Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों के सिकुड़ा हुआ विनियमन का अध्ययन करने के लिए प्रेसिजन-कट फेफड़े के टुकड़े का उपयोग करना

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल लगभग विवो परिवेश में वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों के संकुचन का आकलन करने के लिए माउस परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस तैयार करने और उपयोग करने का वर्णन करता है।

Abstract

चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी) क्रमशः एयरफ्लो प्रतिरोध और फुफ्फुसीय परिसंचरण को संशोधित करने के लिए वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनी के संकुचन की मध्यस्थता करती हैं, इसलिए फुफ्फुसीय प्रणाली के होमोस्टैसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एसएमसी संकुचन का विनियमन अस्थमा और फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप सहित कई फुफ्फुसीय बीमारियों में योगदान देता है। हालांकि, सीमित ऊतक पहुंच और विवो एसएमसी फेनोटाइप में बनाए रखने के लिए संस्कृति प्रणालियों की कमी के कारण, इन बीमारियों में विनियमित एसएमसी संकुचन के अंतर्निहित आणविक तंत्र पूरी तरह से पहचाने जाते हैं। सटीक कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस) एक पूर्व विवो मॉडल प्रदान करता है जो इन तकनीकी कठिनाइयों को दरकिनार करता है। एक जीवित, पतले फेफड़ों के ऊतक अनुभाग के रूप में, पीसीएलएस प्राकृतिक परिवेश में एसएमसी को बरकरार रखता है और एसएमसी संकुचन और इंट्रासेल्युलर सीए2 + सिग्नलिंग के सीटू ट्रैकिंग में अनुमति देता है जो एसएमसी संकुचन को नियंत्रित करता है। यहां, एक विस्तृत माउस पीसीएलएस तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जो बरकरार वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनियों को संरक्षित करता है। इस प्रोटोकॉल में फेफड़ों के लोब को टुकड़ा करने की क्रिया के अधीन करने से पहले दो आवश्यक चरण शामिल हैं: श्वासनली के माध्यम से कम पिघलने-बिंदु एगरोज के साथ वायुमार्ग को फुलाना और दाएं वेंट्रिकल के माध्यम से जिलेटिन के साथ फुफ्फुसीय वाहिकाओं को भरना। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए पीसीएलएस का उपयोग वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनी डिब्बों दोनों में एसएमसी के सीए2 +-मध्यस्थता सिकुड़ा हुआ विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए बायोएसेस के लिए किया जा सकता है। जब श्वसन रोगों के माउस मॉडल पर लागू किया जाता है, तो यह प्रोटोकॉल एसएमसी की कार्यात्मक जांच को सक्षम बनाता है, जिससे रोगों में एसएमसी संकुचन विनियमन के अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है।

Introduction

चिकनी मांसपेशी कोशिका (एसएमसी) फेफड़ों में एक प्रमुख संरचनात्मक कोशिका प्रकार है, जो मुख्य रूप से वायुमार्ग और फुफ्फुसीय वाहिकाओं की मीडिया दीवार में रहती है। एसएमसी ल्यूमिनल कैलिबर को बदलने के लिए अनुबंध करते हैं, इस प्रकार हवा और रक्त प्रवाह 1,2 को विनियमित करते हैं। इसलिए, वायु वेंटिलेशन और फुफ्फुसीय परिसंचरण के होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए एसएमसी का सिकुड़ा हुआ विनियमन आवश्यक है। इसके विपरीत, विचलित एसएमसी संकुचन प्रतिरोधी वायुमार्ग या फुफ्फुसीय संवहनी रोगों जैसे अस्थमा और फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप को उत्तेजित करता है। हालांकि, फेफड़ों के एसएमसी के कार्यात्मक मूल्यांकन को फेफड़ों के ऊतकों तक सीमित पहुंच से चुनौती दी गई है, विशेष रूप से फेफड़ोंके 2,3 के बाहर के हिस्से में उन छोटे वायुमार्ग और माइक्रोवेसल्स। वर्तमान समाधान अप्रत्यक्ष परख का सहारा लेते हैं, जैसे वायुमार्ग कसना को प्रतिबिंबित करने के लिए फ्लेक्सिवेंट द्वारा एयरफ्लो प्रतिरोध को मापना, और फुफ्फुसीय वाहिकासंकीर्णन 4,5 का आकलन करने के लिए सही हृदय कैथीटेराइजेशन द्वारा फुफ्फुसीय धमनी रक्तचाप की जांच करना। हालांकि, इन अप्रत्यक्ष परखों के कई नुकसान हैं, जैसे संरचनात्मक कारकों से भ्रमित होना, पूरे फेफड़ों के पैमाने 6,7 में वायुमार्ग या संवहनी प्रतिक्रियाओं की स्थानिक विविधता को पकड़ने में विफल रहना, और सेलुलर स्तर पर सिकुड़ा हुआ विनियमन के यंत्रवत अध्ययन के लिए अनुपयुक्त। इसलिए, पृथक प्राथमिक कोशिकाओं, श्वासनली / ब्रांकाई मांसपेशी स्ट्रिप्स 8,9, या बड़े संवहनी खंड10 का उपयोग करके वैकल्पिक दृष्टिकोण इन विट्रो में एसएमसी अध्ययन के लिए लागू किए गए हैं। फिर भी, इन तरीकों की सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, संस्कृति की स्थिति11,12 में प्राथमिक एसएमसी का एक त्वरित फेनोटाइपिकल अनुकूलन सेल संस्कृति से विवो सेटिंग्स में निष्कर्षों को एक्सट्रपलेशन करने के लिए समस्याग्रस्त बनाता है। इसके अलावा, पृथक समीपस्थ वायुमार्ग या संवहनी खंडों में एसएमसी का सिकुड़ा हुआ फेनोटाइप डिस्टल फेफड़े 6,7 में एसएमसी का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसके अलावा, ऊतक स्तर पर मांसपेशी बल माप आणविक और सेलुलर घटनाओं से अलग रहता है जो सिकुड़ा हुआ विनियमन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि के लिए आवश्यक हैं।

प्रेसिजन-कट फेफड़ों का टुकड़ा (पीसीएलएस), एक जीवित फेफड़े के ऊतक अनुभाग, फुफ्फुसीय एसएमसी को निकट विवो माइक्रोएनवायरनमेंट (यानी, संरक्षित बहु-सेलुलर वास्तुकला और बातचीत) में चिह्नित करने के लिए एक आदर्श पूर्व विवो उपकरण प्रदान करता है। प्लैक और फिशर ने पहली बार 1980 के दशक 14,15 में एगरोज-फुलाए हुए चूहे और हैम्स्टर फेफड़ों से फेफड़ों के स्लाइसकी तैयारी शुरू की थी, इसलिए इस तकनीक को जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता और अधिक बहुमुखी प्रतिभा के साथ पीसीएलएसएस प्रदान करने के लिए लगातार उन्नत किया गया है। एक महत्वपूर्ण सुधार श्वासनली के माध्यम से एगरोज के साथ फेफड़ों की मुद्रास्फीति के अलावा जिलेटिन जलसेक द्वारा फुफ्फुसीय धमनी संरक्षण की वृद्धि है। नतीजतन, वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियों दोनों को पूर्व विवो मूल्यांकन16 के लिए पीसीएलएस में बरकरार रखा जाता है। इसके अलावा, पीसीएलएसएस संस्कृति में लंबे समय तक व्यवहार्य है। उदाहरण के लिए, माउस पीसीएलएसएस में संस्कृति में कम से कम 12 दिनों के लिए सेल व्यवहार्यता और चयापचय में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ, साथ ही, उन्होंने 7 दिनों17 दिनों तक वायुमार्ग संकुचन को बनाए रखा। इसके अलावा, पीसीएलएस संकुचन और विश्राम परख के लिए विभिन्न आकार के वायुमार्ग या जहाजों को रखता है। इसके अलावा, एसएमसी के इंट्रासेल्युलर सीए2 + सिग्नलिंग, सेल सिकुड़न का निर्धारक कारक, सीए2 + रिपोर्टर रंगों के साथ एक कॉन्फोकल या 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप13 द्वारा चित्रित किया जा सकता है।

फेफड़ों के अनुसंधान में माउस मॉडल के व्यापक अनुप्रयोग को ध्यान में रखते हुए, पूर्व विवो फेफड़ों के अनुसंधान के लिए बरकरार वायुमार्ग और इंट्रापुलमोनरी धमनियों के साथ माउस पीसीएलएस तैयार करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तैयार पीसीएलएसएस का उपयोग करते हुए, हमने बाद में दिखाया कि संकुचित या आराम उत्तेजनाओं के लिए वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कैसे किया जाए। इसके अलावा, सीए2 + रिपोर्टर डाई के साथ पीसीएलएस लोड करने की विधि और फिर सिकुड़ा हुआ या आराम प्रतिक्रियाओं से जुड़े एसएमसी के इमेजिंग सीए2 + सिग्नलिंग का भी वर्णन किया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु देखभाल मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार थी। वर्तमान अध्ययन के लिए जंगली प्रकार के सी 57 / बी 6 नर चूहों, 8 सप्ताह की उम्र का उपयोग किया गया था।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. कामकाजी समाधान तैयार करें।
    1. 1 एक्स हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस, सीए2 + और एमजी 2 + के साथ, औरपीएच 20 एमएम एचईपीईएस के साथ संतुलित, सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। पीसीएलएस तैयार करने और संसाधित करने के लिए एचबीएसएस समाधान का उपयोग करें। पीसीएलएसएस तैयार करते समय बर्फ पर एचबीएसएस समाधान ठंडा रखें।
  2. एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक एजेंट (1: 100 वॉल्यूम अनुपात, सामग्री की तालिका देखें) के साथ डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम और एफ -12 (डीएमईएम-एफ 12) को पूरक करके पीसीएलएस के संस्कृति माध्यम को तैयार करें।
  3. 1.5% एगरोज़ और 6% जिलेटिन समाधान तैयार करें।
    1. अंतिम सांद्रता के लिए 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों (या 50 एमएल ट्यूबों यदि समाधान मात्रा >10 एमएल) में एचबीएसएस समाधान के साथ कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) एगारोज़ या जिलेटिन पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) मिलाएं।
      नोट: एगरोज़ समाधान की कुल मात्रा = चूहों की 5 एमएल /माउस एक्स संख्या; जिलेटिन समाधान = 2 एमएल/माउस एक्स चूहों की संख्या।
    2. पाउडर पूरी तरह से घुलने तक उबलते पानी में समाधान ट्यूबों को गर्म करें। 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एगरोज़ और जिलेटिन समाधान दोनों रखें।
      नोट: विच्छेदन तालिका पर एक हीटिंग लैंप ऑपरेटिंग वातावरण को गर्म रखने और माउस फेफड़ों में इंजेक्शन लगाने से पहले एगरोज़ समाधान को जमने से रोकने के लिए उपयोगी हो सकता है।
  4. विदारक कैंची की एक जोड़ी, घुमावदार सूक्ष्म विदारक संदंश के दो जोड़े, और नसबंदी के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल समाधान में हेमोस्टैटिक संदंश की एक जोड़ी सहित सभी विच्छेदन उपकरण जलमग्न।
  5. फेफड़ों के ऊतकों को पतले स्लाइस में विभाजित करने के लिए एक वाइब्रेटोम तैयार रखें (सामग्री की तालिका देखें)।
  6. फुफ्फुसीय एसएमसी18 में सीए2 + सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए वायुमार्ग या संवहनी सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं और एक कस्टम-निर्मित लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) का मूल्यांकन करने के लिए सीसीडी कैमरे के साथ एक उलटा चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप रखें।

