Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bruk av presisjonskuttet lungeskive for å studere kontraktil regulering av luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskulatur

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Den nåværende protokollen beskriver å forberede og bruke musepresisjonskuttede lungeskiver for å vurdere luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskelkontraktilitet i et nesten in vivo miljø.

Abstract

Glatte muskelceller (SMC) formidler sammentrekningen av luftveien og den intrapulmonale arterien for å modifisere henholdsvis luftstrømmotstand og lungesirkulasjon, og spiller dermed en kritisk rolle i homeostase av lungesystemet. Deregulering av SMC-kontraktilitet bidrar til flere lungesykdommer, inkludert astma og pulmonal hypertensjon. På grunn av begrenset vevstilgang og mangel på dyrkningssystemer for å opprettholde in vivo SMC-fenotyper, forblir imidlertid molekylære mekanismer som ligger til grunn for den deregulerte SMC-kontraktiliteten i disse sykdommene fullstendig identifisert. Den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) tilbyr en ex vivo-modell som omgår disse tekniske vanskelighetene. Som en levende, tynn lungevevsseksjon beholder PCLS SMC i naturlige omgivelser og tillater in situ-sporing av SMC-sammentrekning og intracellulær Ca2+- signalering som regulerer SMC-kontraktilitet. Her er en detaljert mus PCLS forberedelsesprotokoll gitt, som bevarer intakte luftveier og intrapulmonale arterier. Denne protokollen innebærer to viktige trinn før du utsetter lungelappen for kutting: oppblåsing av luftveiene med lavsmeltepunktsagarose gjennom luftrøret og innfylling av lungekar med gelatin gjennom høyre ventrikel. PCLS fremstilt ved hjelp av denne protokollen kan brukes til bioassays for å evaluere Ca2 + -mediert kontraktil regulering av SMC i både luftveier og intrapulmonale arterielle rom. Når den brukes på musemodeller av respiratoriske sykdommer, muliggjør denne protokollen funksjonell undersøkelse av SMC, og gir dermed innsikt i den underliggende mekanismen for SMC-kontraktilitetsderegulering i sykdommer.

Introduction

Glatt muskelcelle (SMC) er en viktig strukturell celletype i lungen, primært bosatt i medieveggen i luftveiene og lungekarene. SMC-er trekker seg sammen for å endre luminalkaliberet, og dermed regulere luft og blodstrøm 1,2. Derfor er kontraktil regulering av SMC avgjørende for å opprettholde homeostase av luftventilasjon og lungesirkulasjon. I motsetning til dette fremkaller avvikende SMC-kontraktilitet obstruktiv luftvei eller lunge vaskulære sykdommer som astma og pulmonal arteriell hypertensjon. Den funksjonelle vurderingen av lunge-SMCer har imidlertid blitt utfordret av begrenset tilgang til lungevevvet, spesielt de små luftveiene og mikroveslene i den distale delen av lungen 2,3. Nåværende løsninger benytter seg av indirekte analyser, for eksempel måling av luftstrømmotstand av Flexivent for å reflektere luftveisinnsnevring, og kontroll av pulmonalt arterielt blodtrykk ved høyre hjertekateterisering for å vurdere pulmonal vasokokontraksjon 4,5. Imidlertid har disse indirekte analysene flere ulemper, for eksempel å bli forvirret av strukturelle faktorer, ikke fange det romlige mangfoldet av luftveier eller vaskulære responser i helelungeskalaen 6,7, og uegnet for den mekanistiske studien av kontraktil regulering på mobilnivå. Derfor har alternative tilnærminger ved bruk av isolerte primære celler, luftrør / bronkie muskelstrimler 8,9 eller store vaskulære segmenter10 blitt brukt for SMC-studien in vitro. Likevel har disse metodene også begrensninger. For eksempel gjør en rask fenotypisk tilpasning av primære SMCer i kulturtilstanden 11,12 det problematisk å ekstrapolere funn fra cellekultur til in vivo-innstillinger. I tillegg kan den kontraktile fenotypen av SMC i de isolerte proksimale luftveis- eller vaskulære segmentene ikke representere SMC-ene i den distale lungen 6,7. Videre forblir muskelkraftmålingen på vevsnivå dissosiert fra molekylære og cellulære hendelser som er avgjørende for mekanistisk innsikt i kontraktil regulering.

Presisjonskuttet lungeskive (PCLS), en seksjon for levende lungevev, gir et ideelt ex vivo-verktøy for å karakterisere lunge-SMCer i et nær in vivo mikromiljø (dvs. bevart multicellulær arkitektur og interaksjon)13. Siden Dr. Placke og Fisher først introduserte tilberedningen av lungeskiver fra agaroseoppblåste rotte- og hamsterlunger på 1980-tallet14,15, har denne teknikken blitt avansert kontinuerlig for å gi PCLSer høyere kvalitet og større allsidighet for biomedisinsk forskning. En signifikant forbedring er forbedring av pulmonal arteriell bevaring ved gelatininfusjon i tillegg til lungeinflasjon med agarose via luftrøret. Som et resultat holdes både luftveier og lungearterier intakte i PCLS for ex vivo-vurdering 16. Videre er PCLS levedyktig i lengre tid i kulturen. For eksempel hadde mus PCLSer ingen signifikant endring i cellens levedyktighet og metabolisme i minst 12 dager i kultur, så vel som de beholdt luftveiskontraktiliteten i opptil 7 dager17. I tillegg holder PCLS forskjellige størrelser luftveier eller fartøy for sammentrekning og avslapningsanalyser. Videre kan intracellulær Ca2+ signalering av SMC, den determinantfaktoren for cellekontraktilitet, analyseres med Ca2+ reporterfarger avbildet av et konfokalt eller 2-foton mikroskop13.

Med tanke på den omfattende anvendelsen av musemodellen i lungeforskning, er en detaljert protokoll beskrevet her for å forberede mus PCLS med intakte luftveier og intrapulmonale arterier for ex vivo lungeforskning. Ved hjelp av de forberedte PCLSene demonstrerte vi deretter hvordan man evaluerer luftveis- og lungearterieresponsene på konstriktive eller relakserende stimuli. I tillegg beskrives også metoden for å laste PCLS med Ca2+ reporterfargestoff og deretter avbilde Ca2+- signalering av SMC-er assosiert med kontraktile eller relakserende responser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All dyrepleie var i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts General Hospital. Villtype C57/B6 hannmus, 8 ukers alder, ble brukt i denne studien.

1. Eksperimentell forberedelse

  1. Forbered arbeidsløsningen.
    1. Forbered 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS, med Ca2+ og Mg2+, og pH balansert med 20 mM HEPES, se materialtabell). Bruk HBSS-løsningen til å klargjøre og behandle PCLS. Hold HBSS-løsningen kald på is når du tilbereder PCLS-er.
  2. Forbered kulturmediet til PCLS ved å supplere Dulbeccos Modified Eagle Medium og F-12 (DMEM-F12) med et antibiotikum-antimykotisk middel (volumforhold 1:100, se Materialtabell).
  3. Forbered 1,5% agarose og 6% gelatinoppløsning.
    1. Bland agarose eller gelatinpulver med lavt smeltepunkt (LMP ) med HBSS-oppløsning separat i 15 ml sterile sentrifugerør (eller 50 ml rør hvis oppløsningsvolumet >10 ml) til endelige konsentrasjoner.
      MERK: Totalt volum av agaroseoppløsning = 5 ml / mus x antall mus; gelatinoppløsning = 2 ml/mus x antall mus.
    2. Varm løsningsrørene i kokende vann til pulveret er helt oppløst. Oppbevar både agarose- og gelatinløsninger i et vannbad på 42 °C.
      MERK: En varmelampe ved disseksjonsbordet kan være nyttig for å holde driftsmiljøet varmt og forhindre at agaroseoppløsningen stivner før den injiseres i muselungen.
  4. Senk alle disseksjonsverktøy, inkludert en dissekerende saks, to par buede mikrodiskerende tang og et par hemostatiske tang i 70% etanoloppløsning i minst 20 minutter for sterilisering.
  5. Hold en vibratom klar (se tabell over materialer) for å dele lungevevet i tynne skiver.
  6. Hold et invertert fasekontrastmikroskop med et CCD-kamera for å evaluere luftveis- eller vaskulære kontraktile responser og et spesialbygd laserskanningskonfokalmikroskop (se materialtabell) for å vurdere Ca2+ signalering i pulmonale SMCer18.

