Summary
O presente protocolo descreve como enxertar pele humana em camundongos diabéticos não obesos (NOD)-scid interleucina-2 receptor de cadeia gama (NSG) camundongos. Uma descrição detalhada da preparação da pele humana para transplante, preparação de camundongos para transplante, transplante de pele humana de espessura dividida e procedimento de recuperação pós-transplante estão incluídas no relatório.
Abstract
O modelo de xenoenxerto de pele humana, no qual a pele do doador humano é transplantada para um hospedeiro de camundongo imunodeficiente, é uma opção importante para a pesquisa translacional em imunologia da pele. A pele murina e humana diferem substancialmente na anatomia e composição das células imunes. Portanto, os modelos tradicionais de camundongos têm limitações para a pesquisa dermatológica e a descoberta de medicamentos. No entanto, xenotransplantes bem-sucedidos são tecnicamente desafiadores e exigem uma preparação ideal do local do espécime e do enxerto de camundongo para a sobrevivência do enxerto e do hospedeiro. O presente protocolo fornece uma técnica otimizada para transplante de pele humana em camundongos e discute considerações necessárias para os objetivos experimentais a jusante. Este relatório descreve a preparação apropriada de uma amostra de pele de doador humano, montagem de uma configuração cirúrgica, preparação de camundongo e local cirúrgico, transplante de pele e monitoramento pós-cirúrgico. A adesão a esses métodos permite a manutenção de xenoenxertos por mais de 6 semanas após a cirurgia. As técnicas descritas abaixo permitem a máxima eficiência do enxerto devido ao desenvolvimento de controles de engenharia, técnica estéril e condicionamento pré e pós-cirúrgico. O desempenho adequado do modelo de xenoenxerto resulta em amostras de enxerto de pele humana de longa duração para caracterização experimental de pele humana e testes pré-clínicos de compostos in vivo.
Introduction
Modelos de camundongos são frequentemente usados para fazer inferências sobre a biologia humana e a doença, em parte devido à sua reprodutibilidade experimental e capacidade de manipulação genética. No entanto, a fisiologia do camundongo não recapitula completamente os sistemas de órgãos humanos, particularmente a pele, e, portanto, tem limitações para uso como modelo pré-clínico no desenvolvimento de fármacos1. As diferenças anatômicas entre a pele de camundongos e humanos incluem diferenças nas espessuras e arquitetura epitelial, falta de glândulas sudoríparas écrinas murinas e variações no ciclo capilar2. Além disso, tanto os braços inato quanto o adaptativo do sistema imunológico são divergentes entre as duas espécies3. A pele de camundongo contém uma população imune única de células T epidérmicas dendríticas (DETCs), tem uma maior abundância de células T γδ dérmicas e varia na localização do subconjunto de células imunes em comparação com o tecido humano4. Portanto, os achados experimentais sobre a biologia da pele humana e a inflamação se beneficiam da validação com tecido humano. Embora os sistemas de cultura in vitro e organoides sejam ferramentas amplamente utilizadas para o estudo do tecido humano, esses sistemas são limitados pela reconstituição imune ausente ou incompleta e pela falta de conexão com a vasculatura periférica5. O modelo humanizado de transplante de pele de xenoenxerto visa permitir a manipulação terapêutica ou biológica de vias imunes e não imunes em tecidos humanos in vivo.
O modelo de xenoenxerto de pele humana tem sido utilizado para estudar a fisiologia e farmacologia da pele, analisar a rejeição e as respostas imunes, dissecar os mecanismos do câncer de pele humano e entender as doenças de pele e a cicatrização de feridas6. Embora aplicável a vários campos de pesquisa da pele, o modelo de xenoenxerto tem menor rendimento do que os estudos in vitro e não tem a facilidade de manipulação genética empregada em modelos de camundongos. Os pontos de tempo dentro deste modelo podem variar de semanas a meses, e o enxerto bem-sucedido requer instalações e equipamentos apropriados para realizar essas cirurgias. No entanto, o modelo de xenoenxerto fornece contexto biológico e fisiológico aos experimentos, enquanto os sistemas de cultura organoides, como os explantes de tecidos, muitas vezes requerem a replicação de uma miríade de partes móveis, como sinais exógenos, em intervalos de tempo específicos7. Portanto, este modelo é melhor utilizado para validar ainda mais os achados observados in vitro e dentro de modelos de camundongos, ou para trabalhos que de outra forma não são biologicamente viáveis. O uso apropriado do modelo de xenoenxerto oferece uma oportunidade única para estudar e manipular o tecido humano intacto in vivo.
A otimização do modelo de transplante de pele de xenoenxerto tem contado com décadas de pesquisa para preservar a integridade do enxerto ao longo do tempo. Crítico para esse processo é a utilização do camundongo receptor de cadeia gama (NSG) não obeso diabético (NOD) e scid interleucina-2, que não possui células imunes adaptativas B e T, células NK funcionais e tem deficiências em macrófagos e células dendríticas8. A natureza imunodeficiente desses hospedeiros NSG permite o transplante de células hematopoiéticas humanas, cânceres derivados de pacientes e pele 8,9,10. Apesar desse ambiente imunossupressor do hospedeiro, a supressão adicional das respostas imunes neutrofílicas de camundongos pela administração de anti-GR1 é necessária para o sucesso do enxerto10. Os principais obstáculos no transplante de tecido intacto são infecção, rejeição e dificuldade em restabelecer o fluxo sanguíneo para o enxerto, às vezes levando à perda da integridade dérmica e epidérmica11. Técnicas que incluem a administração de anti-FR1 e o uso de profundidade apropriada do enxerto melhoram a sobrevida do enxerto10. A otimização meticulosa possibilita a realização de transplantes de pele de xenoenxerto humano em camundongos NSG com alta eficiência e taxas de sobrevivência, variando de 90% a 100%.
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Protocol
O presente estudo foi aprovado e realizado em conformidade com os protocolos UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Amostras de pele, descartadas como parte de procedimentos cirúrgicos eletivos de rotina, como o reparo de hérnia, foram utilizadas para a presente pesquisa. As amostras de pele são desidentificadas e certificadas como Pesquisa Não Humana ou, se informações de identificação clínica forem necessárias para análises a jusante, os pacientes forneceram consentimento por escrito sob o protocolo IRB 13-11307. Nenhum outro critério de inclusão ou exclusão foi utilizado. Camundongos NSG de ambos os sexos, 8-10 semanas de idade, foram empregados no estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Processamento da amostra de pele humana do dador
NOTA: A amostra de pele humana utilizada neste transplante foi uma grande amostra coletada do abdômen de um paciente saudável. A amostra deve ter pelo menos 15 cm x 7,5 cm. As limitações de tamanho podem afetar o número de camundongos para os quais a pele está disponível e a escolha do tamanho do enxerto.
- Manter a amostra de pele a temperaturas frias (no gelo; 4°C) antes da preparação e enxertia. Manter a amostra úmida em um copo de coleta de amostra fechado com a gaze embebida em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: Não é recomendado armazenar a amostra de pele a 4 °C durante mais de 2 dias. No entanto, existem relatos em que as amostras de pele são armazenadas por mais tempo12.
CUIDADO: Trate todo o tecido humano com precauções padrão de risco biológico. - Prepare-se para dermátomo da amostra de pele humana em um capuz de cultura de tecido de pressão negativa esterilizado em uma placa de dissecção esterilizada.
- Coloque a amostra de pele, do lado da epiderme para cima, na placa de dissecção. Limpe a epiderme com uma almofada de preparação de álcool estéril e, em seguida, com PBS.
- Fixe a borda mais próxima da pele no lugar com um pino T de dissecação de 1,5 (ver Tabela de Materiais).
- Dermátomo a amostra de pele a uma espessura de 400 μm, aplicando pressão constante enquanto corta para a frente em um ângulo de 30°-45°. Siga todas as instruções e medidas de segurança específicas do instrumento (consulte Tabela de materiais).
NOTA: Para obter detalhes sobre a técnica do dermátomo, consulte um relatório publicado anteriormente13. - Prepare uma placa de Petri de 100 mm x 20 mm colocando uma gaze estéril embebida em PBS estéril na parte inferior do prato. Coloque a pele, epiderme de lado para cima, sobre a gaze molhada.
- Selar e cobrir as bordas da placa com uma película de vedação semitransparente (ver Tabela de Materiais) para garantir que a amostra não esteja contaminada. Conservar a amostra a 4°C antes da enxertia.
2. Condicionamento e preparação pré-cirúrgica
- Prepare os instrumentos estéreis e uma estação cirúrgica estéril para enxerto. Use toalhas de papel autoclavadas como superfícies estéreis para a colocação de instrumentos e mouses.
NOTA: Os ratos podem ser enxertados após o desmame, mas são preferencialmente enxertados entre 8-10 semanas de idade. Camundongos de ambos os sexos podem ser enxertados. - Realize o preparo cirúrgico, como a depilação, em uma área fisicamente separada da estação cirúrgica.
- Preparar o anti-GR1 (ver Tabela de Materiais) diluindo-o em 1 mg/ml em solução salina estéril. Dose de cada rato com 100 μg/100 μL da solução anti-GR1 por via intraperitoneal após indução anestésica.
- Anestesiar os camundongos, um de cada vez, com isoflurano ou outros anestésicos institucionalmente aprovados.
NOTA: O isoflurano precisa ser administrado a uma concentração de 3% a 5% durante a indução. Uma vez que o rato está imóvel, diminua a concentração de isoflurano para 1%-3% para efeito durante a duração da cirurgia.- Monitore o rato quanto à profundidade apropriada da anestesia, observando a frequência respiratória, a ausência de resposta de beliscar os dedos dos pés e a coloração rosa apropriada das orelhas e da boca.
CUIDADO: Use máquinas anestésicas apropriadas e métodos de limpeza e evite a exposição a vapores de isoflurano.
- Monitore o rato quanto à profundidade apropriada da anestesia, observando a frequência respiratória, a ausência de resposta de beliscar os dedos dos pés e a coloração rosa apropriada das orelhas e da boca.
- Transfira o mouse para uma almofada de aquecimento ou outra fonte de calor (consulte Tabela de materiais).
- Administre a pomada oftálmica passando uma pequena gota de pomada no olho com um dedo enluvado.
- Administrar analgésicos Buprenorfina (0,08 mg/kg) e Carprofeno (5 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea, comprimindo a pele e injetando num ângulo paralelo ao corpo.
NOTA: Preparar a analgesia pré-tratamento seguindo protocolos institucionais. Seguir as diretrizes institucionais para a seleção e administração de analgésicos. O método de analgesia utilizado neste estudo está descrito na etapa 2.7 e na Figura 1 Suplementar. - Administrar o anti-GR1 (preparado no passo 2.4) por via intraperitoneal, levantando ligeiramente o rato pela cauda, expondo o abdómen e injetando num ângulo de 30° utilizando uma seringa de insulina 1 ml (12,7 mm).
- Use cortadores elétricos seguros para animais (consulte Tabela de Materiais) para raspar as porções média e superior do lado dorsal do rato.
- Limpe todo o cabelo e aplique uma quantidade generosa de pomada de depilação na pele raspada por 30 s a 1 min.
- Limpe completamente a pomada de depilação com uma toalha de papel e PBS.
3. Procedimento de transplante
- Transfira o rato para um local cirúrgico secundário, longe da estação de depilação.
- Esterilize o local cirúrgico com o cotonete de iodo em um movimento circular, começando no meio e trabalhando em direção à borda da área depilada.
- Coloque um pedaço de filme plástico estéril sobre o mouse e corte uma janela no plástico um pouco maior do que o tamanho da área a ser enxertada.
- Corte uma porção em forma de retângulo de 10 mm x 10 mm de pele do doador para ser enxertada com um bisturi. Faça isso segurando firmemente a pele do doador no lugar com a parte de trás do fórceps e cortando ao lado do fórceps com o bisturi.
- Usando a tesoura cirúrgica, corte uma área retangular da pele do rato correspondente ao tamanho da peça de pele do doador, criando um leito de enxerto. Use fórceps para puxar a pele para longe do corpo e corte a pele com a tesoura inclinada para longe do corpo para evitar cortar profundamente a fácia.
- Coloque a peça de pele do doador, do lado da epiderme para cima, no leito do enxerto preparado.
- Usando a parte de trás da pinça, manipule a pele, deslizando para frente e para trás até que a pele do doador fique completamente plana contra o leito do enxerto.
- Adicione gotas de adesivo de tecido de cola cirúrgica (ver Tabela de Materiais) onde a pele do doador encontra a pele do rato e segure a pele do rato e do dador juntamente com fórceps por 1-2 s para que a cola adera aos tecidos. Sele completamente a borda do enxerto e deixe a cola secar completamente.
- Bandagem dos ratos (Figura 1) seguindo os passos abaixo.
- Corte um pedaço de gaze de petrolato (ver Tabela de Materiais) grande o suficiente para cobrir completamente a área do enxerto.
- Cubra o enxerto com a gaze de petrolato e pressione levemente a gaze contra a pele usando fórceps.
- Corte uma tira de um curativo de filme transparente longitudinalmente para que a largura seja grande o suficiente para cobrir a ferida do mouse.
- Pressione firmemente o curativo de filme transparente, lado adesivo para baixo, sobre a gaze. Enrole rapidamente o mouse para envolver o curativo completamente ao redor do tronco, garantindo que ele se encaixe firmemente sem impedir a respiração e que todos os membros estejam livres para o movimento.
- Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação e monitore-o até que ele esteja alerta e se movendo. Forneça uma fonte de calor em parte da gaiola por pelo menos 15 minutos após a recuperação.
NOTA: Espera-se que os animais se recuperem dentro de 1-5 minutos depois de colocá-los na gaiola de recuperação.
- Embale individualmente os ratos após o enxerto.
- Administrar analgesia pós-cirúrgica conforme exigido pelos protocolos institucionais.
NOTA: Buprenorfina (0,08 mg/kg) foi administrada por via subcutânea 4-6 h mais tarde durante o presente estudo.
4. Procedimentos pós-cirúrgicos
- Injetar 100 μL (100 μg) de anti-GR1 por via intraperitoneal aos 4 dias, 7 dias e 11 dias após o enxerto para evitar a rejeição do enxerto (Figura 1 Suplementar).
- Substitua as ataduras conforme necessário e se removido por ratos.
- Rebandage todos os ratos no dia 7.
- Retire as ataduras no dia 14.
- Monitore os ratos para sinais de rejeição do enxerto e inflamação sistêmica (perda de peso, perda de cabelo, letargia extrema).
- Colha os ratos entre 3 e 6 semanas após o enxerto.
- Eutanasiar os ratos através da administração de dióxido de carbono (CO2) controlada pelo regulador, seguida de luxação cervical.
NOTA: Siga as diretrizes institucionais para a eutanásia. - Dissecar os enxertos de pele dos camundongos14. Colocar uma porção do enxerto em formalina a 10% por 24 h antes da incorporação e seccionamento da parafina para coloração histológica9.
- Picar os enxertos de pele com uma tesoura e digerir enzimaticamente com 250 UI/mL de colagenase IV e 0,02 mg/mL de DNase em meio de cultura celular durante a noite. Coloração das células para marcadores superficiais e intracelulares seguindo o procedimento descrito anteriormente14.
- Eutanasiar os ratos através da administração de dióxido de carbono (CO2) controlada pelo regulador, seguida de luxação cervical.
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Representative Results
Xenoenxertos de pele humana foram realizados em camundongos NSG dentro de uma instalação animal de super-barreira. O sucesso foi definido pela sobrevida prolongada do enxerto e do rato e pela saúde comportamental dos camundongos pós-transplante. A baixa sobrevida durante a semana seguinte à cirurgia foi inicialmente observada como a maior barreira para o sucesso experimental, com até 50% dos camundongos necessitando de eutanásia. Melhorar a técnica estéril e melhor suporte das temperaturas corporais do rato durante e imediatamente após a cirurgia aumentou a sobrevida cirúrgica consistentemente para mais de 80% e, muitas vezes, para 90% a 100% de sobrevida. Embora a adição de antibióticos na água potável do rato tenha sido testada, não foi determinada a melhorar os resultados e foi descontinuada como um potencial confundidor dos resultados. Camundongos enxertados com sucesso devem parecer ativos e saudáveis nos dias seguintes ao transplante. Os ratos estavam se movendo em torno de sua gaiola, explorando, construindo ninhos e comendo e bebendo como de costume. Um rato doente pode parecer preguiçoso, não reativo e pode não estar comendo ou bebendo o suficiente para manter seu peso. A suplementação de camundongos letárgicos com opções de alimentação mole e hidratação oral pode ajudar na recuperação pós-cirúrgica.
Um xenoenxerto que está cicatrizando corretamente primeiro crosta e, em seguida, se recuperará dentro de cerca de 50 dias após a cirurgia. Os enxertos podem se contrair ao longo do tempo, mas permanecem aderentes ao redor das bordas onde a pele do doador encontra a pele do camundongo (Figura 2). Enquanto a crosta do enxerto deve diminuir, os enxertos permanecerão mais espessos e mais inflamados do que a pele humana saudável (Figura 2). Pode ocorrer contração excessiva dos enxertos, reduzindo o tecido disponível para análise do desfecho. Espera-se que a utilização de enxertos de tamanho consistente e a colocação apropriada do enxerto mitiguem esses problemas. Todos os enxertos ao longo de cinco experimentos independentes sobreviveram até o momento da colheita, até 50 dias após o transplante.
A análise tecidual pode incluir imuno-histoquímica e análises unicelulares após digestão enzimática. Uma porção de pele foi processada por digestão noturna em 250 UI/mL de colagenase tipo IV e 0,02 mg/mL de DNase em meios de cultura celular (ver Tabela de Materiais), e corada para marcadores superficiais e intracelulares, conforme descrito anteriormente14. A análise por citometria de fluxo revelou a presença sustentada de células imunes humanas na maioria dos enxertos, mas as contagens variaram entre os xenoenxertos (Figura 3A). A Figura 3B mostra resultados representativos de um enxerto bem-sucedido (à esquerda) e que não conseguiu manter as células imunes humanas (à direita). A análise dos cortes corados com hematoxilina e eosina (H&E) retirados do centro do enxerto revelou pele intacta, não desvitalizada, composta por derme e epiderme humanas por 35 e 50 dias (Figura 4).
Figura 1: Método de curativo de camundongo após cirurgia. O rato é envolto firmemente em gaze de petrolato e curativo de filme transparente enquanto sob anestesia. (A) A gaze Petrolatum é colocada sobre uma área ligeiramente maior que a ferida cirúrgica. (B) O curativo de filme transparente é preparado: uma tira longa é cortada um pouco mais larga do que a gaze de petrolato. O suporte que cobre o lado adesivo do curativo de filme transparente é parcialmente removido. (C) O lado adesivo do filme é firmemente pressionado contra a parte de trás do mouse, deixando uma polegada de espaço na extremidade frontal do filme. (D) O rato está virado de costas. A parte frontal saliente do filme é pressionada no mouse e a parte traseira é removida. (E) O mouse é firmemente enrolado no filme, e o suporte restante é removido à medida que o mouse é enrolado. (F) O rato é envolto com sucesso no curativo, e seus braços e pernas são irrestritos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de animais transplantados do Dia 10 ao 21 pós-transplante. (A-C) Três camundongos diferentes com transplantes ótimos no dia 10. (D-E) Dois ratos diferentes com transplantes no dia 21. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quimerismo de células imunes na pele enxertada. Dados de citometria de fluxo da recuperação de células imunes humanas de xenoenxertos. Os dados são fechados nos eventos de singlet, ao vivo, humano CD45 + mouse CD45-. (A) Número de células (Live Human CD45+ Events) recuperadas de dois experimentos independentes. (B) Gráficos representativos de coloração de células imunes CD45+ humanas e de camundongos em um enxerto bem-sucedido (à esquerda) em comparação com o enxerto com manutenção malsucedida do compartimento imunológico humano (à direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Histologia da pele humana enxertada nos dias 35 e 50. A pele enxertada foi colhida dos camundongos no 35º dia (A) ou 50 (B), preservada em formalina a 10%, e embutida em parafina e corada para Hematoxilina e Eosina (H&E). (A) A epiderme apresenta hiperplasia moderada (acantose), hipergranulose leve e ortoqueratose compacta. Na derme papilar, há ocasionais capilares dilatados e congestionados. Melanócitos e pigmento de melanina estão presentes na camada basal da epiderme. A derme é moderadamente celular e é composta por fibroblastos ovais rechonchudos com citoplasma sincicial pálido e linfócitos dispersos. (B) A epiderme compreende epitélio escamoso estratificado, ortoqueratose na camada cornificada e é de espessura normal. Melanócitos e pigmento de melanina estão presentes na camada basal da epiderme. A derme apresenta fibroblastos ovais e deposição de matriz extracelular levemente aumentada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Cronograma do protocolo adotado para o estudo do xenoenxerto. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O modelo de transplante de pele de xenoenxerto de camundongo é uma técnica fundamental para dissecar mecanicamente as respostas imunes da pele humana em um ambiente in vivo 14. O sucesso dos transplantes de xenoenxerto de pele depende do preparo adequado de camundongos e espécimes de pele e camundongos e da adesão a métodos de cirurgia asséptica de roedores15. O resfriamento rápido e o armazenamento adequado de amostras de pele a temperaturas frias em meios (como solução salina estéril) são importantes para garantir a saúde contínua dos tecidos antes do transplante12. A coleta de amostras de espessura fracionada, utilizando um instrumento como um dermátomo, permite a consistência na profundidade da amostra entre camundongos e aumenta o fornecimento de nutrientes do hospedeiro para melhorar a sobrevida do enxerto10. Perda da integridade do enxerto com descamação epidérmica pode ser observada, particularmente em enxertos de espessura total com suprimento sanguíneo interrompido16. A sobrevida do camundongo durante e após a cirurgia é auxiliada pela técnica estéril, fornecimento de calor durante e após a cirurgia e técnicas que minimizam o tempo cirúrgico, como a utilização de cola cirúrgica15. A administração de anti-GR1 após o transplante permite a supressão das respostas imunes remanescentes do camundongo no hospedeiro imunodeficiente para promover a sobrevida do enxerto10. Esses métodos aumentam a probabilidade de sobrevivência de camundongos e enxertos durante o modelo de transplante de xenoenxerto e melhoram o número experimental e a reprodutibilidade de um experimento para o outro.
Embora extremamente útil, existem algumas limitações fundamentais para o modelo de transplante de pele de xenoenxerto, como demonstrado. Primeiro, o enxerto existe em um ambiente inflamatório, provavelmente secundário a isquemia transitória e infiltração de tecido humano enxertado com células mieloides murinas. Assim, não reflete a pele humana em estado estacionário e pode não refletir totalmente todas as dermatoses inflamatórias humanas10,14. Estudar os distúrbios inflamatórios humanos por enxertia de biópsias clínicas de pele lesional é uma estratégia alternativa, mas limitações no número de biópsias disponíveis e controle inconsistente da profundidade do enxerto tornam essa opção menos favorável. Além disso, os transplantes de xenoenxerto não recapitulam a arquitetura imune periférica humana. A reconstituição da periferia do rato com células humanas também pode ter ressalvas, uma vez que a estrutura linfoide do rato NSG é atrófica antes do enxerto de células humanas; isso pode levar à seleção preferencial de células em alguns contextos10,17. Além disso, o enxerto de pele e a recuperação de células imunes de espécimes de pele podem variar de rato para rato, mesmo na ausência de tratamento. Pelo menos 10 repetições por condição são recomendadas para este modelo para observar diferenças consistentes entre os grupos. A duração apropriada do ensaio pode precisar ser ajustada para a questão experimental, pois a cicatrização e a revascularização do enxerto ocorrem nas semanas iniciais após o transplante, e o efeito das intervenções pode depender do estágio do enxerto.
Apesar dessas desvantagens, o modelo de transplante de pele de xenoenxerto humano continua sendo um dos poucos ensaios para estudar as respostas imunes da pele humana no órgão intacto in vivo. Embora os modelos de camundongos transgênicos possam permitir a dissecção mecanicista da via, as diferenças na anatomia, composição das células imunes e vias imunes dominantes limitam a tradução para a doença humana1. A cultura ex vivo de células derivadas de humanos, modelos organoides cutâneos e estudos de explante de tecidos humanos podem ser utilizados alternativamente, mas também estão sujeitos a limitações, incluindo ruptura das redes de células imunes e saída de células imunes do tecido intacto18,19. Portanto, os modelos de transplante de pele de xenoenxerto continuam sendo um método-chave para estudar candidatos terapêuticos e respostas da pele humana à inflamação em um ambiente pré-clínico in vivo.
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Disclosures
A MDR é fundadora da TRex Bio e da Sitryx. MDR e MML recebem financiamento de pesquisa da Sitryx, Q32 e TRex Bio.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por acordos de pesquisa patrocinados da TRex Bio e subsídios do NIH (1R01AR075864-01A1). A JMM é apoiada pela Cancer Research Society (subvenção 26005). Reconhecemos o Parnassus Flow Cytometry Core apoiado em parte pelas subvenções NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 e S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
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