Summary
Il presente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .
Abstract
Le cellule muscolari lisce (SMC) mediano la contrazione delle vie aeree e dell'arteria intrapolmonare per modificare rispettivamente la resistenza al flusso d'aria e la circolazione polmonare, svolgendo quindi un ruolo critico nell'omeostasi del sistema polmonare. La deregolamentazione della contrattilità SMC contribuisce a diverse malattie polmonari, tra cui l'asma e l'ipertensione polmonare. Tuttavia, a causa del limitato accesso ai tessuti e della mancanza di sistemi di coltura per mantenere fenotipi SMC in vivo , i meccanismi molecolari alla base della contrattilità SMC deregolata in queste malattie rimangono pienamente identificati. La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS) offre un modello ex vivo che aggira queste difficoltà tecniche. Come sezione di tessuto polmonare vivo e sottile, il PCLS mantiene l'SMC in un ambiente naturale e consente il monitoraggio in situ della contrazione SMC e della segnalazione intracellulare Ca2+ che regola la contrattilità SMC. Qui viene fornito un protocollo dettagliato di preparazione PCLS del topo, che conserva intatte le vie aeree e le arterie intrapolmonari. Questo protocollo prevede due passaggi essenziali prima di sottoporre il lobo polmonare all'affettamento: gonfiare le vie aeree con agarosio a basso punto di fusione attraverso la trachea e riempire i vasi polmonari con gelatina attraverso il ventricolo destro. Il PCLS preparato utilizzando questo protocollo può essere utilizzato per biosaggi per valutare la regolazione contrattile mediata da Ca2+ di SMC sia nelle vie aeree che nei compartimenti arteriosi intrapolmonari. Quando applicato a modelli murini di malattie respiratorie, questo protocollo consente l'indagine funzionale di SMC, fornendo così informazioni sul meccanismo alla base della deregolazione della contrattilità SMC nelle malattie.
Introduction
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono un importante tipo di cellula strutturale nel polmone, che risiede principalmente nella parete media delle vie aeree e dei vasi polmonari. Gli SMC si contraggono per alterare il calibro luminale, regolando così l'aria e il flusso sanguigno 1,2. Pertanto, la regolazione contrattile delle SMC è essenziale per mantenere l'omeostasi della ventilazione dell'aria e della circolazione polmonare. Al contrario, la contrattilità Aberrante SMC provoca vie aeree ostruttive o malattie vascolari polmonari come l'asma e l'ipertensione arteriosa polmonare. Tuttavia, la valutazione funzionale delle SMC polmonari è stata messa in discussione da un accesso limitato al tessuto polmonare, in particolare quelle piccole vie aeree e microvasi nella parte distale del polmone 2,3. Le soluzioni attuali ricorrono a saggi indiretti, come la misurazione della resistenza del flusso d'aria da parte di Flexivent per riflettere la costrizione delle vie aeree e il controllo della pressione arteriosa polmonare mediante cateterizzazione del cuore destro per valutare la vasocontrazione polmonare 4,5. Tuttavia, questi saggi indiretti presentano molteplici svantaggi, come essere confusi da fattori strutturali, non riuscire a catturare la diversità spaziale delle vie aeree o delle risposte vascolari nell'intera scala polmonare 6,7 e inadatti allo studio meccanicistico della regolazione contrattile a livello cellulare. Pertanto, per lo studio SMC sono stati applicati approcci alternativi che utilizzano cellule primarie isolate, strisce muscolari trachea/bronchi 8,9 o grandi segmenti vascolari10. Tuttavia, questi metodi hanno anche delle limitazioni. Ad esempio, un rapido adattamento fenotipico delle SMC primarie nella condizione di coltura11,12 rende problematico estrapolare i risultati dalla coltura cellulare alle impostazioni in vivo. Inoltre, il fenotipo contrattile delle SMC nelle vie aeree prossimali isolate o nei segmenti vascolari può non rappresentare le SMC nel polmone distale 6,7. Inoltre, la misurazione della forza muscolare a livello tissutale rimane dissociata dagli eventi molecolari e cellulari che sono essenziali per la comprensione meccanicistica della regolazione contrattile.