2. Oppblåsing av muselunger med agarose og gelatinoppløsning

  1. Avliv musen.
    1. Plasser musen i et plastkammer (rundt 750 cm3) med 5 % isofluran. Hold musen i kammeret til den slutter å puste i minst 1 min.
      MERK: Andre primære eutanasimetoder, som intraperitoneal injeksjon av ketamin (240 mg/kg) og xylazin (32 mg/kg)19 eller pentobarbital (0,3 ml)20, kan brukes som alternativer til inhalert isofluran.
    2. Plasser musekroppen på et disseksjonsbrett i den bakre posisjonen. Fest kroppen på plass ved å feste halen, forpotene og hodet med 25 G sprøytespisser, og desinfiser kroppen med 70% etanolspray.
    3. Klipp opp musens mage med kirurgisk saks (snitt, ~ 2 cm lang x 2 cm bred). Deretter kutter du av abdominal aorta for å tømme blodvolumet.
  2. Blås opp lungelappene ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Åpne brysthulen forsiktig langs brystbenet og det bilaterale nedre ribbe buret over membranen, og observer lungelappene kollapse når brysthulen åpnes.
    2. Fjern en del av bilaterale ventrale ribbe bur for å eksponere hjertet. Unngå lungeskader ved å peke den skarpe saksespissen bort fra lungevevvet.
    3. Bruk tang for å skille thymus og bløtvev i musehalsen for å eksponere luftrøret.
    4. Skjær et lite hull (1,2 mm i diameter) i den øvre enden av luftrøret slik at spissen av et 20 G Y-formet IV kateter passerer (se materialtabell).
    5. Koble den ene adapterporten til det Y-formede kateteret med en 3 ml sprøyte ferdigfylt med 0,5 ml luft, og den andre porten med en 3 ml sprøyte ferdigfylt med 2 ml varm 1,5 % agaroseoppløsning (42 °C).
    6. Injiser agaroseoppløsning for å fylle kateteret og skyv deretter kateteret gjennom den forhåndskuttede åpningen inn i luftrøret i 5-8 mm lengde.
    7. Injiser langsomt agaroseoppløsningen ved rundt 1 ml/5 s. Lungen vil utvide seg langs den proksimale til distale aksen. Stopp injeksjonen når kanten av hver lungelapp er oppblåst.
      MERK: Ikke overinflate lungen, da dette kan briste den. Volumet av agaroseoppløsning for å blåse opp hele lungen til en ung voksen mus er ca. 1,3 ± 0,1 ml.
    8. Injiser 0,2-0,3 ml luft fra den andre sprøyten for å presse gjenværende agarose i kateteret og ledende luftveier til det distale alveolrommet.
    9. Klipp lukk luftrøret med et par buede hemostatiske tang (se Materialtabell).
  3. Fyll lungevaskulaturen.
    1. Fyll en 1 ml sprøyte med varm 6% gelatin. Koble til en nål hodebunnen venekateter, fyll kateteret med gelatinoppløsning, og punkter deretter høyre ventrikel nær den nedre veggen med nålen.
    2. Skyv nålen inn i høyre ventrikel i 2-3 mm lengde og pek nålespissen mot hovedpulsåren.
    3. Injiser 0,2 ml gelatinoppløsning sakte inn i høyre ventrikel og pulmonale arterielle kar.
      MERK: Lungelappene virker litt blekere med passende gelatininflasjon.
    4. Hold nålen på plass i 5 minutter etter injeksjon, avkjøl lungelappene ved å helle iskald HBSS-løsning på hjertet og lungen, og legg deretter kroppen med disseksjonsbrettet i et kjøleskap på 4 °C eller på is i totalt 10 minutter.
    5. Fjern musen lunge og hjerte fra omkringliggende bindevev med saks. Deretter skiller du hver lungelapp og holder dem i HBSS-løsning på is.

