Summary
À ce jour, le développement de méthodes d’identification de la glande parathyroïde (PG) est limité par le manque de modèles animaux dans la recherche préclinique. Ici, nous établissons un modèle de rat simple et efficace pour l’imagerie PG peropératoire et évaluons son efficacité en utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer comme nouvel agent de contraste PG.
Abstract
L’identification de la glande parathyroïde (PG) est un besoin critique non satisfait dans la thyroïdectomie. L’identification du PG est difficile en chirurgie de la thyroïde car il est de couleur similaire à celle de la glande thyroïde. Le manque de modèles animaux efficaces dans la recherche préclinique est une limite sévère pour le développement des techniques d’identification PG. Ce protocole permet d’établir un modèle de rat simple et efficace pour l’identification des PG. Dans ce modèle, les nanoparticules d’oxyde de fer noir (IONP) sont injectées localement dans la glande thyroïde et diffusent rapidement dans la glande thyroïde, mais pas dans le PG. Un PG coloré négativement et une glande thyroïde colorée positivement peuvent être facilement identifiés à l’œil nu sans nécessiter de microscopes externes. La position du PG peut être identifiée en augmentant le contraste de couleur entre la glande thyroïde et le PG, en fonction de la couleur des IONP noirs. Ce modèle de rat est peu coûteux et pratique pour l’identification des PG, et les IONP sont un nouvel agent de contraste PG.
Introduction
La glande parathyroïde (PG) est de petites glandes endocrines de forme ovale situées dans le cou des humains et d’autres vertébrés, qui produisent et sécrètent des hormones parathyroïdiennes pour réguler et équilibrer les niveaux de calcium et de phosphore dans le sang et dans les os1. Les humains ont généralement deux paires de PG situées derrière les lobes de la glande thyroïde à des endroits variables; la taille du PG humain mesure généralement 6 mm x 4 mm x 2 mm, avec un poids d’environ 35-40 mg2. L’ablation ou l’endommagement du PG provoque une hypoparathyroïdie (HP), un trouble endocrinien caractérisé par une hypocalcémie et des taux faibles ou indétectables d’hormones parathyroïdiennes, qui provoquent un large éventail de symptômes allant des spasmes ressemblant à des crampes aux dents malformées en passant par les maladies rénales chroniques. Certaines de ces complications sont fatales (p. ex. insuffisance cardiaque et convulsions)3,4,5; ainsi, PG est essentiel dans la régulation du métabolisme du corps et le maintien de la vie.
La HP est l’une des complications les plus courantes après une chirurgie antérieure du cou, en particulier dans la thyroïdectomie, un traitement curatif bien établi du cancer de la thyroïde, qui est le cancer endocrinien le plus répandu dans le monde 6,7. La HP post-thyroïdectomie est principalement causée par un traumatisme direct, une ischémie ou l’ablation du PG en chirurgie en raison d’un manque grave de capacité à discriminer de manière fiable le PG des lobes de la glande thyroïde et d’autres tissus environnants (par exemple, les ganglions lymphatiques et les particules de graisse périphériques) en temps réel dans la salle d’opération. En 2021, Barrios et coll. ont signalé un taux moyen de fausses sections PG de 22,4 % dans 1 114 cas de thyroïdectomie, et même des chirurgiens expérimentés qui avaient un taux d’erreur minimum de 7,7 %8. Ces taux élevés de mauvais sections PG concordent avec d’autres rapports similaires 9,10,11. Ainsi, une parathyroïdectomie incorrecte est un facteur de risque indépendant de HPs postopératoires transitoires et permanentes.
La mise au point de méthodes peropératoires efficaces d’identification des PG est essentielle pour répondre à ce besoin médical critique non satisfait; Cependant, il a été sévèrement limité par le manque de modèles animaux dans la recherche préclinique. À ce jour, la plupart des examens peropératoires d’identification des PG ont été effectués sur des patients humains et de gros animaux (p. ex. chiens)12, qui sont coûteux et difficiles à obtenir une approbation éthique, à augmenter le nombre de sujets et à répéter les tests. Pendant ce temps, la souris, le modèle vertébré le plus couramment utilisé dans la recherche biologique, a un PG extrêmement petit, avec une taille inférieure à 1 mm13. En raison de cette limitation, les modèles PG murins ont rarement été utilisés dans la recherche peropératoire sur l’identification des PG.
Cet article fait état de l’établissement d’un modèle simple, direct et efficace chez le rat pour les études peropératoires d’identification des PG. Nous avons étudié l’utilisation de rats Sprague-Dawley (SD) indigènes sans aucune modification chirurgicale ou génie génétique comme modèle animal fiable pour tester un agent de contraste d’imagerie PG, les IONPs, dans une chirurgie de thyroïdectomie. Ce modèle de rat démontre une structure physiologique très similaire de PG et du microenvironnement environnant à celle des humains, et la taille du PG de rat est suffisamment grande pour être détectée visuellement par rapport à celles des souris. La plupart des rats ont un PG de chaque côté de la glande thyroïde. La simplicité et l’efficacité de ce modèle de rat ont été démontrées en effectuant une imagerie PG peropératoire améliorée par IONP dans la chirurgie de thyroïdectomie.
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Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Institut de médecine fondamentale et de cancérologie de l’Académie chinoise des sciences. Il s’agit d’une chirurgie de non-survie.
1. Animal
- Utilisez un rat SD femelle âgé de 6 à 8 semaines, pesant 250 g, pour l’imagerie PG peropératoire.
2. Anesthésie
- Allumez l’appareil d’anesthésie.
- Avant de commencer, assurez-vous que le niveau d’isoflurane est plein dans le vaporisateur d’anesthésie. Ensuite, allumez l’oxygène et réglez le débit sur 0,4-0,8 L / min. Induire l’anesthésie avec 3-5% d’isoflurane et maintenir à 2% isoflurane (débit: 0,4-0,8 L / min).
- Mettez le rat SD dans la boîte de l’appareil d’anesthésie et sélectionnez le modèle Channel pour commencer l’anesthésie animale.
- Observez l’activité du rat dans la boîte. Lorsque le rat tombe dans le coma, déplacez-le vers le cône nasal pour maintenir l’anesthésie (position couchée inconsciente sans réflexe douloureux et réflexe cornéen).
- Utilisez le masque d’anesthésie pour couvrir le nez du rat et passez l’appareil d’anesthésie en mode masque pour garder l’animal sous anesthésie pendant la chirurgie.
3. Posture et fixation
- Transférer le rat anesthésié sur un champ chirurgical sur une table d’opération chirurgicale. Placez un coussin chauffant préchauffé sous l’animal pour maintenir la température corporelle de l’animal pendant la chirurgie.
- Utilisez des élastiques pour fixer les membres du rat à la table d’opération. Placez un oreiller cylindrique fait de drapé sous l’épaule du rat pour pencher sa tête en arrière, exposant complètement la région du cou.
- Appliquez une pommade aux larmes artificielles sur les deux yeux du rat pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
4. Épilation
- Appliquez une crème dépilatoire sur la région du cou: jusqu’à l’espace sous-maxillaire, jusqu’au processus xiphoïde et des deux côtés à l’extérieur du muscle sternocléidomastoïdien.
- Après 3 min, essuyez délicatement les cheveux et la crème dépilatoire avec un mouchoir.
5. Stérilisation
- Utilisez une boule de coton Iodophor pour désinfecter la zone d’opération 3 fois du milieu du cou à la zone environnante. Ne désinfectez que la zone d’où les poils ont été enlevés.
6. Pose chirurgicale de champs
- Utilisez un champ chirurgical pour couvrir la zone d’opération du cou du rat. Gardez le trou du champ chirurgical aligné avec la zone de désinfection de l’animal.
7. Incision
- Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence d’un réflexe de pincement de l’orteil avant de faire l’incision. Ensuite, insérez la lame dans le scalpel et utilisez le scalpel pour faire une incision longitudinale dans la ligne médiane antérieure du cou du rat. Assurez-vous que la longueur de l’incision est d’environ 5 cm et seulement dans le derme.
8. Dissection du tissu sous-cutané du muscle cervical antérieur
- Soulevez la peau le long des deux côtés de l’incision.
- Utilisez un ciseau pour couper longitudinalement le long de la linea alba cervicalis.
- Utilisez une pince pour séparer le muscle sternohyoïdien et le muscle sternothyroïdien.
9. Fixez les muscles antérieurs du cou des deux côtés
- Utilisez une pince vasculaire pour serrer le muscle sternohyoïdien séparé et le muscle sternothyroïdien devant le cou et tirer le tissu serré à l’extérieur.
- Utilisez un rétracteur ou l’aiguille pour faire passer la suture (3-0#) à travers le tissu serré, faites un nœud et fixez la suture au champ chirurgical de la table d’opération.
10. Localisation de la glande thyroïde
- Localisez le cartilage thyroïdien et le cartilage cricoïde comme limite supérieure dans la zone d’opération. Identifier le cartilage thyroïdien en fonction de sa forme de bouclier et le cartilage cricoïde en fonction de sa forme d’anneau.
- Situez la trachée comme limite inférieure dans la zone d’opération. Recherchez la trachée à l’avant et au milieu du cou, en fonction de sa forme tubulaire en anneau cartilagineux.
- Localisez la glande thyroïde entre les limites supérieure et inférieure - une glande rouge en forme de papillon du côté opposé de la trachée.
11. Identification visuelle du PG
- Localisez le PG sur les côtés supérieur et externe de la glande thyroïde. Recherchez deux PG de forme fusiforme d’environ 1,2 à 2 mm de longueur et de 1,0 à 1,5 mm de largeur, rougeâtres mais plus légers que la glande thyroïde environnante avec une certaine limite.
- Prenez une photo frontale du PG avec la trachée, la thyroïde et le larynx pour comparer quantitativement les effets de l’IONP avant et après l’injection.
- Disséquez l’arrière de l’œsophage, puis utilisez l’écarteur pour exposer le côté droit du PG. Prenez une photo de droite du PG avec la glande thyroïde et la trachée.
- Échangez l’écarteur pour exposer le côté opposé du PG et prenez une photo du côté gauche d’eux avec la glande thyroïde et la trachée.
12. Injection thyroïdienne des IONPs
- Utilisez une seringue à insuline pour injecter localement 10 μL de suspension d’IONPs (20 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate) au centre de la glande thyroïde. Appuyez doucement sur le site d’injection avec de la gaze pendant 5 s.
13. Identification du PG après injection d’IONPs
- Après l’injection, observez la diffusion rapide des IONP dans les glandes thyroïdes mais pas dans le PG, car il colore négativement le PG et le différencie de la thyroïde environnante.
- Prenez une photo de face du PG coloré négativement avec la trachée, la glande thyroïde et le larynx.
- Prenez des photos à gauche et à droite du PG taché négativement en utilisant les mêmes procédures que celles mentionnées ci-dessus.
14. Résection de la gorge et de la trachée avec la glande thyroïde et PG
- Une fois que les rats ont inhalé un excès d’isoflurane (isoflurane à 5 % pendant plus de 5 minutes) et sont sous anesthésie profonde, euthanasiez-les par injection intracardiaque de 0,5 mL de solution saturée de chlorure de potassium.
- Post-mortem, enlever la gorge, la trachée, la glande thyroïde et PG.
- Sous une hotte, placer les échantillons enlevés de gorge, de trachée, de glande thyroïde et de PG dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h.
15. Études histopathologiques
- Déshydratez les tissus et intégrez-les dans de la paraffine. Trancher en sections de 5 μm d’épaisseur. Cuire les profilés à 37 °C dans un four pendant une nuit et à 65 °C pendant 1 h.
- Colorer les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) après le lavage 3 x 5 min avec de l’alcool gradient à 75%, 95%, 100% et lavage à l’eau à température ambiante.
- Demandez aux pathologistes d’examiner les coupes colorées H & E au microscope optique.
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Representative Results
Dans ce modèle animal, nous avons incisé chirurgicalement le cou d’un rat SD pour exposer la trachée, le larynx et les tissus environnants. Ensuite, la glande thyroïde était visuellement située des deux côtés de la trachée; Il est en forme de papillon et mesure environ 3 mm x 5 mm. Une paire de PG est généralement située dans la partie supérieure de la glande thyroïde, et leur couleur est très similaire à celle des lobes de la glande thyroïde, ce qui rend extrêmement difficile de les distinguer à l’œil nu (Figure 1).
Après injection, l’agent de contraste (Figure 1 et Figure 2), les IONPs, diffuse facilement dans la glande thyroïde et la colore en noir, mais ne peut pas infiltrer le PG en raison de leur densité tissulaire élevée. La répartition déséquilibrée des IONP entre le PG et la glande thyroïde donne un contraste saisissant, qui peut être facilement visualisé à l’œil nu sans nécessiter d’instruments externes. La figure 2 montre des images représentatives de PG colorées négativement par les IONP dans la thyroïde gauche du rat, dans lesquelles le contraste entre le PG et la glande thyroïde était remarquable, et la taille du PG de rat a été déterminée à environ 2 mm x 1 mm.
L’autopsie, le larynx du rat et la trachée, l’œsophage, la thyroïde et le PG adjacents ont été réséqués pour une coloration histopathologique. Des coupes en série du tissu contenant du PG ont été obtenues pour effectuer la coloration H & E. Ces images colorées H & E (Figure 3) ont révélé que les PG sont enrichis de cellules principales étroitement alignées, tandis que la glande thyroïde présente de nombreuses lumières lâches indiquant une densité tissulaire beaucoup plus faible.
Figure 1 : La structure physiologique des PG et leur microenvironnement. Illustration schématique du PG humain et de la glande thyroïde à l’injection pré- (A) et post-IONPs (B). Images de biopsie représentatives des tissus cervicaux antérieurs du rat, y compris le PG, la glande thyroïde, la trachée et le larynx à l’injection pré- (C) et post-IONP (D). Des images supplémentaires ont été publiées dans notre étude précédente15. Abréviations : PG = glandes parathyroïdes; IONPs = nanoparticules d’oxyde de fer; IONP10 = IONP de 10 nm de diamètre; L’échelle est en centimètres (cm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Identification des PG peropératoires améliorées par les IONPs. Images représentatives des lobes de la glande thyroïde de rat non traités (A) et injectés par des IONPs (B) avant et après l’injection d’IOPs. L’efficacité de l’identification des PG améliorées par les IONP est cohérente en termes de reproductibilité à l’injection pré- (C) et post-IONPs (D). Abréviations : PG = glande parathyroïde; IONPs = nanoparticules d’oxyde de fer; IONP10 = IONP de 10 nm de diamètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse histologique d’une glande thyroïde injectée par des IONPs et de son microenvironnement. (A) Photographies ex vivo représentatives des tissus cervicaux antérieurs du rat lors de l’injection post-IONPs. (B) Images représentatives colorées H&E de rats PG. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Image agrandie de la boîte rouge en pointillés dans le panneau B. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous démontrons une technique d’imagerie négative guidée par les IONPs du rat en utilisant des IONP noirs, qui ont été injectés localement au centre de la glande thyroïde et diffusés dans la glande thyroïde mais pas dans le PG. Il permet une identification claire du PG à l’œil nu sans l’aide d’aucun microscope. Bien que des souris transgéniques avec une protéine fluorescente verte exprimée sélectivement dans le PG aient été signalées13, le modèle décrit dans cet article est plus simple à réaliser. Cela ne prend que ~ 1 min par rat après injection, et une nette différence entre la glande thyroïde et PG peut être observée à l’œil nu.
De plus, un autre avantage de ce modèle est que le coût et la difficulté opérationnelle sont considérablement inférieurs pour ce modèle de rat que pour les modèles de grands animaux (p. ex., chiens12) actuellement utilisés dans les études précliniques pour évaluer les nouvelles méthodes d’identification des PG. Le coût moyen d’un rat SD est proche de celui d’une souris BALB/C, qui est plus de 30 fois moins chère qu’un chien. Cet avantage peu coûteux du modèle du rat permet d’augmenter le nombre de sujets et de répéter les tests dans la recherche préclinique, ce qui est difficile avec les grands modèles animaux. Pendant ce temps, le poids corporel typique d’un rat SD est de 300 à 350 g, ce qui est également plus de 66 fois plus léger que celui d’un chien (22-23 kg)14.
Une telle différence de poids corporel réduit considérablement la difficulté d’opération dans le modèle de rat par rapport aux modèles de grands animaux, car la réalisation d’une thyroïdectomie sur de grands animaux tels que les chiens nécessite des procédures d’anesthésie et de chirurgie plus compliquées, ce qui la rend plus difficile et techniquement difficile. L’exigence d’une intervention chirurgicale (des compétences chirurgicales de base sont requises) pose une limite à ce modèle. Les ionp utilisés dans cette étude ont montré une excellente biosécurité et biodégradabilité, comme indiqué précédemment15. En fin de compte, nous espérons que cette méthode d’imagerie négative du PG du rat à l’aide d’IONP pourra fournir un modèle animal simple et efficace pour les études précliniques impliquant l’identification des PG, facilitant ainsi le développement de nouvelles techniques d’identification des PG.
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Disclosures
P.G. et W.Z. sont les co-inventeurs d’une demande de brevet déposée par l’hôpital du cancer de l’Université de l’Académie chinoise des sciences (Zhejiang Cancer Hospital) sur la base du projet. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC) (82172598), la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang, Chine (LZ22H310001), le 551 Health Talent Training Project de la Commission de la santé de la province du Zhejiang, en Chine, et le Medical and Health Science and Technology Project de la province du Zhejiang, Chine (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
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