2. एगरोज़ और जिलेटिन समाधान के साथ माउस फेफड़ों की मुद्रास्फीति

  1. माउस को इच्छामृत्यु दें।
    1. 5% आइसोफ्लूरेन के साथ एक प्लास्टिक कक्ष (लगभग 750 सेमी3) में माउस रखें। माउस को कक्ष में रखें जब तक कि यह कम से कम 1 मिनट के लिए सांस लेना बंद न कर दे।
      नोट: अन्य प्राथमिक इच्छामृत्यु विधियां, जैसे कि केटामाइन (240 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (32 मिलीग्राम / किग्रा) 19 या पेंटोबार्बिटल (0.3 एमएल) 20 के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन, साँस आइसोफ्लूरेन के विकल्प के रूप में लागू किया जा सकता है।
    2. लापरवाह स्थिति में एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस शरीर रखें। 25 जी सिरिंज सुइयों के साथ पूंछ, सामने के पंजे और सिर को पिन करके शरीर को स्थिति में ठीक करें, और 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ शरीर को साफ करें।
    3. सर्जिकल कैंची (चीरा, ~ 2 सेमी लंबा x 2 सेमी चौड़ा) के साथ माउस के पेट को खोलें। फिर, रक्त की मात्रा को कम करने के लिए पेट की महाधमनी को काट दें।
  2. नीचे दिए गए चरणों के बाद फेफड़ों के लोब को फुलाएं।
    1. डायाफ्राम के ऊपर उरोस्थि और द्विपक्षीय अवर रिब पिंजरे के साथ छाती गुहा को सावधानीपूर्वक खोलें, और छाती गुहा खुलने पर फेफड़ों के लोब पतन का निरीक्षण करें।
    2. दिल को उजागर करने के लिए द्विपक्षीय उदर रिब पिंजरों का हिस्सा निकालें। तेज कैंची टिप को फेफड़ों के ऊतकों से दूर इंगित करके फेफड़ों की क्षति से बचें।
    3. श्वासनली को उजागर करने के लिए माउस गर्दन में थाइमस और नरम ऊतक को अलग करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
    4. श्वासनली के ऊपरी छोर में एक छोटा छेद (व्यास में 1.2 मिमी) काटें जिससे 20 जी वाई के आकार के चतुर्थ कैथेटर की नोक के पारित होने की अनुमति मिलती है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. वाई-आकार के कैथेटर के एक एडाप्टर पोर्ट को 0.5 एमएल हवा के साथ 3 एमएल सिरिंज के साथ कनेक्ट करें, और 3 एमएल सिरिंज के साथ दूसरा बंदरगाह गर्म 1.5% एगरोज समाधान (42 डिग्री सेल्सियस) के 2 एमएल के साथ पहले से भरा हुआ है।
    6. कैथेटर को भरने के लिए एगरोज़ समाधान इंजेक्ट करें और फिर लंबाई में 5-8 मिमी के लिए श्वासनली में पूर्व-कट उद्घाटन के माध्यम से कैथेटर को धक्का दें।
    7. धीरे-धीरे लगभग 1 एमएल / 5 एस पर एगरोज़ समाधान इंजेक्ट करें। फेफड़े समीपस्थ-से-डिस्टल अक्ष के साथ विस्तार करेंगे। इंजेक्शन बंद करो जब प्रत्येक फेफड़े के लोब के किनारे फुलाया जाता है।
      नोट: फेफड़ों को ओवरफ्लेट न करें, क्योंकि यह इसे तोड़ सकता है। एक युवा वयस्क माउस के पूरे फेफड़े को फुलाने के लिए एगरोज़ समाधान की मात्रा लगभग 1.3 ± 0.1 एमएल है।
    8. कैथेटर और प्रवाहकीय वायुमार्ग में अवशिष्ट एगरोज को डिस्टल एल्वियोली स्पेस में धकेलने के लिए अन्य सिरिंज से 0.2-0.3 एमएल हवा इंजेक्ट करें।
    9. क्लिप घुमावदार हेमोस्टैटिक संदंश की एक जोड़ी के साथ श्वासनली को बंद करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  3. फुफ्फुसीय वास्कुलचर को भरें।
    1. गर्म 6% जिलेटिन के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें। एक सुई खोपड़ी नस कैथेटर से कनेक्ट करें, जिलेटिन समाधान के साथ कैथेटर को भरें, और फिर सुई के साथ अवर दीवार के करीब दाएं वेंट्रिकल को पंचर करें।
    2. लंबाई में 2-3 मिमी के लिए दाहिने वेंट्रिकल में सुई को धक्का दें और सुई टिप को मुख्य फुफ्फुसीय धमनी में इंगित करें।
    3. 0.2 मिलीलीटर जिलेटिन समाधान धीरे-धीरे दाहिने वेंट्रिकल और फुफ्फुसीय धमनी वाहिकाओं में इंजेक्ट करें।
      नोट: फेफड़े के लोब उचित जिलेटिन मुद्रास्फीति के साथ थोड़ा पीला दिखाई देते हैं।
    4. इंजेक्शन के बाद 5 मिनट के लिए सुई रखें, दिल और फेफड़ों पर बर्फ-ठंडा एचबीएसएस समाधान डालकर फेफड़ों के लोब को ठंडा करें, फिर शरीर को विच्छेदन बोर्ड के साथ 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में या कुल 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    5. कैंची के साथ आसपास के संयोजी ऊतकों से माउस फेफड़े और दिल निकालें। फिर, प्रत्येक फेफड़े के लोब को अलग करें और उन्हें बर्फ पर एचबीएसएस समाधान में रखें।

3. पतले स्लाइस के लिए फेफड़ों के लोब का सेक्शनिंग

  1. ट्रिम और सुपरग्लू के साथ नमूना स्तंभ के शीर्ष पर फेफड़ों के लोब संलग्न करें, और पालि (चित्रा 1 ए, बी) उन्मुख करने के लिए हिला से फेफड़ों की सतह के लिए सबसे वायुमार्ग के लिए लंबवत होने के लिए काटने की दिशा की अनुमति देने के लिए।
  2. फेफड़ों के लोब को 150 μm स्लाइस में काटने के लिए एक ताजा पतली रेजर ब्लेड के साथ एक वाइब्रेटोम का उपयोग करें। ठंड एचबीएसएस समाधान के साथ पहले से भरे 100 मिमी बाँझ पेट्री व्यंजनों में स्लाइस ले लीजिए।
    नोट: टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करने से पहले उपयुक्त ब्लेड चलती गति और दोलन आवृत्ति सेट करें। एक कंप्रेसटॉम के लिए एक विशिष्ट सेटिंग स्पीड स्तर 4 और दोलन स्तर 4 है।
  3. एफ -12 संस्कृति माध्यम (20 स्लाइस / 15 एमएल मध्यम / पकवान) से भरे पेट्री व्यंजनों में स्लाइस स्थानांतरित करें और प्रयोगों से पहले उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बनाए रखें।
    नोट: माउस पीसीएलएसएस वायुमार्ग सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं को खोए बिना लगभग 7 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है17. फुफ्फुसीय धमनियों की दीर्घायु का पूरी तरह से मूल्यांकन नहीं किया गया है। हमारे अवलोकन में, वे डीएमईएम / एफ 12 माध्यम में कम से कम 3 दिनों के लिए बरकरार संरचना और वासोरेक्शन को बनाए रखते हैं। एफ 12 माध्यम से भरा हुआ क्रायोवियल्स में रखा जा सकता है जिसमें 10% डीएमएसओ (प्रति शीशी 1 एमएल मध्यम में 5 स्लाइस) होते हैं, जो रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर आइसोप्रोपिल अल्कोहल से भरे कंटेनर में जमे हुए होते हैं, और सप्ताह से21 महीने तक तरल नाइट्रोजन में क्रायोप्रिजर्व किए जाते हैं।

4. इंट्रापल्मोनरी वायुमार्ग और धमनियों के सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करना

  1. एक एचबीएसएस से भरे 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में पीसीएलएसएस रखें, प्रत्येक कुएं में एक। कुएं के बीच में पीसीएस का पता लगाएं, फिर एक पिपेट के साथ एचबीएसएस समाधान को हटा दें।
  2. माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइस में लक्ष्य वायुमार्ग और पोत का पता लगाएं, फिर लक्ष्य क्षेत्र को उजागर करने के लिए पूर्व-कट केंद्रीय छेद (व्यास में 2-3 मिमी) के साथ नायलॉन जाल का उपयोग करके टुकड़ा कवर करें।
  3. जगह में स्लाइस (चित्रा 2 ए) को पकड़ने के लिए जाल के शीर्ष पर एक खोखले धातु वॉशर बिछाएं।
  4. पीसीएलएस को डुबोने के लिए एचबीएसएस समाधान के 600 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए टुकड़ा आराम करें, फिर वायुमार्ग या जहाजों की आधारभूत छवियों को रिकॉर्ड करें।
  5. एक पिपेट के साथ खाली एचबीएसएस समाधान को सावधानीपूर्वक चूषण करके वायुमार्ग या संवहनी संकुचन को प्रेरित करें और एगोनिस्ट के साथ एचबीएसएस के 600 μL को जोड़कर, जैसे कि मेथाकोलिन (एमसीएच) के 1 μM या एंडोथेलिन के 10 एनएम ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: मेथाकोलाइन या एंडोथेलिन एक्सपोजर से पहले टूल-सेट मानक के रूप में केसीएल उत्तेजना की आवश्यकता नहीं है। माउस वायुमार्ग में केसीएल उत्तेजना का 100 एमएम केवल एक छोटे और अनियमित वायुमार्ग संकुचन (10% -15%) को प्रेरित करता है। इसी तरह, एक भड़काना मेथाकोलाइन उत्तेजना बाध्य नहीं है क्योंकि हमने पुष्टि की है कि एक ही एगोनिस्ट, उदाहरण के लिए, मेथाकोलाइन या सेरोटोनिन, पहले और दोहराए जाने वाले एक्सपोजर20,22 पर समान वायुमार्ग संकुचन को ट्रिगर करता है।
  6. माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें जब तक कि ल्यूमिनल क्षेत्र परिवर्तन एक संतुलन स्थिति तक नहीं पहुंच जाता है, और फिर विश्लेषण के लिए वायुमार्ग या संवहनी छवियों को रिकॉर्ड करता है।
  7. एक पिपेट के साथ एमसीएच या एंडोथेलिन समाधान निकालें और एक ही एगोनिस्ट एकाग्रता और एक आराम के साथ एक नया 600 μL HBSS समाधान जोड़ें; वायुमार्ग या संवहनी विश्राम का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें।
  8. नीचे दिए गए चरणों के बाद वायुमार्ग या संवहनी प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करें।
    1. छवियों को एनआईएच प्रायोजित मुफ्त सॉफ्टवेयर फिजी में लोड करें।
    2. प्रत्येक फ्रेम पर वायुमार्ग या संवहनी लुमेन को रेखांकित करने के लिए टूलबार में बहुभुज चयन का चयन करें।
    3. क्षेत्र > माप सेट करें विश्लेषण > चुनें।
    4. ब्याज के क्षेत्र को मापने के लिए विश्लेषण > उपाय चुनें। परिणाम सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक अलग विंडो में दिखाए जाते हैं।

5. वायुमार्ग या संवहनी एसएमसी के सीए2 + सिग्नलिंग का विश्लेषण करना

  1. सीए2 + डाई लोडिंग बफर तैयार करें।
    1. सीए2 + डाई को भंग करें, ओरेगन ग्रीन 488 बापटा-1-एएम ( सामग्री की तालिका देखें), डीएमएसओ के 10 μL के साथ 50 μg (एक शीशी)।
    2. 20% प्लूरोनिक समाधान उत्पन्न करने के लिए डीएमएसओ के 1 एमएल में प्लूरोनिक एफ -12 पाउडर के 0.2 ग्राम ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करें।
    3. सीए 2 + डाई-डीएमएसओ समाधान के 10 μL के साथ20 % प्लूरोनिक समाधान के 10 μL मिलाएं।
    4. सल्फोब्रोमोफथेलिन के200 μM के साथ एचबीएसएस समाधान के 2 एमएल में मिश्रण के 20 μL जोड़कर सीए 2 + डाई लोडिंग बफर बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सीए 2+ लोडिंग बफर के 2 एमएल में 15 माउस पीसीएलएसएस रखें और 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। फिर कमरे के तापमान पर फ्लोरोसेंट डाई डी-एस्टरीफिकेशन के लिए अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सल्फोब्रोमोफथेलिन के 100 μM के साथ एचबीएसएस समाधान के 2 मिलीलीटर में स्लाइस को स्थानांतरित करें।
  3. एसएमसी के सीए2 + सिग्नलिंग का पता लगाएं।
    1. एक बड़े कवर ग्लास पर सीए2 + डाई-लोडेड स्लाइस रखें।
    2. उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज भरें। स्लाइस के ऊपर और नीचे कवर ग्लास में दो समानांतर रेखाएं खींचने के लिए 18 जी कुंद सुई के माध्यम से ग्रीस को निचोड़ें।
    3. दो तेल लाइनों के बीच एक नायलॉन जाल का उपयोग करके टुकड़ा कवर करें। पक्षों पर तेल द्वारा सील एक कक्ष उत्पन्न करने के लिए जाल के शीर्ष पर दूसरा कवर ग्लास रखें (चित्रा 3 ए)।
      नोट: नायलॉन जाल नीचे कवरस्लिप से जुड़े टुकड़े रखने के लिए आवश्यक है और इस प्रकार 40x तेल जैसे उच्च परिमाण उल्टे उद्देश्य की कामकाजी दूरी के भीतर रहना चाहिए।
    4. मैन्युअल रूप से या छिड़काव प्रणाली के माध्यम से पाइपिंग करके एक छोर से कक्ष में एचबीएसएस या एगोनिस्ट समाधान जोड़ें। निरंतर द्रव छिड़काव के मामले में टिशू पेपर या वैक्यूम के साथ दूसरे छोर से चूषण करके कक्ष से तरल पदार्थ निकालें।
    5. माइक्रोस्कोप मंच पर पीसीएस कक्ष रखो। एस की लेजर स्कैन दर के साथ कस्टम-निर्मित गुंजयमान स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एसएमसी23 के सीए 2+ सिग्नलिंग का पता लगाएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, वर्तमान में व्यापक रूप से उपलब्ध एक उच्च गति वाणिज्यिक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, पीसीएलएस में फुफ्फुसीय एसएमसी के सीए2 + सिग्नलिंग परख में लागू किया जा सकता है।
  4. एसएमसी में सीए2 + प्रतिदीप्ति की मात्रा निर्धारित करें।
    1. रिकॉर्ड की गई छवि अनुक्रम को फिजी में लोड करें और छवि > टाइप > 8-बिट ग्रेस्केल चुनें।
    2. टूलबार में आयत चयन का चयन करें और एक चिकनी मांसपेशी सेल में ब्याज के 5 पिक्सेल x 5 पिक्सेल क्षेत्र (आरओआई) को परिभाषित करें।
    3. सीए2 + प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हुए, मीन ग्रे मान > विश्लेषण > सेट माप चुनें।
    4. यदि एसएमसी संकुचन के साथ आरओआई की स्थिति बदलती है, तो सीए2 + फ्लोरोसेंट तीव्रता फ्रेम-दर-फ्रेम का विश्लेषण > मापें चुनें।
    5. यदि एसएमसी का आरओआई छवियों के ढेर में एक समान स्थिति में रहता है, तो सीए2 + फ्लोरोसेंट तीव्रता के माप स्टैक > छवि > स्टैक चुनें।
      नोट: एक कस्टम-लिखित मैक्रो को एसएमसी के भीतर आरओआई को ट्रैक करने के लिए प्लग इन किया जा सकता है जब यह एक छवि स्टैक में संकुचन के साथ चलता है और स्वचालित रूप से आरओआई फ्रेम-बाय-फ्रेम के सीए2 + तीव्रता (ग्रे मान) को मापता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

माउस पीसीएलएस तैयारी बरकरार इंट्रापल्मोनरी वायुमार्ग और धमनियों को संरक्षित करना
उल्टे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत एक 150 μm मोटी पीसीएलएस देखी गई थी। माउस फेफड़ों में, प्रवाहकीय वायुमार्ग इंट्रापुलमोनरी धमनियों के साथ होते हैं, जो हिलस से परिधीय फेफड़ों तक चलते हैं। माउस पीसीएलएस में एक प्रतिनिधि फुफ्फुसीय वायुमार्ग-धमनी बंडल चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। वायुमार्ग को आसानी से घनाभ उपकला कोशिकाओं द्वारा पहचाना जा सकता है जिसमें लुमेन की आंतरिक सतह को अस्तर करने वाले सक्रिय सिलियल बीटिंग होते हैं। इसके विपरीत, पास की फुफ्फुसीय धमनी को फ्लैट एंडोथेलियम द्वारा चित्रित किया गया है। परिधीय फेफड़ों के क्षेत्र तक पहुंचने पर, प्रवाहकीय वायुमार्ग श्वसन नलिकाओं और थैलियों में शाखा, छोटे इंट्रा-एसिनार धमनियों (चित्रा 2 सी) के आसपास।

फुफ्फुसीय वायुमार्ग और धमनी संकुचन का आकलन करने के लिए माउस पीसीएलएस का उपयोग करना
मेथाकोलाइन (एमसीएच, 1 μM) प्रेरित वायुमार्ग संकुचन चित्रा 2 बी में प्रदर्शित किया गया है। वायुमार्ग सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं एमसीएच जोखिम (चित्रा 2 डी) के बाद ल्यूमिनल क्षेत्र में कमी के प्रतिशत से मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। इसके विपरीत, फुफ्फुसीय धमनी एमसीएच उत्तेजनाओं (चित्रा 2 बी) के लिए कोई प्रतिक्रिया प्रस्तुत नहीं करती है। एयरवेज 1-दिन या 5-दिवसीय संस्कृति (चित्रा 2 डी) के बाद पीसीएलएस में एमसीएच के समान खुराक-निर्भर सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं को बनाए रखते हैं। जब पीसीएलएस एंडोथेलिन (10 एनएम) के संपर्क में आता है, तो वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियों दोनों संकुचित (चित्रा 2 सी, ई), एनओसी -5 (100 μM) प्रेरित विश्राम (चित्रा 2 ई) के बाद।

वायुमार्ग और धमनी एसएमसी के सीए 2 + सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए माउस पीसीएलएस का उपयोग करना
सीए2 + डाई-लोडेड पीसीएलएस एक कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है। वायुमार्ग (चित्रा 3 बी) और संवहनी (चित्रा 3 सी) एसएमसी में सीए2 + प्रतिदीप्ति आराम की स्थिति में कम है, इंट्रासेल्युलर सीए2 + सिग्नलिंग उल्लेखनीय की कोई फोकल चिंगारी नहीं है। एगोनिस्ट के संपर्क में आने पर, सीए2 + प्रतिदीप्ति तीव्रता एसएमसी (चित्रा 3 बी, सी) में बढ़ जाती है, आमतौर पर एक स्थान से और फिर पूरे सेल में प्रचार करती है। सीए2 + फ्लोरोसेंट तरंगें बार-बार दोलन संकेतों (चित्रा 3 डी, ई) के रूप में एक ही सेल में दिखाई देती हैं। सामान्य तौर पर, सीए2+ दोलन की आवृत्ति बढ़ जाती है क्योंकि एगोनिस्ट एकाग्रता पठार स्तर24 तक पहुंचने तक बढ़ जाती है। वायुमार्ग एसएमसी विश्राम सीए2 + दोलनों 25 के घटने या समाप्ति से जुड़ा हुआ है।

Figure 1
चित्रा 1: वाइब्रेटोम स्लाइसिंग के लिए माउस फेफड़ों के लोब का अभिविन्यास। माउस फेफड़ों के लोब वर्गों के लिए अलग-अलग लोगों में अलग-अलग होते हैं। (ए) नमूना स्तंभ पर फ्लैट काटने की सतह को चिपकाने से पहले बाएं (1), दाएं कपाल (2), और पुच्छल लोब (3) को सफेद बिंदीदार रेखाओं के साथ हिलम के पास छंटनी की जाती है। बाएं लोब की नियुक्ति (4) में दिखाई गई है। (बी) सही मध्य लोब को सीधे नमूना कॉलम से चिपकाया जा सकता है। सही गौण लोब आमतौर पर अपने छोटे आकार के कारण उपयोग नहीं किया जाता था। विभिन्न पालियों का उचित अभिविन्यास यह सुनिश्चित करता है कि अधिकांश वायुमार्ग और फुफ्फुसीय वाहिकाएं पीसीएलएस में अनुप्रस्थ वर्गों को प्रस्तुत करती हैं। स्केल बार = 1 सेमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माउस पीसीएलएस में वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियों के सिकुड़ा हुआ और आराम प्रतिक्रियाएं (ए) संकुचन परख के लिए अच्छी तरह से एक संस्कृति प्लेट में एक पीसीएलएस की नियुक्ति दिखाते हुए योजनाबद्ध। (बी) प्रतिनिधि छवियां आराम से एचबीएसएस में पास के फुफ्फुसीय धमनी (काले तीर) के साथ वायुमार्ग (काला तीर) दिखाती हैं और 1 μM मेथाकोलाइन (एमसीएच) के संपर्क में आने के बाद। (सी) प्रतिनिधि छवियां आराम से और 10 एनएम एंडोथेलिन (एंडो) के संपर्क में आने पर एचबीएसएस में इंट्रा-एसीनार धमनी दिखाती हैं। (डी) 1-दिन (ग्रे लाइन) और 5-दिवसीय (ब्लैक डॉटेड लाइन) संस्कृति के बाद पीसीएलएस में एमसीएच के लिए खुराक-निर्भर वायुमार्ग सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाएं। प्रत्येक बिंदु दो चूहों से नौ वायुमार्ग के औसत ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है। (ई) प्रतिनिधि छवियां 10 एनएम एंडोथेलिन-प्रेरित वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनी संकुचन दिखाती हैं, इसके बाद 100 μM एनओसी -5, एक नाइट्रिक ऑक्साइड दाता, प्रेरित विश्राम। स्केल बार = 100 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सीए2 + पीसीएलएस में वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनी एसएमसी का सिग्नलिंग। (ए) योजनाबद्ध एक शीर्ष और एक नीचे कवर ग्लास, ग्रीस सील, और एक नायलॉन जाल के साथ एक कक्ष के सेटअप को दिखाते हुए सीए2 + एसएमसी की इमेजिंग के लिए फोकल प्लेन में एक पीसीएलएस रखने के लिए। (बी) प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां सीए2 + आराम से वायुमार्ग एसएमसी के सिग्नलिंग और 1 μM MCh के संपर्क में आने के बाद। उपकला कोशिका। (सी) सीए2 + फुफ्फुसीय धमनी एसएमसी की फ्लोरोसेंट छवियां आराम से और 10 एनएम एंडोथेलिन (एंडो) के संपर्क में आने के बाद। बोल्ड सफेद तीर फुफ्फुसीय धमनी के अनुदैर्ध्य अक्ष को इंगित करते हैं, और अंत तीर के साथ बिंदीदार रेखाएं धमनी की दीवार के चारों ओर संवहनी एसएमसी के पेचदार वितरण को इंगित करती हैं। स्केल बार = 20 μm। सीए2 + प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफटी) की दोलन ऊंचाई, आराम की स्थिति (एफ 0) पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात में, एक वायुमार्ग एसएमसी में 1 μM एमसीएच (डी) और 10 एनएम एंडोथेलिन उत्तेजना (ई) के जवाब में फुफ्फुसीय धमनी एसएमसी में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पीसीएलएस की तैयारी में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। सबसे पहले, असमान एगरोज़ वितरण से ऊतक कठोरता की भिन्नता से बचने के लिए फेफड़ों के लोब को सजातीय रूप से फुलाना आवश्यक है। चूंकि तरल एगरोज 37 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान पर पतले कैथेटर या वायुमार्ग में तेजी से जैल करता है, इसलिए डिस्टल फेफड़ों के क्षेत्र में परिणामी भरने वाला दोष फेफड़ों के ऊतकों की कठोरता की असमानता को बढ़ा सकता है और वाइब्रेटोम अनुभाग के दौरान ऊतक फाड़ने का कारण बन सकता है। इसलिए, पानी के स्नान में 42 डिग्री सेल्सियस पर कम पिघलने वाले एगरोज समाधान को रखते हुए और विच्छेदन तालिका पर हीटिंग लैंप का उपयोग करके त्वरित एगरोज गेलिंग से बचने के लिए अभ्यास किया जा सकता है। एक त्वरित इंजेक्शन उच्च अनुपालन के साथ फेफड़ों के पैरेन्काइमा में अधिक अगारोज को धक्का दे सकता है, इसलिए इससे बचने की आवश्यकता है। मैनुअल एगरोज़ इंजेक्शन आमतौर पर लगभग 5-7 एस लेता है। दूसरा, एगरोज़ इनफिलिंग के अंत में एक आवश्यक कदम प्रवाहकीय वायुमार्ग से डिस्टल एल्वियोली स्पेस में एगरोज़ को फ्लश करने के लिए थोड़ी मात्रा में हवा (~ 0.2 एमएल) को धक्का देना है। अन्यथा, एगरोज़ जेल होगा और वायुमार्ग संकुचन का विरोध करने के लिए लुमेन में रहेगा। यह भी ध्यान देने योग्य है कि एल्वियोली के अंदर एगरोज़ गेलिंग जगह में रहता है और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर कभी पिघलता नहीं है। एगरोज़ जेल फेफड़ों के ऊतकों की 3 डी संरचना को पकड़ने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है जैसा कि नकारात्मक इंट्राथोरेसिक दबाव द्वारा बनाए रखा गया विवो में होता है। तीसरा, जिलेटिन समाधान के साथ फुफ्फुसीय धमनियों को सुगंधित करना पीसीएलएस में धमनी लुमेन को खुला रखने के लिए आवश्यक है। जिलेटिन समाधान ऊतक अनुभाग के दौरान रासायनिक और भौतिक उत्तेजनाओं पर वाहिकासंकीर्णन का विरोध करने के लिए एक यांत्रिक अवरोधक के रूप में कमरे के तापमान पर जैल करता है। जिलेटिन मुद्रास्फीति के बिना, फेफड़ों के स्लाइस में फुफ्फुसीय धमनियां आमतौर पर आसपास के अंतरालीय ऊतक से ढह जाती हैं और अलग हो जाती हैं, यहां तक कि मिश्रित वासोडिलेटरी एजेंटों की उच्च खुराक की उपस्थिति में भी, जिसमें फेंटोलामाइन, एपिनेफ्रीन और निफेडिपिन13,16 शामिल हैं। एक एगरोज़ जेल के विपरीत, जिलेटिन जेल 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघल जाता है, रात भर इनक्यूबेशन के बाद संवहनी लुमेन से बाहर निकलता है, धमनी लुमेन को संवहनी प्रतिक्रिया परख से पहले रुकावट से मुक्त छोड़ देता है।

चूंकि पीसीएलएस सीटू में फुफ्फुसीय एसएमसी को संरक्षित करता है और लगभग विवो स्थिति में अपने सिकुड़ा हुआ कार्य को बरकरार रखता है, इसलिए इसे एसएमसी संकुचन के विनियमन की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मंच के रूप में लागू किया गया है, विशेष रूप से सीए2 + निर्भर तंत्र 26 के माध्यम से विनियमन। विशेष रूप से, कम-आवर्धन मल्टी-चैनल कॉन्फोकल या दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ, एगोनिस्ट-प्रेरित सीए2+ वायुमार्ग एसएमसी में सिग्नलिंग और संबंधित ल्यूमिनल कसना यंत्रवत् अध्ययन13,20 के लिए एक साथ कब्जा किया जा सकता है। पीसीएलएस विधि का उपयोग करके मापा गया वायुमार्ग या संवहनी जवाबदेही फेफड़ों के वातावरण से प्रभावों से मुक्त सेलुलर गुणों को प्रतिबिंबित करने की उम्मीद है, जैसे कि भड़काऊ परिवेश, और फेफड़ों में प्रतिक्रिया का तंत्रिका अंतर्वेशन27,28। इस प्रकार, पीएलसीएस आंतरिक बनाम भेद करने में मदद करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली प्रदान करता है। माध्यमिक एसएमसी संशोधन। स्वास्थ्य और रोग मॉडल में एसएमसी के सिकुड़ा हुआ विनियमन की जांच करने के अलावा, प्रसवोत्तर फेफड़ों के विकास के दौरान वायुमार्ग एसएमसी के कार्यात्मक अनुकूलन का पता लगाने और पर्यावरणीय अपमानके जवाब में विभिन्न आयु समूहों से पीसीएलएसएस एकत्र किए गए हैं। इसके अलावा, पीसीएल्स में परिधीय से समीपस्थ फेफड़ों के क्षेत्र तक विभिन्न आकार के वायुमार्ग और रक्त वाहिकाएं होती हैं, जो होमियोस्टेसिस में और रोगजनक उत्तेजनाओं के तहत फुफ्फुसीय एसएमसी संकुचन को विनियमित करने के लिए एक क्षेत्र-विशिष्ट तंत्र की जांच को सक्षम करती हैं। इसके अलावा, जैसा कि माउस पीसीएलएसएस 7 दिनों के लिए संस्कृति माध्यम में वायुमार्ग संकुचन को बनाए रखता है, उन्हें एसएमसी विनियमन के लिए जोखिम कारकों की जांच या मान्य करने के लिए एक पूर्व विवो मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है, जैसे कि साइटोकिन या वायरस एक्सपोजर29। अंत में, पीसीएलएस वासोडिलेटरी या ब्रोन्कोडायलेटरी दवाओं को स्क्रीन करने के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है। विशेष रूप से, पीसीएलएस तैयारी का उपयोग करने वाले बायोएसेस अत्यधिक लागत प्रभावी होते हैं, क्योंकि एक वयस्क माउस सैकड़ों फेफड़ों के स्लाइस उत्पन्न कर सकता है। नियंत्रण और उपचार समूहों में पड़ोसी पीसीएलएसएस का उपयोग करना भी इंटरग्रुप नमूना भिन्नता से प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह को काफी कम कर देता है।

कृंतक और मानव फेफड़ों की शारीरिक रचना के बीच अंतर को ध्यान में रखते हुए, मानव पीसीएलएस अनुवादसंबंधी अनुसंधान के लिए एक अधिक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, मानव फेफड़ों के ऊतकों की सीमित उपलब्धता, विशेष रूप से रोगग्रस्त फेफड़ों के नमूने, एक चुनौती बनी हुई है। इसके विपरीत, माउस फेफड़ों के ऊतक, मानव रोगों के माउस मॉडल और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल व्यापक रूप से जैव चिकित्सा और औषधीय अनुसंधान में लागू होते हैं, जिससे माउस पीसीएलएस एक सुलभ और रोग-प्रासंगिक प्रणाली13,30 हो जाती है। इसके अलावा, इंट्रापल्मोनरी धमनियों का संरक्षण केवल माउस पीसीएलएस तैयारी में सफल रहा है, जो इसे फुफ्फुसीय संवहनी रोगों जैसे फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप में संवहनी विनियमन का पता लगाने के लिए एक अनूठा उपकरण बनाता है। इसलिए, किसी भी बीमारी के मॉडल से जुड़े चेतावनियों के बावजूद, माउस पीसीएलएस तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल स्वास्थ्य और बीमारी में वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियों की जांच के लिए एक पूर्व विवो मंच स्थापित करने के लिए अमूल्य है। हमने और अन्य लोगों ने मानव पीसीएलएसएस31,32,33,34 के साथ फेफड़ों के अनुसंधान की सूचना दी है। हमारे अनुभव में, मानव पीएलसीएस तैयारी का प्रोटोकॉल माउस के समान है, सिवाय 2% की उच्च अगारोज़ एकाग्रता, अधिक अगारोज समाधान (एक फेफड़े के लिए 3 एल), और अगारोज़ इंजेक्शन के लिए मुख्य, लोबार, या खंडीय ब्रांकाई को कैन्युलेट करने के लिए बहुत बड़े आकार के कैथेटर को लागू करने के अलावा। माउस पीएलसीएस तैयारी में अनुभव मानव फेफड़ों के टुकड़े की तैयारी के साथ काफी मदद करता है।

फुफ्फुसीय एसएमसी अनुसंधान में पीसीएलएस तैयारी का उपयोग करने के कई फायदों के बावजूद, इस तकनीक की सीमाओं से अवगत होना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, पीसीएलएस एक स्थिर प्रणाली बनी हुई है, जिसमें शारीरिक श्वास चक्र की कमी होती है जो समय-समय पर फेफड़ों के पैरेन्काइमल और वायुमार्ग को फैलाते हैं। न ही इसमें रक्त परिसंचरण होता है, जो संवहनी एसएमसी पर स्पंदन दबाव और एंडोथेलियल कोशिकाओं पर कतरनी बल उत्पन्न करता है। पीसीएलएस में ये यांत्रिक विविधताएं एसएमसी के सिकुड़ा हुआ विनियमन को संशोधित कर सकती हैं। भले ही पीसीएलएसएस में वायु वेंटिलेशन और रक्त परिसंचरण की पूर्ण स्थापना अप्राप्य है, कम से कम वायुमार्ग एसएमसी अध्ययन के लिए, पिछले दशक में विभिन्न उपकरणों35,36,37 के साथ ऊतक अनुभाग को खींचकर "श्वास" पीसीएलएस उत्पन्न करने के लिए अस्थिर प्रयास किए गए हैं। दूसरा, फुफ्फुसीय एसएमसी केवल सीमित अवधि के लिए अपनी सिकुड़न बनाए रखते हैं। यह समय सीमा पीएलसी को एसएमसी के सबस्यूट परिवर्तनों को मॉडलिंग करने से रोकती है, उदाहरण के लिए, वायुमार्ग एसएमसी को संशोधित करने में 6-7 दिनों से अधिक समय लगने वाली प्रक्रिया। चूंकि पिछले शोध से पता चलता है कि एसएमसी सिकुड़ा हुआ प्रोटीन की कमी के कारण सिकुड़न खो देते हैं, इंसुलिन की अतिरिक्त कम खुराक के साथ संस्कृति माध्यम का अनुकूलन 12 दिनों तक वायुमार्ग एसएमसी संकुचन को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। अंत में, पीसीएलएस के प्लास्मिड या सीआरएनए अभिकर्मक द्वारा फुफ्फुसीय एसएमसी का आनुवंशिक हेरफेर असफल रहता है। पीसीएलएस में ट्रांसफेक्ट एसएमसी के लिए तकनीकी बाधा निश्चित रूप से आगे की जांच की गारंटी देती है, क्योंकि यह विधि फुफ्फुसीय एसएमसी के यांत्रिक अध्ययन के लिए ट्रांसजेनिक पशु मॉडल के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह तकनीक ट्रांसलेशनल रिसर्च में मानव फुफ्फुसीय एसएमसी के आनुवंशिक मॉडुलन को प्राप्त करने के लिए विशेष उपाय है।

यह लेख अच्छी तरह से संरक्षित वायुमार्ग और फुफ्फुसीय धमनियों के साथ माउस पीसीएलएसएस तैयार करने और उन्हें संकुचन और सीए2 + सिग्नलिंग परख में लागू करने का एक व्यापक विवरण प्रदान करता है। पीसीएलएस तैयारी सीटू में कोशिकाओं तक यंत्रवत् अध्ययन पहुंच की अनुमति देते हुए जीवित फेफड़ों के वातावरण में चिकनी मांसपेशियों के कामकाज का समर्थन करती है। इस अनूठी विशेषता ने स्वास्थ्य और बीमारियों में फुफ्फुसीय वायुमार्ग और संवहनी एसएमसी का अध्ययन करने के लिए पीसीएलएस तैयारी को एक बहुमुखी उपकरण बना दिया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान, के08135443 (वाईबी), 1 आर01एचएल132991 (एक्सए) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

जीव विज्ञान अंक 183
वायुमार्ग और इंट्रापल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों के सिकुड़ा हुआ विनियमन का अध्ययन करने के लिए प्रेसिजन-कट फेफड़े के टुकड़े का उपयोग करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter