Summary
현재까지 부갑상선 (PG) 식별 방법의 개발은 전임상 연구에서 동물 모델의 부족으로 인해 제한적입니다. 여기에서 우리는 수술 중 PG 이미징을 위한 간단하고 효과적인 쥐 모델을 설정하고 산화철 나노입자를 새로운 PG 조영제로 사용하여 그 효과를 평가합니다.
Abstract
부갑상선(PG) 식별은 갑상선 절제술에서 충족되지 않은 중요한 요구 사항입니다. PG의 식별은 갑상선과 색이 비슷하기 때문에 갑상선 수술에서 어렵습니다. 전임상 연구에서 효과적인 동물 모델의 부족은 PG 식별 기술의 개발에 심각한 한계입니다. 이 프로토콜을 사용하면 PG 식별을 위한 간단하고 효과적인 쥐 모델을 설정할 수 있습니다. 이 모델에서 흑색 산화철 나노 입자 (IONP)는 갑상선에 국부적으로 주입되고 PG가 아닌 갑상선 내에서 빠르게 확산됩니다. 음성으로 염색된 PG와 양성으로 염색된 갑상선은 외부 현미경 없이도 육안으로 쉽게 식별할 수 있습니다. PG의 위치는 검은색 IONP의 색상을 기반으로 갑상선과 PG 사이의 색상 대비를 증가시켜 식별할 수 있습니다. 이 쥐 모델은 저렴하고 PG 식별에 편리하며 IONP는 새로운 PG 조영제입니다.
Introduction
부갑상선(PG)은 인간과 다른 척추동물의 목에 위치한 작은 타원형 내분비선으로, 혈액과 뼈의 칼슘과 인 수치를 조절하고 균형을 맞추기 위해 부갑상선 호르몬을 생성하고 분비합니다1. 인간은 일반적으로 다양한 위치의 갑상선 엽 뒤에 두 쌍의 PG를 가지고 있습니다. 인간 PG의 크기는 전형적으로 6 mm x 4 mm x 2 mm이고, 무게는 대략 35-40 mg2이다. PG의 제거 또는 손상은 저칼슘혈증과 낮거나 감지할 수 없는 수준의 부갑상선 호르몬을 특징으로 하는 내분비 장애인 부갑상선 기능 저하증(HP)을 유발하여 경련과 같은 경련에서 기형 치아, 만성 신장 질환에 이르기까지 광범위한 증상을 유발합니다. 이러한 합병증 중 일부는 치명적입니다 (예 : 심부전 및 발작)3,4,5; 따라서 PG는 신체의 신진 대사를 조절하고 생명을 유지하는 데 필수적입니다.
HP는 전후 목 수술 후 가장 흔한 합병증 중 하나이며, 특히 갑상선 절제술은 전 세계적으로 가장 흔한 내분비 암 인 갑상선암에 대한 잘 확립 된 치료법입니다 6,7. 갑상선 절제술 후 HP는 수술실에서 실시간으로 갑상선 엽 및 기타 주변 조직(예: 림프절 및 말초 지방 입자)에서 PG를 안정적으로 구별하는 능력이 심각하게 부족하기 때문에 수술에서 직접적인 외상, 허혈 또는 PG 제거로 인해 주로 발생합니다. 2021년에 Barrios et al. 22.4건의 갑상선 절제술 사례에서 평균 PG 잘못된 절부 비율이 1,114%였으며 최소 오류율이 7.7%8인 숙련된 외과의도 보고했습니다. 이러한 높은 PG 오분율은 다른 유사한 보고서 9,10,11과 일치합니다. 따라서 부갑상선 절제술은 일시적이고 영구적 인 수술 후 HP의 독립적 인 위험 요소입니다.
효과적인 수술 중 PG 식별 방법을 개발하는 것은 이러한 중요한 충족되지 않은 의학적 요구를 해결하는 열쇠를 쥐고 있습니다. 그러나 전임상 연구에서 동물 모델이 부족하여 심각하게 제한되었습니다. 현재까지 대부분의 수술 중 PG 식별 조사는 인간 환자와 대형 동물(예: 개)12에 대해 수행되었으며, 이는 비용이 많이 들고 윤리적 승인을 받고 피험자 수를 늘리고 반복 검사를 받기 어렵습니다. 한편, 생물학적 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 척추 동물 모델 인 마우스는 크기가 1mm13 미만인 매우 작은 PG를 가지고 있습니다. 이러한 제한으로 인해 마우스 PG 모델은 수술 중 PG 식별 연구에서 거의 사용되지 않았습니다.
이 논문은 수술 중 PG 식별 연구를 위한 간단하고 간단하며 효과적인 쥐 모델의 확립을 보고합니다. 우리는 갑상선 절제술 수술에서 PG 영상 조영제인 IONP를 테스트하기 위한 신뢰할 수 있는 동물 모델로서 외과적 변형이나 유전 공학이 없는 토종 Sprague-Dawley(SD) 쥐의 사용을 조사했습니다. 이 쥐 모델은 PG 및 주변 미세 환경의 생리적 구조가 인간과 매우 유사하며 쥐 PG의 크기는 마우스와 비교하여 시각적으로 감지 할 수있을만큼 충분히 큽니다. 대부분의 쥐는 갑상선의 양쪽에 하나의 PG를 가지고 있습니다. 이 쥐 모델의 단순성과 효과는 갑상선 절제술 수술에서 수술 중 IONP 강화 PG 영상을 수행함으로써 입증되었습니다.
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Protocol
모든 동물 연구는 중국 과학원 기초 의학 및 암 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이것은 생존이 아닌 수술입니다.
1. 동물
- 수술 중 PG 영상을 위해 체중이 250g 인 6-8 주 된 암컷 SD 쥐를 사용하십시오.
2. 마취
- 마취기를 켭니다.
- 시작하기 전에 마취 기화기에서 이소플루란 수치가 가득 찼는지 확인하십시오. 그런 다음 산소를 켜고 유량을 0.4-0.8 L / min으로 설정하십시오. 3-5% 이소플루란으로 마취를 유도하고 2% 이소플루란(유속: 0.4-0.8L/min)으로 유지합니다.
- SD 쥐를 마취기 상자에 넣고 채널 모델을 선택하여 동물 마취를 시작합니다.
- 상자에서 쥐의 활동을 관찰하십시오. 쥐가 혼수 상태에 빠지면 코 콘으로 옮겨 마취 (통증 반사 및 각막 반사가없는 무의식적 인 앙와위 자세)를 유지하십시오.
- 마취 마스크를 사용하여 쥐의 코를 가리고 마취기를 마스크 모드로 전환하여 수술 중에 동물을 마취 상태로 유지하십시오.
3. 자세와 고정
- 마취 된 쥐를 수술 테이블의 수술 용 드레이프에 옮깁니다. 수술 중 동물의 체온을 유지하기 위해 동물 아래에 예열 된 가열 패드를 놓습니다.
- 고무 밴드를 사용하여 쥐의 팔다리를 수술대에 고정하십시오. 쥐의 어깨 아래에 드레이프로 만든 원통형 베개를 놓고 머리를 뒤로 젖히고 목 부위를 완전히 노출시킵니다.
- 마취 중 건조를 방지하기 위해 쥐의 양쪽 눈에 인공 눈물 연고를 바르십시오.
4. 제모
- 목 부위에 탈모 크림을 바르십시오 : 턱밑 공간까지, xiphoid 과정까지, 그리고 양쪽에서 흉쇄 유돌기 근육의 바깥쪽까지.
- 3 분 후 머리카락과 탈모 크림을 티슈로 부드럽게 닦습니다.
5. 살균
- Iodophor 면봉을 사용하여 목 중앙에서 주변 부위까지 수술 부위를 3 번 소독하십시오. 머리카락이 제거 된 부위 만 소독하십시오.
6. 외과 용 드레이프 놓기
- 수술 용 드레이프를 사용하여 쥐의 목 수술 부위를 덮으십시오. 수술 용 드레이프의 구멍을 동물의 소독 영역과 정렬하십시오.
7. 절개
- 절개를하기 전에 발가락 핀치 반사가 부족하여 마취 수술 평면을 확인하십시오. 그런 다음 칼날을 메스에 끼우고 메스를 사용하여 쥐 목의 앞쪽 정중선에 세로 절개를합니다. 절개 길이가 약 5cm이고 진피에만 있는지 확인하십시오.
8. 전방 자궁 경부 근육에서 피하 조직 해부
- 절개 부위의 양쪽을 따라 피부를 들어 올리십시오.
- 가위를 사용하여 선형 알바 자궁 경부를 따라 세로로 자릅니다.
- 집게를 사용하여 흉골 근육과 흉골 갑상선 근육을 분리하십시오.
9. 목 앞쪽 근육을 양쪽에 고정하십시오.
- 혈관 집게를 사용하여 목 앞에서 분리 된 스테로이드 근육과 흉골 갑상선 근육을 고정하고 고정 된 조직을 바깥쪽으로 당깁니다.
- 견인기 또는 바늘을 사용하여 봉합사 (3-0 #)를 고정 된 조직에 통과시키고 매듭을 만들고 봉합사를 수술대의 수술 용 드레이프에 고정합니다.
10. 갑상선 국소화
- 갑상선 연골과 윤상 연골을 수술 부위의 상부 경계로 찾습니다. 갑상선 연골은 방패 모양으로 식별하고 윤상 연골은 고리 모양으로 식별합니다.
- 수술 영역의 아래쪽 경계로 기관을 찾으십시오. 관 모양의 연골 고리 모양을 기준으로 목의 앞쪽과 중간에있는 기관을 찾으십시오.
- 위쪽과 아래쪽 경계 사이에 갑상선을 찾습니다-기관의 반대쪽에있는 나비 모양의 붉은 샘.
11. PG의 시각적 식별
- 갑상선의 위쪽과 바깥쪽에 PG를 찾습니다. 길이가 약 1.2-2mm, 너비가 1.0-1.5mm인 방추형 모양의 두 개의 PG를 찾으십시오.이 PG는 붉은 색을 띠지 만 특정 경계가있는 주변 갑상선보다 가볍습니다.
- 기관, 갑상선 및 후두와 함께 PG의 정면 사진을 찍어 주사 전후의 IONP 효과를 정량적으로 비교하십시오.
- 식도 뒤쪽을 해부 한 다음 견인기를 사용하여 PG의 오른쪽을 노출시킵니다. 갑상선과 기관이있는 PG의 오른쪽 사진을 찍습니다.
- 견인기를 교체하여 PG의 반대쪽을 노출시키고 갑상선과 기관으로 왼쪽 사진을 찍습니다.
12. IONP의 갑상선 주사
- 인슐린 주사기를 사용하여 10μL의 IONP 현탁액(인산염 완충 식염수 중 20mg/mL)을 갑상선 중앙에 국소 주사합니다. 주사 부위를 거즈로 5 초 동안 부드럽게 누르십시오.
13. IONPs 주입 후 PG 식별
- 주사 후 PG를 부정적으로 염색하고 주변 갑상선과 구별하기 때문에 PG가 아닌 갑상선 내에서 IONP의 빠른 확산을 관찰하십시오.
- 부정적으로 얼룩진 PG의 전면 사진을 기관, 갑상선 및 후두와 함께 찍습니다.
- 위에서 언급한 것과 동일한 절차를 사용하여 부정적으로 얼룩진 PG의 왼쪽 및 오른쪽 사진을 찍습니다.
14. 갑상선과 PG로 인후 및 기관 절제
- 쥐가 과량의 이소 플루 란 (5 분 이상 5 % 이소 플루 란)을 흡입하고 심부 마취하에 있으면 포화 염화칼륨 용액 0.5mL를 심장 내 주사하여 안락사시킵니다.
- 사후 인후, 기관, 갑상선 및 PG를 제거하십시오.
- 흄 후드 아래에서 제거된 목구멍, 기관, 갑상선 및 PG 검체를 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 동안 넣습니다.
15. 조직병리학 연구
- 조직을 탈수하고 파라핀에 묻 힙니다. 5 μm 두께의 섹션으로 자릅니다. 섹션을 오븐에서 37°C에서 밤새 굽고 65°C에서 1시간 동안 굽습니다.
- 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 75%, 95%, 100% 그래디언트 알코올로 3 x 5분 세척하고 실온에서 물 세척 후 섹션을 염색합니다.
- 병리학자들에게 H&E 염색 단면을 광학 현미경으로 검사하게 합니다.
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Representative Results
이 동물 모델에서 우리는 SD 쥐의 목을 외과 적으로 절개하여 기관, 후두 및 주변 조직을 노출했습니다. 그런 다음 갑상선은 기관의 양쪽에 시각적으로 위치했습니다. 나비 모양이며 크기는 약 3mm x 5mm입니다. 한 쌍의 PG는 일반적으로 갑상선의 상부에 위치하며 그 색은 갑상선 엽의 색과 매우 유사하여 육안으로 구별하기가 매우 어렵습니다 (그림 1).
주사 후 조영제(그림 1 및 그림 2)인 IONP는 갑상선 내에서 쉽게 확산되어 검은색으로 염색되지만 조직 밀도가 높기 때문에 PG에 침투할 수 없습니다. PG와 갑상선 사이의 IONP의 불균형 분포는 외부 기구 없이도 육안으로 쉽게 시각화할 수 있는 놀라운 대조를 생성합니다. 도 2 는 쥐의 왼쪽 갑상선에서 IONPs에 의해 음성으로 염색된 PG의 대표적인 이미지를 보여주며, PG와 갑상선 사이의 대조는 현저하였고, 쥐 PG의 크기는 대략 2mm x 1mm로 결정되었다.
사후, 쥐 후두 및 인접한 기관, 식도, 갑상선 및 PG를 조직 병리학 적 염색을 위해 절제했다. H&E 염색을 수행하기 위해 PG를 함유하는 조직의 연속 절편을 수득하였다. 이 H & E 염색 이미지 (그림 3)는 PG가 밀접하게 정렬 된 주요 세포로 풍부 한 반면, 갑상선은 훨씬 낮은 조직 밀도를 나타내는 많은 느슨한 내강을 특징으로한다는 것을 보여주었습니다.
그림 1: PG의 생리학적 구조와 미세 환경. IONPs 주입 전(A) 및 후(B)에서 인간 PG 및 갑상선의 개략도. 사전 (C) 및 IONP 주사 후 (D)에서 PG, 갑상선, 기관 및 후두를 포함한 쥐 전방 자궁 경부 조직의 대표적인 생검 이미지. 추가 이미지는 이전 연구15에 게시되었습니다. 약어 : PG = 부갑상선; 이온 = 산화철 나노 입자; IONP10 = 직경 10nm의 이온; 눈금은 센티미터 (cm) 단위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수술 중 IONP로 강화된 PG 식별. IONP 주입 전후 치료되지 않은(A) 및 IONP 주사(B) 쥐 갑상선 엽의 대표 이미지. IONPs 강화 PG 식별의 효능은 사전 (C) 및 사후 IONP 주입 (D)에서 재현 가능한 것으로 일관됩니다. 약어 : PG = 부갑상선; 이온 = 산화철 나노 입자; IONP10 = 직경 10nm의 이온. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: IONP가 주입된 갑상선과 그 미세 환경의 조직학적 분석 . (A) IONPs 주사 후 쥐 전방 자궁 경부 조직의 대표적인 생체 외 사진. (B) 쥐 PG의 대표적인 H & E 염색 이미지. 스케일 바 = 50 μm. (C) 패널 B의 파선 빨간색 상자의 확대 이미지. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 갑상선 중앙에 국부적으로 주사되고 PG가 아닌 갑상선 내에서 확산되는 검은색 IONP를 사용하여 쥐 PG의 IONP 유도 음성 영상 기술을 시연합니다. 현미경의 도움 없이 육안으로 PG를 명확하게 식별할 수 있습니다. PG에서 선택적으로 발현된 녹색 형광 단백질을 갖는 트랜스제닉 마우스가 보고되었다13, 이 논문에 기술된 모델은 수행하기가 더 간단하다. 주사 후 쥐 당 ~ 1 분 밖에 걸리지 않으며 갑상선과 PG의 명확한 차이를 육안으로 관찰 할 수 있습니다.
또한, 이 모델의 또 다른 이점은 새로운 PG 식별 방법을 평가하기 위해 전임상 연구에서 현재 사용되는 대형 동물 모델(예를 들어, 개(12))에 대한 것보다 이 래트 모델에 대한 비용 및 조작상의 어려움이 상당히 낮다는 것이다. SD 쥐의 평균 비용은 BALB / C 마우스의 평균 비용에 가깝고 개보다 30 배 이상 저렴합니다. 쥐 모델의 이러한 저비용 이점은 전임상 연구에서 피험자 수를 확장하고 반복 테스트를 허용하지만 대형 동물 모델에서는 어렵습니다. 한편, SD 쥐의 일반적인 체중은 300-350g으로 개(22-23kg)보다 66배 이상 가볍습니다14.
이러한 큰 체중 차이는 개와 같은 큰 동물에 갑상선 절제술을 수행하는 것이 더 복잡한 마취 및 수술 절차를 필요로하여 더 어렵고 기술적으로 도전적이기 때문에 대형 동물 모델에 비해 쥐 모델의 수술 어려움을 크게 줄입니다. 수술에 대한 요구 사항 (기본 수술 기술이 필요함)은이 모델에 한계를 제기합니다. 이 연구에 사용된 IONP는 이전에 보고된 바와 같이 우수한 생물안전성과 생분해성을 보여주었습니다15. 궁극적으로, 우리는 IONP를 사용하여 쥐 PG를 음성 이미징하는이 방법이 PG 식별과 관련된 전임상 연구를위한 간단하고 효과적인 동물 모델을 제공하여 새로운 PG 식별 기술의 개발을 촉진 할 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
P.G.와 W.Z.는 이 프로젝트를 기반으로 중국과학원(Zhejiang Cancer Hospital)의 암병원이 제출한 특허 출원의 공동 발명가입니다. 다른 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(NSFC)(82172598), 중국 절강성 자연 과학 재단(LZ22H310001), 중국 저장성 보건위원회 551 건강 인재 양성 프로젝트, 중국 절강성 의료 및 건강 과학 기술 프로젝트(2021KY110)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
- Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
- Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
- Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
- Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
- Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
- Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127 (2019).
- Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702 (2020).
- Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
- Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
- Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
- Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
- Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
- Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
- Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
- Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087 (2022).
