Summary
Até o momento, o desenvolvimento de métodos de identificação da glândula paratireoide (PG) é limitado pela falta de modelos animais na pesquisa pré-clínica. Aqui, estabelecemos um modelo de rato simples e eficaz para imagens de PG intraoperatórias e avaliamos sua eficácia usando nanopartículas de óxido de ferro como um novo agente de contraste PG.
Abstract
A identificação da glândula paratireoide (PG) é uma necessidade crítica não atendida na tireoidectomia. A identificação do PG é um desafio na cirurgia da tireoide, pois é semelhante em cor à glândula tireoide. A falta de modelos animais eficazes na pesquisa pré-clínica é uma grave limitação para o desenvolvimento de técnicas de identificação de PG. Este protocolo permite o estabelecimento de um modelo de rato simples e eficaz para a identificação de PG. Neste modelo, as nanopartículas de óxido de ferro preto (IONPs) são injetadas localmente na glândula tireoide e rapidamente difundidas dentro da glândula tireoide, mas não no PG. Um PG corado negativamente e uma glândula tireoide positivamente corada podem ser facilmente identificados a olho nu sem a necessidade de microscópios externos. A posição do PG pode ser identificada pelo aumento do contraste de cores entre a glândula tireoide e o PG, com base na cor dos IONPs pretos. Este modelo de rato é de baixo custo e conveniente para a identificação de PG, e os IONPs são um novo agente de contraste PG.
Introduction
A glândula paratireoide (PG) é uma pequena glândula endócrina de forma oval localizada no pescoço de humanos e outros vertebrados, que produzem e secretam hormônios paratireoidianos para regular e equilibrar os níveis de cálcio e fósforo no sangue e nos ossos1. Os seres humanos geralmente têm dois pares de PG localizados atrás dos lobos da glândula tireoide em locais variáveis; o tamanho do PG humano normalmente mede 6 mm x 4 mm x 2 mm, com um peso de aproximadamente 35-40 mg2. A remoção ou dano do PG causa hipoparatireoidismo (HP), um distúrbio endócrino caracterizado por hipocalcemia e níveis baixos ou indetectáveis de hormônios paratireoidianos, que causam uma ampla gama de sintomas, desde espasmos semelhantes a cãibras a dentes malformados e doenças renais crônicas. Algumas dessas complicações são fatais (por exemplo, insuficiência cardíaca e convulsão)3,4,5; assim, PG é essencial na regulação do metabolismo do corpo e sustentação da vida.
A HP é uma das complicações mais comuns após a cirurgia do colo anterior, principalmente na tireoidectomia, um tratamento curativo bem estabelecido para o câncer de tireoide, que é o câncer endócrino mais comum em todo o mundo 6,7. A HP pós-tireoidectomia é predominantemente causada por trauma direto, isquemia ou remoção do PG em cirurgia devido a uma grave falta de capacidade de discriminar de forma confiável o PG dos lobos da glândula tireoide e outros tecidos circundantes (por exemplo, linfonodos e partículas de gordura periféricas) em tempo real na sala de cirurgia. Em 2021, Barrios et al. relataram uma taxa média de mis-section de PG de 22,4% em 1.114 casos de tireoidectomia, e até mesmo cirurgiões experientes que tinham uma taxa de erro mínima de 7,7%8. Tais altas taxas de mis-section de PG são consistentes com outros relatos semelhantes 9,10,11. Assim, a paratireoidectomia incorreta é um fator de risco independente para HP pós-operatória transitória e permanente.
O desenvolvimento de métodos eficazes de identificação intraoperatória de PG é a chave para abordar essa necessidade médica crítica não atendida; no entanto, tem sido severamente limitada pela falta de modelos animais na pesquisa pré-clínica. Até o momento, a maioria das investigações intraoperatórias de identificação de PG tem sido realizada em pacientes humanos e animais de grande porte (por exemplo, cães)12, que são caros e difíceis de receber aprovação ética, expandir o número de sujeitos e repetir os testes. Enquanto isso, o rato, o modelo de vertebrado mais comumente usado em pesquisas biológicas, tem PG extremamente pequeno, com um tamanho inferior a 1 mm13. Devido a essa limitação, os modelos de PG de camundongos raramente têm sido utilizados em pesquisas de identificação de PG intraoperatórias.
Este artigo relata o estabelecimento de um modelo de rato simples, direto e eficaz para estudos de identificação de PG intraoperatórios. Investigamos o uso de ratos nativos de Sprague-Dawley (SD) sem modificações cirúrgicas ou engenharia genética como um modelo animal confiável para testar um agente de contraste de imagem PG, IONPs, em uma cirurgia de tireoidectomia. Este modelo de rato demonstra uma estrutura fisiológica altamente semelhante de PG e do microambiente circundante ao dos seres humanos, e o tamanho do PG de rato é grande o suficiente para ser detectado visualmente em comparação com os de camundongos. A maioria dos ratos tem um PG em cada lado da glândula tireoide. A simplicidade e a eficácia deste modelo de rato foram demonstradas através da realização de imagens PG intraoperatórias com IONP na cirurgia de tireoidectomia.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Instituto de Medicina Básica e Câncer da Academia Chinesa de Ciências. Esta é uma cirurgia de não-sobrevivência.
1. Animal
- Use uma rata SD fêmea de 6-8 semanas de idade, pesando 250 g, para imagens de PG intraoperatórias.
2. Anestesia
- Ligue a máquina de anestesia.
- Antes de começar, certifique-se de que o nível de isoflurano esteja cheio no vaporizador de anestesia. Em seguida, ligue o oxigênio e defina a taxa de fluxo para 0,4-0,8 L / min. Induzir anestesia com isoflurano a 3-5% e manter a 2% de isoflurano (taxa de fluxo: 0,4-0,8 L/min).
- Coloque o rato SD na caixa da máquina de anestesia e selecione o modelo de canal para iniciar a anestesia animal.
- Observe a atividade do rato na caixa. Quando o rato entrar em coma, mova-o para o cone do nariz para manter a anestesia (posição supina inconsciente sem reflexo de dor e reflexo corneano).
- Use a máscara de anestesia para cobrir o nariz do rato e mude a máquina de anestesia para o modo Máscara para manter o animal sob anestesia durante a cirurgia.
3. Postura e fixação
- Transfira o rato anestesiado para uma cortina cirúrgica em uma mesa de cirurgia cirúrgica. Coloque uma almofada de aquecimento pré-aquecida sob o animal para sustentar a temperatura corporal do animal durante a cirurgia.
- Use elásticos para fixar os membros do rato à mesa de operação. Coloque um travesseiro cilíndrico feito de cortina sob o ombro do rato para inclinar a cabeça para trás, expondo completamente a área do pescoço.
- Aplique pomada de lágrimas artificiais em ambos os olhos do rato para evitar a secura durante a anestesia.
4. Depilação
- Aplique creme depilatório na área do pescoço: até o espaço submandibular, até o processo xifoide e, em ambos os lados, para o exterior do músculo esternocleidomastoideo.
- Após 3 min, limpe suavemente o cabelo e o creme depilatório com um lenço de papel.
5. Esterilização
- Use uma bola de algodão Iodophor para desinfetar a área de operação 3 vezes do meio do pescoço para a área circundante. Apenas desinfete a área da qual o cabelo foi removido.
6. Colocação cirúrgica de cortinas
- Use uma cortina cirúrgica para cobrir a área de operação do pescoço do rato. Mantenha o orifício da cortina cirúrgica alinhado com a área de desinfecção do animal.
7. Incisão
- Confirme o plano cirúrgico da anestesia através da falta de um reflexo de pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Em seguida, encaixe a lâmina no bisturi e use o bisturi para fazer uma incisão longitudinal na linha média anterior do pescoço do rato. Certifique-se de que o comprimento da incisão é de aproximadamente 5 cm e apenas na derme.
8. Dissecção do tecido subcutâneo do músculo cervical anterior
- Levante a pele ao longo de ambos os lados da incisão.
- Use uma tesoura para cortar longitudinalmente ao longo da linha alba cervical.
- Use fórceps para separar o músculo esterno-hióideo e o músculo esternotireoide.
9. Fixe os músculos anteriores do pescoço em ambos os lados
- Use pinça vascular para prender o músculo esterno-hióideo separado e o músculo esternotireoidiano na frente do pescoço e puxe o tecido pinçado para fora.
- Use um afastador ou a agulha para passar a sutura (3-0#) através do tecido pinçado, fazer um nó e fixar a sutura à cortina cirúrgica da mesa de operação.
10. Localização da glândula tireoide
- Localize a cartilagem tireoidiana e a cartilagem cricoide como o limite superior na área de operação. Identifique a cartilagem tireoidiana com base em sua forma de escudo e a cartilagem cricoide com base em sua forma de anel.
- Localize a traqueia como o limite inferior na área de operação. Procure a traqueia na frente e no meio do pescoço, com base em sua forma de anel de cartilagem tubular.
- Localize a glândula tireoide entre os limites superior e inferior - uma glândula vermelha na forma de uma borboleta no lado oposto da traqueia.
11. Identificação visual do PG
- Localize o PG nos lados superior e externo da glândula tireoide. Procure dois PG em uma forma fusiforme de cerca de 1,2-2 mm de comprimento e 1,0-1,5 mm de largura que são avermelhados, mas mais leves do que a glândula tireoide circundante com um certo limite.
- Tire uma fotografia frontal do PG com a traqueia, tireoide e laringe para comparar quantitativamente os efeitos do IONP antes e após a injeção.
- Disseque a parte de trás do esôfago e, em seguida, use o afastador para expor o lado direito do PG. Tire uma fotografia do lado direito do PG com a glândula tireoide e traqueia.
- Troque o afastador para expor o lado oposto do PG e tire uma fotografia do lado esquerdo deles com a glândula tireoide e a traqueia.
12. Injeção de tireoide dos IONPs
- Use uma seringa de insulina para injetar localmente 10 μL de suspensão de IONPs (20 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato) no centro da glândula tireoide. Pressione suavemente o local de injeção com gaze durante 5 s.
13. Identificação do PG após injeção de IONPs
- Após a injeção, observe a rápida difusão dos IONPs dentro das glândulas tireoides, mas não do PG, pois mancha negativamente o PG e os diferencia da tireoide circundante.
- Tire uma fotografia frontal do PG manchado negativamente juntamente com a traqueia, glândula tireoide e laringe.
- Tire fotografias do lado esquerdo e direito do PG manchado negativamente usando os mesmos procedimentos mencionados acima.
14. Ressecção da garganta e traqueia com a glândula tireoide e PG
- Uma vez que os ratos tenham inalado o excesso de isoflurano (isoflurano a 5% por mais de 5 min) e estejam sob anestesia profunda, eutanasie-os por injeção intracardíaca de 0,5 mL de solução saturada de cloreto de potássio.
- Postmortem, remova a garganta, traqueia, glândula tireoide e PG.
- Sob um exaustor, coloque a garganta, a traqueia, a glândula tireoide e os espécimes de PG removidos em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h.
15. Estudos histopatológicos
- Desidrate os tecidos e incorpore-os em parafina. Corte em seções de 5 μm de espessura. Asse as secções a 37 °C num forno durante a noite e a 65 °C durante 1 h.
- Coloração dos cortes com hematoxilina e eosina (H&E) após lavagem 3 x 5 min com álcool gradiente de 75%, 95%, 100% e lavagem com água à temperatura ambiente.
- Peça aos patologistas que examinem as seções coradas por H & E sob um microscópio de luz.
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Representative Results
Neste modelo animal, incisamos cirurgicamente o pescoço de um rato SD para expor a traqueia, a laringe e os tecidos circundantes. Em seguida, a glândula tireoide estava visualmente localizada em ambos os lados da traqueia; é em forma de borboleta e aproximadamente 3 mm x 5 mm de tamanho. Um par de PG geralmente está localizado na parte superior da glândula tireoide, e sua cor é muito semelhante à dos lobos da glândula tireoide, tornando extremamente difícil distingui-los a olho nu (Figura 1).
Após a injeção, o meio de contraste (Figura 1 e Figura 2), os IONPs, difundem-se prontamente dentro da glândula tireoide e a mancham de preto, mas não podem se infiltrar no PG devido à sua alta densidade tecidual. A distribuição desequilibrada dos IONPs entre o PG e a glândula tireoide produz um contraste marcante, que pode ser facilmente visualizado a olho nu sem a necessidade de instrumentos externos. A Figura 2 mostra imagens representativas de PG coradas negativamente por IONPs na tireoide esquerda do rato, nas quais o contraste entre o PG e a glândula tireoide foi notável, e o tamanho do PG do rato foi determinado em aproximadamente 2 mm x 1 mm.
Postmortem, laringe de rato e traqueia, esôfago, tireoide e PG adjacentes foram ressecados para coloração histopatológica. Cortes seriados do tecido contendo PG foram obtidos para realizar a coloração H&E. Essas imagens coradas por H&E (Figura 3) revelaram que os PG são enriquecidos com células principais estreitamente alinhadas, enquanto a glândula tireoide apresenta muitos lúmens soltos, indicando densidade tecidual muito menor.
Figura 1: A estrutura fisiológica do PG e seu microambiente. Ilustração esquemática de PG humano e glândula tireoide na injeção pré (A) e pós-IONPs (B). Imagens representativas de biópsia de tecidos cervicais anteriores de ratos, incluindo PG, glândula tireoide, traqueia e laringe na pré (C) e pós-injeção de IONPs (D). Imagens adicionais foram publicadas em nosso estudo anterior15. Abreviaturas: PG = glândulas paratireoides; IONPs = nanopartículas de óxido de ferro; IONP10 = IONPs de 10 nm de diâmetro; a escala é em centímetros (cm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação de PG aprimorada por IONPs intraoperatórias. Imagens representativas de lobos da glândula tireoide de ratos não tratados (A) e injetados (B) com IONPs no pré e pós-injeção de IONPs. A eficácia da identificação de PG aprimorada por IONPs é consistente em reprodutível na pré (C) e pós-injeção de IONPs (D). Abreviaturas: PG = glândula paratireoide; IONPs = nanopartículas de óxido de ferro; IONP10 = IONPs de 10 nm de diâmetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise histológica de uma glândula tireoide injetada em IONPs e seu microambiente . (A) Fotografias ex vivo representativas de tecidos cervicais anteriores de ratos após a injeção de IONPs. (B) Imagens representativas coradas por H&E de ratos PG. Barra de escala = 50 μm. (C) Imagem ampliada da caixa vermelha tracejada no painel B. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Demonstramos uma técnica de imagem negativa guiada por IONPs de PG de ratos usando IONPs pretos, que foram injetados localmente no centro da glândula tireoide e difundidos dentro da glândula tireoide, mas não no PG. Permite a identificação clara do PG a olho nu sem o auxílio de qualquer microscópio. Embora camundongos transgênicos com proteína verde fluorescente seletivamente expressa no PG tenham sido relatados13, o modelo descrito neste artigo é mais simples de executar. Leva apenas ~ 1 min por rato após a injeção, e uma clara diferença entre a glândula tireoide e PG pode ser observada a olho nu.
Além disso, outra vantagem deste modelo é que o custo e a dificuldade operacional são consideravelmente menores para este modelo de rato do que para modelos animais de grande porte (por exemplo, cães12) atualmente utilizados em estudos pré-clínicos para avaliar novos métodos de identificação de PG. O custo médio de um rato SD é próximo ao de um rato BALB/C, que é mais de 30 vezes mais barato do que um cão. Essa vantagem de baixo custo do modelo de rato permite expandir o número de sujeitos e repetir testes em pesquisas pré-clínicas, o que é difícil com modelos animais de grande porte. Enquanto isso, o peso corporal típico de um rato SD é de 300-350 g, que também é mais de 66 vezes mais leve que o de um cão (22-23 kg)14.
Uma diferença de peso corporal tão grande reduz tremendamente a dificuldade de operação no modelo de rato em relação a modelos animais de grande porte, uma vez que a realização de tireoidectomia em animais de grande porte, como cães, requer procedimentos anestésicos e cirúrgicos mais complicados, tornando-a mais difícil e tecnicamente desafiadora. A exigência de cirurgia (habilidades cirúrgicas básicas são necessárias) representa uma limitação para este modelo. Os IONPs utilizados neste estudo mostraram excelente biossegurança e biodegradabilidade, como relatado anteriormenteanteriormente 15. Em última análise, esperamos que este método de imagem negativa de PG de ratos usando IONPs possa fornecer um modelo animal simples e eficaz para estudos pré-clínicos envolvendo identificação de PG, facilitando assim o desenvolvimento de novas técnicas de identificação de PG.
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Disclosures
P.G. e W.Z. são co-inventores de um pedido de patente apresentado pelo Hospital do Câncer da Universidade da Academia Chinesa de Ciências (Zhejiang Cancer Hospital) com base no projeto. Os demais autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC) (82172598), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang, China (LZ22H310001), o 551 Projeto de Treinamento de Talentos em Saúde da Comissão de Saúde da Província de Zhejiang, China, e o Projeto de Ciência e Tecnologia Médica e de Saúde da Província de Zhejiang, China (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
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