La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS), una sezione di tessuto polmonare vivo, fornisce uno strumento ex vivo ideale per caratterizzare le SMC polmonari in un microambiente quasi in vivo (cioè l'architettura e l'interazione multicellulare conservate)13. Da quando i dottori Placke e Fisher hanno introdotto per la prima volta la preparazione di fette polmonari da polmoni di ratto e criceto gonfiati di agarosio negli anni 1980 14,15, questa tecnica è stata continuamente avanzata per fornire AI PCLS una qualità superiore e una maggiore versatilità per la ricerca biomedica. Un miglioramento significativo è il miglioramento della conservazione arteriosa polmonare mediante infusione di gelatina oltre al gonfiaggio polmonare con agarosio attraverso la trachea. Di conseguenza, sia le vie aeree che le arterie polmonari sono mantenute intatte nel PCLS per la valutazione ex vivo 16. Inoltre, il PCLS è praticabile per un tempo prolungato in coltura. Ad esempio, i PCLS di topo non hanno avuto cambiamenti significativi nella vitalità cellulare e nel metabolismo per un minimo di 12 giorni in coltura, oltre a mantenere la contrattilità delle vie aeree fino a 7 giorni17. Inoltre, PCLS mantiene vie aeree o vasi di dimensioni diverse per i test di contrazione e rilassamento. Inoltre, la segnalazione intracellulare Ca2+ delle SMC, il fattore determinante della contrattilità cellulare, può essere dosata con coloranti Reporter Ca2+ ripresi da un microscopio confocale o a 2 fotoni13.
Considerando l'ampia applicazione del modello murino nella ricerca polmonare, qui viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di PCLS murini con vie aeree intatte e arterie intrapolmonari per la ricerca polmonare ex vivo . Utilizzando i PCLS preparati, abbiamo successivamente dimostrato come valutare le vie aeree e le risposte arteriose polmonari a stimoli costrittivi o rilassanti. Inoltre, viene descritto anche il metodo di caricamento del PCLS con colorante reporter Ca2+ e quindi l'imaging della segnalazione Ca2+ di SMC associati a risposte contrattili o rilassanti.
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Protocol
Tutta la cura degli animali era conforme alle linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee del Massachusetts General Hospital. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi di tipo C57/B6 di tipo selvatico, di 8 settimane di età.
1. Preparazione sperimentale
- Preparare la soluzione di lavoro.
- Preparare 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, con Ca2+ e Mg2+, e pH bilanciato con 20 mM HEPES, vedere Tabella dei materiali). Utilizzare la soluzione HBSS per preparare ed elaborare il PCLS. Mantenere la soluzione HBSS fredda sul ghiaccio durante la preparazione dei PCLS.
- Preparare il terreno di coltura di PCLS integrando l'Eagle Medium modificato di Dulbecco e l'F-12 (DMEM-F12) con un agente antibiotico-antimicotico (rapporto volume 1:100, vedere Tabella dei materiali).
- Preparare la soluzione di agarosio all'1,5% e gelatina al 6%.
- Mescolare separatamente l'agarosio a basso punto di fusione (LMP) o la gelatina in polvere (vedere Tabella dei materiali) con la soluzione HBSS in tubi centrifughi sterili da 15 mL (o tubi da 50 mL se il volume della soluzione >10 mL) alle concentrazioni finali.
NOTA: Volume totale della soluzione di agarosio = 5 ml/mouse x numero di topi; soluzione di gelatina = 2 ml/mouse x numero di topi. - Riscaldare i tubi della soluzione in acqua bollente fino a quando la polvere non si dissolve completamente. Conservare le soluzioni di agarosio e gelatina a bagnomaria a 42 °C.
NOTA: Una lampada riscaldante sul tavolo di dissezione può essere utile per mantenere caldo l'ambiente operativo e impedire che la soluzione di agarosi si solidifichi prima di essere iniettata nel polmone del topo.
- Mescolare separatamente l'agarosio a basso punto di fusione (LMP) o la gelatina in polvere (vedere Tabella dei materiali) con la soluzione HBSS in tubi centrifughi sterili da 15 mL (o tubi da 50 mL se il volume della soluzione >10 mL) alle concentrazioni finali.
- Immergere tutti gli strumenti di dissezione, tra cui un paio di forbici di dissezione, due paia di pinze di micro-dissezione curve e un paio di pinze emostatiche in soluzione di etanolo al 70% per almeno 20 minuti per la sterilizzazione.
- Tenere un vibratoma pronto (vedere Tabella dei materiali) per sezionare il tessuto polmonare in fette sottili.
- Tenere un microscopio a contrasto di fase invertito con una telecamera CCD per valutare le risposte contrattili delle vie aeree o vascolari e un microscopio confocale a scansione laser personalizzato (vedere Tabella dei materiali) per valutare la segnalazione Ca2+ nelle SMC polmonari18.
2. Gonfiaggio dei polmoni di topo con soluzione di agarosio e gelatina
- Eutanasia del mouse.
- Posizionare il mouse in una camera di plastica (circa 750 cm3) con il 5% di isoflurano. Tenere il mouse nella camera fino a quando non smette di respirare per almeno 1 minuto.
NOTA: Altri metodi di eutanasia primaria, come l'iniezione intraperitoneale di ketamina (240 mg/Kg) e xilazina (32 mg/Kg)19 o pentobarbital (0,3 ml)20, possono essere applicati in alternativa all'isoflurano per via inalatoria. - Posizionare il corpo del mouse su una scheda di dissezione in posizione supina. Fissa il corpo in posizione bloccando la coda, le zampe anteriori e la testa con aghi per siringhe da 25 G e disinfetta il corpo con spray al 70% di etanolo.
- Tagliare l'addome del topo con le forbici chirurgiche (incisione, ~ 2 cm di lunghezza x 2 cm di larghezza). Quindi, tagliare l'aorta addominale per esaurire il volume del sangue.
- Posizionare il mouse in una camera di plastica (circa 750 cm3) con il 5% di isoflurano. Tenere il mouse nella camera fino a quando non smette di respirare per almeno 1 minuto.
- Gonfiare i lobi polmonari seguendo i passaggi seguenti.
- Aprire attentamente la cavità toracica lungo lo sterno e la gabbia toracica inferiore bilaterale sopra il diaframma e osservare i lobi polmonari collassare quando la cavità toracica si apre.
- Rimuovere parte delle gabbie toraciche ventrali bilaterali per esporre il cuore. Evitare danni ai polmoni puntando la punta affilata della forbice lontano dal tessuto polmonare.
- Utilizzare una pinza per separare il timo e i tessuti molli nel collo del topo per esporre la trachea.
- Tagliare un piccolo foro (1,2 mm di diametro) all'estremità superiore della trachea che consente il passaggio della punta di un catetere IV a forma di Y da 20 G (vedi Tabella dei materiali).
- Collegare una porta adattatore del catetere a forma di Y con una siringa da 3 mL preriempita con 0,5 mL di aria e l'altra porta con una siringa da 3 mL preriempita con 2 mL di soluzione calda di agarosio all'1,5% (42 °C).
- Iniettare la soluzione di agarosio per riempire il catetere e quindi spingere il catetere attraverso l'apertura pretagliata nella trachea per 5-8 mm di lunghezza.
- Iniettare lentamente la soluzione di agarosio a circa 1 mL/5 s. Il polmone si espanderà lungo l'asse prossimale-distale. Interrompere l'iniezione quando il bordo di ciascun lobo polmonare è gonfiato.
NOTA: Non gonfiare eccessivamente il polmone, in quanto ciò potrebbe romperlo. Il volume della soluzione di agarosio per gonfiare l'intero polmone di un topo giovane adulto è di circa 1,3 ± 0,1 ml. - Iniettare 0,2-0,3 mL di aria dall'altra siringa per spingere l'agarosio residuo nel catetere e nelle vie aeree conduttive nello spazio degli alveoli distali.
- Clip chiudere la trachea con un paio di pinze emostatiche curve (vedi Tabella dei materiali).
- Riempire la vascolarizzazione polmonare.
- Riempire una siringa da 1 mL con gelatina tiepida al 6%. Collegare a un catetere venoso del cuoio capelluto ad ago, riempire il catetere con una soluzione di gelatina, quindi perforare il ventricolo destro vicino alla parete inferiore con l'ago.
- Spingere l'ago nel ventricolo destro per 2-3 mm di lunghezza e puntare la punta dell'ago verso l'arteria polmonare principale.
- Iniettare lentamente 0,2 mL di soluzione di gelatina nel ventricolo destro e nei vasi arteriosi polmonari.
NOTA: I lobi polmonari appaiono leggermente più chiari con un adeguato gonfiaggio della gelatina. - Tenere l'ago in posizione per 5 minuti dopo l'iniezione, raffreddare i lobi polmonari versando la soluzione di HBSS ghiacciata sul cuore e sul polmone, quindi posizionare il corpo con il pannello di dissezione in un frigorifero a 4 °C o su ghiaccio per un totale di 10 minuti.
- Rimuovere il polmone e il cuore del topo dai tessuti connettivi circostanti con le forbici. Quindi, separare ogni lobo polmonare e tenerli in soluzione HBSS sul ghiaccio.
3. Sezionamento dei lobi polmonari a fette sottili
- Tagliare e attaccare il lobo polmonare sulla parte superiore della colonna del campione con supercolla e orientare il lobo (Figura 1A, B) per consentire alla direzione di taglio di essere perpendicolare alla maggior parte delle vie aeree dall'hila alla superficie polmonare.
- Utilizzare un vibratoma con una lama di rasoio sottile fresca per tagliare il lobo polmonare in fette da 150 μm. Raccogliere le fette in piastre di Petri sterili da 100 mm preriempite con soluzione fredda di HBSS.
NOTA: impostare la velocità di movimento della lama e la frequenza di oscillazione appropriate prima di iniziare l'affettatura. Un'impostazione tipica per un Compresstom è Il livello di velocità 4 e il livello di oscillazione 4. - Trasferire le fette in piastre di Petri riempite con terreno di coltura DMEM / F-12 (20 fette / 15 ml medio / piatto) e mantenerle in un incubatore a 37 ° C durante la notte prima degli esperimenti.
NOTA: i PCLS del mouse possono essere mantenuti in coltura per circa 7 giorni senza perdere le risposte contrattili delle vie aeree17. La longevità delle arterie polmonari non è stata valutata a fondo. Nella nostra osservazione, mantengono intatta la struttura e la vasoreazione per almeno 3 giorni nel mezzo DMEM / F12. Per la conservazione a lungo termine, i PCLS del mouse possono essere collocati in crioviali riempiti con un mezzo DMEM/F12 contenente il 10% di DMSO (5 fette in 1 mL di mezzo per flaconcino), congelati in un contenitore pieno di alcool isopropilico a -80 °C durante la notte e crioconservati in azoto liquido per settimane o mesi21.
4. Analisi delle risposte contrattili delle vie aeree e delle arterie intrapolmonari
- Posizionare i PCLS in una piastra di coltura a 24 pozzetti riempita di HBSS, uno in ogni pozzetto. Individuare il PCLS al centro del pozzo, quindi rimuovere la soluzione HBSS con una pipetta.
- Trova le vie aeree e il vaso bersaglio nella fetta al microscopio, quindi copri la fetta usando una rete di nylon con un foro centrale pretagliato (2-3 mm di diametro) per esporre l'area target.
- Stendere una rondella metallica cava sopra la rete per mantenere le fette in posizione (Figura 2A).
- Aggiungere 600 μL di soluzione HBSS per immergere il PCLS. Riposare la fetta per 10 minuti, quindi registrare le immagini di base delle vie aeree o dei vasi.
- Indurre le vie aeree o la contrazione vascolare aspirando con cautela la soluzione vuota di HBSS con una pipetta e aggiungendo 600 μL di HBSS con un agonista, come 1 μM di metacolina (MCh) o 10 nM di endotelina (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: La stimolazione KCl come standard di set di strumenti non è richiesta prima dell'esposizione a metacolina o endotelina. 100 mM di stimolazione KCl nelle vie aeree del topo inducono solo una contrazione delle vie aeree piccola e irregolare (10%-15%)20. Allo stesso modo, una stimolazione di metacolina primordiale non è obbligata in quanto abbiamo confermato che lo stesso agonista, ad esempio metacolina o serotonina, innesca una contrazione delle vie aeree simile alle prime e ripetitive esposizioni20,22. - Osservare la reazione al microscopio fino a quando il cambiamento dell'area luminale raggiunge uno stato equilibratorio, quindi registrare le immagini delle vie aeree o vascolari per l'analisi.
- Rimuovere MCh o soluzione di endotelina con una pipetta e aggiungere una nuova soluzione HBSS da 600 μL con la stessa concentrazione di agonista e un rilassante; osservare e registrare le vie aeree o il rilassamento vascolare.
- Quantificare le vie aeree o la reazione vascolare seguendo i passaggi seguenti.
- Carica le immagini sul software libero sponsorizzato dal NIH FIJI.
- Selezionate selezione poligono nella barra degli strumenti per delineare le vie aeree o il lume vascolare su ciascun fotogramma.
- Selezionate Analizza (Analyze) > Imposta misure (Set Measurements > Area).
- Scegliere Analizza > Misura per quantificare l'area di interesse. I risultati sono mostrati in una finestra separata per l'analisi statistica.
5. Analisi della segnalazione Ca2+ delle vie aeree o delle SMC vascolari
- Preparare il buffer di caricamento del colorante Ca2 +.
- Sciogliere il colorante Ca2+ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (vedere Tabella dei materiali), 50 μg (una fiala) con 10 μL di DMSO.
- Sciogliere 0,2 g di polvere Pluronic F-12 (vedere Tabella dei materiali) in 1 mL di DMSO per generare una soluzione Pluronic al 20%.
- Miscelare 10 μL di soluzione pluronica al 20% con 10 μL di soluzione colorante-DMSO Ca2 +.
- Fare il tampone di carico del colorante Ca2+ aggiungendo 20 μL della miscela a 2 mL di soluzione HBSS con 200 μM di sulfobromophthalein (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare 15 PCLS del mouse in 2 mL di tampone di carico Ca2+ e incubare a 30 °C per 1 ora. Quindi spostare le fette a 2 mL di soluzione HBSS con 100 μM di sulfobromophthalein per ulteriori 30 minuti per la desterificazione del colorante fluorescente a temperatura ambiente.
- Rileva la segnalazione Ca2+ di SMC.
- Posizionare le fette caricate con colorante Ca2+ su un grande coperchio di vetro.
- Riempire una siringa da 3 ml con grasso siliconico ad alto vuoto. Spremere il grasso attraverso un ago smussato da 18 G per disegnare due linee parallele attraverso il vetro di copertura sopra e sotto la fetta.
- Coprire la fetta con una rete di nylon tra due linee di grasso. Posizionare il secondo vetro di copertura sopra la rete per generare una camera sigillata da grasso sui lati (Figura 3A).
NOTA: La rete di nylon è essenziale per mantenere la fetta attaccata al coperchio inferiore e quindi rimanere entro la distanza di lavoro di un obiettivo invertito di grandezza elevata, come l'olio 40x. - Aggiungere HBSS o soluzione agonista nella camera da un'estremità mediante pipettaggio manuale o tramite un sistema di perfusione. Rimuovere il fluido dalla camera aspirando dall'altra estremità con carta velina o vuoto in caso di perfusione continua di fluido.
- Posizionare la camera PCLS sullo stadio del microscopio. Rileva la segnalazione Ca2+ di SMC23 con un microscopio confocale a scansione risonante personalizzato con una velocità di scansione laser di 15 o 30 immagini/s.
NOTA: In alternativa, un microscopio confocale a scansione laser commerciale ad alta velocità, ampiamente disponibile al momento, può essere applicato nel test di segnalazione Ca2+ di SMC polmonari in PCLS.
- Quantificare la fluorescenza di Ca2+ nelle SMC.
- Caricare la sequenza di immagini registrata in FIJI e scegliere image > Type > scala di grigi a 8 bit.
- Selezionare la selezione del rettangolo nella barra degli strumenti e definire una regione di interesse (ROI) di 5 pixel x 5 pixel in una cellula muscolare liscia.
- Selezionate Analizza > Imposta misure (Set Measurements) > Valore grigio medio (Mean gray value), che rappresenta l'intensità di fluorescenza Ca2 +.
- Se la posizione di un ROI cambia con la contrazione SMC, scegliete Analizza > Misura l'intensità fluorescente Ca2+ fotogramma per fotogramma.
- Se il ROI di SMC rimane in una posizione simile in una pila di immagini, scegliere Image > Stacks > Measure stack dell'intensitàfluorescente Ca 2+ .
NOTA: è possibile collegare una macro scritta su misura per tenere traccia del ROI all'interno dell'SMC quando si muove con contrazione in uno stack di immagini e misura automaticamente l'intensità Ca2+ (valore grigio) del ROI fotogramma per fotogramma.
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Representative Results
Preparazione PCLS del topo che preserva intatte le vie aeree e le arterie intrapolmonari
Un PCLS di 150 μm di spessore è stato osservato al microscopio a contrasto di fase invertito. Nei polmoni di topo, le vie aeree conduttive sono accompagnate da arterie intrapolmonari, che vanno dall'ilo al polmone periferico. Un fascio rappresentativo delle vie aeree-arterie polmonari in un PCLS di topo è mostrato nella Figura 2B. Le vie aeree possono essere facilmente identificate da cellule epiteliali cuboidali con battito ciliale attivo che riveste la superficie interna del lume. Al contrario, l'arteria polmonare vicina è caratterizzata da endotelio piatto. Quando si raggiunge il campo polmonare periferico, le vie aeree conduttive si ramificano in dotti respiratori e sacche, circondando le piccole arteriole intra-acinari (Figura 2C).
Utilizzo di PCLS di topo per valutare le vie aeree polmonari e la contrazione arteriosa
La contrazione delle vie aeree indotta da metacolina (MCh, 1 μM) è dimostrata nella Figura 2B. Le risposte contrattili delle vie aeree sono quantificate dalla percentuale di riduzione dell'area luminale dopo esposizione a MCh (Figura 2D). Al contrario, l'arteria polmonare non presenta alcuna risposta agli stimoli MCh (Figura 2B). Le vie aeree mantengono risposte contrattili dose-dipendenti simili a MCh nella PCLS dopo coltura di 1 o 5 giorni (Figura 2D). Quando il PCLS è esposto all'endotelina (10 nM), sia le vie aeree che le arterie polmonari si restringono (Figura 2C, E), seguite dal rilassamento indotto da NOC-5 (100 μM) (Figura 2E).
Utilizzo di PCLS del mouse per valutare la segnalazione Ca 2+ delle vie aeree e della SMC arteriosa
Il PCLS caricato con colorante Ca2+ è osservato al microscopio fluorescente confocale. La fluorescenza di Ca2+ nelle SMC delle vie aeree (Figura 3B) e vascolari (Figura 3C) è bassa allo stato di riposo, senza alcuna scintilla focale di segnalazione intracellulare Ca2+ degna di nota. Dopo l'esposizione agli agonisti, l'intensità di fluorescenza di Ca2+ si eleva nell'SMC (Figura 3B, C), di solito da un punto e poi si propaga all'intera cellula. Le onde fluorescenti Ca2+ appaiono ripetutamente nella stessa cella dei segnali oscillatori (Figura 3D,E). In generale, la frequenza dell'oscillazione di Ca2+ aumenta all'aumentare della concentrazione agonista fino a raggiungere un livello di plateau24. Il rilassamento SMC delle vie aeree è associato alla diminuzione o alla cessazione delle oscillazioni di Ca2+ 25.
Figura 1: Orientamento dei lobi polmonari del topo per l'affettamento del vibratoma. I lobi polmonari del topo sono separati in singoli per le sezioni. (A) I lobi cranici sinistro (1), destro (2) e caudale (3) vengono tagliati vicino all'ilo lungo le linee tratteggiate bianche prima di attaccare la superficie di taglio piana sulla colonna del campione. Il posizionamento del lobo sinistro è mostrato in (4). (B) Il lobo centrale destro può essere incollato direttamente alla colonna del campione. Il lobo accessorio destro non era comunemente usato a causa delle sue piccole dimensioni. L'orientamento appropriato dei diversi lobi assicura che la maggior parte delle vie aeree e dei vasi polmonari presenti sezioni trasversali nel PCLS. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risposte contrattili e rilassanti delle vie aeree e delle arterie polmonari nella PCLS del topo. (A) Schema che mostra il posizionamento di un PCLS in una piastra di coltura per il saggio di contrazione. (B) Immagini rappresentative che mostrano una via aerea (frecce nere) con un'arteria polmonare vicina (punte di freccia nere) in HBSS a riposo e dopo l'esposizione a 1 μM di metacolina (MCh). (C) Immagini rappresentative che mostrano un'arteriola intra-acinare in HBSS a riposo e dopo l'esposizione a 10 nM di endotelina (Endo). (D) Risposte contrattili delle vie aeree dose-dipendenti a MCh in PCLS dopo coltura di 1 giorno (linea grigia) e 5 giorni (linea tratteggiata nera). Ogni punto rappresenta la media ± SEM di nove vie aeree da due topi. (E) Immagini rappresentative che mostrano 10 nM di contrazione arteriosa indotta da endotelina e arteriosa polmonare, seguita da 100 μM NOC-5, un donatore di ossido nitrico, ha indotto il rilassamento. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Segnalazione Ca2+ delle SMC arteriose aeree e polmonari in PCLS. (A) Schema che mostra la configurazione di una camera con un vetro di copertura superiore e inferiore, una guarnizione di grasso e una rete di nylon per contenere un PCLS nel piano focale per l'imaging Ca2+ di SMC. (B) Immagini fluorescenti rappresentative che mostrano la segnalazione Ca2+ delle SMC delle vie aeree a riposo e dopo l'esposizione a 1 μM MCh. Epi, cellula epiteliale. (C) Immagini fluorescenti Ca2+ di SMC arteriose polmonari a riposo e dopo esposizione a 10 nM di endotelina (Endo). Le frecce bianche in grassetto indicano l'asse longitudinale dell'arteria polmonare e le linee tratteggiate con frecce terminali indicano la distribuzione elicoidale delle SMC vascolari attorno alla parete arteriosa. Barra della scala = 20 μm. Elevazione oscillatoria dell'intensità di fluorescenza di Ca2+ (Ft), in rapporto all'intensità di fluorescenza in condizioni di riposo (F0), in un SMC delle vie aeree a 1 μM MCh (D) e in un SMC arterioso polmonare in risposta alla stimolazione dell'endotelina 10 nM (E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La preparazione di PCLS comporta diversi passaggi critici. In primo luogo, è essenziale gonfiare il lobo polmonare in modo omogeneo per evitare la variazione della rigidità dei tessuti da distribuzione irregolare dell'agarosio. Poiché l'agarosio liquido si gelifica rapidamente in cateteri sottili o vie aeree a una temperatura inferiore a 37 °C, il conseguente difetto di riempimento nel campo polmonare distale potrebbe aumentare la disparità di rigidità del tessuto polmonare e causare lacerazione del tessuto durante la sezione del vibratoma. Pertanto, è possibile mantenere la soluzione di agarosio a bassa fusione a 42 °C a bagnomaria e utilizzare una lampada riscaldante al tavolo di dissezione per evitare una rapida gelificazione dell'agarosio. Un'iniezione rapida potrebbe spingere più agarosio al parenchima polmonare con una maggiore compliance, quindi deve essere evitata. L'iniezione manuale di agarosio di solito richiede circa 5-7 s. In secondo luogo, un passo necessario alla fine del riempimento dell'agarosio è quello di spingere una piccola quantità di aria (~ 0,2 ml) per lavare l'agarosio dalle vie aeree conduttive allo spazio degli alveoli distali. Altrimenti, l'agarosio gelificherebbe e rimarrebbe nel lume per resistere alla contrazione delle vie aeree. Vale anche la pena notare che il gelificare di agarosio all'interno degli alveoli rimane in posizione e non si scioglie mai più a 37 ° C nell'incubatore. Il gel di agarosio svolge un ruolo essenziale nel mantenere la struttura 3D del tessuto polmonare come in vivo mantenuta dalla pressione intratoracica negativa. In terzo luogo, la perfusione delle arterie polmonari con una soluzione di gelatina è essenziale per mantenere aperto il lume arterioso nel PCLS. La soluzione di gelatina gelifica a temperatura ambiente come bloccante meccanico per resistere alla vasocostrizione su stimoli chimici e fisici durante la sezione tissutale. Senza inflazione di gelatina, le arterie polmonari nelle fette polmonari di solito collassano e si staccano dal tessuto interstiziale circostante, anche in presenza di alte dosi di agenti vasodilatatori misti, tra cui fentolamina, epinefrina e nifedipina13,16. A differenza di un gel di agarosio, il gel di gelatina si scioglie a 37 °C, fluendo fuori dal lume vascolare dopo l'incubazione notturna, lasciando il lume arterioso privo di ostruzioni prima del test di reazione vascolare.
Poiché il PCLS preserva gli SMC polmonari in situ e mantiene la loro funzione contrattile in una condizione quasi in vivo, è stato applicato come una potente piattaforma per studiare la regolazione della contrazione SMC, in particolare la regolazione tramite i meccanismi dipendenti da Ca2+ 26. In particolare, con un microscopio confocale multicanale o a due fotoni a basso ingrandimento, la segnalazione Ca2+ indotta da agonisti nelle SMC delle vie aeree e la costrizione luminale associata possono essere catturate simultaneamente per lo studio meccanicistico13,20. Ci si aspetta che la reattività delle vie aeree o vascolari misurata utilizzando il metodo PCLS rifletta le proprietà cellulari prive di influenze dall'ambiente polmonare, come l'ambiente infiammatorio e l'innervazione neurale della risposta nel polmone27,28. Come tale, il PLCS fornisce un sistema sperimentale per aiutare a distinguere intrinseco vs. modifica secondaria degli SMC. Oltre a studiare la regolazione contrattile delle SMC in modelli di salute e malattia, i PCLS sono stati raccolti da diverse fasce di età per esplorare l'adattamento funzionale delle SMC delle vie aeree durante lo sviluppo polmonare postnatale e in risposta a insulti ambientali27. Inoltre, i PCLS contengono vie aeree e vasi sanguigni di diverse dimensioni dal campo polmonare periferico a quello prossimale, consentendo lo studio di un meccanismo specifico della regione per regolare la contrattilità delle SMC polmonari nell'omeostasi e sotto stimoli patogeni. Inoltre, poiché i PCLS di topo mantengono la contrattilità delle vie aeree nel terreno di coltura per 7 giorni17, sono stati utilizzati come modello ex vivo per esaminare o convalidare i fattori di rischio per la deregolazione SMC, come l'esposizione a citochine o virus29. Infine, PCLS fornisce una piattaforma ideale per lo screening di farmaci vasodilatatori o broncodilatatori. In particolare, i biotest che utilizzano la preparazione PCLS sono altamente convenienti, poiché un topo adulto può generare centinaia di fette polmonari. L'uso di PCLS vicini nei gruppi di controllo e trattamento riduce anche significativamente il bias sperimentale dalla variazione del campione intergruppo.
Considerando la differenza tra l'anatomia del polmone umano e del roditore, il PCLS umano è uno strumento più potente per la ricerca traslazionale. Tuttavia, la limitata disponibilità di tessuto polmonare umano, in particolare campioni polmonari malati, rimane una sfida. Al contrario, il tessuto polmonare del topo, i modelli murini di malattie umane e i modelli murini transgenici sono ampiamente applicati nella ricerca biomedica e farmacologica, rendendo il PCLS del topo un sistema accessibile e rilevante per la malattia13,30. Inoltre, la conservazione delle arterie intrapolmonari ha avuto successo solo nella preparazione pcls del topo, il che lo rende uno strumento unico per esplorare la deregolazione vascolare nelle malattie vascolari polmonari come l'ipertensione polmonare. Pertanto, nonostante gli avvertimenti associati a qualsiasi modello di malattia, un protocollo per la preparazione di PCLS murini è inestimabile per stabilire una piattaforma ex vivo per studiare le vie aeree e le arterie polmonari in salute e malattia. Noi e altri abbiamo riportato ricerche polmonari con PCLS umani 31,32,33,34. Nella nostra esperienza, il protocollo di preparazione del PLCS umano è simile a quello del topo, tranne l'applicazione di una concentrazione di agarosio più elevata del 2%, più soluzione di agarosio (3 L per un polmone) e cateteri di dimensioni molto più grandi per cannulare bronchi principali, lobari o segmentali per l'iniezione di agarosio. L'esperienza nella preparazione di PLCS per topi aiuta enormemente con la preparazione di fette polmonari umane.
Nonostante i numerosi vantaggi dell'utilizzo della preparazione PCLS nella ricerca SMC polmonare, è fondamentale essere consapevoli dei limiti di questa tecnica. In primo luogo, il PCLS rimane un sistema statico, privo di cicli respiratori fisiologici che periodicamente allungano il parenchima polmonare e le vie aeree. Né contiene la circolazione sanguigna, che genera pressione pulsiva sulle SMC vascolari e forze di taglio sulle cellule endoteliali. Queste variazioni meccaniche nel PCLS potrebbero modificare la regolazione contrattile delle SMC. Anche se una piena istituzione della ventilazione dell'aria e della circolazione sanguigna nei PCLS è irraggiungibile, almeno per lo studio SMC delle vie aeree, negli ultimi dieci anni sono stati compiuti sforzi vani per generare un PCLS "respirante" allungando la sezione tissutale con una varietà di dispositivi 35,36,37. In secondo luogo, le SMC polmonari mantengono la loro contrattilità solo per un periodo limitato. Questo limite di tempo impedisce al PLCS di modellare le modifiche subacute delle SMC, ad esempio un processo che richiede più di 6-7 giorni per modificare gli SMC delle vie aeree. Poiché ricerche precedenti rivelano che le SMC perdono contrattilità a causa di una diminuzione delle proteine contrattili, l'ottimizzazione del terreno di coltura con un'ulteriore bassa dose di insulina ha dimostrato di sostenere la contrazione SMC delle vie aeree fino a 12 giorni17. Infine, la manipolazione genetica delle SMC polmonari mediante trasfezione di plasmidi o siRNA del PCLS rimane infruttuosa. La barriera tecnica alla trasfezione delle SMC nella PCLS merita certamente ulteriori indagini, in quanto questo metodo fornisce un approccio alternativo al modello animale transgenico per lo studio meccanicistico delle SMC polmonari. Ancora più importante, questa tecnica è la misura esclusiva per ottenere la modulazione genetica delle SMC polmonari umane nella ricerca traslazionale.
Questo articolo fornisce una descrizione completa della preparazione di PCLS di topo con vie aeree e arterie polmonari ben conservate e della loro applicazione nei test di contrazione e segnalazione Ca2 +. La preparazione PCLS supporta il funzionamento della muscolatura liscia in un ambiente polmonare vivo, consentendo allo stesso tempo l'accesso allo studio meccanicistico alle cellule in situ. Questa caratteristica unica ha reso la preparazione PCLS uno strumento versatile per lo studio delle vie aeree polmonari e delle SMC vascolari in salute e malattie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
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