3. Inndeling av lungelapper til tynne skiver

  1. Trim og fest lungelappen på toppen av prøvesøylen med superlim, og orienter (figur 1A,B) slik at skjæreretningen blir vinkelrett på de fleste luftveier fra hila til lungeoverflaten.
  2. Bruk en vibratom med et friskt tynt barberblad for å kutte lungelappen i 150 μm skiver. Samle skivene i 100 mm sterile petriskåler ferdigfylt med kald HBSS-løsning.
    MERK: Still inn riktig bladbevegelseshastighet og oscillasjonsfrekvens før du begynner å skjære. En typisk innstilling for en Compresstom er hastighetsnivå 4 og oscillasjonsnivå 4.
  3. Overfør skiver til petriskåler fylt med DMEM/F-12 kulturmedium (20 skiver/15 ml medium/fat) og vedlikehold dem i en 37 °C inkubator over natten før eksperimenter.
    MERK: Mus PCLSer kan opprettholdes i kultur i ca 7 dager uten å miste luftveis kontraktile responser17. Levetiden til lungearteriene har ikke blitt grundig evaluert. I vår observasjon beholder de intakt struktur og vasoreaction i minst 3 dager i DMEM / F12 medium. For langtidslagring kan PCLSSer fra mus plasseres i kryovialer fylt med DMEM/F12-medium som inneholder 10 % DMSO (5 skiver i 1 ml medium per hetteglass), fryses i en beholder fylt med isopropylalkohol ved -80 °C over natten, og kryopreserveres i flytende nitrogen i uker til måneder21.

4. Analysere kontraktile responser av intrapulmonale luftveier og arterier

  1. Plasser PCLSer i en HBSS-fylt 24-brønns kulturplate, en i hver brønn. Finn PCLS i midten av brønnen, og fjern deretter HBSS-løsningen med en pipette.
  2. Finn målluftveien og beholderen i skiven under mikroskopet, og dekk deretter skiven ved hjelp av et nylonnett med et forhåndsskåret sentralt hull (2-3 mm i diameter) for å eksponere målområdet.
  3. Legg ned en hul metallskive på toppen av nettet for å holde skivene på plass (figur 2A).
  4. Tilsett 600 μL HBSS-løsning for å senke PCLS. Hvil skiven i 10 minutter, og ta deretter opp grunnlinjebildene av luftveier eller fartøy.
  5. Induser luftveien eller vaskulær sammentrekning ved forsiktig å suge ut den tomme HBSS-løsningen med en pipette og tilsett 600 μL HBSS med en agonist, for eksempel 1 μM metakolin (MCh) eller 10 nM endotelin (se materialtabell).
    MERK: KCl-stimulering som verktøysettstandard er ikke nødvendig før metakolin- eller endotelineksponering. 100 mM KCl-stimulering i museluftveier induserer bare en liten og uregelmessig luftveiskontraksjon (10% -15%)20. På samme måte er en priming metakolinstimulering ikke forpliktet, da vi har bekreftet at den samme agonisten, for eksempel metakolin eller serotonin, utløser lignende luftveiskontraksjon ved første og repeterende eksponeringer20,22.
  6. Vær oppmerksom på reaksjonen under mikroskopet til endringen i luminalområdet når en likevektsstatus, og registrer deretter luftveis- eller vaskulære bilder for analyse.
  7. Fjern MCh eller endotelinoppløsning med pipette og tilsett en ny 600 μL HBSS-løsning med samme agonistkonsentrasjon og et avslappende middel; observere og registrere luftveien eller vaskulær avslapning.
  8. Kvantifiser luftveien eller vaskulær reaksjon ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Last bildene til NIH-sponset fri programvare FIJI.
    2. Velg markeringen av polygon på verktøylinjen for å omrisse luftveien eller det vaskulære lumen på hvert delbilde.
    3. Velg Analyser > Angi mål > område.
    4. Velg Analyser > mål for å kvantifisere interesseområdet. Resultatene vises i et eget vindu for statistisk analyse.

5. Analysere Ca2+ signalering av luftveier eller vaskulære SMCer

  1. Forbered Ca2+ fargebelastningsbufferen.
    1. Løs opp Ca2+ fargestoff, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (se materialtabell), 50 μg (ett hetteglass) med 10 μL DMSO.
    2. Løs opp 0,2 g Pluronic F-12 pulver (se materialtabell) i 1 ml DMSO for å generere en 20 % pluronisk oppløsning.
    3. Bland 10 μL 20% pluronisk oppløsning med 10 μL Ca2+ fargestoff-DMSO-løsning.
    4. Lag Ca2+ fargestoffbelastningsbuffer ved å tilsette 20 μL av blandingen til 2 ml HBSS-løsning med 200 μM sulfobromoftalein (se materialtabell).
  2. Plasser 15 mus PCLSer i 2 ml Ca2+ lastebuffer og inkuber ved 30 °C i 1 time. Flytt deretter skivene til 2 ml HBSS-løsning med 100 μM sulfobromoftalin i ytterligere 30 minutter for fluorescerende fargestoffavesterifisering ved romtemperatur.
  3. Oppdag Ca2+ signalering av SMC-er.
    1. Plasser Ca2+ fargebelastede skiver på et stort dekselglass.
    2. Fyll en 3 ml sprøyte med høyvakuum silikonfett. Klem fettet gjennom en 18 G buttet nål for å tegne to parallelle linjer over dekkglasset over og under skiven.
    3. Dekk skiven med et nylonnett mellom to fettlinjer. Plasser det andre dekselglasset på toppen av nettet for å generere et kammer forseglet av fett på sidene (figur 3A).
      NOTAT: Nylonnettet er viktig for å holde skiven festet til bunndekselet og dermed holde seg innenfor arbeidsavstanden til et omvendt mål av høy størrelse, for eksempel 40x olje.
    4. Tilsett HBSS eller agonistløsning i kammeret fra den ene enden ved pipettering manuelt eller via et perfusjonssystem. Fjern væsken fra kammeret ved å suge fra den andre enden med silkepapir eller vakuum ved kontinuerlig væskeperfusjon.
    5. Sett PCLS-kammeret på mikroskopstadiet. Oppdag Ca2+ -signaleringen til SMC23 med et spesialbygd konfokalmikroskop for resonansskanning med en laserskanningshastighet på 15 eller 30 bilder/s.
      MERK: Alternativt kan et høyhastighets kommersielt laserskanningskonfokalmikroskop, allment tilgjengelig for tiden, brukes i Ca2 + signalanalyse av lunge-SMCer i PCLS.
  4. Kvantifiser Ca2+ fluorescens i SMC.
    1. Last inn den innspilte bildesekvensen til FIJI, og velg Image > Type > 8-bits gråtoner.
    2. Velg Rektangelvalget på verktøylinjen, og definer et interesseområde på 5 x 5 piksler i en glatt muskelcelle.
    3. Velg Analyser > Angi målinger > gjennomsnittlig gråverdi , som representerer fluorescensintensiteten Ca2+ .
    4. Hvis plasseringen av en avkastning endres med SMC-sammentrekning, velger du Analyser > Mål ca2+ fluorescerende intensitet ramme for ramme.
    5. Hvis avkastningen på SMC forblir i en lignende posisjon i en stabel med bilder, velger du Bilde > stakker > Mål stabel med ca2+ fluorescerende intensitet.
      MERK: En spesialskrevet makro kan kobles til for å spore avkastningen i SMC når den beveger seg med sammentrekning i en bildestakk og måler automatisk Ca2+ -intensiteten (gråverdien) for ROI ramme for ramme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pcls-preparat fra mus som bevarer intakte intrapulmonale luftveier og arterier
En 150 μm tykk PCLS ble observert under det inverterte fasekontrastmikroskopet. I muselunger er ledende luftveier ledsaget av intrapulmonale arterier, som går fra hilus til perifer lunge. En representativ pulmonal luftveisarteriebunt i muse-PCLS er vist i figur 2B. Luftveien kan lett identifiseres av kuboidale epitelceller med aktiv cilial juling som fôrer den indre overflaten av lumen. I motsetning til dette er den nærliggende lungearterien omtalt av flatt endotel. Når man når det perifere lungefeltet, forgrener de ledende luftveiene seg til luftveier og sekker, som omgir de små intra-acinære arteriolene (figur 2C).

Bruk av mus PCLS for å vurdere pulmonale luftveier og arteriell sammentrekning
Metakolin (MCh, 1 μM) indusert luftveiskontraksjon er vist i figur 2B. Luftveiskontraktile responser kvantifiseres ved prosentandel av luminalarealreduksjon etter MCh-eksponering (figur 2D). Lungearterien har derimot ingen respons på MCh-stimuli (figur 2B). Airways opprettholder lignende doseavhengige kontraktile responser på MCh i PCLS etter 1-dagers eller 5-dagers kultur (figur 2D). Når PCLS eksponeres for endotelin (10 nM), innsnevres både luftveier og lungearterier (figur 2C,E), etterfulgt av NOC-5 (100 μM) relaksasjon (figur 2E).

Bruk av mus PCLS for å vurdere Ca2+ signalering av luftveier og arteriell SMC
Ca2+ fargebelastet PCLS observeres under et konfokalt fluorescerende mikroskop. Ca2+ -fluorescensen i luftveiene (figur 3B) og vaskulære (figur 3C) SMC-er er lav ved hvilestatus, uten at fokal gnist av intracellulær Ca2+- signalering er merkbar. Ved eksponering for agonister øker Ca2+ fluorescensintensiteten i SMC (figur 3B, C), vanligvis fra ett sted og deretter forplanter seg til hele cellen. Ca2+ fluorescerende bølger vises gjentatte ganger i samme celle som oscillerende signaler (figur 3D, E). Generelt øker frekvensen av Ca2+ oscillasjon etter hvert som agonistkonsentrasjonen stiger til den når et platånivå24. Airway SMC-relaksasjon er assosiert med reduksjon eller opphør av Ca2+- svingninger25.

Figure 1
Figur 1: Orientering av lungelapper fra mus for vibratomsnitt. Musens lungelapper er delt inn i individuelle for seksjoner. (A) Venstre (1), høyre kranial (2) og kaudale lober (3) trimmes nær hilum langs de hvite stiplede linjene før de stikker den flate skjæreflaten på prøvesøylen. Plasseringen av venstre er vist i (4). (B) Den høyre midtlappen kan limes direkte til prøvekolonnen. Den høyre tilbehørslappen ble ikke ofte brukt på grunn av sin lille størrelse. Passende orientering av forskjellige lober sikrer at de fleste luftveier og lungekar presenterer tverrseksjoner i PCLS. Skalalinje = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Kontraktile og relakserende responser av luftveier og lungearterier i mus PCLS. (A) Skjematisk viser plassering av en PCLS i en kulturplate godt for kontraksjonsanalyse. (B) Representative bilder som viser en luftvei (svarte piler) med en nærliggende lungearterie (svarte pilspisser) i HBSS i ro og etter eksponering for 1 μM metakolin (MCh). (C) Representative bilder som viser en intra-acinær arteriole i HBSS i hvile og ved eksponering for 10 nM endotelin (Endo). (D) Doseavhengige luftveiskontraktile responser på MCh i PCLSer etter 1-dagers (grå linje) og 5-dagers (svart stiplet linje) kultur. Hvert punkt representerer gjennomsnittlig ± SEM på ni luftveier fra to mus. (E) Representative bilder som viser 10 nM endotelinindusert luftvei og pulmonal arteriell sammentrekning, etterfulgt av 100 μM NOC-5, en nitrogenoksiddonor, induserte avslapning. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Ca2+-signalering av luftveier og pulmonale arterielle SMC-er i PCLS. (A) Skjematisk som viser oppsettet av et kammer med et topp- og bunndekselglass, fettforsegling og et nylonnett for å holde en PCLS i fokalplanet for Ca2+ avbildning av SMCer. (B) Representative fluorescerende bilder som viser Ca2+ signalering av luftveis-SMCer i ro og etter eksponering for 1 μM MCh. Epi, epitelcelle. (C) Ca2+ fluorescerende bilder av pulmonale arterielle SMCer i hvile og etter eksponering for 10 nM endotelin (Endo). De dristige hvite pilene indikerer lungearteriens lengdeakse, og de stiplede linjene med endepiler indikerer spiralfordelingen av vaskulære SMCer rundt arterieveggen. Skala bar = 20 μm. Oscillerende økning av Ca2+ fluorescensintensitet (Ft), i forhold til fluorescensintensiteten ved hviletilstand (F0), i en luftveis SMC til 1 μM MCh (D) og i en pulmonal arteriell SMC som respons på 10 nM endotelinstimulering (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utarbeidelsen av PCLS innebærer flere kritiske trinn. For det første er det viktig å blåse opp lungelappen homogent for å unngå variasjon av vevsstivhet fra ujevn agarosefordeling. Siden væsken agarose raskt gelerer i tynne katetre eller luftveier ved en temperatur under 37 °C, kan den resulterende fyllingsdefekten i det distale lungefeltet øke forskjellen i stivhet i lungevevet og forårsake vevsrivning under vibratomsnittet. Derfor kan det praktiseres å holde den lavsmeltende agaroseoppløsningen ved 42 °C i et vannbad og bruke en varmelampe ved disseksjonsbordet for å unngå rask agarosegelering. En rask injeksjon kan presse mer agarose til lungeparenchymen med høyere etterlevelse, og må derfor unngås. Den manuelle agarose injeksjon tar vanligvis rundt 5-7 s. For det andre er et nødvendig trinn på slutten av agarosefylling å skyve en liten mengde luft (~ 0,2 ml) for å skylle agarose fra den ledende luftveien til det distale alveolrommet. Ellers ville agarose gel og holde seg i lumen for å motstå luftveiskontraksjonen. Det er også verdt å merke seg at agarosegeleringen inne i alveolene holder seg på plass og smelter aldri igjen ved 37 °C i inkubatoren. Agarosegelen spiller en viktig rolle i å holde 3D-strukturen i lungevevet som in vivo opprettholdt av det negative intratorakale trykket. For det tredje er det viktig å perfusere lungearterier med gelatinoppløsning for å holde arteriell lumen åpent i PCLS. Gelatinoppløsningen gelerer ved romtemperatur som en mekanisk blokkering for å motstå vasokonstriksjon på kjemiske og fysiske stimuli under vevsseksjonen. Uten gelatininflasjon kollapser lungearteriene i lungeskiver vanligvis og løsner fra det omkringliggende interstitielle vevet, selv i nærvær av høye doser blandede vasodilatoriske midler, inkludert fentolamin, epinefrin og nifedipin13,16. I motsetning til en agarosegel smelter gelatingel ved 37 °C, som strømmer ut av det vaskulære lumen etter inkubering over natten, slik at arteriell lumen blir fri for obstruksjon før vaskulær reaksjonsanalyse.

Siden PCLS bevarer pulmonale SMCer in situ og beholder sin kontraktile funksjon i en nesten in vivo tilstand, har den blitt brukt som en kraftig plattform for å undersøke reguleringen av SMC-sammentrekning, spesielt reguleringen via Ca2+ avhengige mekanismer26. Spesielt med et lav-forstørrelse flerkanals konfokalt eller to-foton mikroskop, kan agonist-indusert Ca2 + signalering i luftveis SMCs og tilhørende luminal innsnevring fanges samtidig for mekanistisk studie13,20. Luftveis- eller vaskulær respons målt med PCLS-metoden forventes å reflektere cellulære egenskaper uten påvirkning fra lungemiljøet, som det inflammatoriske miljøet, og nevral innervering av responsen i lungen27,28. Som sådan gir PLCS et eksperimentelt system for å skille mellom inneboende vs. sekundær SMCs modifikasjon. I tillegg til å undersøke kontraktil regulering av SMC i helse- og sykdomsmodeller, har PCLSer blitt samlet inn fra ulike aldersgrupper for å utforske funksjonell tilpasning av luftveis SMC under postnatal lungeutvikling og som svar på miljømessige fornærmelser27. Videre inneholder PCLSer forskjellige størrelser luftveier og blodkar fra perifert til det proksimale lungefeltet, noe som muliggjør undersøkelse av en regionspesifikk mekanisme for å regulere lunge-SMCs kontraktilitet i homeostase og under patogene stimuli. Videre, da mus PCLSer beholder luftveiskontraktiliteten i kulturmediet i 7 dager17, har de blitt brukt som en ex vivo-modell for å undersøke eller validere risikofaktorer for SMC-deregulering, for eksempel cytokin eller viruseksponering29. Til slutt gir PCLS en ideell plattform for å skjerme vasodilatoriske eller bronkodilaterende medisiner. Spesielt er bioassays ved hjelp av PCLS-preparat svært kostnadseffektive, da en voksen mus kan generere hundrevis av lungeskiver. Bruk av nabo-PCLS-er i kontroll- og behandlingsgruppene reduserer også den eksperimentelle skjevheten fra variasjon mellom grupper.

Tatt i betraktning forskjellen mellom gnager og menneskelig lungeanatomi, er den menneskelige PCLS et kraftigere verktøy for translasjonsforskning. Imidlertid er den begrensede tilgjengeligheten av menneskelig lungevev, spesielt syke lungeprøver, fortsatt en utfordring. I motsetning til dette er mus lungevev, musemodeller av menneskelige sykdommer og transgene musemodeller mye brukt i biomedisinsk og farmakologisk forskning, noe som gjør mus PCLS til et tilgjengelig og sykdomsrelevant system13,30. I tillegg har bevaring av intrapulmonale arterier vært vellykket bare i mus PCLS forberedelse, noe som gjør det til et unikt verktøy for å utforske vaskulær deregulering i lunge vaskulære sykdommer som pulmonal hypertensjon. Derfor, til tross for advarsler forbundet med noen sykdomsmodeller, er en protokoll for mus PCLS-forberedelse uvurderlig for å etablere en ex vivo-plattform for å undersøke luftveier og lungearterier i helse og sykdom. Vi og andre har rapportert lungeforskning med humane PCLSer 31,32,33,34. Etter vår erfaring er protokollen for human PLCS-forberedelse lik musen, bortsett fra å bruke en høyere agarosekonsentrasjon på 2%, mer agaroseløsning (3 L for en lunge) og mye større katetre for å kanylere hoved-, lobar- eller segmentbronkriner for agaroseinjeksjon. Erfaring i mus PLCS forberedelse hjelper enormt med menneskelig lunge skive forberedelse.

Til tross for mange fordeler ved å bruke PCLS-preparat i lunge-SMC-forskning, er det avgjørende å være klar over begrensningene i denne teknikken. For det første forblir PCLS et statisk system, som mangler fysiologiske pustesykluser som periodisk strekker lungeparenkymalen og luftveiene. Det inneholder heller ikke blodsirkulasjon, noe som genererer pulserende trykk på vaskulære SMCer og skjærekrefter på endotelceller. Disse mekaniske variasjonene i PCLS kan endre kontraktilreguleringen av SMCer. Selv om en full etablering av luftventilasjon og blodsirkulasjon i PCLSer er uoppnåelig, i hvert fall for luftveis SMC-studien, har vagarious innsats blitt plassert det siste tiåret for å generere en "pustende" PCLS ved å strekke vevsseksjonen med en rekke enheter 35,36,37. For det andre opprettholder lunge-SMCer sin kontraktilitet bare i en begrenset periode. Denne tidsbegrensningen forhindrer PLCS i å modellere de subakutte endringene til SMC-er, for eksempel en prosess som tar mer enn 6-7 dager å modifisere SMC-er i luftveiene. Siden tidligere forskning viser at SMCer mister kontraktilitet på grunn av en reduksjon av kontraktile proteiner, har optimalisering av kulturmediet med en ekstra lav dose insulin vist seg å opprettholde luftveien SMC-sammentrekning i opptil 12 dager17. Til slutt forblir den genetiske manipulasjonen av lunge-SMCer ved plasmid- eller siRNA-transfeksjon av PCLS mislykket. Den tekniske barrieren for transfekte SMCer i PCLS garanterer absolutt videre undersøkelse, da denne metoden gir en alternativ tilnærming til den transgene dyremodellen for den mekanistiske studien av lunge-SMCer. Enda viktigere, denne teknikken er det eksklusive tiltaket for å oppnå genetisk modulering av humane lunge-SMCer i translasjonsforskning.

Denne artikkelen gir en omfattende beskrivelse av klargjøring av mus PCLSer med godt bevarte luftveier og lungearterier og påføring av dem i sammentreknings- og Ca2+ -signalanalysene. PCLS-forberedelse støtter glatt muskelfunksjon i et levende lungemiljø, samtidig som mekanistisk studietilgang til celler in situ. Denne unike funksjonen har gjort PCLS-preparatet til et allsidig verktøy for å studere pulmonale luftveier og vaskulære SMCer i helse og sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av NIH tilskudd, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

Biologi utgave 183
Bruk av presisjonskuttet lungeskive for å studere kontraktil regulering av luftveier og intrapulmonal arteriell glatt muskulatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter