose à 1,5 % (42 °C).
- Injecter une solution d’agarose pour remplir le cathéter, puis pousser le cathéter à travers l’ouverture prédécoupée dans la trachée sur une longueur de 5 à 8 mm.
- Injecter lentement la solution d’agarose à environ 1 mL/5 s. Le poumon se dilatera le long de l’axe proximal-distal. Arrêter l’injection lorsque le bord de chaque lobe pulmonaire est gonflé.
REMARQUE: Ne gonflez pas trop le poumon, car cela pourrait le rompre. Le volume de la solution d’agarose pour gonfler tout le poumon d’une souris jeune adulte est d’environ 1,3 ± 0,1 mL. - Injecter 0,2 à 0,3 mL d’air de l’autre seringue pour pousser l’agarose résiduelle dans le cathéter et les voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.
- Coupez la trachée avec une paire de pinces hémostatiques incurvées (voir Tableau des matériaux).
- Remplissez le système vasculaire pulmonaire.
- Remplissez une seringue de 1 mL avec de la gélatine chaude de 6 %. Connectez-vous à un cathéter veineux du cuir chevelu à aiguille, remplissez le cathéter avec une solution de gélatine, puis perforez le ventricule droit près de la paroi inférieure avec l’aiguille.
- Poussez l’aiguille dans le ventricule droit sur une longueur de 2 à 3 mm et pointez la pointe de l’aiguille vers l’artère pulmonaire principale.
- Injecter lentement 0,2 mL de solution de gélatine dans le ventricule droit et les vaisseaux artériels pulmonaires.
REMARQUE: Les lobes pulmonaires apparaissent légèrement plus pâles avec un gonflage approprié de la gélatine. - Gardez l’aiguille en place pendant 5 minutes après l’injection, refroidissez les lobes pulmonaires en versant une solution HBSS glacée sur le cœur et les poumons, puis placez le corps avec la dissection dans un réfrigérateur à 4 °C ou sur de la glace pendant un total de 10 min.
- Retirez le poumon et le cœur de la souris des tissus conjonctifs environnants avec des ciseaux. Ensuite, séparez chaque lobe pulmonaire et conservez-les dans une solution HBSS sur de la glace.
3. Sectionnement des lobes pulmonaires en fines tranches
- Couper et fixer le lobe pulmonaire sur le dessus de la colonne d’échantillon avec de la supercolle et orienter le lobe (Figure 1A, B) pour permettre à la direction de coupe d’être perpendiculaire à la plupart des voies respiratoires de la hile à la surface du poumon.
- Utilisez un vibratome avec une lame de rasoir mince et fraîche pour couper le lobe pulmonaire en tranches de 150 μm. Recueillir les tranches dans des boîtes de Petri stériles de 100 mm préremplies de solution HBSS froide.
REMARQUE: Réglez la vitesse de déplacement et la fréquence d’oscillation appropriées de la lame avant de commencer le tranchage. Un réglage typique pour un Compresstom est le niveau de vitesse 4 et le niveau d’oscillation 4. - Transférer les tranches dans des boîtes de Petri remplies de milieu de culture DMEM/F-12 (20 tranches/15 mL de milieu/plat) et les conserver dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit avant les expériences.
REMARQUE: Les PCLS de souris peuvent être maintenus en culture pendant environ 7 jours sans perdre les réponses contractiles des voies respiratoires17. La longévité des artères pulmonaires n’a pas été évaluée de manière approfondie. Dans notre observation, ils conservent une structure intacte et une vasoréaction pendant au moins 3 jours en milieu DMEM/F12. Pour un stockage à long terme, les PCLS de souris peuvent être placés dans des cryoviales remplies de milieu DMEM/F12 contenant 10% de DMSO (5 tranches dans un milieu de 1 mL par flacon), congelées dans un récipient rempli d’alcool isopropylique à -80 ° C pendant la nuit et cryoconservées dans de l’azote liquide pendant des semaines àdes mois 21.
4. Analyse des réponses contractiles des voies respiratoires et des artères intrapulmonaires
- Placez les PCLS dans une plaque de culture de 24 puits remplie de HBSS, une dans chaque puits. Localisez le PCLS au milieu du puits, puis retirez la solution HBSS à l’aide d’une pipette.
- Trouvez les voies respiratoires et le récipient cibles dans la tranche au microscope, puis couvrez la tranche à l’aide d’un maillage en nylon avec un trou central prédécoupé (2-3 mm de diamètre) pour exposer la zone cible.
- Posez une rondelle métallique creuse sur le dessus du maillage pour maintenir les tranches en place (Figure 2A).
- Ajouter 600 μL de solution HBSS pour immerger le PCLS. Reposez la tranche pendant 10 minutes, puis enregistrez les images de base des voies respiratoires ou des navires.
- Induire la contraction des voies respiratoires ou vasculaires en aspirant prudemment la solution HBSS vierge avec une pipette et en ajoutant 600 μL de HBSS avec un agoniste, comme 1 μM de méthacholine (MCh) ou 10 nM d’endothéline (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: La stimulation KCl en tant que norme d’ensemble d’outils n’est pas nécessaire avant l’exposition à la méthcholine ou à l’endothéline. 100 mM de stimulation KCl dans les voies respiratoires de la souris n’induit qu’une contraction petite et irrégulière des voies respiratoires (10%-15%)20. De même, une stimulation amorçante de la méthacholine n’est pas obligatoire car nous avons confirmé que le même agoniste, par exemple la méthacholine ou la sérotonine, déclenche une contraction similaire des voies respiratoires lors de la première exposition répétitive20,22. - Observez la réaction au microscope jusqu’à ce que le changement de la zone luminale atteigne un état équilibrant, puis enregistrez les images des voies respiratoires ou vasculaires pour analyse.
- Retirer la solution de MCh ou d’endothéline à l’aide d’une pipette et ajouter une nouvelle solution HBSS de 600 μL avec la même concentration d’agonistes et un relaxant; observer et enregistrer les voies respiratoires ou la relaxation vasculaire.
- Quantifiez les voies respiratoires ou la réaction vasculaire en suivant les étapes ci-dessous.
- Chargez les images sur le logiciel gratuit FIJI sponsorisé par les NIH.
- Sélectionnez la sélection de polygones dans la barre d’outils pour dessiner le contour des voies respiratoires ou de la lumière vasculaire sur chaque image.
- Choisissez Analyser > Définir les mesures > la zone.
- Choisissez Analyser > Mesure pour quantifier le domaine d’intérêt. Les résultats sont affichés dans une fenêtre distincte pour l’analyse statistique.
5. Analyse de la signalisation Ca2+ des SMC des voies respiratoires ou vasculaires
- Préparez le tampon de chargement du colorant Ca2+ .
- Dissoudre le colorant Ca2+ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (voir tableau des matériaux), 50 μg (un flacon) avec 10 μL de DMSO.
- Dissoudre 0,2 g de poudre de Pluronic F-12 (voir Tableau des matériaux) dans 1 mL de DMSO pour générer une solution pluronique à 20 %.
- Mélanger 10 μL de solution pluronique à 20 % avec 10 μL de solution de colorant-DMSO Ca2 +.
- Fabriquer un tampon de charge de colorant Ca2+ en ajoutant 20 μL du mélange à 2 mL de solution HBSS avec 200 μM de sulfobromophtaléine (voir Tableau des matériaux).
- Placer 15 PCLS souris dans 2 mL de tampon de chargement Ca2+ et incuber à 30 °C pendant 1 h. Déplacer ensuite les tranches à 2 mL de solution HBSS avec 100 μM de sulfobromophtaléine pendant 30 minutes supplémentaires pour la désestérification des colorants fluorescents à température ambiante.
- Détecter la signalisation Ca2+ des SMC.
- Placez les tranches chargées de colorant Ca2+ sur un grand verre de couverture.
- Remplissez une seringue de 3 mL avec de la graisse de silicone sous vide poussé. Pressez la graisse à travers une aiguille émoussée de 18 G pour tracer deux lignes parallèles sur le verre de couverture au-dessus et au-dessous de la tranche.
- Couvrir la tranche à l’aide d’une maille en nylon entre deux lignes de graisse. Placez le deuxième verre de couverture sur le dessus de la maille pour générer une chambre scellée par de la graisse sur les côtés (Figure 3A).
