Summary
Ad oggi, lo sviluppo di metodi di identificazione della ghiandola paratiroidea (PG) è limitato dalla mancanza di modelli animali nella ricerca preclinica. Qui, stabiliamo un modello di ratto semplice ed efficace per l'imaging PG intraoperatorio e valutiamo la sua efficacia utilizzando nanoparticelle di ossido di ferro come nuovo agente di contrasto PG.
Abstract
L'identificazione della ghiandola paratiroidea (PG) è un bisogno critico insoddisfatto nella tiroidectomia. L'identificazione del PG è impegnativa nella chirurgia della tiroide in quanto è di colore simile alla ghiandola tiroidea. La mancanza di modelli animali efficaci nella ricerca preclinica è una grave limitazione per lo sviluppo di tecniche di identificazione PG. Questo protocollo consente di stabilire un modello di ratto semplice ed efficace per l'identificazione PG. In questo modello, le nanoparticelle di ossido di ferro nero (IONP) vengono iniettate localmente nella ghiandola tiroidea e si diffondono rapidamente all'interno della ghiandola tiroidea ma non del PG. Un PG colorato negativamente e una ghiandola tiroidea colorata positivamente possono essere facilmente identificati ad occhio nudo senza richiedere microscopi esterni. La posizione del PG può essere identificata aumentando il contrasto cromatico tra la ghiandola tiroidea e il PG, in base al colore degli IONP neri. Questo modello di ratto è a basso costo e conveniente per l'identificazione PG, e gli IONP sono un nuovo agente di contrasto PG.
Introduction
La ghiandola paratiroidea (PG) è una piccola ghiandola endocrina di forma ovale situata nel collo degli esseri umani e di altri vertebrati, che producono e secernono ormoni paratiroidei per regolare e bilanciare i livelli di calcio e fosforo nel sangue e nelle ossa1. Gli esseri umani di solito hanno due paia di PG situati dietro i lobi della ghiandola tiroidea in posizioni variabili; la dimensione del PG umano misura tipicamente 6 mm x 4 mm x 2 mm, con un peso di circa 35-40 mg2. La rimozione o il danneggiamento del PG provoca ipoparatiroidismo (HP), un disturbo endocrino caratterizzato da ipocalcemia e livelli bassi o non rilevabili di ormoni paratiroidei, che causano una vasta gamma di sintomi da spasmi simili a crampi a denti malformati a malattie renali croniche. Alcune di queste complicanze sono fatali (ad esempio, insufficienza cardiaca e convulsioni)3,4,5; pertanto, PG è essenziale per regolare il metabolismo del corpo e sostenere la vita.
L'HP è una delle complicanze più comuni dopo la chirurgia del collo anteriore, specialmente nella tiroidectomia, un trattamento curativo ben consolidato per il cancro della tiroide, che è il tumore endocrino più comune in tutto il mondo 6,7. L'HP post-tiroidectomia è causata prevalentemente da traumi diretti, ischemia o rimozione del PG in chirurgia a causa di una grave mancanza di capacità di discriminare in modo affidabile il PG dai lobi delle ghiandole tiroidee e da altri tessuti circostanti (ad esempio, linfonodi e particelle di grasso periferico) in tempo reale nella sala operatoria. Nel 2021, Barrios et al. hanno riportato un tasso medio di resezione da PG del 22,4% all'interno di 1.114 casi di tiroidectomia e persino chirurghi esperti che avevano un tasso di errore minimo del 7,7%8. Tali alti tassi di errori di sezione PG sono coerenti con altri rapporti simili 9,10,11. Pertanto, la paratiroidectomia errata è un fattore di rischio indipendente per l'HP postoperatoria transitoria e permanente.
Lo sviluppo di efficaci metodi di identificazione intraoperatoria della PG è la chiave per affrontare questa esigenza medica critica insoddisfatta; Tuttavia, è stato gravemente limitato dalla mancanza di modelli animali nella ricerca preclinica. Ad oggi, la maggior parte delle indagini di identificazione intraoperatoria di PG sono state eseguite su pazienti umani e animali di grossa taglia (ad esempio, cani)12, che sono costose e difficili da ricevere l'approvazione etica, espandere il numero di soggetti e ripetere i test. Nel frattempo, il topo, il modello di vertebrato più comunemente usato nella ricerca biologica, ha PG estremamente piccolo, con una dimensione inferiore a 1 mm13. A causa di questa limitazione, i modelli di PG murino sono stati raramente utilizzati nella ricerca sull'identificazione intraoperatoria della PG.
Questo articolo riporta la creazione di un modello di ratto semplice, diretto ed efficace per gli studi di identificazione intraoperatoria della PG. Abbiamo studiato l'uso di ratti nativi di Sprague-Dawley (SD) senza alcuna modifica chirurgica o ingegneria genetica come modello animale affidabile per testare un agente di contrasto di imaging PG, IONP, in un intervento chirurgico di tiroidectomia. Questo modello di ratto dimostra una struttura fisiologica molto simile del PG e del microambiente circostante a quella degli esseri umani, e la dimensione del PG del ratto è abbastanza grande da essere rilevata visivamente rispetto a quelle dei topi. La maggior parte dei ratti ha un PG su ciascun lato della ghiandola tiroidea. La semplicità e l'efficacia di questo modello di ratto sono state dimostrate eseguendo l'imaging PG intraoperatorio potenziato da IONP nella chirurgia della tiroidectomia.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Istituto di medicina di base e cancro, Accademia cinese delle scienze. Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza.
1. Animale
- Utilizzare un ratto SD femmina di 6-8 settimane, del peso di 250 g, per l'imaging PG intraoperatorio.
2. Anestesia
- Accendi la macchina per anestesia.
- Prima di iniziare, assicurarsi che il livello di isoflurano sia pieno nel vaporizzatore per anestesia. Quindi, accendere l'ossigeno e impostare la portata su 0,4-0,8 L / min. Indurre l'anestesia con isoflurano al 3-5% e mantenere al 2% isoflurano (portata: 0,4-0,8 L/min).
- Metti il ratto SD nella scatola della macchina per anestesia e seleziona il modello di canale per iniziare l'anestesia animale.
- Osserva l'attività del ratto nella scatola. Quando il ratto cade in coma, spostarlo sul cono del naso per mantenere l'anestesia (posizione supina inconscia senza riflesso del dolore e riflesso corneale).
- Utilizzare la maschera per anestesia per coprire il naso del ratto e passare la macchina per anestesia in modalità maschera per mantenere l'animale sotto anestesia durante l'intervento chirurgico.
3. Postura e fissazione
- Trasferire il ratto anestetizzato su un drappo chirurgico su un tavolo operatorio. Posizionare una piastra riscaldante preriscaldata sotto l'animale per sostenere la temperatura corporea dell'animale durante l'intervento chirurgico.
- Utilizzare elastici per fissare gli arti del topo al tavolo operatorio. Posizionare un cuscino cilindrico fatto di drappo sotto la spalla del topo per appoggiare la testa all'indietro, esponendo completamente l'area del collo.
- Applicare un unguento di lacrime artificiali su entrambi gli occhi del ratto per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
4. Depilazione
- Applicare la crema depilatoria sulla zona del collo: fino allo spazio sottomandibolare, fino al processo xifoideo e su entrambi i lati all'esterno del muscolo sternocleidomastoideo.
- Dopo 3 minuti, pulire delicatamente i capelli e la crema depilatoria con un fazzoletto.
5. Sterilizzazione
- Utilizzare un batuffolo di cotone Iodophor per disinfettare l'area operativa 3 volte dal centro del collo all'area circostante. Disinfettare solo l'area da cui sono stati rimossi i capelli.
6. Posa del drappo chirurgico
- Utilizzare un drappo chirurgico per coprire l'area operativa del collo del ratto. Mantenere il foro del drappo chirurgico allineato con l'area di disinfezione dell'animale.
7. Incisione
- Confermare il piano chirurgico dell'anestesia attraverso la mancanza di un riflesso del pizzico del dito prima di effettuare l'incisione. Quindi, inserire la lama nel bisturi e utilizzare il bisturi per fare un'incisione longitudinale nella linea mediana anteriore del collo del ratto. Assicurarsi che la lunghezza dell'incisione sia di circa 5 cm e solo nel derma.
8. Dissezione del tessuto sottocutaneo dal muscolo cervicale anteriore
- Sollevare la pelle lungo entrambi i lati dell'incisione.
- Utilizzare una forbice per tagliare longitudinalmente lungo la linea alba cervicalis.
- Utilizzare una pinza per separare il muscolo sternoioideo e il muscolo sternotiroideo.
9. Fissare i muscoli anteriori del collo su entrambi i lati
- Utilizzare una pinza vascolare per bloccare il muscolo sternoioideo separato e il muscolo sternotiroideo davanti al collo e tirare il tessuto bloccato all'esterno.
- Utilizzare un divaricatore o l'ago per far passare la sutura (3-0 #) attraverso il tessuto bloccato, fare un nodo e fissare la sutura al drappo chirurgico del tavolo operatorio.
10. Localizzazione della ghiandola tiroidea
- Individuare la cartilagine tiroidea e la cartilagine cricoide come limite superiore nell'area operativa. Identificare la cartilagine tiroidea in base alla sua forma a scudo e la cartilagine cricoide in base alla sua forma ad anello.
