Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Verwendung von präzise geschnittenen Lungenschnitten der Maus zur Beurteilung der Kontraktilität der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur in einem nahezu in vivo Milieu.
Abstract
Glatte Muskelzellen (SMC) vermitteln die Kontraktion der Atemwege und der intrapulmonalen Arterie, um den Luftströmungswiderstand bzw. die Lungenzirkulation zu modifizieren, und spielen somit eine entscheidende Rolle in der Homöostase des Lungensystems. Die Deregulation der SMC-Kontraktilität trägt zu mehreren Lungenerkrankungen bei, einschließlich Asthma und pulmonaler Hypertonie. Aufgrund des begrenzten Gewebezugangs und des Mangels an Kultursystemen zur Aufrechterhaltung von In-vivo-SMC-Phänotypen bleiben molekulare Mechanismen, die der deregulierten SMC-Kontraktilität bei diesen Krankheiten zugrunde liegen, jedoch vollständig identifiziert. Die präzisionsgeschnittene Lungenscheibe (PCLS) bietet ein Ex-vivo-Modell , das diese technischen Schwierigkeiten umgeht. Als lebender, dünner Lungengewebeschnitt behält das PCLS SMC in natürlicher Umgebung und ermöglicht die In-situ-Verfolgung der SMC-Kontraktion und der intrazellulären Ca 2 + -Signalgebung, die dieSMC-Kontraktilität reguliert. Hier wird ein detailliertes PCLS-Vorbereitungsprotokoll für die Maus bereitgestellt, das intakte Atemwege und intrapulmonale Arterien bewahrt. Dieses Protokoll umfasst zwei wesentliche Schritte, bevor der Lungenlappen dem Schneiden unterzogen wird: Aufblasen der Atemwege mit Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch die Luftröhre und Auffüllen der Lungengefäße mit Gelatine durch den rechten Ventrikel. Das mit diesem Protokoll hergestellte PCLS kann für Bioassays verwendet werden, um die Ca2+-vermittelte kontraktile Regulation von SMC sowohl in den Atemwegen als auch in den intrapulmonalen arteriellen Kompartimenten zu bewerten. Bei der Anwendung auf Mausmodelle von Atemwegserkrankungen ermöglicht dieses Protokoll die funktionelle Untersuchung von SMC und gibt so Einblick in den zugrunde liegenden Mechanismus der SMC-Kontraktilitätsderegulierung bei Krankheiten.
Introduction
Die glatte Muskelzelle (SMC) ist ein wichtiger struktureller Zelltyp in der Lunge, der sich hauptsächlich in der Medienwand der Atemwege und Lungengefäße befindet. SMCs ziehen sich zusammen, um das luminale Kaliber zu verändern und so den Luft- und Blutfluss zu regulieren 1,2. Daher ist die kontraktile Regulierung von SMCs unerlässlich, um die Homöostase der Luftbelüftung und der Lungenzirkulation aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu provoziert die aberrante SMC-Kontraktilität obstruktive Atemwegs- oder pulmonale Gefäßerkrankungen wie Asthma und pulmonale arterielle Hypertonie. Die funktionelle Beurteilung von Lungen-SMCs wurde jedoch durch den begrenzten Zugang zum Lungengewebe in Frage gestellt, insbesondere zu den kleinen Atemwegen und Mikrogefäßen im distalen Teil der Lunge 2,3. Aktuelle Lösungen greifen auf indirekte Assays zurück, wie z.B. die Messung des Luftstromwiderstands durch Flexivent, um die Verengung der Atemwege zu reflektieren, und die Überprüfung des pulmonalen arteriellen Blutdrucks durch Rechtsherzkatheterisierung zur Beurteilung der pulmonalen Vasokontraktion 4,5. Diese indirekten Assays haben jedoch mehrere Nachteile, wie z.B. strukturelle Faktoren zu verwirren, die räumliche Vielfalt der Atemwegs- oder Gefäßreaktionen in der gesamten Lungenskala nicht zu erfassen 6,7 und sind für die mechanistische Untersuchung der kontraktilen Regulation auf zellulärer Ebene ungeeignet. Daher wurden alternative Ansätze mit isolierten Primärzellen, Luftröhren-/Bronchi-Muskelstreifen 8,9 oder großen Gefäßsegmenten10 für die SMC-Studie in vitro angewendet. Dennoch haben diese Methoden auch Grenzen. Zum Beispiel macht es eine schnelle phänotypische Anpassung primärer SMCs im Kulturzustand11,12 problematisch, Befunde aus der Zellkultur auf In-vivo-Einstellungen zu extrapolieren. Darüber hinaus kann der kontraktile Phänotyp von SMCs in den isolierten proximalen Atemwegs- oder Gefäßsegmenten nicht die SMCs in der distalen Lungedarstellen 6,7. Darüber hinaus bleibt die Muskelkraftmessung auf Gewebeebene von molekularen und zellulären Ereignissen getrennt, die für den mechanistischen Einblick in die kontraktile Regulation unerlässlich sind.
Precision-cut lung slice (PCLS), ein lebender Lungengewebeabschnitt, bietet ein ideales Ex-vivo-Werkzeug zur Charakterisierung pulmonaler SMCs in einer nahezu in vivo Mikroumgebung (d. h. erhaltene multizelluläre Architektur und Interaktion)13. Seit Dr. Placke und Dr. Fisher in den 1980er Jahren erstmals die Herstellung von Lungenscheiben aus mit Agarose aufgeblasenen Ratten- und Hamsterlungen eingeführt haben14,15, wurde diese Technik kontinuierlich weiterentwickelt, um PCLS eine höhere Qualität und größere Vielseitigkeit für die biomedizinische Forschung zu bieten. Eine signifikante Verbesserung ist die Verbesserung der pulmonalen arteriellen Erhaltung durch Gelatineinfusion zusätzlich zur Lungeninflation mit Agarose über die Luftröhre. Infolgedessen werden sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien im PCLS für die Ex-vivo-Beurteilung intakt gehalten 16. Darüber hinaus ist das PCLS für eine längere Zeit in der Kultur lebensfähig. Zum Beispiel hatten Maus-PCLS für mindestens 12 Tage in Kultur keine signifikante Veränderung der Zelllebensfähigkeit und des Metabolismus, und sie behielten die Kontraktilität der Atemwege für bis zu 7 Tagebei 17. Darüber hinaus hält PCLS unterschiedlich große Atemwege oder Gefäße für Kontraktions- und Entspannungsassays. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Ca 2 + -Signalgebung von SMCs, dem Determinantenfaktor der Zellkontraktilität, mit Ca 2+ -Reporterfarbstoffen untersucht werden, die von einem konfokalen oder 2-Photonen-Mikroskop13 aufgenommen wurden.
Unter Berücksichtigung der umfangreichen Anwendung des Mausmodells in der Lungenforschung wird hier ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Maus-PCLS mit intakten Atemwegen und intrapulmonalen Arterien für die Ex-vivo-Lungenforschung beschrieben. Anhand der präparierten PCLS demonstrierten wir anschließend, wie die Reaktionen der Atemwege und der Lungenarterien auf konstriktive oder relaxante Reize bewertet werden können. Darüber hinaus wird auch das Verfahren beschrieben, das PCLS mit Ca 2 + -Reporterfarbstoff zu beladen und dann die Ca2 + -Signalgebung von SMCs in Verbindung mit kontraktilen oder relaxanten Reaktionen abzubilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die gesamte Tierpflege erfolgte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Massachusetts General Hospital. Wildtyp C57/B6 männliche Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet.
1. Versuchsvorbereitung
- Bereiten Sie die funktionierende Lösung vor.
- Bereiten Sie 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, mit Ca 2+ und Mg 2+ und pH ausgewogen mit20 mM HEPES, siehe Materialtabelle) vor. Verwenden Sie die HBSS-Lösung, um das PCLS vorzubereiten und zu verarbeiten. Halten Sie die HBSS-Lösung bei der Herstellung von PCLS kalt auf Eis.
- Bereiten Sie das Kulturmedium von PCLS vor, indem Sie Dulbeccos modifiziertes Adlermedium und F-12 (DMEM-F12) mit einem antibiotisch-antimykotischen Mittel (Volumenverhältnis 1:100, siehe Materialtabelle) ergänzen.
- Bereiten Sie 1,5% Agarose und 6% ige Gelatinelösung vor.
- Agarose oder Gelatinepulver mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) (siehe Materialtabelle) mit HBSS-Lösung separat in 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen (oder 50 ml Röhrchen bei Lösungsvolumen >10 ml) zu Endkonzentrationen mischen.
HINWEIS: Gesamtvolumen der Agaroselösung = 5 ml/Maus x Anzahl der Mäuse; Gelatinelösung = 2 ml/Maus x Anzahl der Mäuse. - Erhitzen Sie die Lösungsrohre in kochendem Wasser, bis sich das Pulver vollständig auflöst. Bewahren Sie sowohl Agarose- als auch Gelatinelösungen in einem 42 °C warmen Wasserbad auf.
HINWEIS: Eine Heizlampe am Seziertisch kann nützlich sein, um die Betriebsumgebung warm zu halten und zu verhindern, dass sich Agaroselösung verfestigt, bevor sie in die Mauslunge injiziert wird.
- Agarose oder Gelatinepulver mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) (siehe Materialtabelle) mit HBSS-Lösung separat in 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen (oder 50 ml Röhrchen bei Lösungsvolumen >10 ml) zu Endkonzentrationen mischen.
- Tauchen Sie alle Sezierwerkzeuge, einschließlich einer Sezierschere, zwei Paare gekrümmter Mikrosezierungszange und eines Paares hämostatischer Pinzetten für mindestens 20 Minuten zur Sterilisation in 70% ige Ethanollösung.
- Halten Sie ein Vibratom bereit (siehe Materialtabelle), um das Lungengewebe in dünne Scheiben zu schneiden.
- Bewahren Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop mit einer CCD-Kamera auf, um die Atemwegs- oder Gefäßkontraktionsreaktionen zu bewerten, und ein speziell angefertigtes konfokales Laserscanning-Mikroskop (siehe Materialtabelle), um die Ca2 + -Signalgebung in pulmonalen SMCs18 zu beurteilen.
2. Aufblasen von Mauslungen mit Agarose und Gelatinelösung
- Euthanasieren Sie die Maus.
- Legen Sie die Maus in eine Kunststoffkammer (ca. 750 cm3) mit 5% Isofluran. Halten Sie die Maus in der Kammer, bis sie mindestens 1 min aufhört zu atmen.
HINWEIS: Andere primäre Euthanasiemethoden, wie die intraperitoneale Injektion von Ketamin (240 mg/Kg) und Xylazin (32 mg/Kg)19 oder Pentobarbital (0,3 ml)20, können als Alternativen zu inhalativem Isofluran angewendet werden. - Legen Sie den Mauskörper auf ein Sezierbrett in Rückenlage. Fixieren Sie den Körper in Position, indem Sie den Schwanz, die Vorderpfoten und den Kopf mit 25 G Spritzennadeln festnageln und den Körper mit 70% Ethanolspray desinfizieren.
- Schneiden Sie den Bauch der Maus mit einer chirurgischen Schere auf (Schnitt, ~2 cm lang x 2 cm breit). Schneiden Sie dann die Bauchaorta ab, um das Blutvolumen zu erschöpfen.
- Legen Sie die Maus in eine Kunststoffkammer (ca. 750 cm3) mit 5% Isofluran. Halten Sie die Maus in der Kammer, bis sie mindestens 1 min aufhört zu atmen.
- Blasen Sie die Lungenlappen mit den folgenden Schritten auf.
- Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig entlang des Brustbeins und des bilateralen unteren Brustkorbs über dem Zwerchfell und beobachten Sie, wie die Lungenlappen kollabieren, wenn sich die Brusthöhle öffnet.
- Entfernen Sie einen Teil der bilateralen ventralen Brustkäfige, um das Herz freizulegen. Vermeiden Sie Lungenschäden, indem Sie die scharfe Scherenspitze vom Lungengewebe wegrichten.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Thymus und das Weichgewebe im Maushals zu trennen, um die Luftröhre freizulegen.
- Schneiden Sie ein kleines Loch (1,2 mm Durchmesser) in das obere Ende der Luftröhre, das den Durchgang der Spitze eines 20 G Y-förmigen IV-Katheters ermöglicht (siehe Materialtabelle).
- Verbinden Sie einen Adapteranschluss des Y-förmigen Katheters mit einer 3-ml-Spritze, die mit 0,5 ml Luft vorgefüllt ist, und den anderen Anschluss mit einer 3-ml-Spritze, die mit 2 ml warmer 1,5%iger Agaroselösung (42 °C) vorgefüllt ist.
- Injizieren Sie Agaroselösung, um den Katheter zu füllen, und drücken Sie dann den Katheter durch die vorgeschnittene Öffnung in die Luftröhre für 5-8 mm Länge.
- Injizieren Sie die Agaroselösung langsam bei etwa 1 ml/5 s. Die Lunge dehnt sich entlang der proximalen zu distalen Achse aus. Stoppen Sie die Injektion, wenn der Rand jedes Lungenlappens aufgeblasen ist.
HINWEIS: Überpumpen Sie die Lunge nicht, da dies zu einem Bruch führen könnte. Das Volumen der Agaroselösung, um die gesamte Lunge einer jungen erwachsenen Maus aufzublasen, beträgt etwa 1,3 ± 0,1 ml. - Injizieren Sie 0,2-0,3 ml Luft aus der anderen Spritze, um die Restagarose im Katheter und in den leitenden Atemwegen in den distalen Alveolenraum zu drücken.
- Schließen Sie die Luftröhre mit einer gekrümmten hämostatischen Pinzette (siehe Materialtabelle).
- Füllen Sie das Lungengefäßsystem aus.
- Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit warmer 6% Gelatine. Schließen Sie sich an einen Nadel-Kopfhautvenenkatheter an, füllen Sie den Katheter mit Gelatinelösung und punktieren Sie dann den rechten Ventrikel in der Nähe der unteren Wand mit der Nadel.
- Drücken Sie die Nadel für 2-3 mm Länge in den rechten Ventrikel und richten Sie die Nadelspitze auf die Hauptlungenarterie.
- Injizieren Sie 0,2 ml Gelatinelösung langsam in den rechten Ventrikel und die pulmonalen arteriellen Gefäße.
HINWEIS: Die Lungenlappen erscheinen bei entsprechender Gelatineinflation etwas blasser. - Halten Sie die Nadel nach der Injektion 5 Minuten an Ort und Stelle, kühlen Sie die Lungenlappen, indem Sie eiskalte HBSS-Lösung auf Herz und Lunge gießen, und legen Sie dann den Körper mit dem Sezierbrett für insgesamt 10 Minuten in einen 4 ° C-Kühlschrank oder auf Eis.
- Entfernen Sie die Mauslunge und das Herz mit einer Schere aus dem umgebenden Bindegewebe. Trennen Sie dann jeden Lungenlappen und bewahren Sie ihn in HBSS-Lösung auf Eis auf.
3. Schneiden von Lungenlappen in dünne Scheiben
- Schneiden und befestigen Sie den Lungenlappen an der Oberseite der Probensäule mit Sekundenkleber und richten Sie den Lappen aus (Abbildung 1A, B), damit die Schnittrichtung senkrecht zu den meisten Atemwegen von der Hila bis zur Lungenoberfläche steht.
- Verwenden Sie ein Vibratom mit einer frischen, dünnen Rasierklinge, um den Lungenlappen in 150 μm-Scheiben zu schneiden. Sammeln Sie die Scheiben in 100 mm sterilen Petrischalen vorgefüllt mit kalter HBSS-Lösung.
HINWEIS: Stellen Sie die entsprechende Blattbewegungsgeschwindigkeit und Schwingungsfrequenz ein, bevor Sie mit dem Schneiden beginnen. Eine typische Einstellung für einen Compresstom ist Speed Level 4 und Oscillation Level 4. - Die mit DMEM/F-12-Kulturmedium gefüllten Petrischalen (20 Scheiben/15 ml Medium/Schale) in Petrischalen überführen und vor den Experimenten über Nacht in einem 37 °C Inkubator aufbewahren.
HINWEIS: Maus-PCLS können etwa 7 Tage lang in Kultur gehalten werden, ohne die kontraktilen Reaktionen der Atemwege zu verlieren17. Die Langlebigkeit der Lungenarterien wurde nicht gründlich untersucht. Nach unserer Beobachtung behalten sie ihre intakte Struktur und Vasoreaktion für mindestens 3 Tage in DMEM/F12-Medium. Zur Langzeitlagerung können Maus-PCLS in Kryoviale gegeben werden, die mit DMEM/F12-Medium gefüllt sind, das 10% DMSO enthält (5 Scheiben in 1 ml Medium pro Durchstechflasche), in einem mit Isopropylalkohol gefüllten Behälter bei -80 °C über Nacht eingefroren und in flüssigem Stickstoff für Wochen bis Monate21 kryokonserviert werden.
4. Analyse kontraktiler Reaktionen von intrapulmonalen Atemwegen und Arterien
- Legen Sie PCLS in eine HBSS-gefüllte 24-Well-Kulturplatte, eine in jedem Well. Suchen Sie das PCLS in der Mitte des Bohrlochs und entfernen Sie dann die HBSS-Lösung mit einer Pipette.
- Suchen Sie die Zielatemwege und das Gefäß in der Scheibe unter dem Mikroskop und bedecken Sie die Scheibe dann mit einem Nylonnetz mit einem vorgeschnittenen zentralen Loch (2-3 mm Durchmesser), um den Zielbereich freizulegen.
- Legen Sie eine hohle Metallscheibe auf das Netz, um die Scheiben an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2A).
- Fügen Sie 600 μL HBSS-Lösung hinzu, um das PCLS zu untertauchen. Ruhen Sie den Schnitt für 10 Minuten aus und zeichnen Sie dann die Basisbilder von Atemwegen oder Schiffen auf.
- Induzieren Sie die Atemwegs- oder Gefäßkontraktion, indem Sie die leere HBSS-Lösung vorsichtig mit einer Pipette absaugen und 600 μL HBSS mit einem Agonisten hinzufügen, wie z. B. 1 μM Methacholin (MCh) oder 10 nM Endothelin (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Eine KCl-Stimulation als Werkzeugstandard ist vor der Methacholin- oder Endothelin-Exposition nicht erforderlich. 100 mM KCl-Stimulation in den Atemwegen der Maus induzieren nur eine kleine und unregelmäßige Atemwegskontraktion (10%-15%)20. Ebenso ist eine Priming-Methacholin-Stimulation nicht erforderlich, da wir bestätigt haben, dass derselbe Agonist, zum Beispiel Methacholin oder Serotonin, bei der ersten und wiederholten Exposition eine ähnliche Atemwegskontraktion auslöst20,22. - Beobachten Sie die Reaktion unter dem Mikroskop, bis die Luminalbereichsänderung einen Gleichgewichtsstatus erreicht, und zeichnen Sie dann die Atemwegs- oder Gefäßbilder zur Analyse auf.
- Entfernen Sie MCh- oder Endothelinlösung mit einer Pipette und fügen Sie eine neue 600-μL-HBSS-Lösung mit der gleichen Agonistenkonzentration und einem Relaxans hinzu; Beobachten und erfassen Sie die Atemwegs- oder Gefäßentspannung.
- Quantifizieren Sie die Atemwegs- oder Gefäßreaktion mit den folgenden Schritten.
- Laden Sie die Bilder in die von NIH gesponserte kostenlose Software FIJI.
- Wählen Sie in der Symbolleiste die Polygonauswahl aus, um die Atemwege oder das Gefäßlumen auf jedem Rahmen zu umreißen.
- Wählen Sie Analysieren > Messen > Bereich festlegen.
- Wählen Sie Analyze > Measure aus, um den Interessenbereich zu quantifizieren. Die Ergebnisse werden in einem separaten Fenster zur statistischen Analyse angezeigt.
5. Analyse der Ca2+ Signalgebung von Atemwegs- oder Gefäß-SMCs
- Bereiten Sie den Farbstoffladepuffer Ca2+ vor.
- Lösen Sie Ca2+ Farbstoff, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (siehe Materialtabelle), 50 μg (eine Durchstechflasche) mit 10 μL DMSO auf.
- 0,2 g Pluronic F-12-Pulver (siehe Materialtabelle) in 1 ml DMSO auflösen, um eine 20%ige Plunonic-Lösung zu erzeugen.
- Mischen Sie 10 μL 20%ige Plunonic-Lösung mit 10 μL Ca2+ Farbstoff-DMSO-Lösung.
- Machen Sie Ca 2+ Farbstoffbelastungspuffer, indem Sie 20 μL der Mischung zu 2 ml HBSS-Lösung mit200 μM Sulfobromphthalein hinzufügen (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie 15 Maus-PCLS in 2 ml Ca2+ Ladepuffer und inkubieren Sie bei 30 °C für 1 h. Dann bewegen Sie die Scheiben auf 2 ml HBSS-Lösung mit 100 μM Sulfobromphthalein für weitere 30 min für die Entesterung von Fluoreszenzfarbstoffen bei Raumtemperatur.
- Erkennen Sie Ca2+ Signalisierung von SMCs.
- Legen Sie Ca2+ farbstoffbeladene Scheiben auf ein großes Deckglas.
- Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit Hochvakuum-Silikonfett. Drücken Sie das Fett durch eine abgestumpfte Nadel mit 18 G, um zwei parallele Linien über das Deckglas über und unter der Scheibe zu ziehen.
- Decken Sie die Scheibe mit einem Nylonnetz zwischen zwei Fettlinien ab. Legen Sie das zweite Deckglas auf das Netz, um eine an den Seiten fettversiegelte Kammer zu erzeugen (Abbildung 3A).
HINWEIS: Das Nylonnetz ist wichtig, um die Scheibe am unteren Deckglas befestigt zu halten und somit innerhalb des Arbeitsabstands eines invertierten Objektivs hoher Größe, wie z. B. 40-faches Öl, zu bleiben. - Fügen Sie HBSS- oder Agonistenlösung von einem Ende in die Kammer hinzu, indem Sie manuell oder über ein Perfusionssystem pipettieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der Kammer, indem Sie vom anderen Ende mit Seidenpapier oder Vakuum im Falle einer kontinuierlichen Flüssigkeitsperfusion absaugen.
- Stellen Sie die PCLS-Kammer auf den Mikroskoptisch. Detektieren Sie die Ca 2+ Signalisierung von SMC23 mit einem speziell entwickelten resonanten scannenden konfokalen Mikroskop mit einer Laserabtastrate von 15 oder 30 Bildern/s.
HINWEIS: Alternativ kann ein kommerzielles Hochgeschwindigkeits-Laserscanning-Konfokalmikroskop, das derzeit weit verbreitet ist, im Ca2+ Signalisierungsassay von pulmonalen SMCs in PCLS angewendet werden.
- Quantifizieren Sie die Ca2+ Fluoreszenz in SMCs.
- Laden Sie die aufgezeichnete Bildsequenz auf FIJI und wählen Sie das Bild > Typ > 8-Bit-Graustufen.
- Wählen Sie in der Symbolleiste die Rechteckauswahl aus und definieren Sie einen 5 Pixel x 5 Pixel großen Bereich von Interesse (ROI) in einer glatten Muskelzelle.
- Wählen Sie Analysieren > Messungen einstellen > Mittleren Grauwert , der die Fluoreszenzintensität von Ca2+ darstellt.
- Wenn sich die Position eines ROI mit der SMC-Kontraktion ändert, wählen Sie Analysieren > Messen Sie die Ca2+ Fluoreszenzintensität Bild für Bild.
- Wenn der ROI von SMC in einem Stapel von Bildern in einer ähnlichen Position bleibt, wählen Sie Bild > Stapel > Messen Sie den Stapel der Fluoreszenzintensität von Ca2+ .
HINWEIS: Ein benutzerdefiniertes Makro kann angeschlossen werden, um den ROI innerhalb des SMC zu verfolgen, wenn es sich mit Kontraktion in einem Bildstapel bewegt und automatisch die Ca2+ Intensität (Grauwert) des ROI Bild für Bild misst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Maus-PCLS-Präparat zur Erhaltung intakter intrapulmonaler Atemwege und Arterien
Ein 150 μm dickes PCLS wurde unter dem invertierten Phasenkontrastmikroskop beobachtet. In der Mauslunge werden leitfähige Atemwege von intrapulmonalen Arterien begleitet, die vom Hilus bis zur peripheren Lunge verlaufen. Ein repräsentatives Lungen-Atemwegs-Arterie-Bündel in einem Maus-PCLS ist in Abbildung 2B dargestellt. Die Atemwege können leicht durch quaderförmige Epithelzellen identifiziert werden, wobei aktive Zilienschläge die innere Oberfläche des Lumens auskleiden. Im Gegensatz dazu ist die nahe gelegene Lungenarterie durch ein flaches Endothel gekennzeichnet. Beim Erreichen des peripheren Lungenfeldes verzweigen sich die leitfähigen Atemwege in Atemwege und Säcke, die die kleinen intraazinaren Arteriolen umgeben (Abbildung 2C).
Verwendung von Maus-PCLS zur Beurteilung der Lungenatemwege und der arteriellen Kontraktion
Die durch Methacholin (MCh, 1 μM) induzierte Atemwegskontraktion ist in Abbildung 2B dargestellt. Die kontraktilen Reaktionen der Atemwege werden durch den Prozentsatz der luminalen Flächenreduktion nach MCh-Exposition quantifiziert (Abbildung 2D). Im Gegensatz dazu reagiert die Lungenarterie nicht auf MCh-Reize (Abbildung 2B). Die Atemwege behalten nach einer 1-tägigen oder 5-tägigen Kultur ähnliche dosisabhängige kontraktile Reaktionen auf MCh im PCLS bei (Abbildung 2D). Wenn das PCLS bei Endothelin (10 nM) exponiert wird, verengen sich sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien (Abbildung 2C, E), gefolgt von einer NOC-5 (100 μM) induzierten Relaxation (Abbildung 2E).
Verwendung von Maus-PCLS zur Beurteilung der Ca2 + -Signalisierung der Atemwege und des arteriellen SMC
Das Ca2+ farbstoffbeladene PCLS wird unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Ca2 + -Fluoreszenz in den Atemwegen (Abbildung 3B) und vaskulären (Abbildung 3C) SMCs ist im Ruhezustand niedrig, wobei kein fokaler Funke der intrazellulären Ca2 + -Signalgebung bemerkenswert ist. Bei Exposition gegenüber Agonisten steigt die Ca2+ Fluoreszenzintensität im SMC (Abbildung 3B,C), normalerweise von einem Punkt aus und breitet sich dann auf die gesamte Zelle aus. Die Ca2+ Fluoreszenzwellen erscheinen wiederholt in derselben Zelle wie oszillierende Signale (Abbildung 3D,E). Im Allgemeinen nimmt die Häufigkeit der Ca 2+ Oszillation zu, wenn die Agonistenkonzentration ansteigt, bis ein Plateau von24 erreicht ist. Die SMC-Entspannung der Atemwege ist mit einer Abnahme oder Beendigung der Ca 2+ Schwingungen25 verbunden.
Abbildung 1: Ausrichtung der Lungenlappen der Maus für das Vibratom-Slicing. Die Lungenlappen der Maus werden für Schnitte in einzelne getrennt. (A) Die linken (1), rechten Schädel- (2) und Schwanzlappen (3) werden in der Nähe des Hilums entlang der weiß gepunkteten Linien getrimmt, bevor die flache Schnittfläche auf die Probensäule geklebt wird. Die Platzierung des linken Lappens ist in (4) dargestellt. (B) Der rechte Mittellappen kann direkt auf die Probensäule geklebt werden. Der richtige Zubehörlappen wurde aufgrund seiner geringen Größe nicht häufig verwendet. Eine angemessene Ausrichtung der verschiedenen Lappen stellt sicher, dass die meisten Atemwege und Lungengefäße Querschnitte im PCLS aufweisen. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Kontraktile und relaxante Reaktionen von Atemwegen und Lungenarterien bei PCLS der Maus. (A) Schematische Darstellung der Platzierung eines PCLS in einem Kulturplattenbrunnen für den Kontraktionsassay. (B) Repräsentative Bilder, die einen Atemweg (schwarze Pfeile) mit einer nahe gelegenen Lungenarterie (schwarze Pfeilspitzen) in HBSS in Ruhe und nach Exposition gegenüber 1 μM Methacholin (MCh) zeigen. (C) Repräsentative Bilder, die eine intra-acinoare Arteriole in HBSS in Ruhe und bei Exposition bei 10 nM Endothelin (Endo) zeigen. (D) Dosisabhängige kontraktile Reaktionen der Atemwege auf MCh in PCLS nach 1-Tages- (graue Linie) und 5-Tage-Kultur (schwarze gepunktete Linie). Jeder Punkt repräsentiert den durchschnittlichen ± SEM von neun Atemwegen von zwei Mäusen. (E) Repräsentative Bilder, die eine 10 nM Endothelin-induzierte Atemwegs- und Lungenarterienkontraktion zeigen, gefolgt von 100 μM NOC-5, einem Stickoxidspender, induzierte Relaxation. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ca2+ Signalisierung von intravenösen und pulmonalen arteriellen SMCs in PCLS. (A) Schematische Darstellung des Aufbaus einer Kammer mit einem oberen und einem unteren Deckglas, einer Fettdichtung und einem Nylonnetz, um ein PCLS in der Brennebene für die Ca 2+-Bildgebung von SMCs zu halten. (B) Repräsentative fluoreszierende Bilder, die die Ca2+ Signalgebung von Atemwegs-SMCs in Ruhe und nach Exposition bei 1 μM MCh zeigen. Epi, Epithelzelle. (C) Ca2+ fluoreszierende Bilder von pulmonalen arteriellen SMCs in Ruhe und nach Exposition bei 10 nM Endothelin (Endo). Die fetten weißen Pfeile zeigen die Längsachse der Lungenarterie an, und die gepunkteten Linien mit Endpfeilen zeigen die spiralförmige Verteilung der vaskulären SMCs um die Arterienwand an. Maßstabsleiste = 20 μm. Oszillatorische Erhöhung der Ca2+ Fluoreszenzintensität (Ft), im Verhältnis zur Fluoreszenzintensität im Ruhezustand (F0), in einem Atemwegs-SMC bis 1 μM MCh (D) und in einem pulmonalen arteriellen SMC als Reaktion auf 10 nM Endothelinstimulation (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Vorbereitung von PCLS umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens ist es wichtig, den Lungenlappen homogen aufzublasen, um die Variation der Gewebesteifigkeit durch ungleichmäßige Agaroseverteilung zu vermeiden. Da die flüssige Agarose bei einer Temperatur unter 37 °C schnell in dünnen Kathetern oder Atemwegen geliert, könnte der daraus resultierende Fülldefekt im distalen Lungenfeld die Disparität der Lungengewebesteifigkeit erhöhen und Geweberisse während des Vibratomabschnitts verursachen. Daher kann geübt werden, die niedrigschmelzende Agaroselösung bei 42 °C in einem Wasserbad zu halten und eine Heizlampe am Seziertisch zu verwenden, um ein schnelles Agarosegelieren zu vermeiden. Eine schnelle Injektion könnte mehr Agarose mit höherer Nachgiebigkeit in das Lungenparenchym schieben und muss daher vermieden werden. Die manuelle Agaroseinjektion dauert in der Regel etwa 5-7 s. Zweitens besteht ein notwendiger Schritt am Ende der Agarosefüllung darin, eine kleine Menge Luft (~ 0,2 ml) zu drücken, um die Agarose aus den leitenden Atemwegen in den distalen Alveolenraum zu spülen. Andernfalls würde die Agarose gelieren und im Lumen bleiben, um der Atemwegskontraktion zu widerstehen. Es ist auch erwähnenswert, dass das Agarosegelieren in den Alveolen an Ort und Stelle bleibt und bei 37 ° C im Inkubator nie wieder schmilzt. Das Agarosegel spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der 3D-Struktur des Lungengewebes, wie sie in vivo durch den negativen intrathorakalen Druck aufrechterhalten wird. Drittens ist die Perfusion von Lungenarterien mit Gelatinelösung unerlässlich, um das arterielle Lumen im PCLS offen zu halten. Die Gelatinelösung geliert bei Raumtemperatur als mechanischer Blocker, um Vasokonstriktion bei chemischen und physikalischen Reizen während des Gewebeschnitts zu widerstehen. Ohne Gelatineinflation kollabieren und lösen sich die Lungenarterien in Lungenschnitten normalerweise vom umgebenden interstitiellen Gewebe, selbst in Gegenwart hoher Dosen gemischter vasodilatatorischer Mittel, einschließlich Phentolamin, Adrenalin und Nifedipin13,16. Im Gegensatz zu einem Agarosegel schmilzt Gelatinegel bei 37 °C und fließt nach der nächtlichen Inkubation aus dem Gefäßlumen, so dass das arterielle Lumen vor dem Gefäßreaktionsassay frei von Obstruktion bleibt.
Da das PCLS pulmonale SMCs in situ bewahrt und ihre kontraktile Funktion in einem nahezu in vivo Zustand beibehält, wurde es als leistungsfähige Plattform zur Untersuchung der Regulation der SMC-Kontraktion eingesetzt, insbesondere der Regulation über Ca2 + abhängige Mechanismen26. Insbesondere mit einem Mehrkanal-Konfokal- oder Zwei-Photonen-Mikroskop mit geringer Vergrößerung können die Agonist-induzierte Ca 2+-Signalgebung in den Atemwegs-SMCs und die damit verbundene luminale Verengung gleichzeitig für die mechanistische Studie13,20 erfasst werden. Es wird erwartet, dass die mit der PCLS-Methode gemessene Atemwegs- oder Gefäßreaktionsfähigkeit zelluläre Eigenschaften widerspiegelt, die frei von Einflüssen aus der Lungenumgebung sind, wie das entzündliche Milieu und die neuronale Innervation der Reaktion in der Lunge27,28. Als solches bietet die SPS ein experimentelles System, um zu helfen, intrinsische vs. sekundäre SMCs-Modifikation. Neben der Untersuchung der kontraktilen Regulation von SMCs in Gesundheits- und Krankheitsmodellen wurden PCLS aus verschiedenen Altersgruppen gesammelt, um die funktionelle Anpassung von Atemwegs-SMC während der postnatalen Lungenentwicklung und als Reaktion auf Umweltbeleidigungenzu untersuchen 27. Darüber hinaus enthalten PCLS unterschiedlich große Atemwege und Blutgefäße vom peripheren bis zum proximalen Lungenfeld, was die Untersuchung eines regionsspezifischen Mechanismus zur Regulierung der pulmonalen SMC-Kontraktilität in der Homöostase und unter pathogenen Reizen ermöglicht. Da Maus-PCLS die Kontraktilität der Atemwege im Kulturmedium für 7 Tageaufrechterhalten 17, wurden sie als Ex-vivo-Modell verwendet, um Risikofaktoren für die SMC-Deregulierung wie Zytokin- oder Virusexposition zu untersuchen oder zu validieren29. Schließlich bietet PCLS eine ideale Plattform, um vasodilatatorische oder bronchodilatatorische Medikamente zu screenen. Insbesondere die Bioassays mit PCLS-Präparat sind sehr kostengünstig, da eine erwachsene Maus Hunderte von Lungenschnitten erzeugen kann. Die Verwendung von benachbarten PCLS in der Kontroll- und Behandlungsgruppe reduziert auch signifikant die experimentelle Verzerrung durch Intergruppenprobenvariation.
In Anbetracht des Unterschieds zwischen der Anatomie von Nagetieren und der menschlichen Lunge ist das menschliche PCLS ein leistungsfähigeres Werkzeug für die translationale Forschung. Die begrenzte Verfügbarkeit von menschlichem Lungengewebe, insbesondere von erkrankten Lungenproben, bleibt jedoch eine Herausforderung. Im Gegensatz dazu werden Mauslungengewebe, Mausmodelle menschlicher Krankheiten und transgene Mausmodelle in der biomedizinischen und pharmakologischen Forschung weit verbreitet eingesetzt, was das PCLS der Maus zu einem zugänglichen und krankheitsrelevanten Systemmacht 13,30. Darüber hinaus war die Erhaltung der intrapulmonalen Arterien nur bei der PCLS-Vorbereitung der Maus erfolgreich, was sie zu einem einzigartigen Werkzeug zur Erforschung der vaskulären Deregulation bei pulmonalen Gefäßerkrankungen wie pulmonaler Hypertonie macht. Daher ist trotz der Vorbehalte, die mit Krankheitsmodellen verbunden sind, ein Protokoll für die PCLS-Vorbereitung von Mäusen von unschätzbarem Wert, um eine Ex-vivo-Plattform zur Untersuchung von Atemwegen und Lungenarterien in Gesundheit und Krankheit zu etablieren. Wir und andere haben Lungenforschung mit humanen PCLS31,32,33,34 gemeldet. Nach unserer Erfahrung ähnelt das Protokoll der menschlichen SPS-Vorbereitung dem der Maus, mit Ausnahme der Anwendung einer höheren Agarosekonzentration von 2%, mehr Agaroselösung (3 L für eine Lunge) und viel größerer Katheter zur Kanülierung von Haupt-, Lobar- oder Segmentbronchien für die Agaroseinjektion. Erfahrung in der Vorbereitung von Maus-SPSen hilft enorm bei der Vorbereitung menschlicher Lungenschnitte.
Trotz zahlreicher Vorteile der Verwendung der PCLS-Präparation in der pulmonalen SMC-Forschung ist es wichtig, sich der Grenzen dieser Technik bewusst zu sein. Erstens bleibt das PCLS ein statisches System, dem physiologische Atemzyklen fehlen, die das Lungenparenchym und die Atemwege periodisch dehnen. Es enthält auch keine Blutzirkulation, die pulsierenden Druck auf die vaskulären SMCs und Scherkräfte auf Endothelzellen erzeugt. Diese mechanischen Variationen im PCLS könnten die kontraktile Regulierung von SMCs modifizieren. Obwohl eine vollständige Etablierung der Luftbelüftung und der Blutzirkulation in PCLS unerreichbar ist, zumindest für die Atemwegs-SMC-Studie, wurden in den letzten zehn Jahren enorme Anstrengungen unternommen, um ein "atmendes" PCLS zu erzeugen, indem der Gewebeabschnitt mit einer Vielzahl von Gerätengedehnt wurde 35,36,37. Zweitens behalten pulmonale SMCs ihre Kontraktilität nur für einen begrenzten Zeitraum bei. Diese Zeitbegrenzung verhindert, dass die SPS die subakuten Veränderungen von SMCs modellieren kann, z. B. ein Prozess, der mehr als 6-7 Tage dauert, um Atemwegs-SMCs zu modifizieren. Da frühere Forschungen zeigen, dass SMCs aufgrund einer Verringerung kontraktiler Proteine an Kontraktilität verlieren, hat sich gezeigt, dass die Optimierung des Kulturmediums mit einer zusätzlichen niedrigen Insulindosis die SMC-Kontraktion der Atemwege für bis zu12 Tage aufrechterhält 17. Schließlich bleibt die genetische Manipulation pulmonaler SMCs durch Plasmid- oder siRNA-Transfektion des PCLS erfolglos. Die technische Barriere für transfekte SMCs im PCLS rechtfertigt sicherlich weitere Untersuchungen, da diese Methode einen alternativen Ansatz zum transgenen Tiermodell für die mechanistische Untersuchung von pulmonalen SMCs bietet. Noch wichtiger ist, dass diese Technik die exklusive Maßnahme ist, um eine genetische Modulation von humanen pulmonalen SMCs in der translationalen Forschung zu erreichen.
Dieser Artikel enthält eine umfassende Beschreibung der Vorbereitung von Maus-PCLS mit gut erhaltenen Atemwegen und Lungenarterien und deren Anwendung in den Kontraktions- und Ca2 + -Signalassays. Das PCLS-Präparat unterstützt die Funktion der glatten Muskulatur in einer lebenden Lungenumgebung und ermöglicht gleichzeitig den Zugang mechanistischer Studien zu Zellen in situ. Diese einzigartige Eigenschaft hat die PCLS-Vorbereitung zu einem vielseitigen Werkzeug für die Untersuchung der Lungenatemwege und vaskulären SMCs bei Gesundheit und Krankheiten gemacht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch NIH-Zuschüsse, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
- Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
- Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
- Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
- McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172 (2013).
- Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252 (2020).
- Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
- Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
- Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
- Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
- Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
- Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
- Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
- Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Sanderson, M. J., Parker, I.
- Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636 (2020).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Sanderson, M. J., et al.
- Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
- Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
- Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
- Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
- Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
- Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
- Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
- Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566 (2020).
- Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
- Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).