REMARQUE: La maille en nylon est essentielle pour maintenir la tranche attachée au couvercle inférieur et ainsi rester à la distance de travail d’un objectif inversé de grande magnitude, tel que l’huile 40x. - Ajouter HBSS ou solution agoniste dans la chambre à partir d’une extrémité en pipetant manuellement ou via un système de perfusion. Retirez le fluide de la chambre en aspirant de l’autre extrémité avec du papier de soie ou du vide dans le cas d’une perfusion continue de liquide.
- Placez la chambre PCLS sur la scène du microscope. Détectez la signalisation Ca2+ de SMC23 avec un microscope confocal à balayage résonant sur mesure avec un taux de balayage laser de 15 ou 30 images / s.
REMARQUE: Alternativement, un microscope confocal à balayage laser commercial à grande vitesse, largement disponible à l’heure actuelle, peut être appliqué dans le test de signalisation Ca2+ des SMC pulmonaires dans pcLS.
- Quantifier la fluorescence du Ca2+ dans les SMC.
- Chargez la séquence d’images enregistrée sur FIJI et choisissez le Type d’image > > niveaux de gris 8 bits.
- Sélectionnez la sélection de rectangle dans la barre d’outils et définissez une région d’intérêt (ROI) de 5 pixels x 5 pixels dans une cellule musculaire lisse.
- Choisissez Analyser > Définir les mesures > valeur grise moyenne, représentant l’intensité de fluorescence Ca2 +.
- Si la position d’un retour sur investissement change avec la contraction SMC, choisissez Analyser > Mesurer l’intensité fluorescente Ca2+ image par image.
- Si le retour sur investissement de SMC reste dans une position similaire dans une pile d’images, choisissez Pile d’images > > Pile de mesure de l’intensité fluorescente Ca2 +.
REMARQUE: Une macro écrite sur mesure peut être branchée pour suivre le retour sur investissement dans le SMC lorsqu’il se déplace avec contraction dans une pile d’images et mesure automatiquement l’intensité Ca2+ (valeur grise) du retour sur investissement image par image.
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Representative Results
Préparation pcLS de souris préservant les voies respiratoires et les artères intrapulmonaires intactes
Un PCLS de 150 μm d’épaisseur a été observé au microscope à contraste de phase inversé. Dans les poumons de souris, les voies respiratoires conductrices sont accompagnées d’artères intrapulmonaires, allant du hile au poumon périphérique. Un faisceau sinusoïdal-artère pulmonaire représentatif dans un PCLS de souris est illustré à la figure 2B. Les voies respiratoires peuvent être facilement identifiées par les cellules épithéliales cuboïdes avec des battements ciliaux actifs tapissant la surface interne de la lumière. En revanche, l’artère pulmonaire voisine est caractérisée par un endothélium plat. Lorsqu’elles atteignent le champ pulmonaire périphérique, les voies respiratoires conductrices se ramifient dans les canaux respiratoires et les sacs, entourant les petites artérioles intra-acineuses (Figure 2C).
Utilisation du PCLS de souris pour évaluer les voies respiratoires pulmonaires et la contraction artérielle
La contraction des voies respiratoires induite par la méthacholine (MCh, 1 μM) est démontrée à la figure 2B. Les réponses contractiles des voies respiratoires sont quantifiées par le pourcentage de réduction de la surface luminale après une exposition au MCh (figure 2D). En revanche, l’artère pulmonaire ne présente aucune réponse aux stimuli de la MCh (Figure 2B). Les voies respiratoires maintiennent des réponses contractiles dose-dépendantes similaires à la MCh dans le PCLS après une culture de 1 jour ou de 5 jours (Figure 2D). Lorsque le PCLS est exposé à l’endothéline (10 nM), les voies respiratoires et les artères pulmonaires se contractent (Figure 2C,E), suivies de la relaxation induite par le NOC-5 (100 μM) (Figure 2E).
Utilisation de PCLS de souris pour évaluer la signalisation Ca 2+ des voies respiratoires et du SMC artériel
Le PCLS chargé de colorant Ca2+ est observé sous un microscope fluorescent confocal. La fluorescence ca2+ dans les voies respiratoires (figure 3B) et vasculaires (figure 3C) est faible à l’état de repos, sans étincelle focale de signalisation intracellulaire Ca2+ notable. Lors de l’exposition à des agonistes, l’intensité de fluorescence Ca2+ augmente dans le SMC (Figure 3B, C), généralement à partir d’un endroit, puis se propageant à l’ensemble de la cellule. Les ondes fluorescentes Ca2+ apparaissent à plusieurs reprises dans la même cellule que les signaux oscillatoires (Figure 3D,E). En général, la fréquence de l’oscillation ca2+ augmente à mesure que la concentration d’agonistes augmente jusqu’à atteindre un niveau de plateau24. La relaxation SMC des voies respiratoires est associée à la diminution ou à l’arrêt des oscillations Ca2+ 25.
Figure 1 : Orientation des lobes pulmonaires de souris pour le tranchage du vibratome. Les lobes pulmonaires de la souris sont séparés en lobes individuels pour les sections. (A) Les lobes crânien gauche (1), crânien droit (2) et caudal (3) sont coupés près du hile le long des lignes pointillées blanches avant de coller la surface de coupe plane sur la colonne d’échantillonnage. Le placement du lobe gauche est indiqué en (4). (B) Le lobe central droit peut être directement collé à la colonne d’échantillonnage. Le lobe accessoire droit n’était pas couramment utilisé en raison de sa petite taille. L’orientation appropriée des différents lobes garantit que la plupart des voies respiratoires et des vaisseaux pulmonaires présentent des sections transversales dans le PCLS. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.
Figure 2 : Réponses contractiles et relaxantes des voies respiratoires et des artères pulmonaires chez les SOURIS PCLS. (A) Schéma montrant le placement d’une PCLS dans une plaque de culture bien pour le dosage de contraction. (B) Images représentatives montrant une voie respiratoire (flèches noires) avec une artère pulmonaire voisine (pointes de flèches noires) dans HBSS au repos et après une exposition à 1 μM de méthacholine (MCh). (C) Images représentatives montrant un artériole intra-acineux dans l’HBSS au repos et lors de l’exposition à 10 nM d’endothéline (Endo). (D) Réponses contractiles des voies respiratoires dose-dépendantes à la MCh dans les PCLS après une culture de 1 jour (ligne grise) et de 5 jours (ligne pointillée noire). Chaque point représente la moyenne ± SEM de neuf voies respiratoires de deux souris. (E) Des images représentatives montrant une contraction des voies respiratoires et de l’artère pulmonaire induite par l’endothéline de 10 nM, suivie d’une relaxation induite par 100 μM de NOC-5, un donneur d’oxyde nitrique. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Signalisation Ca2+ des SMC des voies respiratoires et des artères pulmonaires dans le SPC. (A) Schéma montrant la configuration d’une chambre avec un verre de couverture supérieure et inférieure, un joint de graisse et un maillage en nylon pour maintenir un PCLS dans le plan focal pour l’imagerie Ca2+ des SMC. (B) Images fluorescentes représentatives montrant la signalisation Ca2+ des SMC des voies respiratoires au repos et après exposition à 1 μM MCh. Epi, cellule épithéliale. (C) Images fluorescentes Ca2+ de SMC artériels pulmonaires au repos et après exposition à 10 nM d’endothéline (Endo). Les flèches blanches en gras indiquent l’axe longitudinal de l’artère pulmonaire et les lignes pointillées avec des flèches d’extrémité indiquent la distribution hélicoïdale des SMC vasculaires autour de la paroi artérielle. Barre d’échelle = 20 μm. Élévation oscillatoire de l’intensité de fluorescence Ca2+ (Ft), par rapport à l’intensité de fluorescence au repos (F0), dans un SMC des voies respiratoires à 1 μM MCh (D) et dans un SMC artériel pulmonaire en réponse à une stimulation de l’endothéline (E) de 10 nM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La préparation du PCLS implique plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, il est essentiel de gonfler le lobe pulmonaire de manière homogène pour éviter la variation de la rigidité tissulaire due à une distribution inégale de l’agarose. Comme l’agarose liquide se gélifie rapidement dans de minces cathéters ou des voies respiratoires à une température inférieure à 37 ° C, le défaut de remplissage résultant dans le champ pulmonaire distal pourrait augmenter la disparité de la rigidité du tissu pulmonaire et provoquer une déchirure des tissus pendant la section vibratome. Par conséquent, il est possible de maintenir la solution d’agarose à faible fusion à 42 °C au bain-marie et d’utiliser une lampe chauffante à la table de dissection pour éviter une gélification rapide de l’agarose. Une injection rapide pourrait pousser plus d’agarose vers le parenchyme pulmonaire avec une plus grande observance, il faut donc éviter. L’injection manuelle d’agarose prend généralement environ 5-7 s. Deuxièmement, une étape nécessaire à la fin du remplissage de l’agarose consiste à pousser une petite quantité d’air (~ 0,2 mL) pour rincer l’agarose des voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales. Sinon, l’agarose se gélifierait et resterait dans la lumière pour résister à la contraction des voies respiratoires. Il convient également de noter que la gélification de l’agarose à l’intérieur des alvéoles reste en place et ne fond plus jamais à 37 ° C dans l’incubateur. Le gel d’agarose joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure 3D du tissu pulmonaire telle qu’elle est maintenue in vivo par la pression intrathoracique négative. Troisièmement, il est essentiel de perfuser les artères pulmonaires avec une solution de gélatine pour maintenir la lumière artérielle ouverte dans le PCLS. La solution de gélatine se gélifie à température ambiante comme bloqueur mécanique pour résister à la vasoconstriction lors de stimuli chimiques et physiques pendant la section tissulaire. Sans gonflage de la gélatine, les artères pulmonaires dans les tranches pulmonaires s’effondrent généralement et se détachent du tissu interstitiel environnant, même en présence de fortes doses d’agents vasodilatateurs mixtes, notamment la phentolamine, l’épinéphrine et la nifédipine13,16. Contrairement à un gel d’agarose, le gel de gélatine fond à 37 °C, s’écoulant de la lumière vasculaire après une incubation d’une nuit, laissant la lumière artérielle exempte d’obstruction avant le test de réaction vasculaire.
Comme le PCLS préserve les SMC pulmonaires in situ et conserve leur fonction contractile dans un état presque in vivo, il a été appliqué comme une plate-forme puissante pour étudier la régulation de la contraction SMC, en particulier la régulation via les mécanismes dépendants de Ca2+ 26. En particulier, avec un microscope confocal ou à deux photons multicanaux à faible grossissement, la signalisation Ca2+ induite par les agonistes dans les SMC des voies respiratoires et la constriction luminale associée peuvent être capturées simultanément pour l’étude mécaniste13,20. La réactivité des voies respiratoires ou vasculaire mesurée à l’aide de la méthode PCLS devrait refléter des propriétés cellulaires exemptes d’influences de l’environnement pulmonaire, telles que le milieu inflammatoire, et l’innervation neurale de la réponse dans le poumon27,28. En tant que tel, le PLCS fournit un système expérimental pour aider à distinguer intrinsèque vs. modification des SMC secondaires. En plus d’étudier la régulation contractile des SMC dans les modèles de santé et de maladie, des PCLS ont été collectés auprès de différents groupes d’âge pour explorer l’adaptation fonctionnelle de la SMC des voies respiratoires au cours du développement pulmonaire postnatal et en réponse aux insultes environnementales27. De plus, les PCLS contiennent des voies respiratoires et des vaisseaux sanguins de différentes tailles, du champ pulmonaire périphérique au champ pulmonaire proximal, ce qui permet d’étudier un mécanisme spécifique à la région pour réguler la contractilité des SMC pulmonaires dans l’homéostasie et sous des stimuli pathogènes. De plus, comme les PCLS de souris conservent la contractilité des voies respiratoires dans le milieu de culture pendant 7 jours17, ils ont été utilisés comme modèle ex vivo pour examiner ou valider les facteurs de risque de dérégulation du SMC, tels que l’exposition aux cytokines ou aux virus29. Enfin, PCLS fournit une plate-forme idéale pour dépister les médicaments vasodilatateurs ou bronchodilatateurs. En particulier, les essais biologiques utilisant la préparation PCLS sont très rentables, car une souris adulte peut générer des centaines de tranches de poumons. L’utilisation de PCLS voisins dans les groupes témoin et de traitement réduit également considérablement le biais expérimental de la variation de l’échantillon intergroupe.
Compte tenu de la différence entre l’anatomie pulmonaire des rongeurs et de l’homme, le PCLS humain est un outil plus puissant pour la recherche translationnelle. Cependant, la disponibilité limitée de tissus pulmonaires humains, en particulier d’échantillons pulmonaires malades, reste un défi. En revanche, le tissu pulmonaire de souris, les modèles murins de maladies humaines et les modèles murins transgéniques sont largement appliqués dans la recherche biomédicale et pharmacologique, faisant du PCLS de souris un système accessible et pertinent pourla maladie 13,30. En outre, la préservation des artères intrapulmonaires n’a été couronnée de succès que dans la préparation du PCLS de souris, ce qui en fait un outil unique pour explorer la dérégulation vasculaire dans les maladies vasculaires pulmonaires telles que l’hypertension pulmonaire. Par conséquent, malgré les mises en garde associées à tous les modèles de maladie, un protocole pour la préparation du PCLS chez la souris est inestimable pour établir une plate-forme ex vivo pour étudier les voies respiratoires et les artères pulmonaires dans la santé et la maladie. Nous et d’autres avons rapporté des recherches pulmonaires avec des PCLS humains 31,32,33,34. D’après notre expérience, le protocole de préparation de PLCS humain est similaire à celui de la souris, sauf en appliquant une concentration d’agarose plus élevée de 2%, plus de solution d’agarose (3 L pour un poumon) et des cathéters de taille beaucoup plus grande pour canuler les bronches principales, lobaires ou segmentaires pour l’injection d’agarose. L’expérience dans la préparation de PLCS de souris aide énormément à la préparation de tranches de poumon humain.
Malgré les nombreux avantages de l’utilisation de la préparation PCLS dans la recherche sur les SMC pulmonaires, il est crucial d’être conscient des limites de cette technique. Tout d’abord, le PCLS reste un système statique, dépourvu de cycles respiratoires physiologiques qui étirent périodiquement le parenchymeux pulmonaire et les voies respiratoires. Il ne contient pas non plus de circulation sanguine, qui génère une pression pulsive sur les SMC vasculaires et des forces de cisaillement sur les cellules endothéliales. Ces variations mécaniques dans le PCLS pourraient modifier la régulation contractile des SMC. Même si un établissement complet de la ventilation de l’air et de la circulation sanguine dans les PCLS est irréalisable, du moins pour l’étude SMC des voies respiratoires, des efforts vagabonds ont été déployés au cours de la dernière décennie pour générer un PCLS « respirant » en étirant la section tissulaire avec une variété de dispositifs 35,36,37. Deuxièmement, les SMC pulmonaires ne maintiennent leur contractilité que pendant une période limitée. Cette limite de temps empêche les PLCS de modéliser les changements subaigus des SMC, par exemple, un processus prenant plus de 6 à 7 jours pour modifier les SMC des voies respiratoires. Étant donné que des recherches antérieures révèlent que les SMC perdent leur contractilité en raison d’une diminution des protéines contractiles, il a été démontré que l’optimisation du milieu de culture avec une faible dose supplémentaire d’insuline maintient la contraction de la SMC des voies respiratoires jusqu’à 12 jours17. Enfin, la manipulation génétique des SMC pulmonaires par transfection de plasmide ou de siRNA du PCLS reste infructueuse. La barrière technique au transfectement des SMC dans le PCLS mérite certainement une étude plus approfondie, car cette méthode fournit une approche alternative au modèle animal transgénique pour l’étude mécaniste des SMC pulmonaires. Plus important encore, cette technique est la mesure exclusive pour obtenir une modulation génétique des SMC pulmonaires humains dans la recherche translationnelle.
Cet article fournit une description complète de la préparation des PCLS de souris avec des voies respiratoires et des artères pulmonaires bien préservées et de leur application dans les tests de contraction et de signalisation Ca2 +. La préparation pcLS soutient le fonctionnement des muscles lisses dans un environnement pulmonaire vivant tout en permettant l’accès à l’étude mécaniste aux cellules in situ. Cette caractéristique unique a fait de la préparation PCLS un outil polyvalent pour étudier les voies respiratoires pulmonaires et les SMC vasculaires dans la santé et les maladies.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions des NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
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