Summary
本プロトコルは、非肥満糖尿病(NOD)-scidインターロイキン-2ガンマ鎖受容体(NSG)マウスにヒト皮膚を移植する方法を記載している。移植のためのヒト皮膚の準備、移植のためのマウスの準備、分割厚さのヒト皮膚の移植、および移植後の回復手順の詳細な説明がレポートに含まれています。
Abstract
ヒトドナー皮膚を免疫不全マウス宿主に移植するヒト皮膚異種移植モデルは、皮膚免疫学におけるトランスレーショナル研究の重要な選択肢です。マウスとヒトの皮膚は、解剖学的構造および免疫細胞組成において実質的に異なる。したがって、従来のマウスモデルには、皮膚科学的研究と創薬には限界があります。ただし、異種移植を成功させるには技術的に困難であり、移植片と宿主の生存のために最適な標本とマウスの移植部位の準備が必要です。本プロトコルは、ヒトの皮膚をマウスに移植するための最適化された技術を提供し、下流の実験目的に必要な考慮事項について説明します。このレポートでは、ヒトドナー皮膚サンプルの適切な調製、手術セットアップの組み立て、マウスおよび手術部位の準備、皮膚移植、および術後のモニタリングについて説明します。これらの方法を順守することで、術後6週間以上異種移植片を維持することができます。以下に概説する技術は、工学的制御、滅菌技術、および術前および術後のコンディショニングの開発により、最大の移植効率を可能にします。異種移植片モデルの適切な性能により、ヒト皮膚の実験的特性評価および in vivo化合物の前臨床試験のための長寿命のヒト皮膚移植サンプルが得られます。
Introduction
マウスモデルは、実験的な再現性と遺伝子操作の能力のために、人間の生物学と病気についての推論を行うために頻繁に使用されます。しかし、マウス生理学はヒトの臓器系、特に皮膚を完全に再現するものではないため、創薬における前臨床モデルとしての利用には限界があります1。マウスとヒトの皮膚の解剖学的違いには、上皮の厚さと構造の違い、マウスエクリン汗腺の欠如、およびヘアサイクリングの変化が含まれます2。さらに、免疫系の先天的アームと適応アームの両方が2つの種の間で分岐しています3。マウスの皮膚は、樹状表皮T細胞(DETC)のユニークな免疫集団を含み、真皮γδT細胞の存在量が高く、ヒト組織と比較して免疫細胞サブセットの局在が異なります4。したがって、ヒトの皮膚生物学および炎症に関する実験的知見は、ヒト組織による検証の恩恵を受ける。 in vitro およびオルガノイド培養システムは、ヒト組織の研究に広く利用されているツールですが、これらのシステムは、免疫再構成の欠如または不完全、および末梢血管系との関連性の欠如によって制限されています5。ヒト化異種移植皮膚移植モデルは、 in vivoでのヒト組織における免疫経路および非免疫経路の治療的または生物学的操作を可能にすることを目的としています。
ヒト皮膚異種移植片モデルは、皮膚生理学と薬理学の研究、免疫拒絶反応と反応の分析、ヒト皮膚がんのメカニズムの解剖、皮膚疾患と創傷治癒の理解に利用されています6。皮膚研究の複数の分野に適用できますが、異種移植片モデルは in vitro 研究よりもスループットが低く、マウスモデルで採用されている遺伝子操作の容易さに欠けています。このモデル内の時点は数週間から数か月の範囲であり、移植を成功させるには、これらの手術を実行するための適切な施設と機器が必要です。しかしながら、異種移植片モデルは実験に生物学的および生理学的文脈を提供するが、組織外植片などのオルガノイド培養系は、しばしば特定の時間間隔で外因性シグナルなどの無数の可動部分を複製することを必要とする7。したがって、このモデルは、 in vitro およびマウスモデル内で観察された所見をさらに検証するため、または生物学的に実現不可能な研究のために最もよく利用されます。異種移植片モデルの適切な使用は、 in vivoで無傷のヒト組織を研究し、操作するユニークな機会を提供します。
異種移植片皮膚移植モデルの最適化は、移植片の完全性を長期にわたって維持するために数十年の研究に依存してきました。このプロセスに重要なのは、BおよびT適応免疫細胞、機能的なNK細胞を欠き、マクロファージと樹状細胞に欠損している非肥満糖尿病(NOD)-scidインターロイキン-2ガンマ鎖受容体(NSG)マウスを利用することです8。これらのNSG宿主の免疫不全の性質は、ヒト造血細胞、患者由来の癌、および皮膚の移植を可能にする8,9,10。この免疫抑制宿主環境にもかかわらず、抗GR1投与によるマウス好中球免疫応答のさらなる抑制が移植片の成功に必要である10。無傷の組織を移植する際の主な障害は、感染、拒絶反応、および移植片への血流の再確立の難しさであり、皮膚および表皮の完全性の喪失につながることがあります11。抗FR1の投与および適切な移植深さの使用を含む技術は、移植片生存を改善する10。綿密な最適化により、NSGマウスにヒト異種移植片皮膚移植を90%〜100%の範囲の高効率と生存率で実施することが可能になります。
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Protocol
本研究は承認され、UCSF IACUC(AN191105-01H)およびIRB(13-11307)プロトコルに準拠して実施されました。ヘルニア修復などの日常的な選択的外科的処置の一部として廃棄された皮膚サンプルを本研究に使用しました。皮膚サンプルは、非識別化され、非ヒト被験者研究として認定されるか、臨床的に識別情報が下流の分析に必要な場合は、IRBプロトコル13-11307に基づいて患者が書面による同意を提供しました。他の選択基準または除外基準は利用されなかった。8〜10週齢のいずれかの性別のNSGマウスを研究に採用した。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。
1.ドナーヒト皮膚サンプルの処理
注:この移植で使用されたヒト皮膚サンプルは、健康な患者の腹部から収集された大きなサンプルでした。サンプルは少なくとも15 cm x 7.5 cmである必要があります。サイズ制限は、皮膚が利用可能なマウスの数と移植片サイズの選択に影響を与える可能性があります。
- 準備と移植の前に、皮膚サンプルを低温(氷上; 4°C)に維持します。ガーゼをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸した密閉標本収集カップでサンプルを湿らせておきます。
注意: 皮膚サンプルを4°Cで2日以上保存することはお勧めしません。しかしながら、皮膚サンプルがより長期間保存される報告が存在する12。
注意: すべての人体組織は、標準的なバイオハザード予防策で治療してください。 - ヒト皮膚サンプルを滅菌された解剖ボード上の滅菌された陰圧組織培養フードでダーマトームに調製する。
- 皮膚サンプルを表皮側を上にして解剖板に置きます。滅菌アルコール準備パッドで表皮を拭き、次にPBSで拭きます。
- 皮膚の近い方の端を1.5インチの解剖Tピンで所定の位置に固定します(材料の表を参照)。
- 皮膚標本を400μmの厚さでダーマトメークし、30°〜45°の角度で前方に切断しながら安定した圧力をかけます。機器固有のすべての指示と安全対策に従ってください(材料表を参照)。
注:ダーマトーム法の詳細については、以前に発表されたレポート13を参照してください。 - 100 mm x 20 mmのペトリ皿に、滅菌PBSに浸した滅菌ガーゼを皿の底に置いて準備します。皮膚を表皮側を上にして、濡れたガーゼの上に置きます。
- プレートの端をシールし、半透明のシーリングフィルム( 材料表を参照)で覆い、サンプルが汚染されていないことを確認します。グラフトする前にサンプルを4°Cで保存してください。
2.手術前のコンディショニングと準備
- 移植のための滅菌器具と滅菌手術ステーションを準備します。オートクレーブ滅菌したペーパータオルを器具やマウスの配置用の滅菌面として使用します。
注:マウスは離乳後に移植することができますが、好ましくは8〜10週齢の間に移植されます。いずれの性別のマウスも移植してもよい。 - 脱毛などの外科的準備は、手術ステーションから物理的に離れた領域で実行します。
- 抗GR1( 材料の表を参照)を滅菌生理食塩水で1 mg / mLに希釈して調製します。麻酔導入後、各マウスに100 μg / 100 μLの抗GR1溶液を腹腔内に投与します。.
- マウスを一度に1つずつ、イソフルランまたは他の制度的に承認された麻酔薬で麻酔します。.
注:イソフルランは、誘導中に3%〜5%の濃度で投与する必要があります。マウスが動かなくなったら、イソフルラン濃度を1%〜3%に下げて、手術期間中効果を発揮します。- 呼吸数、つま先のつまみ反応の欠如、および耳と口の適切なピンク色の色を観察することにより、マウスの適切な麻酔深度を監視します。.
注意: 適切な麻酔機器と清掃方法を使用し、イソフルラン蒸気への暴露を避けてください。.
- 呼吸数、つま先のつまみ反応の欠如、および耳と口の適切なピンク色の色を観察することにより、マウスの適切な麻酔深度を監視します。.
- マウスを加熱パッドまたは別の熱源に移します( 材料表を参照)。
- 手袋をはめた指で目に軟膏の小滴を軽くたたくことによって眼科用軟膏を投与する。
- 鎮痛薬のブプレノルフィン(0.08 mg / kg)とカルプロフェン(5 mg / kg)( 材料の表を参照)を皮下投与し、皮膚をつまんで体に平行な角度で注射します。.
注:施設のプロトコルに従って、治療前の鎮痛を準備します。鎮痛薬の選択と投与に関する制度的ガイドラインに従ってください。.この研究で使用された鎮痛の方法は、ステップ2.7および 補足図1に概説されています。 - 抗GR1(ステップ2.4で調製)を腹腔内に投与し、マウスの尾をわずかに持ち上げ、腹部を露出させ、インスリン1 mL(12.7 mm)シリンジを使用して30°の角度で注射します。.
- 動物に安全な電気バリカン( 材料の表を参照)を使用して、マウスの背側の中央部と上部を剃ります。
- すべての髪をきれいにし、剃った皮膚にたっぷりの脱毛軟膏を30秒から1分間塗ります。
- ペーパータオルとPBSで脱毛軟膏を完全に拭き取ります。
3.移植手順
- マウスを脱毛ステーションから離れた二次手術場所に移します。
- ヨウ素綿棒スティックで手術部位を円を描くように滅菌し、中央から始めて脱毛領域の端に向かって運動します。
- マウスの上に滅菌ラップを置き、移植する領域のサイズよりわずかに大きいプラスチックの窓を切ります。
- メスで移植するドナー皮膚の長方形の10 mm x 10 mmの部分を切り取ります。これを行うには、ドナーの皮膚を鉗子の裏側でしっかりと固定し、メスで鉗子と一緒に切断します。
- 外科用ハサミを使用して、ドナーの皮膚片のサイズに一致するマウス皮膚の長方形の領域を切り取り、移植床を作成します。鉗子を使用して皮膚を体から引き離し、顔面に深く切り込まないように、はさみを体から離して角度を付けて皮膚を切ります。
- ドナースキンピースを表皮側を上にして、準備したグラフトベッドに置きます。
- 鉗子の後ろを使用して、ドナーの皮膚が移植片床に対して完全に平らになるまで前後にスライドしながら、皮膚を操作します。
- ドナーの皮膚がマウスの皮膚と出会う場所に外科用接着剤組織接着剤( 材料の表を参照)を滴下し、マウスとドナーの皮膚を鉗子で1〜2秒間保持して、接着剤が組織に付着するようにします。グラフトの端を完全に密閉し、接着剤が完全に乾くようにします。
- 以下の手順に従ってマウス(図1)に包帯を貼ります。
- グラフト領域を完全に覆うのに十分な大きさのワセリンガーゼ( 材料の表を参照)を切り取ります。
- 移植片をワセリンガーゼで覆い、鉗子を使用してガーゼを皮膚に軽く押し付けます。
- 幅がマウスの傷を覆うのに十分な大きさになるように、透明フィルムドレッシングのストリップを縦にカットします。
- 透明フィルムドレッシングを粘着面を下にしてガーゼの上にしっかりと押し付けます。マウスをすばやく転がしてドレッシングを胴体に完全に巻き付け、呼吸を妨げることなくしっかりとフィットし、すべての手足が自由に動くようにします。
- マウスを回復ケージに入れ、警告して動き回るまでマウスを監視します。回復後少なくとも15分間、ケージの一部に熱源を提供します。
注:動物は、回復ケージに入れてから1〜5分以内に回復することが期待されています。
- 移植後のマウスを単独で収容する。
- 施設のプロトコルで必要に応じて術後鎮痛を投与します。
注:ブプレノルフィン(0.08 mg / kg)は、本研究中に4〜6時間後に皮下投与されました。.
4.術後の処置
- 移植片拒絶反応を防ぐために、移植後4日、7日、および11日に100μL(100μg)の抗GR1を腹腔内に注射します(補足図1)。
- 必要に応じて包帯を交換し、マウスが取り外した場合は交換します。.
- 7日目にすべてのマウスを包帯します。
- 14日目に包帯を取り外します。
- 移植片拒絶反応および全身性炎症(体重減少、脱毛、極度の嗜眠)の兆候についてマウスを監視する。
- 移植後3〜6週間でマウスを収穫します。
- レギュレーター制御の二酸化炭素(CO2)投与とそれに続く頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
注:安楽死の制度的ガイドラインに従ってください。 - マウス14から皮膚移植片を解剖する。グラフトの一部を10%ホルマリンに24時間入れてから、パラフィン包埋および切片作成を行い、組織像染色を行います9。
- 皮膚移植片をハサミで細かく刻み、細胞培養培地で250 IU / mLのコラゲナーゼIVと0.02 mg / mLのDNaseで一晩酵素的に消化します。表面および細胞内マーカーについて細胞を染色し、前述の手順14に従う。
- レギュレーター制御の二酸化炭素(CO2)投与とそれに続く頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
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Representative Results
ヒト皮膚異種移植片は、スーパーバリア動物施設内のNSGマウスで実施されました。成功は、移植後のマウスの長期の移植片およびマウスの生存および行動の健康によって定義されました。手術後の1週間の生存率の低下は、当初、実験の成功に対する最大の障壁として観察され、マウスの最大50%が安楽死を必要としていました。手術中および手術直後の無菌技術を改善し、マウスの体温をより適切にサポートすることで、外科的生存率が一貫して80%を超え、多くの場合90%〜100%の生存率に増加しました。マウスの飲料水への抗生物質の添加が試行されたが、転帰を改善するとは決定されず、結果の潜在的な交絡因子として中止された。移植に成功したマウスは、移植後の数日間で活動的で健康に見えるはずです。ネズミはケージの周りを動き回り、いつものように探索したり、巣を作ったり、食べたり飲んだりしていました。体調の悪いマウスは怠惰で反応がないように見え、体重を維持するのに十分な食べたり飲んだりしていない可能性があります。無気力マウスにソフトフィードと経口水分補給のオプションを補給すると、術後の回復に役立つ可能性があります。.
正しく治癒している異種移植片は、最初にかさぶたになり、次に手術後約50日以内に回復します。移植片は時間の経過とともに収縮する可能性がありますが、ドナーの皮膚がマウスの皮膚と出会う縁の周りで付着したままです(図2)。移植片のかさぶたは治まるはずですが、移植片は健康な人間の皮膚よりも厚く炎症を起こしたままになります(図2)。移植片の過度の収縮が起こり、エンドポイント分析に利用できる組織が減少する可能性があります。一貫したサイズのグラフトと適切なグラフト配置を利用することで、このような問題を軽減することが期待されます。5つの独立した実験を通して、すべての移植片は、移植後50日まで、収穫時まで生き残った。
組織分析には、酵素消化後の免疫組織化学および単一細胞分析が含まれる場合があります。皮膚の一部を、250IU/mLのコラゲナーゼIV型および0.02mg/mLのDNaseを細胞培養培地中で一晩消化して処理し( 材料の表を参照)、前述のように表面マーカーおよび細胞内マーカーについて染色した14。フローサイトメトリーによる分析により、ほとんどの移植片にヒト免疫細胞が持続的に存在することが明らかになりましたが、異種移植片間で数は異なりました(図3A)。 図3B は、成功した移植片(左)とヒト免疫細胞の維持に失敗した移植片(右)の代表的な結果を示しています。移植片の中心から採取したヘマトキシリンおよびエオジン染色(H&E)切片の分析により、35日と50日の両方の時点で、ヒトの真皮と表皮で構成される無傷の非活性化皮膚が明らかになりました(図4)。
図1:手術後のマウスの包帯方法。 マウスは、麻酔下にある間、ワセリンガーゼと透明なフィルムドレッシングでしっかりと包まれています。(A)ワセリンガーゼは、手術創よりわずかに大きい領域に配置されます。(B)透明フィルムドレッシングを準備する:長いストリップをワセリンガーゼよりわずかに広く切断する。透明フィルムドレッシングの接着側を覆う裏地は部分的に除去されている。(C)フィルムの接着面をマウスの背面にしっかりと押し付け、フィルムの前端に1インチのスペースを残します。(D)マウスを仰向けにします。フィルムの張り出した前部をマウスに押し付け、裏地を取り外します。(E)マウスをフィルムでしっかりと包み、マウスを包むにつれて残りの支持体を除去する。(F)マウスはドレッシングにうまく包まれており、その腕と脚は拘束されていません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:移植後10日目から21日目までの移植動物からの代表的な画像。 (A-C)10日目に最適な移植を行った3匹の異なるマウス。(D-E)21日目に移植した2つの異なるマウス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:移植皮膚における免疫細胞キメラ。 異種移植片からのヒト免疫細胞回収のフローサイトメトリーデータ。データは、一重項、生きた、ヒトCD45+マウスCD45-のイベントにゲーティングされます。(A)2つの独立した実験から回収された細胞数(ライブヒトCD45+イベント)。(B)ヒト免疫コンパートメントの維持に失敗した移植片(右)と比較した、成功した移植片(左)におけるヒトおよびマウスCD45+ 免疫細胞染色の代表的なプロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:35日目および50日目の移植ヒト皮膚の組織像。 移植皮膚を35日目(A)または50日目(B)にマウスから採取し、10%ホルマリンで保存し、パラフィン包埋してヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)について染色した。(A)表皮は中等度の過形成(表皮肥厚症)、軽度の過顆粒症、コンパクトなオルソケラトーシスを示します。乳頭状真皮では、時折拡張して混雑した毛細血管があります。メラノサイトとメラニン色素は表皮の基底層に存在します。真皮は適度に細胞性であり、淡い合胞体細胞質と散在するリンパ球を伴うふっくらとした楕円形の線維芽細胞で構成されています。(B)表皮は、角化層に重層扁平上皮、バスケット織りのオルソ角化症を含み、通常の厚さです。メラノサイトとメラニン色素は表皮の基底層に存在します。真皮は楕円形の線維芽細胞とわずかに増強された細胞外マトリックス沈着を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:異種移植片研究に採用されたプロトコルのタイムライン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウス異種移植皮膚移植モデルは、 in vivo 設定でヒト皮膚免疫応答を機械的に解剖するための重要な技術です14。皮膚異種移植の成功は、マウスと皮膚標本とマウスの適切な準備と無菌げっ歯類手術方法の順守に依存しています15。皮膚サンプルを培地(滅菌生理食塩水など)に低温で迅速に冷却して適切に保管することは、移植前の継続的な組織の健康を確保するために重要です12。ダーマトームなどの器具を使用した分割厚さサンプルの収集は、マウス間のサンプル深度の一貫性を可能にし、移植片の生存率を改善するために宿主からの栄養素の供給を増加させる10。表皮脱落による移植片の完全性の喪失は、特に血液供給が破壊された全層移植片で観察され得る16。手術中および手術後のマウスの生存は、滅菌技術、手術中および手術後の熱の供給、および手術用接着剤15を利用するなどの手術時間を最小化する技術によって支援される。移植後の抗GR1の投与は、移植片生存を促進する免疫不全宿主における残りのマウス免疫応答の抑制を可能にする10。これらの方法は、異種移植モデル中のマウスおよび移植片の生存の可能性を高め、実験数およびある実験から次の実験への再現性を改善する。
非常に有用ですが、示されているように、異種移植片皮膚移植モデルにはいくつかの重要な制限があります。第一に、移植片は炎症環境に存在し、おそらく一過性虚血およびマウス骨髄系細胞によるヒト移植組織の浸潤に続発する。したがって、それは定常状態でヒトの皮膚を反映するものではなく、すべてのヒト炎症性皮膚疾患を完全に反映しているわけではないかもしれない10,14。病変皮膚から臨床生検を移植することによってヒト炎症性疾患を研究することは代替戦略であるが、利用可能な生検の数の制限および移植深さの一貫性のない制御により、このオプションはあまり好ましくない。さらに、異種移植はヒト末梢免疫アーキテクチャを再現しません。NSGマウスのリンパ系構造はヒト細胞の生着前に萎縮するため、マウスの周辺をヒト細胞で再構成することも注意点があります。これは、いくつかの設定10、17で優先的なセル選択につながる可能性がある。さらに、皮膚標本からの皮膚の生着と免疫細胞の回復は、治療がない場合でも、マウスごとに異なる場合があります。このモデルでは、グループ間の一貫した差を観察するために、条件ごとに少なくとも10回の反復が推奨されます。移植片の治癒と血管再血管新生は移植後の最初の数週間で発生し、介入の効果は生着の段階に依存する可能性があるため、アッセイの適切な期間は実験的な質問に合わせて調整する必要があるかもしれません。
これらの欠点にもかかわらず、ヒト異種移植皮膚移植モデルは、 インビボで無傷の臓器におけるヒト皮膚免疫応答を研究するための数少ないアッセイの1つであり続けています。トランスジェニックマウスモデルは機構的な経路解剖を可能にする可能性がありますが、解剖学的構造、免疫細胞組成、および優性免疫経路の違いにより、ヒト疾患への翻訳が制限されています1。ヒト由来細胞の エクスビボ 培養、皮膚オルガノイドモデル、およびヒト組織外植片研究を代替的に使用してもよいが、免疫細胞ネットワークの破壊および無傷組織からの免疫細胞の流出を含む制限も受ける18、19。したがって、異種移植片皮膚移植モデルは、前臨床 のin vivo 設定における炎症に対する治療候補とヒト皮膚反応を研究するための重要な方法であり続けています。
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Disclosures
MDRはTRex BioとSitryxの創設者です。MDRとMMLは、Sitryx、Q32、TRex Bioから研究資金を受けています。
Acknowledgments
この研究の一部は、TRex Bioからのスポンサー付き研究契約とNIHからの助成金(1R01AR075864-01A1)によって資金提供されました。JMMは、Cancer Research Society(助成金26005)の支援を受けています。我々は、助成金NIH P30 DK063720、S10 1S10OD021822-01、およびS10 1S10OD018040-01によって部分的にサポートされているParnassusフローサイトメトリーコアを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
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