Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Brug af den præcisionsskårne lungeskive til at studere den kontraktile regulering af luftveje og intrapulmonal arteriel glat muskel

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63932
Automatic Translation
1, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Den nuværende protokol beskriver forberedelse og anvendelse af musepræcisionsskårne lungeskiver til at vurdere luftvejene og intrapulmonal arteriel glat muskelkontraktilitet i et næsten in vivo miljø.

Abstract

Glatte muskelceller (SMC) formidler sammentrækningen af luftvejene og den intrapulmonale arterie for at ændre henholdsvis luftstrømsmodstand og lungecirkulation og spiller dermed en kritisk rolle i lungesystemets homeostase. Deregulering af SMC-kontraktilitet bidrager til flere lungesygdomme, herunder astma og pulmonal hypertension. På grund af begrænset vævsadgang og mangel på kultursystemer til opretholdelse af in vivo SMC-fænotyper forbliver molekylære mekanismer, der ligger til grund for den deregulerede SMC-kontraktilitet i disse sygdomme, imidlertid fuldt identificeret. Den præcisionsskårne lungeskive (PCLS) tilbyder en ex vivo-model , der omgår disse tekniske vanskeligheder. Som en levende, tynd lungevævssektion bevarer PCLS SMC i naturlige omgivelser og tillader in situ-sporing af SMC-sammentrækning og intracellulær Ca2+ signalering, der regulerer SMC-kontraktilitet. Her leveres en detaljeret mus PCLS-forberedelsesprotokol, som bevarer intakte luftveje og intrapulmonale arterier. Denne protokol involverer to væsentlige trin, før lungeloben udsættes for udskæring: oppustning af luftvejene med lavsmeltepunktsagarose gennem luftrøret og påfyldning af lungekar med gelatine gennem højre ventrikel. PCLS udarbejdet ved hjælp af denne protokol kan bruges til bioassays til at evaluere Ca2 + -medieret kontraktil regulering af SMC i både luftvejene og de intrapulmonale arterielle rum. Når den anvendes på musemodeller af luftvejssygdomme, muliggør denne protokol den funktionelle undersøgelse af SMC og giver derved indsigt i den underliggende mekanisme for SMC-kontraktilitetsderegulering i sygdomme.

Introduction

Glat muskelcelle (SMC) er en vigtig strukturel celletype i lungen, der primært befinder sig i medievæggen i luftveje og lungekar. SMC'er indgår kontrakt om at ændre luminalkaliberen og dermed regulere luft og blodgennemstrømning 1,2. Derfor er kontraktil regulering af SMC'er afgørende for at opretholde homeostase af luftventilation og lungecirkulation. I modsætning hertil fremkalder afvigende SMC-kontraktilitet obstruktiv luftvejs- eller lunge vaskulære sygdomme som astma og pulmonal arteriel hypertension. Den funktionelle vurdering af lunge-SMC'er er imidlertid blevet udfordret af begrænset adgang til lungevævet, især de små luftveje og mikrofartøjer i den distale del af lungen 2,3. Nuværende løsninger anvender indirekte assays, såsom måling af luftstrømsmodstand af Flexivent for at afspejle luftvejsforsnævring og kontrol af lungearterielt blodtryk ved højre hjertekateterisering for at vurdere lungevaokontraktion 4,5. Disse indirekte assays har imidlertid flere ulemper, såsom at være forvirret af strukturelle faktorer, undlade at fange den rumlige mangfoldighed af luftvejs- eller vaskulære reaktioner i hele lungeskalaen 6,7 og uegnet til den mekanistiske undersøgelse af kontraktil regulering på celleniveau. Derfor er alternative tilgange ved hjælp af isolerede primære celler, luftrør / bronchi muskelstrimler 8,9 eller store vaskulære segmenter10 blevet anvendt til SMC-undersøgelsen in vitro. Ikke desto mindre har disse metoder også begrænsninger. For eksempel gør en hurtig fænotypisk tilpasning af primære SMC'er i kulturtilstanden11,12 det problematisk at ekstrapolere fund fra cellekultur til in vivo-indstillinger. Desuden repræsenterer den kontraktile fænotype af SMC'er i de isolerede proksimale luftvejs- eller vaskulære segmenter muligvis ikke SMC'erne i den distale lunge 6,7. Desuden forbliver muskelkraftmålingen på vævsniveau adskilt fra molekylære og cellulære begivenheder, der er afgørende for mekanistisk indsigt i kontraktil regulering.

Præcisionsskåret lungeskive (PCLS), en levende lungevævssektion, giver et ideelt ex vivo-værktøj til at karakterisere lunge-SMC'er i et nær in vivo-mikromiljø (dvs. bevaret multicellulær arkitektur og interaktion)13. Siden Dr. Placke og Fisher først introducerede fremstillingen af lungeskiver fra agaroseoppustede rotte- og hamsterlunger i 1980'erne 14,15, er denne teknik blevet avanceret kontinuerligt for at give PCLS'er højere kvalitet og større alsidighed til biomedicinsk forskning. En væsentlig forbedring er forbedringen af lungearteriel konservering ved gelatineinfusion ud over lungeinflation med agarose via luftrøret. Som følge heraf holdes både luftvejene og lungearterierne intakte i PCLS til ex vivo-vurdering 16. Desuden, PCLS er levedygtig i længere tid i kultur. For eksempel havde mus PCLS'er ingen signifikant ændring i cellelevedygtighed og metabolisme i mindst 12 dage i kultur, såvel som de bevarede luftvejskontraktilitet i op til 7 dage17. Derudover, PCLS holder luftveje eller skibe i forskellige størrelser til sammentræknings- og afslapningsassays. Desuden kan intracellulær Ca2+ signalering af SMC'er, den afgørende faktor for cellekontraktilitet, analyseres med Ca2+ reporterfarvestoffer afbildet af et konfokalt eller 2-fotonmikroskop13.

I betragtning af den omfattende anvendelse af musemodellen i lungeforskning, en detaljeret protokol er beskrevet her til forberedelse af mus PCLS med intakte luftveje og intrapulmonale arterier til ex vivo lungeforskning. Ved hjælp af de forberedte PCLS'er demonstrerede vi efterfølgende, hvordan man evaluerer luftvejene og lungearterielle reaktioner på snærende eller afslappende stimuli. Derudover beskrives metoden til indlæsning af PCLS med Ca2+ reporterfarvestof og derefter billeddannelse ca2+ signalering af SMC'er forbundet med kontraktile eller afslappende reaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al dyrepleje var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts General Hospital. Vildtype C57/B6 hanmus, 8 uger gamle, blev anvendt til denne undersøgelse.

1. Eksperimentel forberedelse

  1. Forbered arbejdsløsningen.
    1. Forbered 1x Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS, med Ca2+ og Mg2+, og pH afbalanceret med 20 mM HEPES, se Materialetabel). Brug HBSS-løsningen til at forberede og behandle PCLS. Hold HBSS-opløsningen kold på is, når du forbereder PCLS'er.
  2. Forbered dyrkningsmediet af PCLS ved at supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium og F-12 (DMEM-F12) med et antibiotisk-antimykotisk middel (1: 100 volumenforhold, se Materialetabel).
  3. Forbered 1,5% agarose og 6% gelatineopløsning.
    1. Agarose eller gelatinepulver med lavt smeltepunkt (LMP) blandes separat med HBSS-opløsning i 15 ml sterile centrifugerør (eller 50 ml rør, hvis opløsningsvolumen >10 ml) til slutkoncentrationer.
      BEMÆRK: Samlet volumen af agaroseopløsning = 5 ml/mus x antal mus; gelatineopløsning = 2 ml/mus x antal mus.
    2. Opvarm opløsningsrørene i kogende vand, indtil pulveret er helt opløst. Opbevar både agarose- og gelatineopløsninger i et 42 °C vandbad.
      BEMÆRK: En varmelampe ved dissektionsbordet kan være nyttig til at holde driftsmiljøet varmt og forhindre agaroseopløsning i at størkne, før den injiceres i muselungen.
  4. Nedsænk alle dissektionsværktøjer, herunder et par dissekeringssaks, to par buede mikrodiskerende tang og et par hæmostatiske tang i 70% ethanolopløsning i mindst 20 minutter til sterilisering.
  5. Hold en vibratom klar (se Materialetabel) til at skære lungevævet i tynde skiver.
  6. Opbevar et omvendt fasekontrastmikroskop med et CCD-kamera for at evaluere luftvejene eller vaskulære kontraktile reaktioner og et specialbygget laserscanningskonfokalmikroskop (se materialetabel) for at vurdere Ca2+ signalering i lunge-SMC'er18.

2. Inflation af muselunger med agarose- og gelatineopløsning

  1. Afliv musen.
    1. Anbring musen i et plastkammer (ca. 750 cm3) med 5% isofluran. Hold musen i kammeret, indtil den holder op med at trække vejret i mindst 1 min.
      BEMÆRK: Andre primære eutanasimetoder, såsom intraperitoneal injektion af ketamin (240 mg / kg) og xylazin (32 mg / kg) 19 eller pentobarbital (0,3 ml) 20, kan anvendes som alternativer til inhaleret isofluran.
    2. Placer musekroppen på et dissektionsbræt i liggende stilling. Fastgør kroppen på plads ved at fastgøre halen, forpoterne og hovedet med 25 G sprøjtenåle, og desinficer kroppen med 70% ethanolspray.
    3. Skær musens mave op med kirurgisk saks (snit, ~ 2 cm lang x 2 cm bred). Skær derefter abdominal aorta af for at nedbryde blodvolumenet.
  2. Oppust lungelober ved at følge nedenstående trin.
    1. Åbn brysthulen forsigtigt langs brystbenet og bilateralt ringere ribbenbur over membranen, og observer lungeloberne kollapse, når brysthulen åbner.
    2. Fjern en del af bilaterale ventrale ribbenbure for at udsætte hjertet. Undgå lungeskader ved at pege den skarpe saksespids væk fra lungevævet.
    3. Brug pincet til at adskille thymus og blødt væv i musehalsen for at udsætte luftrøret.
    4. Skær et lille hul (1,2 mm i diameter) i den øverste ende af luftrøret, så spidsen af et 20 G Y-formet IV-kateter passeres (se materialetabel).
    5. Tilslut den ene adapterport på det Y-formede kateter med en 3 ml sprøjte fyldt med 0,5 ml luft og den anden port med en 3 ml sprøjte fyldt med 2 ml varm 1,5% agaroseopløsning (42 ° C).
    6. Injicer agaroseopløsning for at fylde kateteret, og skub derefter kateteret gennem den forskårne åbning ind i luftrøret i 5-8 mm i længden.
    7. Injicer langsomt agaroseopløsningen ved ca. 1 ml/5 s. Lungen vil udvide sig langs den proksimale til distale akse. Stop injektionen, når kanten af hver lungelap er oppustet.
      BEMÆRK: Oppust ikke lungen, da dette kan sprænge den. Volumenet af agaroseopløsning til oppustning af hele lungen hos en ung voksen mus er ca. 1,3 ± 0,1 ml.
    8. Injicer 0,2-0,3 ml luft fra den anden sprøjte for at skubbe den resterende agarose i kateteret og ledende luftveje til det distale alveolrum.
    9. Klip luk luftrøret med et par buede hæmostatiske tang (se Materialetabel).
  3. Udfyld lungevaskulaturen.
    1. Fyld en 1 ml sprøjte med varm 6% gelatine. Tilslut til et nålebundsvenekateter, fyld kateteret med gelatineopløsning, og punkter derefter højre ventrikel tæt på den ringere væg med nålen.
    2. Skub nålen ind i højre ventrikel i 2-3 mm i længden og peg nålespidsen mod hovedpulmonalarterien.
    3. Injicer 0,2 ml gelatineopløsning langsomt i højre ventrikel og lungearteriekar.
      BEMÆRK: Lungelapperne ser lidt lysere ud med passende gelatineinflation.
    4. Hold nålen på plads i 5 minutter efter injektion, afkøl lungelapperne ved at hælde iskold HBSS-opløsning på hjertet og lungen, og placer derefter kroppen med dissektionsbrættet i et 4 °C køleskab eller på is i alt 10 minutter.
    5. Fjern muselungen og hjertet fra omgivende bindevæv med en saks. Adskil derefter hver lungelap og opbevar dem i HBSS-opløsning på is.

3. Sektionering af lungelober til tynde skiver

  1. Trim og fastgør lungeloben på toppen af prøvekolonnen med superlim, og orienter loben (figur 1A, B) for at tillade skæreretningen at være vinkelret på de fleste luftveje fra hila til lungeoverfladen.
  2. Brug en vibratom med et frisk tyndt barberblad til at skære lungelappen i 150 μm skiver. Skiverne opsamles i 100 mm sterile petriskåle, der er fyldt med kold HBSS-opløsning.
    BEMÆRK: Indstil passende bladbevægelseshastighed og svingningsfrekvens, før du begynder at skære. En typisk indstilling for en Compresstom er Hastighedsniveau 4 og Svingningsniveau 4.
  3. Overfør skiver til petriskåle fyldt med DMEM/F-12-dyrkningsmedium (20 skiver/15 ml medium/fad) og opbevar dem i en 37 °C inkubator natten over før forsøg.
    BEMÆRK: Mus PCLS'er kan opretholdes i kultur i ca. 7 dage uden at miste luftvejskontraktile reaktioner17. Levetiden af lungearterier er ikke blevet grundigt evalueret. I vores observation bevarer de intakt struktur og vasoreaction i mindst 3 dage i DMEM / F12 medium. Til langtidsopbevaring kan pclsser til mus anbringes i kryovirale fyldt med DMEM/F12-medium indeholdende 10% DMSO (5 skiver i 1 ml medium pr. hætteglas), fryses i en isopropylalkoholfyldt beholder ved -80 °C natten over og kryopræserveres i flydende nitrogen i uger til måneder21.

4. Analyse af kontraktile reaktioner af intrapulmonale luftveje og arterier

  1. Placer PCLS'er i en HBSS-fyldt 24-brønds kulturplade, en i hver brønd. Find PCLS midt i brønden, og fjern derefter HBSS-opløsningen med en pipette.
  2. Find målluftvejen og karret i skiven under mikroskopet, og dæk derefter skiven med et nylonnet med et forskåret centralt hul (2-3 mm i diameter) for at udsætte målområdet.
  3. Læg en hul metalskive oven på masken for at holde skiverne på plads (figur 2A).
  4. Tilsæt 600 μL HBSS-opløsning for at nedsænke PCLS. Hvil udsnittet i 10 minutter, og optag derefter basisbillederne af luftveje eller fartøjer.
  5. Inducer luftvejs- eller vaskulær sammentrækning ved forsigtigt at suge den tomme HBSS-opløsning ud med en pipette og tilsætte 600 μL HBSS med en agonist, såsom 1 μM methacholin (MCh) eller 10 nM endothelin (se materialetabel).
    BEMÆRK: KCl-stimulering som en værktøjssætstandard er ikke påkrævet før methacholin- eller endothelineksponering. 100 mM KCl-stimulering i musenes luftveje inducerer kun en lille og uregelmæssig luftvejskontraktion (10%-15%)20. Ligeledes er en priming methacholinstimulering ikke forpligtet, da vi har bekræftet, at den samme agonist, for eksempel methacholin eller serotonin, udløser lignende luftvejskontraktion ved den første og gentagne eksponeringer 20,22.
  6. Overhold reaktionen under mikroskopet, indtil ændringen af luminalområdet når en ækvilibrerende status, og registrer derefter luftvejs- eller vaskulærbillederne til analyse.
  7. MCh- eller endothelinopløsning fjernes med en pipette, og der tilsættes en ny 600 μL HBSS-opløsning med samme agonistkoncentration og et afslappende middel. observere og registrere luftvejene eller vaskulær afslapning.
  8. Kvantificer luftvejs- eller vaskulær reaktionen ved at følge nedenstående trin.
    1. Indlæs billederne til NIH-sponsoreret gratis software FIJI.
    2. Vælg Polygonvalg på værktøjslinjen for at skitsere luftvejene eller vaskulær lumen på hver ramme.
    3. Vælg Analysér > Indstil målinger > område.
    4. Vælg Analysér > Måling for at kvantificere interesseområdet. Resultaterne vises i et separat vindue til statistisk analyse.

5. Analyse af Ca2+ signalering af luftvejs eller vaskulære SMC'er

  1. Forbered Ca2+ farvestofindlæsningsbufferen.
    1. Opløs Ca2+ farvestof, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (se materialetabel), 50 μg (et hætteglas) med 10 μL DMSO.
    2. 0,2 g pluronisk F-12 pulver (se materialetabel) opløses i 1 ml DMSO for at generere en 20% pluronisk opløsning.
    3. Bland 10 μL 20% pluronisk opløsning med 10 μL Ca2+ farvestof-DMSO-opløsning.
    4. Der fremstilles Ca2+ farvestofbelastningsbuffer ved at tilsætte 20 μL af blandingen til 2 ml HBSS-opløsning med 200 μM sulfobromophthalein (se materialetabel).
  2. Anbring 15 mus PCLS'er i 2 ml Ca2+ belastningsbuffer, og inkuberes ved 30 ° C i 1 time. Derefter flyttes skiverne til 2 ml HBSS-opløsning med 100 μM sulfobromophthalein i yderligere 30 minutter til fluorescerende farvestofdeesterificering ved stuetemperatur.
  3. Registrer Ca2+ signalering af SMC'er.
    1. Placer Ca2+ farvestofbelastede skiver på et stort dækglas.
    2. Fyld en 3 ml sprøjte med silikonefedt med højt vakuum. Pres fedtet gennem en 18 G stump nål for at tegne to parallelle linjer over dækglasset over og under skiven.
    3. Dæk skiven med et nylonnet mellem to fedtlinjer. Placer det andet dækglas oven på masken for at generere et kammer forseglet med fedt på siderne (figur 3A).
      BEMÆRK: Nylonnet er afgørende for at holde skiven fastgjort til bunddækslet og dermed holde sig inden for arbejdsafstanden for et omvendt mål af høj størrelse, såsom 40x olie.
    4. Tilsæt HBSS eller agonistopløsning i kammeret fra den ene ende ved pipettering manuelt eller via et perfusionssystem. Fjern væsken fra kammeret ved at suge fra den anden ende med silkepapir eller vakuum i tilfælde af kontinuerlig væskeperfusion.
    5. Sæt PCLS-kammeret på mikroskopstadiet. Registrer Ca2+ -signalering af SMC23 med et specialbygget konfokalt resonansscanningsmikroskop med en laserscanningshastighed på 15 eller 30 billeder/s.
      BEMÆRK: Alternativt kan et højhastigheds kommercielt laserscanningskonfokalmikroskop, der er bredt tilgængeligt i øjeblikket, anvendes i Ca2+ signalassay af lunge-SMC'er i PCLS.
  4. Kvantificer Ca2+ fluorescensen i SMC'er.
    1. Indlæs den optagede billedsekvens til FIJI, og vælg > Type > 8-bit gråtoner.
    2. Vælg rektangelvalget på værktøjslinjen, og definer et interesseområde på 5 pixel x 5 pixel i en jævn muskelcelle.
    3. Vælg Analysér > Indstil målinger > Middelgrå værdi, der repræsenterer ca. 2+ fluorescensintensiteten.
    4. Hvis placeringen af et investeringsafkast ændres med SMC-sammentrækning, skal du vælge Analyser > Måle Ca2+ fluorescerende intensitet ramme for ramme.
    5. Hvis roi for SMC forbliver i en lignende position i en stak billeder, skal du vælge Image > Stacks > Mål stakken af Ca2+ fluorescerende intensitet.
      BEMÆRK: En brugerdefineret skrevet makro kan tilsluttes for at spore ROI i SMC, når den bevæger sig med sammentrækning i en billedstak og automatisk måler Ca2+ intensitet (grå værdi) af ROI ramme for ramme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus PCLS-præparat, der bevarer intakte intrapulmonale luftveje og arterier
En 150 μm tyk PCLS blev observeret under det omvendte fasekontrastmikroskop. I musens lunger ledsages ledende luftveje af intrapulmonale arterier, der løber fra hilus til den perifere lunge. Et repræsentativt lungeluftvejsarteriebundt i en mus PCLS er vist i figur 2B. Luftvejene kan let identificeres ved hjælp af kuboidale epitelceller med aktiv cilial slag, der forer den indre overflade af lumen. I modsætning hertil er den nærliggende lungearterie præget af fladt endotel. Når man når det perifere lungefelt, forgrener de ledende luftveje sig i åndedrætskanaler og sække, der omgiver de små intra-acinar arterioler (figur 2C).

Brug af mus PCLS til at vurdere lungeluftvejen og arteriel sammentrækning
Methacholin (MCh, 1 μM) induceret luftvejskontraktion er vist i figur 2B. Luftvejenes kontraktile reaktioner kvantificeres ved procentdelen af luminal arealreduktion efter MCh-eksponering (figur 2D). I modsætning hertil præsenterer lungearterien intet respons på MCh-stimuli (figur 2B). Luftveje opretholder lignende dosisafhængige kontraktile reaktioner på MCh i PCLS efter 1-dages eller 5-dages kultur (figur 2D). Når PCLS udsættes for endothelin (10 nM), både luftveje og lungearterier indsnævres (figur 2C, E), efterfulgt af NOC-5 (100 μM) induceret afslapning (figur 2E).

Brug af musens PCLS til at vurdere Ca2+ signalering af luftvejene og arteriel SMC
Ca2+ farvestofbelastet PCLS observeres under et konfokalt fluorescerende mikroskop. Ca2+ fluorescens i luftvejene (figur 3B) og vaskulære (figur 3C) SMC'er er lave ved hvilestatus, uden at nogen fokal gnist af intracellulær Ca2+ signalering er bemærkelsesværdig. Ved eksponering for agonister hæves Ca2+ fluorescensintensiteten i SMC (figur 3B, C), normalt fra et sted og formerer sig derefter til hele cellen. Ca2+ fluorescerende bølger vises gentagne gange i samme celle som oscillerende signaler (figur 3D, E). Generelt øges frekvensen af Ca2+ oscillation, når agonistkoncentrationen stiger, indtil den når et plateauniveau24. Airway SMC afslapning er forbundet med faldende eller ophør af Ca2+ svingninger25.

Figure 1
Figur 1: Orientering af muselungelober til vibratomskæring. Musens lungelober er opdelt i individuelle til sektioner. (A) Venstre (1), højre kranie (2) og kaudale lobes (3) trimmes nær hilum langs de hvide stiplede linjer, inden den flade skæreflade klæbes på prøvekolonnen. Placeringen af venstre lap er vist i (4). (B) Den højre midterste lap kan limes direkte på prøvekolonnen. Den højre tilbehørslap blev ikke almindeligt anvendt på grund af dens lille størrelse. Passende orientering af forskellige lobes sikrer, at de fleste luftveje og lungekar præsenterer tværgående sektioner i PCLS. Skalabjælke = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kontraktile og afslappende reaktioner af luftveje og lungearterier i mus PCLS. (A) Skematisk viser placeringen af en PCLS i en kulturpladebrønd til sammentrækningsassay. (B) Repræsentative billeder, der viser en luftvej (sorte pile) med en nærliggende lungearterie (sorte pilespidser) i HBSS i hvile og efter eksponering for 1 μM methacholin (MCh). (C) Repræsentative billeder, der viser en intra-acinar arteriole i HBSS i hvile og ved eksponering for 10 nM endothelin (Endo). (D) Dosisafhængige luftvejskontraktile reaktioner på MCh i PCLS'er efter 1-dages (grå linje) og 5-dages (sort stiplet linje) kultur. Hvert punkt repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM på ni luftveje fra to mus. (E) Repræsentative billeder, der viser 10 nM endothelin-induceret luftvejs- og lungearteriel sammentrækning, efterfulgt af 100 μM NOC-5, en nitrogenoxiddonor, induceret afslapning. Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ca2+ signalering af luftvejs- og lungearterielle SMC'er i PCLS. (A) Skematisk, der viser opsætningen af et kammer med et top- og bunddækselglas, fedtforsegling og et nylonnet til at holde et PCLS i brændplanet til Ca2+ billeddannelse af SMC'er. (B) Repræsentative fluorescerende billeder, der viser Ca2+ signalering af luftvejs-SMC'er i hvile og efter eksponering for 1 μM MCh. Epi, epitelcelle. (C) Ca2+ fluorescerende billeder af lungearterielle SMC'er i hvile og efter eksponering for 10 nM endothelin (Endo). De dristige hvide pile angiver lungearteriens længdeakse, og de stiplede linjer med endepile angiver den spiralformede fordeling af vaskulære SMC'er omkring arterievæggen. Skala bar = 20 μm. Oscillerende forhøjelse af Ca2+ fluorescensintensitet (Ft), i forhold til fluorescensintensiteten ved hviletilstand (F0), i en luftvejs SMC til 1 μM MCh (D) og i en lungearteriel SMC som reaktion på 10 nM endothelinstimulering (E). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forberedelsen af PCLS involverer flere kritiske trin. For det første er det vigtigt at blæse lungeloben homogent for at undgå variation af vævsstivhed fra ujævn agarosefordeling. Da den flydende agarose hurtigt gelerer i tynde katetre eller luftveje ved en temperatur under 37 ° C, kan den resulterende påfyldningsfejl i det distale lungefelt øge forskellen i lungevævsstivhed og forårsage vævsrivning under vibratomsektionen. Derfor kan det praktiseres at holde den lavsmeltende agaroseopløsning ved 42 ° C i et vandbad og bruge en varmelampe ved dissektionsbordet for at undgå hurtig agarosegelering. En hurtig injektion kan skubbe mere agarose til lungeparenchymen med højere overholdelse, og det skal derfor undgås. Den manuelle agaroseinjektion tager normalt omkring 5-7 s. For det andet er et nødvendigt trin i slutningen af agarosefyldning at skubbe en lille mængde luft (~ 0,2 ml) for at skylle agarosen fra den ledende luftvej til det distale alveolrum. Ellers ville agarosen gelere og forblive i lumen for at modstå luftvejskontraktionen. Det er også værd at bemærke, at agarosegeleringen inde i alveolerne forbliver på plads og aldrig smelter igen ved 37 ° C i inkubatoren. Agarosegelen spiller en væsentlig rolle i at holde lungevævets 3D-struktur som in vivo opretholdt af det negative intrathoraciske tryk. For det tredje er det vigtigt at perfusere lungearterier med gelatineopløsning for at holde arteriel lumen åbent i PCLS. Gelatineopløsningen gelerer ved stuetemperatur som en mekanisk blokering for at modstå vasokonstriktion ved kemiske og fysiske stimuli under vævssektionen. Uden gelatineinflation kollapser lungearterierne i lungeskiver normalt og løsnes fra det omgivende interstitielle væv, selv i nærvær af høje doser blandede vasodilatatoriske midler, herunder phentolamin, adrenalin og nifedipin13,16. I modsætning til en agarosegel smelter gelatinegel ved 37 ° C, der strømmer ud af det vaskulære lumen efter inkubation natten over, hvilket efterlader arteriel lumen fri for obstruktion før vaskulær reaktionsassay.

Da PCLS bevarer lunge-SMC'er in situ og bevarer deres kontraktile funktion i en næsten in vivo-tilstand, det er blevet anvendt som en kraftfuld platform til at undersøge reguleringen af SMC-sammentrækning, især reguleringen via Ca2+ afhængige mekanismer26. Især med et multikanalskonfokalt eller to-fotonmikroskop med lav forstørrelse kan agonistinduceret Ca2+ signalering i luftvejs-SMC'er og tilhørende luminal indsnævring fanges samtidigt til mekanistisk undersøgelse13,20. Luftvejs- eller vaskulær lydhørhed målt ved hjælp af PCLS-metoden forventes at afspejle cellulære egenskaber fri for påvirkninger fra lungemiljøet, såsom det inflammatoriske miljø, og neural innervering af responsen i lungen27,28. Som sådan giver PLCS et eksperimentelt system til at hjælpe med at skelne mellem iboende vs. sekundær SMC-ændring. Ud over at undersøge den kontraktile regulering af SMC'er i sundheds- og sygdomsmodeller er PCLS'er blevet indsamlet fra forskellige aldersgrupper for at undersøge den funktionelle tilpasning af luftvejs-SMC under postnatal lungeudvikling og som reaktion på miljømæssige fornærmelser27. Desuden indeholder PCLS'er forskellige størrelser luftveje og blodkar fra det perifere til det proksimale lungefelt, hvilket muliggør undersøgelse af en regionsspecifik mekanisme til regulering af lunge-SMC'ernes kontraktilitet i homeostase og under patogene stimuli. Da pclsser med mus bevarer luftvejskontraktiliteten i dyrkningsmediet i 7 dage17, er de desuden blevet brugt som en ex vivo-model til at undersøge eller validere risikofaktorer for SMC-deregulering, såsom cytokin eller viruseksponering29. Endelig, PCLS giver en ideel platform til at screene vasodilatatoriske eller bronkodilatatoriske lægemidler. Især bioassays ved hjælp af PCLS-præparat er yderst omkostningseffektive, da en voksen mus kan generere hundredvis af lungeskiver. Brug af nabo-PCLS'er i kontrol- og behandlingsgrupperne reducerer også den eksperimentelle bias fra intergroup-prøvevariationen betydeligt.

I betragtning af forskellen mellem gnaver og menneskelig lungeanatomi, den menneskelige PCLS er et mere kraftfuldt værktøj til translationel forskning. Den begrænsede tilgængelighed af humant lungevæv, især syge lungeprøver, er dog fortsat en udfordring. I modsætning hertil anvendes muselungevæv, musemodeller af humane sygdomme og transgene musemodeller i vid udstrækning i biomedicinsk og farmakologisk forskning, hvilket gør mus PCLS til et tilgængeligt og sygdomsrelevant system13,30. Derudover har bevarelsen af intrapulmonale arterier kun været vellykket i mus PCLS-forberedelse, hvilket gør det til et unikt værktøj til at udforske vaskulær deregulering i lunge vaskulære sygdomme som pulmonal hypertension. Derfor, på trods af forbehold forbundet med eventuelle sygdomsmodeller, en protokol til mus PCLS forberedelse er uvurderlig for at etablere en ex vivo platform til at undersøge luftvejs- og lungearterier i sundhed og sygdom. Vi og andre har rapporteret lungeforskning med humane PCLS'er 31,32,33,34. Efter vores erfaring ligner protokollen for human PLCS-forberedelse musens, bortset fra at anvende en højere agarosekoncentration på 2%, mere agaroseopløsning (3 L for en lunge) og meget større katetre til cannulate main, lobar eller segmentale bronchi til agaroseinjektion. Erfaring med plcs-forberedelse af mus hjælper enormt med forberedelse af human lungeskiver.

På trods af mange fordele ved at bruge PCLS-forberedelse i lunge SMC-forskning, Det er afgørende at være opmærksom på begrænsningerne ved denne teknik. For det første forbliver PCLS et statisk system, der mangler fysiologiske vejrtrækningscyklusser, der periodisk strækker lungeparenkymale og luftveje. Det indeholder heller ikke blodcirkulation, som genererer pulserende tryk på de vaskulære SMC'er og skærekræfter på endotelceller. Disse mekaniske variationer i PCLS kunne ændre den kontraktile regulering af SMC'er. Selvom en fuld etablering af luftventilation og blodcirkulation i PCLS'er er uopnåelig, i det mindste for luftvejs SMC-undersøgelsen, er der i det sidste årti gjort en vagarious indsats for at generere en "vejrtrækning" PCLS ved at strække vævssektionen med en række forskellige enheder 35,36,37. For det andet opretholder lunge-SMC'er kun deres kontraktilitet i en begrænset periode. Denne tidsbegrænsning forhindrer PLCS'erne i at modellere de subakutte ændringer af SMC'er, for eksempel en proces, der tager mere end 6-7 dage at ændre luftvejs-SMC'er. Da tidligere forskning afslører, at SMC'er mister kontraktilitet på grund af en formindskelse af kontraktile proteiner, har optimering af kulturmediet med en yderligere lav dosis insulin vist sig at opretholde luftvejene SMC-sammentrækning i op til 12 dage17. Endelig er den genetiske manipulation af lunge-SMC'er ved plasmid- eller siRNA-transfektion af PCLS fortsat mislykket. Den tekniske barriere for transfekte SMC'er i PCLS berettiger bestemt yderligere undersøgelse, da denne metode giver en alternativ tilgang til den transgene dyremodel til mekanistisk undersøgelse af lunge-SMC'er. Endnu vigtigere er denne teknik den eneste foranstaltning til at opnå genetisk modulering af humane lunge-SMC'er i translationel forskning.

Denne artikel giver en omfattende beskrivelse af forberedelse af mus PCLS'er med velbevarede luftveje og lungearterier og anvendelse af dem i sammentrækning og Ca2 + signaleringsassays. PCLS forberedelse understøtter den glatte muskelfunktion i et levende lungemiljø, samtidig med at mekanistisk undersøgelse får adgang til celler in situ. Denne unikke funktion har gjort PCLS-præparatet til et alsidigt værktøj til at studere lungeluftvejene og vaskulære SMC'er i sundhed og sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af NIH-tilskud, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309626
15 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229411
3 mL syringe BD 309585
50 mL sterile centrifuge tubes Celltreat 229422
Acetyl-beta-methacholine Millipore Sigma 62-51-1
Antibiotic-anitmycotic Thermo Fisher 15240-062
CCD-camera Nikon Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess Fisher Scientific 12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials Fisher Scientific 430488
Custom-built laser scanning confocal microscope Details in Reference 18
DMEM/F12 Fisher Scientific MT-10-092-CM
Endothelin 1 Millipore Sigma E7764
Fine dissecting scissor Fisher Scientific NC9702861
Freezing container Sigma-Aldrich C1562
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich 9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher 14025092
Hemostatic forcep Fisher Scientific 16-100-117
HEPES Thermo Fisher 15630080
High vaccum silicone grease Fisher Scientific 146355d
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907-1KG-K
Metal washers Home Depot Product Authority 800442 Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep Sigma-Aldrich F4142
Needle scalp vein set (25 G) EXELINT 26708
NOC-5 Cayman Chemical 16534
Nylon mesh Component Supply U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM Life Technologies o-6807
Phase-contrast microscope Nikon Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127 Thermo Fisher P-6867
Razor blades Personna Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein Sigma-Aldrich S0252
Superglue Krazy Glue Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose Thermo Fisher 16520050
Vibratome Precisionary VF 310-0Z
Vibratome chilling block Precisionary SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube Precisionary SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter BD 383336 BD Saf-T-Intima closed IV catheter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795 (2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Tags

Biologi udgave 183
Brug af den præcisionsskårne lungeskive til at studere den kontraktile regulering af luftveje og intrapulmonal arteriel glat muskel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the… More

Bai, Y., Ai, X. Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63932, doi:10.3791/63932 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter