Summary
На сегодняшний день развитие методов идентификации паращитовидных желез (ПГ) ограничено отсутствием животных моделей в доклинических исследованиях. Здесь мы устанавливаем простую и эффективную модель крыс для интраоперационной визуализации ПГ и оцениваем ее эффективность, используя наночастицы оксида железа в качестве нового контрастного агента ПГ.
Abstract
Идентификация паращитовидной железы (ПГ) является критической неудовлетворенной потребностью в тиреоидэктомии. Идентификация ПГ является сложной задачей в хирургии щитовидной железы, поскольку она похожа по цвету на щитовидную железу. Отсутствие эффективных моделей на животных в доклинических исследованиях является серьезным ограничением для развития методов идентификации ПГ. Этот протокол позволяет создать простую и эффективную модель крыс для идентификации ПГ. В этой модели наночастицы черного оксида железа (ИОНП) вводятся локально в щитовидную железу и быстро диффундируют внутри щитовидной железы, но не ПГ. Отрицательно окрашенная ПГ и положительно окрашенная щитовидная железа могут быть легко идентифицированы невооруженным глазом, не требуя внешних микроскопов. Положение ПГ может быть идентифицировано путем увеличения цветового контраста между щитовидной железой и ПГ, основываясь на цвете черных ИОНП. Эта модель крыс является недорогой и удобной для идентификации PG, а IONP являются новым контрастным веществом PG.
Introduction
Паращитовидная железа (ПГ) представляет собой небольшие эндокринные железы овальной формы, расположенные на шее человека и других позвоночных, которые производят и секретируют паратиреоидные гормоны для регулирования и балансировки уровня кальция и фосфора в крови и в костях1. У людей обычно есть две пары ПГ, расположенные за долями щитовидной железы в переменных местах; размер человеческой ПГ обычно составляет 6 мм х 4 мм х 2 мм, при весе примерно 35-40 мг2. Удаление или повреждение ПГ вызывает гипопаратиреоз (НР), эндокринное расстройство, характеризующееся гипокальциемией и низкими или неопределяемыми уровнями паратиреоидных гормонов, которые вызывают широкий спектр симптомов от спазмоподобных спазмов до деформированных зубов и хронических заболеваний почек. Некоторые из этих осложнений являются фатальными (например, сердечная недостаточность и судороги)3,4,5; таким образом, ПГ имеет важное значение для регулирования метаболизма организма и поддержания жизни.
HP является одним из наиболее распространенных осложнений после операции на передней части шеи, особенно при тиреоидэктомии, хорошо зарекомендовавшем себя лечебном лечении рака щитовидной железы, который является наиболее распространенным эндокринным раком во всем мире 6,7. Посттиреоидэктомия HP преимущественно вызвана прямой травмой, ишемией или удалением PG в хирургии из-за серьезной неспособности надежно различать PG от долей щитовидной железы и других окружающих тканей (например, лимфатических узлов и периферических жировых частиц) в режиме реального времени в операционной. В 2021 году Barrios et al. сообщили о среднем уровне неправильного сечения ПГ в 22,4% в 1 114 случаях тиреоидэктомии и даже о опытных хирургах, у которых минимальная частота ошибок составляла 7,7%8. Такие высокие показатели расхождений в ПГ согласуются с другими аналогичными отчетами 9,10,11. Таким образом, неправильная паратиреоидэктомия является самостоятельным фактором риска транзиторной и постоянной послеоперационной НР.
Разработка эффективных интраоперационных методов идентификации ПГ является ключом к удовлетворению этой критической неудовлетворенной медицинской потребности; однако он был серьезно ограничен отсутствием моделей на животных в доклинических исследованиях. На сегодняшний день большинство интраоперационных исследований идентификации ПГ были проведены на людях и крупных животных (например, собаках)12, которые являются дорогостоящими и трудными для получения этического одобрения, расширения числа субъектов и повторных тестов. Между тем, мышь, наиболее часто используемая модель позвоночных в биологических исследованиях, имеет чрезвычайно маленький ПГ, размером менее 1 мм13. Из-за этого ограничения мышиные модели PG редко использовались в интраоперационных исследованиях идентификации PG.
В этой статье сообщается о создании простой, понятной и эффективной модели крыс для интраоперационных исследований идентификации ПГ. Мы исследовали использование местных крыс Sprague-Dawley (SD) без каких-либо хирургических модификаций или генной инженерии в качестве надежной модели на животных для тестирования контрастного вещества для визуализации PG, IONPs, в хирургии тиреоидэктомии. Эта модель крыс демонстрирует очень похожую физиологическую структуру ПГ и окружающей микросреды на человеческую, а размер ПГ крыс достаточно велик, чтобы его можно было визуально обнаружить по сравнению с размерами мышей. Большинство крыс имеют по одной ПГ с каждой стороны щитовидной железы. Простота и эффективность этой модели крыс были продемонстрированы путем выполнения интраоперационной визуализации ПГ с усилением IONP в хирургии тиреоидэктомии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Института фундаментальной медицины и рака Китайской академии наук. Это операция, не связанная с выживанием.
1. Животное
- Используйте 6-8-недельную самку SD-крысы весом 250 г для интраоперационной визуализации ПГ.
2. Анестезия
- Включите аппарат для анестезии.
- Перед началом убедитесь, что уровень изофлурана в испарителе анестезии заполнен. Затем включите кислород и установите расход на 0,4-0,8 л/мин. Индуцируют анестезию 3-5% изофлураном и поддерживают при 2% изофлуране (расход: 0,4-0,8 л/мин).
- Поместите крысу SD в коробку анестезиологического аппарата и выберите модель Channel , чтобы начать анестезию животных.
- Понаблюдайте за активностью крыс в коробке. Когда крыса впадет в кому, переместите ее к носовому конусу для поддержания анестезии (бессознательное положение лежа на спине без болевого рефлекса и рефлекса роговицы).
- Используйте анестезиологическую маску, чтобы покрыть нос крысы и переключить анестезиологический аппарат в режим маски, чтобы держать животное под наркозом во время операции.
3. Осанка и фиксация
- Перенесите обезболенную крысу на хирургическую драпировку на операционном столе. Поместите предварительно расплавленную грелку под животное, чтобы поддерживать температуру тела животного во время операции.
- Используйте резинки, чтобы закрепить конечности крысы на операционном столе. Поместите цилиндрическую подушку из драпировки под плечо крысы, чтобы откинуть ее голову назад, полностью обнажив область шеи.
- Нанесите искусственную слезную мазь на оба глаза крысы, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
4. Эпиляция
- Нанесите крем для депиляции на область шеи: до подчелюстного пространства, вплоть до мечевидного отростка и с обеих сторон наружу грудино-ключично-сосцевидной мышцы.
- Через 3 мин аккуратно протрите волосы и крем для депиляции салфеткой.
5. Стерилизация
- Используйте йодофорный ватный тампон для дезинфекции области операции 3 раза от середины шеи до окружающей области. Дезинфицируйте только область, с которой были удалены волосы.
6. Хирургическая укладка драпировки
- Используйте хирургическую драпировку, чтобы покрыть операционную область шеи крысы. Держите отверстие хирургической драпировки выровненным с областью дезинфекции животного.
7. Разрез
- Подтвердите хирургическую плоскость анестезии через отсутствие рефлекса защемления пальца ноги перед тем, как сделать разрез. Затем поместите лезвие в скальпель и используйте скальпель, чтобы сделать продольный разрез в передней средней линии шеи крысы. Убедитесь, что длина разреза составляет примерно 5 см и только в дерме.
8. Рассечение подкожной клетчатки из передней шейной мышцы
- Поднимите кожу по обеим сторонам разреза.
- Используйте ножницы, чтобы продольно разрезать вдоль линии alba cervicalis.
- Используйте щипцы, чтобы разделить грудиногиоидную мышцу и грудино-щитовидную мышцу.
9. Зафиксируйте передние мышцы шеи с обеих сторон
- Используйте сосудистые щипцы, чтобы зажать отделенную грудиногиоидную мышцу и грудино-щитовидную мышцу перед шеей и вытянуть зажатую ткань наружу.
- Используйте втягивающее устройство или иглу, чтобы пропустить шов (3-0#) через зажатую ткань, сделать узел и закрепить шов к хирургической драпировке операционного стола.
10. Локализация щитовидной железы
- Найдите щитовидный хрящ и крикоидный хрящ в качестве верхней границы в области операции. Определите щитовидный хрящ на основе его формы щита и крикоидный хрящ на основе его кольцевой формы.
- Найдите трахею как нижнюю границу в области операции. Ищите трахею в передней и средней части шеи, основываясь на ее трубчатой форме хрящевого кольца.
- Расположите щитовидную железу между верхней и нижней границами — красную железу в форме бабочки на противоположной стороне трахеи.
11. Визуальная идентификация ПГ
- Расположите ПГ на верхней и внешней сторонах щитовидной железы. Ищите две ПГ в веретенообразной форме около 1,2-2 мм в длину и 1,0-1,5 мм в ширину, которые красноваты, но легче, чем окружающая щитовидная железа с определенной границей.
- Сделайте фронтальную фотографию ПГ с трахеей, щитовидной железой и гортанью, чтобы количественно сравнить эффекты IONP до и после инъекции.
- Рассекните заднюю часть пищевода, затем используйте втягивающее устройство, чтобы обнажить правую сторону ПГ. Сделайте фотографию с правой стороны ПГ со щитовидной железой и трахеей.
- Поменяйте местами втягивающее устройство, чтобы обнажить противоположную сторону ПГ, и сделайте их левую фотографию со щитовидной железой и трахеей.
12. Инъекция щитовидной железы ИОНП
- Используйте инсулиновый шприц для местной инъекции 10 мкл суспензии IONPs (20 мг / мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе) в центр щитовидной железы. Аккуратно надавите на место инъекции марлей в течение 5 с.
13. Идентификация ПГ после инъекции ИОНП
- После инъекции наблюдайте быструю диффузию ИОНП в щитовидной железе, но не ПГ, так как она отрицательно окрашивает ПГ и дифференцирует их от окружающей щитовидной железы.
- Сделайте переднюю фотографию отрицательно окрашенного ПГ вместе с трахеей, щитовидной железой и гортанью.
- Сделайте фотографии с левой и правой стороны отрицательно окрашенного ПГ, используя те же процедуры, что и упомянутые выше.
14. Резекция горла и трахеи со щитовидной железой и ПГ
- После того, как крысы вдохнули избыток изофлурана (5% изофлурана в течение более 5 мин) и находятся под глубоким наркозом, усыпляют их путем внутрисердечной инъекции 0,5 мл насыщенного раствора хлорида калия.
- Вскрытие, удаление горла, трахеи, щитовидной железы и ПГ.
- Под вытяжной капюшон поместите удаленные образцы горла, трахеи, щитовидной железы и ПГ в 4% раствор параформальдегида в течение 24 ч.
15. Гистопатологические исследования
- Обезвоживают ткани и встраивают их в парафин. Нарежьте на участки толщиной 5 мкм. Выпекать срезы при 37 °C в духовке на ночь и при 65 °C в течение 1 ч.
- Окрашивают срезы гематоксилином и эозином (H&E) после промывки 3 х 5 мин 75%, 95%, 100% градиентным спиртом и промывкой водой комнатной температуры.
- Попросите патологоанатомов исследовать окрашенные H&E участки под световым микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой животной модели мы хирургически разрезали шею крысы SD, чтобы обнажить трахею, гортань и окружающие ткани. Затем щитовидная железа визуально располагалась по обеим сторонам трахеи; он имеет форму бабочки и размером примерно 3 мм х 5 мм. Пара ПГ обычно располагается в верхней части щитовидной железы, а их цвет очень похож на цвет долей щитовидной железы, что крайне затрудняет их различение невооруженным глазом (рисунок 1).
После инъекции контрастное вещество (Рисунок 1 и Рисунок 2), ИОНП, легко диффундирует внутри щитовидной железы и окрашивает ее в черный цвет, но не может проникнуть в ПГ из-за их высокой плотности тканей. Несбалансированное распределение ИОНП между ПГ и щитовидной железой дает поразительный контраст, который можно легко визуализировать невооруженным глазом, не требуя внешних инструментов. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения ПГ, отрицательно окрашенных ИОНП в левой щитовидной железе крысы, в которых контраст между ПГ и щитовидной железой был замечательным, а размер ПГ крысы был определен примерно в 2 мм х 1 мм.
Патологоанатомическая, гортань крыс и прилегающая трахея, пищевод, щитовидная железа и ПГ были резецированы для гистопатологического окрашивания. Серийные участки ткани, содержащей PG, были получены для выполнения окрашивания H&E. Эти H&E-окрашенные изображения (рисунок 3) показали, что PG обогащены тесно выровненными главными клетками, тогда как щитовидная железа имеет много рыхлых просветов, указывающих на гораздо более низкую плотность тканей.
Рисунок 1: Физиологическое строение ПГ и их микросреда. Схематическая иллюстрация ПГ человека и щитовидной железы при пре- (А) и пост-ИОНП (В). Репрезентативные биопсийные изображения передних тканей шейки матки крыс, включая ПГ, щитовидную железу, трахею и гортань при инъекции до (C) и после инъекции IONPs (D). Дополнительные изображения были опубликованы в нашем предыдущем исследовании15. Сокращения: PG = паращитовидные железы; IONPs = наночастицы оксида железа; IONP10 = ИОНП диаметром 10 нм; шкала в сантиметрах (см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Интраоперационная идентификация ПГ с усилением ИОНП. Репрезентативные изображения необработанных (А) и ИОНП-инъекционных (В) долей щитовидной железы крыс при до и после инъекции ИОНП. Эффективность идентификации ПГ, усиленной ИОНП, стабильна в воспроизводимой при инъекции (D) до (C) и после инъекции ИОНП ( D). Сокращения: PG = паращитовидная железа; IONPs = наночастицы оксида железа; IONP10 = IONP диаметром 10 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гистологический анализ щитовидной железы, вводимой в ИОНП, и ее микроокружения. (A) Репрезентативные ex vivo фотографии передних тканей шейки матки крыс при инъекции после ИОНП. (B) Репрезентативные H&E-окрашенные изображения крысы PG. Шкала шкалы = 50 мкм. (C) Увеличенное изображение пунктирной красной рамки на панели B. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы демонстрируем метод отрицательной визуализации ПГ крыс с использованием черных ИОНП, которые вводились локально в центр щитовидной железы и диффундировали внутри щитовидной железы, но не ПГ. Это позволяет четко идентифицировать ПГ невооруженным глазом без помощи какого-либо микроскопа. Хотясообщалось о трансгенных мышах с зеленым флуоресцентным белком, селективно экспрессируемым в ПГ, модель, описанная в этой статье, более проста в исполнении. Это занимает всего ~ 1 мин на крысу после инъекции, и четкую разницу между щитовидной железой и ПГ можно наблюдать невооруженным глазом.
Кроме того, еще одним преимуществом этой модели является то, что стоимость и эксплуатационные трудности для этой модели крыс значительно ниже, чем для моделей крупных животных (например, собак12), используемых в настоящее время в доклинических исследованиях для оценки новых методов идентификации ПГ. Средняя стоимость SD-крысы близка к стоимости мыши BALB/C, которая более чем в 30 раз дешевле собаки. Это недорогое преимущество модели крыс позволяет расширять число субъектов и повторять тесты в доклинических исследованиях, что трудно с моделями крупных животных. Между тем, типичная масса тела крысы SD составляет 300-350 г, что также более чем в 66 раз легче, чем у собаки (22-23 кг)14.
Такая большая разница в массе тела значительно снижает сложность операции в модели крысы по сравнению с моделями крупных животных, поскольку выполнение тиреоидэктомии на крупных животных, таких как собаки, требует более сложных процедур анестезии и хирургии, что делает ее более сложной и технически сложной. Требование к хирургии (требуются базовые хирургические навыки) создает ограничение для этой модели. ИОНП, использованные в этом исследовании, показали отличную биобезопасность и биоразлагаемость, как сообщалось ранее15. В конечном счете, мы надеемся, что этот метод негативной визуализации ПГ крыс с использованием ИОНП может обеспечить простую и эффективную модель на животных для доклинических исследований, включающих идентификацию ПГ, тем самым способствуя разработке новых методов идентификации ПГ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.G. и W.Z. являются соавторами патентной заявки, поданной Онкологической больницей Университета Китайской академии наук (Zhejiang Cancer Hospital) на основе проекта. Другие авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC) (82172598), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян, Китай (LZ22H310001), Проектом по подготовке талантов в области здравоохранения 551 Комиссии по здравоохранению провинции Чжэцзян, Китай, и Проектом медицинских и медицинских наук и технологий провинции Чжэцзян, Китай (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
- Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
- Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
- Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
- Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
- Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
- Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127 (2019).
- Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702 (2020).
- Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
- Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
- Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
- Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
- Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
- Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
- Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
- Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087 (2022).
