Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

يصف هذا البروتوكول إعداد واستخدام شرائح الرئة المقطوعة بدقة للفأر لتقييم مجرى الهواء وانقباض العضلات الملساء الشريانية داخل الرئة في بيئة حية تقريبا.

Abstract

تتوسط خلايا العضلات الملساء (SMC) في تقلص مجرى الهواء والشريان داخل الرئة لتعديل مقاومة تدفق الهواء والدورة الدموية الرئوية ، على التوالي ، وبالتالي تلعب دورا حاسما في توازن الجهاز الرئوي. يساهم تحرير انقباض SMC في العديد من الأمراض الرئوية ، بما في ذلك الربو وارتفاع ضغط الدم الرئوي. ومع ذلك ، نظرا لمحدودية الوصول إلى الأنسجة وعدم وجود أنظمة استزراع للحفاظ على الأنماط الظاهرية SMC في الجسم الحي ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء انقباض SMC غير المنظم في هذه الأمراض لا تزال محددة بالكامل. توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) نموذجا خارج الجسم الحي يتحايل على هذه الصعوبات التقنية. كقسم أنسجة رئوية حي ورقيق ، يحتفظ PCLS ب SMC في المناطق الطبيعية المحيطة ويسمح في الموقع بتتبع تقلص SMC وإشارات Ca2 + داخل الخلايا التي تنظم انقباض SMC. هنا ، يتم توفير بروتوكول إعداد PCLS مفصل للماوس ، والذي يحافظ على الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة. يتضمن هذا البروتوكول خطوتين أساسيتين قبل إخضاع فص الرئة للتقطيع: تضخيم مجرى الهواء باستخدام الأغاروز منخفض الانصهار عبر القصبة الهوائية وملء الأوعية الرئوية بالجيلاتين من خلال البطين الأيمن. يمكن استخدام PCLS المعد باستخدام هذا البروتوكول للمقايسات الحيوية لتقييم تنظيم الانقباض بوساطة Ca2 + ل SMC في كل من مجرى الهواء ومقصورات الشرايين داخل الرئة. عند تطبيقه على نماذج الفئران لأمراض الجهاز التنفسي ، يمكن هذا البروتوكول من التحقيق الوظيفي ل SMC ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة على الآلية الأساسية لإزالة الانقباض SMC في الأمراض.

Introduction

خلية العضلات الملساء (SMC) هي نوع رئيسي من الخلايا الهيكلية في الرئة ، وتقيم في المقام الأول في الجدار الإعلامي للممرات الهوائية والأوعية الرئوية. تتعاقد SMCs لتغيير العيار المضيء ، وبالتالي تنظيم تدفق الهواء والدم 1,2. لذلك ، فإن التنظيم الانقباضي ل SMCs ضروري للحفاظ على توازن تهوية الهواء والدورة الدموية الرئوية. في المقابل ، يثير انقباض SMC الشاذ انسداد مجرى الهواء أو أمراض الأوعية الدموية الرئوية مثل الربو وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. ومع ذلك ، فقد واجه التقييم الوظيفي ل SMCs الرئة تحديا بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة الرئة ، وخاصة تلك الشعب الهوائية الصغيرة والأوعية الدقيقة في الجزء البعيد من الرئة 2,3. تلجأ الحلول الحالية إلى المقايسات غير المباشرة ، مثل قياس مقاومة تدفق الهواء بواسطة Flexivent لتعكس انقباض مجرى الهواء ، وفحص ضغط الدم الشرياني الرئوي عن طريق قسطرة القلب اليمنى لتقييم تقلص الأوعية الرئوية 4,5. ومع ذلك ، فإن هذه الفحوصات غير المباشرة لها عيوب متعددة ، مثل الارتباك بسبب العوامل الهيكلية ، والفشل في التقاط التنوع المكاني للمجرى الهوائي أو الاستجابات الوعائية في مقياس الرئة بأكمله 6,7 ، وغير مناسب للدراسة الميكانيكية للتنظيم الانقباضي على المستوى الخلوي. لذلك ، تم تطبيق طرق بديلة باستخدام الخلايا الأولية المعزولة ، أو شرائط عضلات القصبة الهوائية / الشعب الهوائية 8,9 ، أو شرائح الأوعية الدموية الكبيرة10 لدراسة SMC في المختبر. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لها قيود أيضا. على سبيل المثال ، فإن التكيف الظاهري السريع ل SMCs الأولية في حالة الثقافة11,12 يجعل من الصعب استقراء النتائج من زراعة الخلايا إلى إعدادات الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يمثل النمط الظاهري المقلص ل SMCs في مجرى الهواء القريب المعزول أو الأجزاء الوعائية SMCs في الرئة البعيدة 6,7. علاوة على ذلك ، يظل قياس قوة العضلات على مستوى الأنسجة منفصلا عن الأحداث الجزيئية والخلوية الضرورية للرؤية الميكانيكية لتنظيم الانقباض.

توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS)، وهي قسم أنسجة رئوية حية، أداة مثالية خارج الجسم الحي لتوصيف SMCs الرئوية في بيئة دقيقة قريبة من الجسم الحي (أي البنية والتفاعل متعدد الخلايا المحفوظة)13. منذ أن قدم الدكتوران بلاكي وفيشر لأول مرة إعداد شرائح الرئة من رئتي الفئران والهامستر المنفوخة بالأغاروز في1980s 14,15 ، تم تطوير هذه التقنية باستمرار لتزويد PCLSs بجودة أعلى وتنوع أكبر للبحوث الطبية الحيوية. أحد التحسينات الهامة هو تعزيز الحفاظ على الشرايين الرئوية عن طريق ضخ الجيلاتين بالإضافة إلى تضخم الرئة مع الأغاروز عبر القصبة الهوائية. ونتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كل من مجرى الهواء والشرايين الرئوية سليمة في PCLS لتقييم خارج الجسم الحي 16. علاوة على ذلك ، فإن PCLS قابل للتطبيق لفترة طويلة في الثقافة. على سبيل المثال ، لم يكن لدى PCLSs الفئران أي تغيير كبير في صلاحية الخلايا والتمثيل الغذائي لمدة لا تقل عن 12 يوما في الثقافة ، وكذلك احتفظت بانقباض مجرى الهواء لمدة تصل إلى 7 أيام17. بالإضافة إلى ذلك ، يحتفظ PCLS بممرات هوائية أو أوعية مختلفة الأحجام لفحوصات الانكماش والاسترخاء. علاوة على ذلك ، يمكن فحص إشارات Ca 2 + داخل الخلايا ل SMCs ، العامل المحدد لانقباض الخلايا ، باستخدام أصباغ مراسل Ca 2+ التي تم تصويرها بواسطة مجهر متحد البؤرة أو2-photon 13.

بالنظر إلى التطبيق المكثف لنموذج الماوس في أبحاث الرئة ، يتم وصف بروتوكول مفصل هنا لإعداد PCLS للفأر مع الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة لأبحاث الرئة خارج الجسم الحي . باستخدام PCLSs المعدة ، أوضحنا لاحقا كيفية تقييم استجابات مجرى الهواء والشرايين الرئوية للمحفزات الانقباضية أو المرخية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف طريقة تحميل PCLS بصبغة مراسل Ca2 + ثم تصوير إشارات Ca2 + ل SMCs المرتبطة بالاستجابات الانقباضية أو المرخية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كانت جميع رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى ماساتشوستس العام. تم استخدام الفئران الذكور من النوع البري C57 / B6 ، التي يبلغ عمرها 8 أسابيع ، لهذه الدراسة.

1. التحضير التجريبي

  1. إعداد حل العمل.
    1. قم بإعداد محلول الملح المتوازن 1x Hank (HBSS ، مع Ca 2+ و Mg 2+ ، ودرجة الحموضة المتوازنة مع20 mM HEPES ، انظر جدول المواد). استخدم حل HBSS لإعداد ومعالجة PCLS. حافظ على برودة محلول HBSS على الجليد عند تحضير PCLSs.
  2. قم بإعداد الوسط الاستزراعي ل PCLS عن طريق استكمال Dulbecco's Modified Eagle Medium و F-12 (DMEM-F12) بعامل مضاد حيوي مضاد للفطريات (نسبة حجم 1:100 ، انظر جدول المواد).
  3. تحضير 1.5 ٪ من محلول الأغاروز و 6 ٪ من محلول الجيلاتين.
    1. امزج مسحوق الأغاروز أو الجيلاتين منخفض درجة الانصهار (LMP) (انظر جدول المواد) مع محلول HBSS بشكل منفصل في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مل (أو أنابيب 50 مل إذا كان حجم المحلول >10 مل) إلى التركيزات النهائية.
      ملاحظة: الحجم الإجمالي لمحلول الأغاروز = 5 مل / ماوس × عدد الفئران ؛ محلول الجيلاتين = 2 مل / فأر × عدد الفئران.
    2. سخني أنابيب المحلول في الماء المغلي حتى يذوب المسحوق تماما. احتفظ بكل من محاليل الأغاروز والجيلاتين في حمام مائي 42 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مصباح التسخين الموجود على طاولة التشريح مفيدا للحفاظ على بيئة التشغيل دافئة ومنع محلول الأغاروز من التصلب قبل حقنه في رئة الماوس.
  4. قم بغمر جميع أدوات التشريح ، بما في ذلك زوج من مقص التشريح ، وزوجان من ملقط التشريح الدقيق المنحني ، وزوج من ملقط مرقئ في محلول الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل للتعقيم.
  5. حافظ على اهتزاز جاهز (انظر جدول المواد) لتقسيم أنسجة الرئة إلى شرائح رقيقة.
  6. احتفظ بمجهر مقلوب لتباين الطور باستخدام كاميرا CCD لتقييم استجابات مجرى الهواء أو انقباض الأوعية الدموية ومجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر مصمم خصيصا (انظر جدول المواد) لتقييم إشارات Ca2+ في SMCs الرئوية18.

2. تضخم رئتي الفأر بمحلول الأغاروز والجيلاتين

  1. القتل الرحيم للماوس.
    1. ضع الماوس في غرفة بلاستيكية (حوالي 750 سم3) مع 5٪ isoflurane. احتفظ بالماوس في الغرفة حتى يتوقف عن التنفس لمدة 1 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن تطبيق طرق القتل الرحيم الأولية الأخرى، مثل الحقن داخل الصفاق للكيتامين (240 مغ/كغ) والزيلازين (32 مغ/كغ)19 أو بنتوباربيتال (0.3 مل)20، كبدائل للإيزوفلوران المستنشق.
    2. ضع جسم الماوس على لوحة تشريح في وضع الاستلقاء. قم بإصلاح الجسم في موضعه عن طريق تثبيت الذيل والكفوف الأمامية والرأس باستخدام إبر حقنة 25 جم ، وقم بتعقيم الجسم باستخدام رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪.
    3. اقطع بطن الفأر بمقص جراحي (شق ، طوله ~ 2 سم × عرضه 2 سم). ثم ، قطع الشريان الأورطي البطني لاستنفاد حجم الدم.
  2. تضخيم فصوص الرئة باتباع الخطوات أدناه.
    1. افتح تجويف الصدر بعناية على طول القص والقفص الصدري السفلي الثنائي فوق الحجاب الحاجز ، ولاحظ انهيار فصوص الرئة عند فتح تجويف الصدر.
    2. إزالة جزء من الأقفاص الصدرية البطنية الثنائية لفضح القلب. تجنب تلف الرئة عن طريق توجيه طرف المقص الحاد بعيدا عن أنسجة الرئة.
    3. استخدم الملقط لفصل الغدة الصعترية والأنسجة الرخوة في عنق الفأر لفضح القصبة الهوائية.
    4. قم بقص ثقب صغير (قطره 1.2 مم) في الطرف العلوي من القصبة الهوائية مما يسمح بمرور طرف قسطرة وريدية على شكل حرف Y بحجم 20 جم (انظر جدول المواد).
    5. قم بتوصيل منفذ محول واحد من القسطرة على شكل حرف Y بحقنة 3 مل مملوءة مسبقا ب 0.5 مل من الهواء ، والمنفذ الآخر بحقنة 3 مل معبأة مسبقا ب 2 مل من محلول الأغاروز الدافئ بنسبة 1.5٪ (42 درجة مئوية).
    6. حقن محلول الأغاروز لملء القسطرة ثم دفع القسطرة من خلال فتحة القطع مسبقا في القصبة الهوائية لمدة 5-8 مم في الطول.
    7. حقن محلول الأغاروز ببطء في حوالي 1 مل / 5 ثانية. سوف تتوسع الرئة على طول المحور القريب إلى البعيد. توقف عن الحقن عندما يتم تضخيم حافة كل فص رئة.
      ملاحظة: لا تبالغ في تضخيم الرئة، لأن هذا يمكن أن يمزقها. يبلغ حجم محلول agarose لتضخيم الرئة الكاملة لفأر شاب بالغ حوالي 1.3 ± 0.1 مل.
    8. حقن 0.2-0.3 مل من الهواء من المحقنة الأخرى لدفع الأغاروز المتبقي في القسطرة والشعب الهوائية الموصلة إلى الفضاء الحويصلات الهوائية البعيدة.
    9. أغلق القصبة الهوائية بزوج من ملقط مرقئ منحني (انظر جدول المواد).
  3. املأ الأوعية الدموية الرئوية.
    1. املأ حقنة 1 مل بالجيلاتين الدافئ بنسبة 6٪. قم بالاتصال بقسطرة وريد فروة الرأس بالإبرة ، واملأ القسطرة بمحلول الجيلاتين ، ثم ثقب البطين الأيمن بالقرب من الجدار السفلي بالإبرة.
    2. ادفع الإبرة إلى البطين الأيمن لطول 2-3 مم ووجه طرف الإبرة إلى الشريان الرئوي الرئيسي.
    3. حقن 0.2 مل من محلول الجيلاتين ببطء في البطين الأيمن والأوعية الشريانية الرئوية.
      ملاحظة: تبدو فصوص الرئة شاحبة قليلا مع تضخم الجيلاتين المناسب.
    4. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق بعد الحقن ، وقم بتبريد فصوص الرئة عن طريق سكب محلول HBSS البارد على القلب والرئة ، ثم ضع الجسم مع لوح التشريح في ثلاجة 4 درجات مئوية أو على الجليد لمدة 10 دقائق.
    5. قم بإزالة رئة الفأر والقلب من الأنسجة الضامة المحيطة باستخدام المقص. ثم افصل كل فص رئوي واحتفظ به في محلول HBSS على الجليد.

3. تقسيم فصوص الرئة إلى شرائح رقيقة

  1. قم بتقليم وربط فص الرئة في الجزء العلوي من عمود العينة باستخدام الغراء الفائق ، وتوجيه الفص (الشكل 1A ، B) للسماح لاتجاه القطع بأن يكون عموديا على معظم الشعب الهوائية من الهيلا إلى سطح الرئة.
  2. استخدم اهتزازا مع شفرة حلاقة رقيقة جديدة لقطع فص الرئة إلى شرائح 150 ميكرومتر. اجمع الشرائح في أطباق بتري معقمة مقاس 100 مم معبأة مسبقا بمحلول HBSS البارد.
    ملاحظة: اضبط سرعة تحريك الشفرة المناسبة وتردد التذبذب قبل بدء التقطيع. الإعداد النموذجي للضغط هو مستوى السرعة 4 ومستوى التذبذب 4.
  3. انقل الشرائح إلى أطباق بتري المملوءة بوسط ثقافة DMEM / F-12 (20 شريحة / 15 مل متوسطة / طبق) واحتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل التجارب.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على PCLSs الماوس في الثقافة لمدة 7 أيام تقريبا دون فقدان استجابات انقباض مجرى الهواء17. لم يتم تقييم طول عمر الشرايين الرئوية بدقة. في ملاحظتنا ، فإنها تحتفظ ببنية سليمة ورد فعل وعائي لمدة 3 أيام على الأقل في وسط DMEM / F12. للتخزين على المدى الطويل ، يمكن وضع PCLSs الماوس في cryovials مليئة بوسط DMEM / F12 الذي يحتوي على 10٪ DMSO (5 شرائح في 1 مل وسط لكل قارورة) ، وتجميدها في حاوية مملوءة بالكحول الأيزوبروبيل عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، والمحفوظة في الثلاجة في النيتروجين السائل لأسابيع إلى أشهر21.

4. تحليل الاستجابات الانقباضية للممرات الهوائية والشرايين داخل الرئة

  1. ضع PCLSs في لوحة استزراع مملوءة ب HBSS مكونة من 24 بئرا ، واحدة في كل بئر. حدد موقع PCLS في منتصف البئر ، ثم قم بإزالة محلول HBSS باستخدام ماصة.
  2. ابحث عن مجرى الهواء المستهدف والأوعية في الشريحة تحت المجهر ، ثم قم بتغطية الشريحة باستخدام شبكة نايلون مع ثقب مركزي مقطوع مسبقا (قطره 2-3 مم) لفضح المنطقة المستهدفة.
  3. ضع غسالة معدنية مجوفة فوق الشبكة لتثبيت الشرائح في مكانها (الشكل 2A).
  4. أضف 600 ميكرولتر من محلول HBSS لغمر PCLS. ضع الشريحة لمدة 10 دقائق، ثم سجل الصور الأساسية للممرات الهوائية أو السفن.
  5. حث مجرى الهواء أو تقلص الأوعية الدموية عن طريق شفط محلول HBSS الفارغ بحذر باستخدام ماصة وإضافة 600 ميكرولتر من HBSS مع ناهض ، مثل 1 ميكرومتر من الميثاكولين (MCh) أو 10 نانومتر من الإندوثيلين (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تحفيز KCl كمعيار لمجموعة الأدوات غير مطلوب قبل التعرض للميثاكولين أو الإندوثيلين. 100 mM من تحفيز KCl في الشعب الهوائية للفئران يحفز فقط تقلص مجرى الهواء الصغير وغير المنتظم (10٪ -15٪)20. وبالمثل ، فإن تحفيز الميثاكولين التحضيري غير ملزم لأننا أكدنا أن نفس المنبهات ، على سبيل المثال ، الميثاكولين أو السيروتونين ، يؤدي إلى تقلص مجرى الهواء المماثل في التعرض الأول والمتكرر20,22.
  6. راقب التفاعل تحت المجهر حتى يصل تغيير المنطقة المضيئة إلى حالة توازن ، ثم سجل صور مجرى الهواء أو الأوعية الدموية لتحليلها.
  7. قم بإزالة محلول MCh أو endothelin باستخدام ماصة وإضافة محلول HBSS جديد سعة 600 ميكرولتر بنفس تركيز ناهض ومرخي ؛ مراقبة وتسجيل مجرى الهواء أو استرخاء الأوعية الدموية.
  8. حدد كمية مجرى الهواء أو تفاعل الأوعية الدموية باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بتحميل الصور إلى برنامج FIJI المجاني الذي ترعاه المعاهد الوطنية للصحة.
    2. حدد تحديد المضلع في شريط الأدوات لتحديد مجرى الهواء أو تجويف الأوعية الدموية على كل إطار.
    3. اختر تحليل > مجموعة قياسات > منطقة.
    4. اختر تحليل > قياس لتحديد مجال الاهتمام. يتم عرض النتائج في نافذة منفصلة للتحليل الإحصائي.

5. تحليل إشارات Ca2+ للمجرى الهوائي أو SMCs الوعائية

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحميل الصبغة Ca2+ .
    1. قم بإذابة صبغة Ca2+ ، أوريغون جرين 488 BAPTA-1-AM (انظر جدول المواد) ، 50 ميكروغرام (قارورة واحدة) مع 10 ميكرولتر من DMSO.
    2. قم بإذابة 0.2 جم من مسحوق Pluronic F-12 (انظر جدول المواد) في 1 مل من DMSO لإنشاء محلول Pluronic بنسبة 20٪.
    3. امزج 10 ميكرولتر من محلول Pluronic بنسبة 20٪ مع 10 ميكرولتر من محلول صبغة Ca2+ DMSO.
    4. اجعل Ca 2+ مخزن مؤقت لتحميل الصبغة عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الخليط إلى 2 مل من محلول HBSS مع200 ميكرومتر من السلفوبروموفثالين (انظر جدول المواد).
  2. ضع 15 PCLSs بالماوس في 2 مل من مخزن التخزين المؤقت للتحميل Ca2+ واحتضنه عند 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم حرك الشرائح إلى 2 مل من محلول HBSS مع 100 ميكرومتر من السلفوبروموفثالين لمدة 30 دقيقة إضافية لإزالة أسترة صبغة الفلورسنت في درجة حرارة الغرفة.
  3. الكشف عن إشارات Ca2+ من SMCs.
    1. ضع شرائح Ca2+ المحملة بالصبغة على غطاء زجاجي كبير.
    2. املأ حقنة سعة 3 مل بشحوم سيليكون عالية الفراغ. اضغط على الشحوم من خلال إبرة مخففة بوزن 18 جم لرسم خطين متوازيين عبر زجاج الغطاء أعلى وأسفل الشريحة.
    3. غطي الشريحة باستخدام شبكة نايلون بين خطين من الشحوم. ضع زجاج الغطاء الثاني فوق الشبكة لإنشاء غرفة مغلقة بالشحوم على الجانبين (الشكل 3A).
      ملاحظة: شبكة النايلون ضرورية للحفاظ على الشريحة متصلة بالغطاء السفلي وبالتالي البقاء ضمن مسافة العمل لهدف مقلوب عالي الحجم ، مثل زيت 40x.
    4. أضف HBSS أو محلول ناهض إلى الغرفة من طرف واحد عن طريق السحب يدويا أو عبر نظام التروية. قم بإزالة السائل من الغرفة عن طريق الشفط من الطرف الآخر باستخدام المناديل الورقية أو الفراغ في حالة تروية السوائل المستمرة.
    5. ضع غرفة PCLS على مرحلة المجهر. اكتشف إشارات Ca 2+ ل SMC23 باستخدام مجهر بؤري بؤري ضوئي رنين مصمم خصيصا بمعدل مسح ضوئي بالليزر يبلغ 15 أو 30 صورة / صورة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تطبيق مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر التجاري عالي السرعة ، وهو متاح على نطاق واسع في الوقت الحاضر ، في فحص إشارات Ca2 + ل SMCs الرئوي في PCLS.
  4. حدد كميا التألق Ca2+ في SMCs.
    1. قم بتحميل تسلسل الصور المسجلة إلى FIJI واختر نوع الصورة > > تدرج رمادي 8 بت.
    2. حدد تحديد المستطيل في شريط الأدوات وحدد منطقة اهتمام 5 بكسل × 5 بكسل (ROI) في خلية عضلية ملساء.
    3. اختر تحليل > تعيين القياسات > متوسط القيمة الرمادية ، التي تمثل كثافة التألق Ca2+ .
    4. إذا تغير موضع عائد الاستثمار مع انكماش SMC، فاختر تحليل > قياس كثافة الفلورسنت Ca2+ إطارا تلو الآخر.
    5. إذا ظل عائد الاستثمار ل SMC في موضع مماثل في مكدس من الصور، فاختر مكدسات > الصور > مكدس قياس كثافة الفلورسنت Ca2+ .
      ملاحظة: يمكن توصيل ماكرو مكتوب خصيصا لتتبع عائد الاستثمار داخل SMC عندما يتحرك مع انكماش في مكدس صورة ويقيس تلقائيا كثافة Ca2+ (القيمة الرمادية) لعائد الاستثمار إطارا تلو الآخر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إعداد PCLS الماوس الحفاظ على الشعب الهوائية داخل الرئة سليمة والشرايين
وقد لوحظت PCLS بسماكة 150 ميكرومتر تحت مجهر تباين الطور المقلوب. في رئتي الفأر ، تكون الشعب الهوائية الموصلة مصحوبة بشرايين داخل الرئة ، تمتد من التلال إلى الرئة الطرفية. يظهر الشكل 2B حزمة تمثيلية للمجرى الهوائي الرئوي في PCLS للماوس. يمكن التعرف بسهولة على مجرى الهواء بواسطة الخلايا الظهارية المكعبة مع الضرب الأهداب النشطة التي تبطن السطح الداخلي للتجويف. في المقابل ، يتميز الشريان الرئوي القريب ببطانة مسطحة. عند الوصول إلى حقل الرئة المحيطي ، تتفرع الشعب الهوائية الموصلة إلى القنوات التنفسية والأكياس ، المحيطة بالشرايين الصغيرة داخل الأسينار (الشكل 2C).

استخدام PCLS للماوس لتقييم مجرى الهواء الرئوي وتقلص الشرايين
يوضح الشكل 2B تقلص مجرى الهواء الناجم عن الميثاكولين (MCh ، 1 ميكرومتر). يتم تحديد استجابات انقباض مجرى الهواء كميا من خلال النسبة المئوية لانخفاض مساحة اللمعان بعد التعرض ل MCh (الشكل 2D). في المقابل، لا يقدم الشريان الرئوي أي استجابة لمحفزات MCh (الشكل 2B). تحتفظ الخطوط الجوية باستجابات انقباضية مماثلة تعتمد على الجرعة ل MCh في PCLS بعد ثقافة 1 يوم أو 5 أيام (الشكل 2D). عندما يتعرض PCLS للإندوثيلين (10 نانومتر) ، تنقبض كل من الشعب الهوائية والشرايين الرئوية (الشكل 2C ، E) ، تليها NOC-5 (100 ميكرومتر) الاسترخاء الناجم عن (الشكل 2E).

استخدام PCLS الماوس لتقييم إشارات Ca2+ للمجرى الهوائي و SMC الشرياني
لوحظ PCLS المحمل بالصبغة Ca2+ تحت المجهر الفلوري البؤري. التألق Ca2+ في مجرى الهواء (الشكل 3B) والأوعية الدموية (الشكل 3C) SMCs منخفض في حالة الراحة ، مع عدم وجود شرارة بؤرية من إشارات Ca2 + داخل الخلايا ملحوظة. عند التعرض للناهضات ، ترتفع شدة التألق Ca2 + في SMC (الشكل 3B ، C) ، عادة من بقعة واحدة ثم تنتشر إلى الخلية بأكملها. تظهر موجات الفلورسنت Ca2+ بشكل متكرر في نفس الخلية مثل الإشارات المتذبذبة (الشكل 3D ، E). بشكل عام ، يزداد تواتر تذبذب Ca2 + مع ارتفاع تركيز ناهض حتى يصل إلى مستوى الهضبة24. يرتبط استرخاء SMC في مجرى الهواء بانخفاض أو توقف تذبذبات Ca 2+ 25.

Figure 1
الشكل 1: اتجاه فصوص رئة الفأر لتقطيع الاهتزاز. يتم فصل فصوص رئة الماوس إلى فصوص فردية للأقسام. (أ) يتم قطع الفصوص اليسرى (1) والجمجمة اليمنى (2) والفصوص الذيلية (3) بالقرب من الهيلوم على طول الخطوط البيضاء المنقطة قبل لصق سطح القطع المستوي على عمود العينة. يظهر موضع الفص الأيسر في (4). (ب) يمكن لصق الفص الأوسط الأيمن مباشرة على عمود العينة. لم يكن الفص الملحق الصحيح شائعا بسبب صغر حجمه. يضمن التوجيه المناسب للفصوص المختلفة أن معظم الشعب الهوائية والأوعية الرئوية تقدم أقساما عرضية في PCLS. شريط المقياس = 1 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: الاستجابات الانقباضية والمرخية للممرات الهوائية والشرايين الرئوية في PCLS . (أ) تخطيطي يوضح وضع PCLS في صفيحة استزراع جيدة لفحص الانقباض. (ب) صور تمثيلية تظهر مجرى هوائي (أسهم سوداء) مع شريان رئوي قريب (رؤوس أسهم سوداء) في HBSS أثناء الراحة وبعد التعرض ل 1 ميكرومتر ميثاكولين (MCh). (ج) صور تمثيلية تظهر شريانا داخل الأسينار في HBSS أثناء الراحة وعند التعرض لإندوثيلين 10 نانومتر (إندو). (د) استجابات انقباض مجرى الهواء المعتمدة على الجرعة ل MCh في PCLSs بعد زراعة 1 يوم (الخط الرمادي) و 5 أيام (الخط الأسود المنقط). تمثل كل نقطة متوسط SEM ± تسعة ممرات هوائية من اثنين من الفئران. (ه) صور تمثيلية تظهر 10 نانومتر من الانكباض الهوائي الناجم عن الإندوثيلين وانقباض الشرايين الرئوية، يليه 100 ميكرومتر NOC-5، وهو متبرع بأكسيد النيتريك، مما أدى إلى الاسترخاء. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إشارات Ca2+ للمجرى الهوائي و SMCs الشرياني الرئوي في PCLS. (أ) مخطط يوضح إعداد غرفة ذات غطاء علوي وسفلي زجاجي ، وختم شحوم ، وشبكة نايلون لتثبيت PCLS في المستوى البؤري لتصوير Ca 2 + ل SMCs. (B) صور فلورسنت تمثيلية تظهر إشارات Ca2 + ل SMCs في مجرى الهواء في حالة السكون وبعد التعرض ل 1 ميكرومتر MCh. Ep ، خلية ظهارية. (C) Ca2+ الصور الفلورية ل SMCs الشريانية الرئوية في حالة الراحة وبعد التعرض ل 10 نانومتر إندوثيلين (إندو). تشير الأسهم البيضاء الجريئة إلى المحور الطولي للشريان الرئوي ، وتشير الخطوط المنقطة مع أسهم النهاية إلى التوزيع الحلزوني ل SMCs الوعائية حول جدار الشرايين. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الارتفاع المتذبذب لشدة التألق Ca2+ (Ft) ، بنسبة إلى شدة التألق في حالة الراحة (F0) ، في مجرى الهواء SMC إلى 1 ميكرومتر MCh (D) وفي SMC الشرياني الرئوي استجابة لتحفيز 10 نانومتر إندوثيلين (E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتضمن إعداد PCLS عدة خطوات حاسمة. أولا ، من الضروري تضخيم فص الرئة بشكل متجانس لتجنب اختلاف تصلب الأنسجة عن توزيع الأغاروز غير المتساوي. نظرا لأن الأغاروز السائل يتدفق بسرعة في القسطرة الرقيقة أو الشعب الهوائية عند درجة حرارة أقل من 37 درجة مئوية ، فإن عيب الملء الناتج في مجال الرئة البعيد يمكن أن يزيد من تباين تصلب أنسجة الرئة ويسبب تمزق الأنسجة أثناء قسم الاهتزاز. لذلك ، يمكن ممارسة الحفاظ على محلول الأغاروز منخفض الذوبان عند 42 درجة مئوية في حمام مائي واستخدام مصباح تسخين على طاولة التشريح لتجنب تبلور الأغاروز السريع. يمكن للحقن السريع أن يدفع المزيد من الأغاروز إلى حمة الرئة مع امتثال أعلى ، وبالتالي يجب تجنبه. عادة ما يستغرق حقن الأغاروز اليدوي حوالي 5-7 ثوان. ثانيا ، تتمثل الخطوة الضرورية في نهاية ملء الأغاروز في دفع كمية صغيرة من الهواء (~ 0.2 مل) لطرد الأغاروز من مجرى الهواء الموصل إلى الفضاء الحويصلات الهوائية البعيدة. خلاف ذلك ، فإن الأغاروز سوف هلام والبقاء في التجويف لمقاومة تقلص مجرى الهواء. تجدر الإشارة أيضا إلى أن تبلور الأغاروز داخل الحويصلات الهوائية يبقى في مكانه ولا يذوب مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. يلعب هلام الأغاروز دورا أساسيا في الاحتفاظ ببنية 3D لأنسجة الرئة كما هو الحال في الجسم الحي الذي يحافظ عليه الضغط السلبي داخل الصدر. ثالثا ، يعد دمج الشرايين الرئوية بمحلول الجيلاتين أمرا ضروريا للحفاظ على تجويف الشرايين مفتوحا في PCLS. محلول الجيلاتين الهلامي في درجة حرارة الغرفة كمانع ميكانيكي لمقاومة تضيق الأوعية على المحفزات الكيميائية والفيزيائية أثناء قسم الأنسجة. بدون تضخم الجيلاتين ، عادة ما تنهار الشرايين الرئوية في شرائح الرئة وتنفصل عن الأنسجة الخلالية المحيطة ، حتى في وجود جرعات عالية من العوامل الموسعة للأوعية الدموية المختلطة ، بما في ذلك الفينتولامين والإبينفرين والنيفيديبين13,16. على النقيض من هلام الأغاروز ، يذوب هلام الجيلاتين عند 37 درجة مئوية ، ويتدفق من تجويف الأوعية الدموية بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، تاركا تجويف الشرايين خاليا من الانسداد قبل فحص التفاعل الوعائي.

نظرا لأن PCLS يحافظ على SMCs الرئوية في الموقع ويحتفظ بوظيفته الانقباضية في حالة الجسم الحي تقريبا ، فقد تم تطبيقه كمنصة قوية للتحقيق في تنظيم انكماش SMC ، وخاصة التنظيم عبر آليات تعتمد على Ca2 + 26. على وجه الخصوص ، مع مجهر متعدد القنوات متعدد القنوات منخفض التكبير أو مجهر ثنائي الفوتون ، يمكن التقاط إشارات Ca2 + المستحثة بالمنبهات في SMCs في مجرى الهواء وانقباض اللمعان المرتبط بها في وقت واحد للدراسة الميكانيكية13,20. من المتوقع أن تعكس استجابة مجرى الهواء أو الأوعية الدموية التي تم قياسها باستخدام طريقة PCLS الخصائص الخلوية الخالية من التأثيرات من بيئة الرئة ، مثل الوسط الالتهابي ، والتعصيب العصبي للاستجابة في الرئة27,28. على هذا النحو ، يوفر PLCS نظاما تجريبيا للمساعدة في التمييز بين الجوهرية مقابل . تعديل SMCs الثانوية. بالإضافة إلى التحقيق في التنظيم الانقباضي ل SMCs في نماذج الصحة والمرض ، تم جمع PCLSs من مختلف الفئات العمرية لاستكشاف التكيف الوظيفي ل SMC مجرى الهواء أثناء تطور الرئة بعد الولادة واستجابة للإهانات البيئية27. وعلاوة على ذلك، تحتوي مركبات PCLSs على ممرات هوائية وأوعية دموية مختلفة الأحجام من المجال المحيطي إلى حقل الرئة القريب، مما يتيح التحقيق في آلية خاصة بكل منطقة لتنظيم انقباض SMCs الرئوي في التوازن وتحت المحفزات المسببة للأمراض. علاوة على ذلك ، نظرا لأن PCLSs الفأر تحتفظ بانقباض مجرى الهواء في وسط الاستزراع لمدة 7 أيام17 ، فقد تم استخدامها كنموذج خارج الجسم الحي لفحص أو التحقق من صحة عوامل الخطر لتحرير SMC ، مثل التعرض للسيتوكين أو الفيروس29. وأخيرا، يوفر PCLS منصة مثالية لفحص الأدوية الموسعة للأوعية الدموية أو القصباتية. على وجه الخصوص ، فإن المقايسات الحيوية باستخدام إعداد PCLS فعالة للغاية من حيث التكلفة ، حيث يمكن لفأر بالغ واحد توليد مئات شرائح الرئة. كما أن استخدام PCLSs المجاورة في مجموعات التحكم والعلاج يقلل بشكل كبير من التحيز التجريبي من تباين العينات بين المجموعات.