- Individuare la trachea come limite inferiore nell'area operativa. Cerca la trachea nella parte anteriore e centrale del collo, in base alla sua forma tubolare ad anello cartilagineo.
- Individuare la ghiandola tiroidea tra i confini superiore e inferiore, una ghiandola rossa a forma di farfalla sul lato opposto della trachea.
11. Identificazione visiva del PG
- Individuare il PG sui lati superiore ed esterno della ghiandola tiroidea. Cerca due PG in una forma fusiforme di circa 1,2-2 mm di lunghezza e 1,0-1,5 mm di larghezza che sono rossastri ma più leggeri della ghiandola tiroidea circostante con un certo limite.
- Scatta una fotografia frontale del PG con la trachea, la tiroide e la laringe per confrontare quantitativamente gli effetti di IONP prima e dopo l'iniezione.
- Sezionare la parte posteriore dell'esofago, quindi utilizzare il divaricatore per esporre il lato destro del PG. Scatta una fotografia sul lato destro del PG con la ghiandola tiroidea e la trachea.
- Scambia il divaricatore per esporre il lato opposto del PG e scatta una fotografia sul lato sinistro di loro con la ghiandola tiroidea e la trachea.
12. Iniezione tiroidea degli IONP
- Utilizzare una siringa da insulina per iniettare localmente 10 μL di sospensione di IONPs (20 mg/ml in soluzione salina tamponata fosfato) nel centro della ghiandola tiroidea. Premere delicatamente il sito di iniezione con una garza per 5 s.
13. Identificazione del PG dopo iniezione di IONPs
- Dopo l'iniezione, osservare la rapida diffusione degli IONP all'interno delle ghiandole tiroidee ma non del PG, poiché colora negativamente il PG e li differenzia dalla tiroide circostante.
- Scatta una fotografia frontale del PG colorato negativamente insieme alla trachea, alla ghiandola tiroidea e alla laringe.
- Scatta fotografie sul lato sinistro e destro del PG colorato negativamente usando le stesse procedure menzionate sopra.
14. Resezione della gola e della trachea con la ghiandola tiroidea e PG
- Una volta che i ratti hanno inalato isoflurano in eccesso (isoflurano al 5% per più di 5 minuti) e sono sotto anestesia profonda, eutanasizzarli mediante iniezione intracardiaca di 0,5 ml di soluzione satura di cloruro di potassio.
- Postmortem, rimuovere la gola, la trachea, la ghiandola tiroidea e PG.
- Sotto una cappa aspirante, posizionare la gola, la trachea, la ghiandola tiroidea e i campioni di PG rimossi in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore.
15. Studi di istopatologia
- Disidratare i tessuti e incorporarli nella paraffina. Tagliare in sezioni spesse 5 μm. Cuocere le sezioni a 37 °C in forno per una notte e a 65 °C per 1 ora.
- Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina (H & E) dopo il lavaggio 3 x 5 min con alcool sfumato al 75%, 95%, 100% e lavaggio con acqua a temperatura ambiente.
- Chiedi ai patologi di esaminare le sezioni colorate con H & E al microscopio ottico.
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Representative Results
In questo modello animale, abbiamo inciso chirurgicamente il collo di un ratto SD per esporre la trachea, la laringe e i tessuti circostanti. Quindi, la ghiandola tiroidea era visivamente posizionata su entrambi i lati della trachea; È a forma di farfalla e ha dimensioni di circa 3 mm x 5 mm. Una coppia di PG si trova solitamente nella parte superiore della ghiandola tiroidea e il loro colore è molto simile a quello dei lobi delle ghiandole tiroidee, rendendo estremamente difficile distinguerli ad occhio nudo (Figura 1).
Dopo l'iniezione, l'agente di contrasto (Figura 1 e Figura 2), gli IONP, si diffondono facilmente all'interno della ghiandola tiroidea e la colorano di nero, ma non possono infiltrarsi nel PG a causa della loro elevata densità tissutale. La distribuzione squilibrata degli IONP tra il PG e la ghiandola tiroidea produce un contrasto sorprendente, che può essere facilmente visualizzato ad occhio nudo senza richiedere strumenti esterni. La figura 2 mostra immagini rappresentative di PG colorate negativamente da IONP nella tiroide sinistra del ratto, in cui il contrasto tra il PG e la ghiandola tiroidea era notevole, e la dimensione del PG del ratto è stata determinata essere di circa 2 mm x 1 mm.
Postmortem, la laringe del ratto e la trachea, l'esofago, la tiroide e il PG adiacenti sono stati resecati per la colorazione istopatologica. Sono state ottenute sezioni seriali del tessuto contenente PG per eseguire la colorazione H&E. Queste immagini colorate con H & E (Figura 3) hanno rivelato che i PG sono arricchiti con cellule principali strettamente allineate, mentre la ghiandola tiroidea presenta molti lumi sciolti che indicano una densità tissutale molto più bassa.
Figura 1: La struttura fisiologica dei PG e il loro microambiente. Illustrazione schematica della PG umana e della ghiandola tiroidea a iniezione pre- (A) e post-IONPs (B). Immagini biopsiche rappresentative dei tessuti cervicali anteriori del ratto, tra cui PG, ghiandola tiroidea, trachea e laringe prima (C) e post-iniezione di IONP (D). Ulteriori immagini sono state pubblicate nel nostro precedente studio15. Abbreviazioni: PG = ghiandole paratiroidi; IONPs = nanoparticelle di ossido di ferro; IONP10 = IONP di 10 nm di diametro; La scala è in centimetri (cm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Identificazione intraoperatoria di PG potenziata da IONPs. Immagini rappresentative dei lobi delle ghiandole tiroidee di ratto non trattati (A) e iniettati con IONPs (B) al momento dell'iniezione pre e post-IONPs. L'efficacia dell'identificazione di PG potenziata con IONPs è coerente nella riproducibilità all'iniezione pre- (C) e post-IONPs (D). Abbreviazioni: PG = ghiandola paratiroidea; IONPs = nanoparticelle di ossido di ferro; IONP10 = IONP di 10 nm di diametro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi istologica di una ghiandola tiroidea iniettata con IONPs e del suo microambiente . (A) Fotografie rappresentative ex vivo di tessuti cervicali anteriori di ratto all'iniezione post-IONPs. (B) Immagini rappresentative macchiate con H&E del ratto PG. Barra della scala = 50 μm. (C) Immagine ingrandita del riquadro rosso tratteggiato nel pannello B. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Dimostriamo una tecnica di imaging negativo guidata da IONP di ratto PG utilizzando IONP neri, che sono stati iniettati localmente nel centro della ghiandola tiroidea e diffusi all'interno della ghiandola tiroidea ma non nel PG. Consente una chiara identificazione del PG ad occhio nudo senza l'ausilio di alcun microscopio. Sebbene siano stati riportati topi transgenici con proteina fluorescente verde espressa selettivamente nel PG13, il modello descritto in questo articolo è più semplice da eseguire. Ci vuole solo ~ 1 minuto per ratto dopo l'iniezione, e una chiara differenza tra la ghiandola tiroidea e PG può essere osservata ad occhio nudo.
Inoltre, un altro vantaggio di questo modello è che il costo e la difficoltà operativa sono considerevolmente inferiori per questo modello di ratto rispetto ai modelli animali di grandi dimensioni (ad esempio, cani12) attualmente utilizzati negli studi preclinici per valutare nuovi metodi di identificazione PG. Il costo medio di un ratto SD è vicino a quello di un mouse BALB / C, che è oltre 30 volte più economico di un cane. Questo vantaggio a basso costo del modello di ratto consente di espandere il numero di soggetti e ripetere i test nella ricerca preclinica, il che è difficile con modelli animali di grandi dimensioni. Nel frattempo, il peso corporeo tipico di un ratto SD è di 300-350 g, che è anche oltre 66 volte più leggero di quello di un cane (22-23 kg)14.
Una differenza di peso corporeo così grande riduce enormemente la difficoltà operativa nel modello di ratto rispetto ai modelli animali di grandi dimensioni, poiché l'esecuzione della tiroidectomia su animali di grandi dimensioni come i cani richiede anestesia e procedure chirurgiche più complicate, rendendolo più difficile e tecnicamente impegnativo. Il requisito per la chirurgia (sono richieste competenze chirurgiche di base) pone un limite per questo modello. Gli IONP utilizzati in questo studio hanno dimostrato un'eccellente biosicurezza e biodegradabilità, come precedentemente riportato in precedenza15. In definitiva, speriamo che questo metodo di imaging negativo del PG del ratto utilizzando IONP possa fornire un modello animale semplice ed efficace per studi preclinici che coinvolgono l'identificazione di PG, facilitando così lo sviluppo di nuove tecniche di identificazione PG.
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Disclosures
P.G. e W.Z. sono co-inventori di una domanda di brevetto depositata dal Cancer Hospital dell'Università dell'Accademia cinese delle scienze (Zhejiang Cancer Hospital) sulla base del progetto. Gli altri autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82172598), dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang, Cina (LZ22H310001), dal 551 Health Talent Training Project della Health Commission della provincia di Zhejiang, in Cina, e dal Medical and Health Science and Technology Project della provincia di Zhejiang, Cina (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
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