بالنظر إلى الفرق بين تشريح القوارض والرئة البشرية ، فإن PCLS البشري هو أداة أكثر قوة للبحث الانتقالي. ومع ذلك، فإن التوافر المحدود لأنسجة الرئة البشرية، وخاصة عينات الرئة المريضة، لا يزال يشكل تحديا. في المقابل ، يتم تطبيق أنسجة رئة الفئران ، ونماذج الفئران للأمراض البشرية ، ونماذج الفئران المعدلة وراثيا على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية والدوائية ، مما يجعل PCLS الفأر نظاما يمكن الوصول إليه وذا صلة بالأمراض13,30. بالإضافة إلى ذلك ، لم ينجح الحفاظ على الشرايين داخل الرئة إلا في إعداد PCLS للفئران ، مما يجعله أداة فريدة لاستكشاف تحرير الأوعية الدموية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية مثل ارتفاع ضغط الدم الرئوي. لذلك ، على الرغم من المحاذير المرتبطة بأي نماذج مرضية ، فإن بروتوكول إعداد PCLS للفأر لا يقدر بثمن لإنشاء منصة خارج الجسم الحي للتحقيق في مجرى الهواء والشرايين الرئوية في الصحة والمرض. لقد أبلغنا نحن وآخرون عن أبحاث الرئة مع PCLSs البشرية31،32،33،34. في تجربتنا ، يشبه بروتوكول إعداد PLCS البشري بروتوكول الفأر ، باستثناء تطبيق تركيز أغاروز أعلى بنسبة 2٪ ، ومحلول أغاروز أكثر (3 لتر لرئة واحدة) ، وقسطرة أكبر حجما بكثير لتقليب الشعب الهوائية الرئيسية أو الفصيصية أو القطاعية لحقن الأغاروز. تساعد الخبرة في إعداد PLCS للماوس بشكل كبير في إعداد شريحة الرئة البشرية.

على الرغم من المزايا العديدة لاستخدام إعداد PCLS في أبحاث SMC الرئوية ، فمن الأهمية بمكان أن تكون على دراية بقيود هذه التقنية. أولا ، لا يزال PCLS نظاما ثابتا ، يفتقر إلى دورات التنفس الفسيولوجية التي تمتد بشكل دوري إلى متني الرئة والشعب الهوائية. كما أنه لا يحتوي على الدورة الدموية ، والتي تولد ضغطا نابضا على SMCs الوعائية وقوى القص على الخلايا البطانية. هذه الاختلافات الميكانيكية في PCLS يمكن أن تعدل التنظيم المتقلص للشركات الصغيرة والمتوسطة. على الرغم من أن التأسيس الكامل لتهوية الهواء والدورة الدموية في PCLSs أمر غير قابل للتحقيق ، على الأقل بالنسبة لدراسة SMC مجرى الهواء ، فقد بذلت جهود متباينة في العقد الماضي لتوليد PCLS "تنفس" عن طريق تمديد قسم الأنسجة مع مجموعة متنوعة من الأجهزة35،36،37. ثانيا ، تحافظ SMCs الرئوية على انقباضها لفترة محدودة فقط. هذا الحد الزمني يمنع PLCS من نمذجة التغيرات تحت الحادة للشركات الصغيرة والمتوسطة ، على سبيل المثال ، عملية تستغرق أكثر من 6-7 أيام لتعديل SMCs مجرى الهواء. نظرا لأن الأبحاث السابقة تكشف عن فقدان SMCs للانكماش بسبب انخفاض البروتينات المقلصة ، فقد ثبت أن تحسين وسط الثقافة بجرعة منخفضة إضافية من الأنسولين يحافظ على تقلص SMC في مجرى الهواء لمدة تصل إلى 12 يوما17. وأخيرا، لا يزال التلاعب الجيني ب SMCs الرئوية عن طريق نقل البلازميد أو siRNA ل PCLS غير ناجح. من المؤكد أن الحاجز التقني أمام نقل SMCs في PCLS يستحق المزيد من التحقيق ، حيث توفر هذه الطريقة نهجا بديلا للنموذج الحيواني المعدل وراثيا للدراسة الميكانيكية ل SMCs الرئوية. الأهم من ذلك ، هذه التقنية هي المقياس الحصري لتحقيق التعديل الجيني ل SMCs الرئوي البشري في البحوث الانتقالية.

تقدم هذه المقالة وصفا شاملا لإعداد PCLSs للفأر مع الشعب الهوائية والشرايين الرئوية المحفوظة جيدا وتطبيقها في اختبارات الانقباض وإشارات Ca2+ . يدعم إعداد PCLS عمل العضلات الملساء في بيئة الرئة الحية مع السماح بوصول الدراسة الميكانيكية إلى الخلايا في الموقع. جعلت هذه الميزة الفريدة من نوعها إعداد PCLS أداة متعددة الاستخدامات لدراسة مجرى الهواء الرئوي و SMCs الوعائية في الصحة والأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة ، K08135443 (Y.B) ، 1R01HL132991 (X.A).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

علم الأحياء ، العدد 183 ،
استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter